專利名稱：一種Bt蛋白Cry70Ba1、其編碼基因及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的Bt蛋白，具體地說，涉及一種Bt蛋白Cry70Bal、其編碼基因
及應用。
背景技術(shù)：
在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素，據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟損失高達14%，病害損失達12%，草害損失達11%。損失額高達1260億美元，相當于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。另外，蚊媒病在預防醫(yī)學中占有重要位置，其中登革熱和黃熱病等蚊媒病傳播力強、流行面廣、發(fā)病率高、危害性大。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年感染登革熱人數(shù)多達8000萬，我國的海南省在1980和1986年曾經(jīng)暴發(fā)過兩次登革熱，發(fā)病分別達到437469例和113589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊蚊傳播。為了減少這些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學防治手段進行防治，但由于化學農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白Qnsectididal crystalproteins,簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981印f從菌株HD-I中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(Adang M. J 等’ Characterized full-length and truncatedplasmid clones of thecrystal protein of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 and theirtoxicity to Manduca sexta, Gene, 1985,36(3)』89 300.)，人們已經(jīng)分離克隆了500多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N, Zeigler D R, Feitelson J，等 Revision ofthenomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev,1998,62 :807-813 ；http://www. biols. susx.ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，CryU Cry2 和 Cry9 等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應用于植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie，Μ. G.，Beland, G. L ， Bowman, C.，等 Field performance of elite transgenicmaize plantsexpressing an insecticidal protein derived from Bacillusthuringiensis.Bio/Technology, 1993，11 :194-200 ；Perlak，F(xiàn). J.，Deaton，R. W.，Armstrong，T.A.，等 Insectresistant cotton plants.bio/technology,1990 ；8 :939-943 ；Van Frankenhuyzen,K.，Gringorten，L，and Gauhier，D. 1997. Cry9Cal toxin, a Bacillus thuringiensisinsecticidal crystalprotein with high activity against the spruce budworm(Choristoneurafnniferana). Appl. Environ, Microbviol. 63 :4132-4134 ； 王飛，2001，蘇云金芽孢桿菌特異菌株生物學特性及cry9新基因的研究，碩士論文，南開大學)。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(B. thuringiensis subsp. israelensis，簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用于蚊蟲的防治(Goldberg L J，and Margalit J,1977. A bacterialspore demonstrating rapid larvicidal activityagainst Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedesaegypit, and Culexpipiens. Mosqito News，37 :355-358)。同時，Cyt 蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu，D.，Johnson, J. J.，and Federici,B. Α. 1994.Synergism of mosquitocidal toxicity betweenCytA and CryIVD Proteinsusing inclusion sproduced from cloned genesof Bacillus thuringiensis. Mol.Microbiol. 13:965-972 ；ffirth, Μ. C. ， Georghiou, G. P. ， and Federeci, B.Α. 1997. CytAenables CryIVendotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels ofCryIVresistance in the mosquito, Culex quinquefasciatus. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 10536-10540) 自上世紀初發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌至今已有100多年的歷史，在農(nóng)作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治方面得到廣泛的應用，也起到良好的效果。但是，由于大規(guī)模和反復使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群已相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGaughey，W. H. 1985. Insect resistance to the biologicalinsecticide Bacillus thuringiensis. Science. 229 :193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodiainterpunctella)在DipeKBt subsp. kurstaik HD-I的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對 Bt 殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik, B. E.，F(xiàn)inson, N.，Groeters, F. R.，等 1994.Reversal of resistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世紀90年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.廣東小菜蛾對蘇云金桿菌的抗性研究.昆蟲學報，39(3) =238-244 ；Hofte, H. , Van Rie, J. , Jansens, S. , Van Houtven, Α. ,Vanderbruggen, H. , and Vaeck,Μ.,1988. Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum ofthree types oflepidopteran-specific insecticidal crystal proteins ofBacillus thuringiensis.Appl. Environ. Microbiol. 54 :2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學模型預測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性Gchn印f，Ε.，Crickmore, N.，Van Pie, J.，^ 1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystal proteins. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。另外，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問IS (Regis L, 2000. The use of bacterial larvicides inmosquito and black flycontrol programs in Brazil. Mem. InstitutoOswaldo Cruz,95 :207-210.),但是岐蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(xiàn)(Georghiou GP, and WirthM C,1997. Influence of exposure to single versus multiple toxinsofBacillus thuringiensis subsp. israelensis on development of resistance inthemosquito Culex quinquefasciatus(Diptera :Culicidae). Applied andEnvironmentalMicrobiology,63 :1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生抗性的問題，提供一種新的Bt蛋白Cry70Bal、其編碼基因及應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種Bt蛋白Cry70Bal，其氨基酸序列為1) SEQID No. 1所示的氨基酸序列；或 SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如在非活性區(qū)段，將第766位的Gly替換為Ala，將第781位的Ala缺失，在第691位增加Leu，不影響蛋白的活性。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。本發(fā)明從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)新菌株BtM(^8。該菌株已于2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 2719。通過對BtMC^S的毒力測試表明，BtMC^S對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等，均具有極高的毒力。從財1 ^8基因組及質(zhì)粒測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該菌株存在一個新的cry基因，進一步設計其全長基因引物，克隆得到cry70Bal基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，全長為2427bp,分析表明，GC含量為34. 2%，編碼808個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。在 softberry 網(wǎng)站采用 bacterial sigma7. Opromoter 程序?qū)θ蛄羞M行預測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為cry70Bal。Cry70Bal蛋白的氨基酸組成如表1所示。表lCry70Bal蛋白的氨基酸組成
權(quán)利要求
1.一種Bt蛋白Cry70Bal，其氨基酸序列為1)SEQID No. 1所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含有權(quán)利要求1所述蛋白的殺蟲劑。
7.權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
8.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述載體或權(quán)利要求5所述宿主細胞在提高植物抗蟲性中的應用。
9.如權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，所述植物為棉花、玉米、水稻。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cry70Ba1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明的Cry70Ba1蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，可將其編碼基因轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102584959SQ201110459460
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者關(guān)鵬, 劉懷年, 朱軍, 李平, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學