專利名稱：甘藍tt2基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別涉及甘藍(Brassica oleracea) TT2 (TRANSPARENT TESTA 2，透明種皮2 ；又稱MYB12!3)基因家族及其應用。
背景技術：
蕓薹屬(Brassica)是十字花科(Brassicacease) 300多個屬中最重要的一個屬， 含有世界性的重要蔬菜、油料和觀賞作物，如白菜(B.rapa)、甘藍(B. oleracea)和甘藍型油菜(B. napus)，而且甘藍型油菜是由白菜和甘藍通過天然種間雜交并加倍而形成的異源四倍體。擬南芥(Arabidopsis thaliana)則是來自十字花科的研究最深入的模式植物。染色體分子標記共線性研究發(fā)現(xiàn)，蕓薹屬植物之間以及蕓薹屬與擬南芥之間均存在基因組水平和基因水平的保守性。
甘藍型油菜黃籽品系具有種皮薄、種皮色素極少、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟價值和油的品質都有所提高。 雖然親本物種白菜和甘藍中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但甘藍型油菜中不存在天然的黃籽基因型。已有的甘藍型油菜黃籽材料主要通過遠緣雜交等方式而創(chuàng)造，但其存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負相關性狀難以克服等缺點，遠遠不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍型油菜黃籽性狀成為甘藍型油菜育種的重要目標。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進行了廣泛研究， 但到目前為止主要限于傳統(tǒng)研究領域，對于黃籽性狀形成的分子機理仍然不清楚，還沒有任何通過轉基因分子育種創(chuàng)造甘藍型油菜黃籽材料的報道。
類黃酮化合物是廣泛存在的植物次生代謝物，它是植物組織中紅色、藍色和紫色花青素色素呈色物質。擬南芥等植物中種皮色素的主要成分是原花青素(原花青素， proanthocyanidin,PA)單體的聚合物，是由公共苯丙烷-類黃酮-原花青素途徑而合成的。
同為十字花科的模式植物擬南芥功能基因組學的研究成果，為推動蕓薹屬植物重要性狀的分子機理研究和比較基因組學研究提供了重要參考。擬南芥透明種皮2(AtTT2) 基因編碼R2R3-MYB轉錄因子AtMYB123，在種皮色素生物合成與轉運中具有重要的調控功能。TT2可與TT8、TTG1 —起協(xié)同調節(jié)TT3、TT18、TT12、BAN等結構基因的表達，直接調節(jié)種皮色素——原花青素(即縮合單寧)及其前體物(如花青素)的合成和沉積。AtTT2功能失活性即單基因突變導致種皮由野生型的深褐色種子轉變?yōu)橥该鞣N皮(黃籽)。但是，目前甘藍型油菜、白菜和甘藍等蕓薹屬植物TT2基因的成員數(shù)、蛋白特征、進化關系、表達的組織特異性、與黃籽性狀的關系和在基因工程中的應用等都未見報道。發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍TT2基因家族。為達到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術，分別克隆了甘藍型油菜、白菜、甘藍TT2基因家族成員的全長cDNA和對應的基因組序列，并進行了系統(tǒng)的生物信息學分析和功能比較基因組學研究。結果顯示所述白菜TT2 (BrTD)基因家族包括2個成員BrTT2_l基因和BrTT2_2基因；所述BrTT2-l基因如SEQ ID No. 1所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示；所述BrTT2_2 基因如SEQ ID No. 3所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示；所述甘藍TT2 (BoTT2)基因序列如SEQ ID No. 5所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示；所述甘藍型油菜ΤΤ2(&ιΤ ^)基因家族包括以下3個成員ΒηΤΤ2-1基因、ΒηΤΤ2_2 基因和ΒηΤΤ2-3基因；所述ΒηΤΤ2-1基因如SEQ ID No. 7所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示；所述BnTT2-2基因如SEQ ID No. 9所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示；所述BnTT2-3基因如SEQ ID No. 11所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。蕓薹屬TT2基因家族6個成員的6條TT2基因之間具有較高的同源性，基因組序列一致率為91. 8% 99. 5%，編碼區(qū)序列一致性為98. 100%，編碼蛋白水平的一致性和相似性分別為96. 5% 100%和96. 9% 100% ；蕓薹屬TT2基因家族6個TT2成員與與擬南芥TT2(AtTT2)基因間基因組序列一致率為69. 8% 72. 4%，編碼區(qū)序列一致率為78. 8% 79. 4%，編碼蛋白水平的一致率和相似率分別為71. 71. 8%和77. 77. 8%，其中在R2R3-MTO區(qū)域的相似性達到97. 1 %。核酸水平的序列比對、系統(tǒng)發(fā)生聚類、 特征性變異堿基、特征性變異氨基酸等方面都表明，蕓薹屬6條TT2基因都是AtTT2基因的垂直同源基因，具有相似的結構特征。半定量RT-PCR檢測表明，蕓薹屬3個物種間TT2總體表達是相似的，也與擬南芥 TT2大體相似，均主要在發(fā)育的種子中表達，但物種間的垂直同源基因間和同一物種內的水平同源基因間在器官特異性上也存在一定的歧化；此外，TT2基因在白菜、甘藍的黑籽與黃籽材料的生殖器官中的表達存在著較明顯的差異，TT2基因在甘藍型油菜的黑籽與黃籽材料的發(fā)育后期種子中的表達也存在一定的差異，TT2基因表達的下調是蕓薹屬黃籽性狀的重要成因?；谏鲜鼋Y果，利用本發(fā)明的BrTT2、BoTT2、&iTT2基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構建TT2基因重組表達載體和轉化體，用于TT2基因的超量表達、 反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍TT2基因在植物種皮顏色性狀的分子育種中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明選取代表性成員BrTT2_2、BoTT2的全長cDNA，分別正義插入到改造的植物正義表達載體PCAMBIA2301G的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間，構建了蕓薹屬TT2基因家族正義表達載體pBrTT2-2和pBoTT2，采用Flower Dip法將BrTT2_2 轉化擬南芥tt2-l突變體，經(jīng)過PCR和⑶S鑒定表明BrTT2-2全長cDNA整合到tt2_l突變體中，T2代轉基因種子表型分析表明，轉基因植株與野生型擬南芥以及tt2-l突變體相比， 轉基因擬南芥種皮由突變體原來的透明種皮(黃籽)恢復為深褐色，與野生型擬南芥相同， 說明BrTT2-2基因具有與AtTT2基因相同的蛋白功能，即調控種皮色素合成等。
為達到上述目的，進一步，本發(fā)明選取BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族保守片段 ΒΤΤ2Α(核苷酸序列如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 10的第104 737位所示)作為反義片段，將其插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間，構建了 BnTT2、BrTT2 和BoTT2基因家族共抑制的反義抑制表達載體PBTT2A，并通過農(nóng)桿菌介導的下胚軸侵染法轉入甘藍型油菜典型品種中油821，得到了抑制內源TT2表達的轉基因株系。反義&1TT2的轉基因油菜中，種籽普遍失去光澤，有的外觀上表現(xiàn)為褐籽、褐黃籽、紅褐籽，有的種皮仍然在外觀上呈黑籽或黑褐籽，種皮色素均有不同程度下降，最高的比對照下降66. 2%。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TT2基因在白菜和甘藍中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進化關系、表達的組織特異性等，并確認了 TT2基因表達顯著下調是所檢測的蕓薹屬黃籽性狀的重要成因，采用轉基因技術將其正義轉化擬南芥tt2-l突變體能夠完成功能互補而恢復種皮色素積累，反義抑制甘藍型油菜內源TT2基因家族的表達后種皮色素明顯減少，種皮顏色明顯變淺，證明TT2基因對于甘藍型油菜等植物的黃籽性狀等的分子育種中具有重要意義，應用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中
圖1為電泳圖，其中A為BrTT2和BoTT2 5’RACE末端擴增；B為BnTT2 5’RACE末端擴增。
圖2為電泳圖，其中A為BrTT2和BoTT2 3’RACE末端擴增；B為BnTT2 3’RACE末端擴增。
圖3為電泳圖，其中a為BrTT2全長cDNA的擴增，b為BrTT2基因組DNA的擴增， c為BoTT2全長cDNA(2)和基因組DNA(I)的擴增，d為BnTT2全長cDNA的擴增，e為BnTT2 基因組DNA的擴增。
圖4為蕓薹屬ΤΤ2家族成員及AtTT2核苷酸序列的比對圖，其分別代表一致性、保守性、不相似的堿基。
圖5為分析圖，其中A為白菜、甘藍、甘藍型油菜TT2基因ORF的聚類分析，B為推導的蕓薹屬6個TT2蛋白與其它的MYB蛋白的系統(tǒng)分析。
圖6為BrTT2、BoTT2、BnTT2家族6個蛋白及AtTT2的氨基到序列多重比對圖。 黃、藍、綠、白色背景分別代表一致性、保守性、塊狀相似、不相似的氨基酸，其中綠色前景的氨基酸與其它蛋白之間具有弱相似性。
圖7為BrTT2、BoTT2,BnTT2家族6個蛋白的二級結構圖。
圖8為采用SWISS-MODEL預測的BrTT2、BoTT2、BnTT2家族6個蛋白的MYB域的三級結構。
圖9為Southern雜交結果圖，a為BoTT2, b為BrTT2家族，c為BnTT2家族。
圖10為電泳圖，其中A為BrTT2基因家族總體及分成員在白菜黑、黃籽各器官中轉錄水平的RT-PCR檢測，B為BoTT2基因在甘藍黑、黃籽各器官中轉錄水平的RT-PCR檢測； Ro表示根，Hy表示下胚軸，Co表示子葉，St表示莖，Le表示葉，F(xiàn)l表示花，Bu表示蕾，10D、 25D、30D、分別表示開花后10、25、30天的種子，SP表示莢果皮。
圖11為電泳圖，其中I為BnTT2基因家族總體及分成員在甘藍型油菜黑籽材料各器官中轉錄水平的RT-PCR檢測，II為ΒηΤΤ2基因家族總體表達在甘藍型油菜黑、黃籽生殖器官中轉錄水平的RT-PCR檢測的比較；圖注同圖10。
圖12為正義植物表達載體用Xmal+Mcl完全雙酶切驗證的電泳圖，其中a為 pBoTT2,b為pBrTT2-2 ；M為Marker，相鄰M的泳道為酶切反應，遠離M的泳道為未酶切的質粒。
圖13為BrTT2_2和BoTT2正義轉化擬南芥tt2_l突變體T1代轉化子的篩選照片， A為T1代種子的篩選，B為Kan抗性的T1代植株，C為T1代抗性植株移栽。
圖14為BrTT2_2和BoTT2正義轉化擬南芥tt2_l突變體以后Kan抗性擬南芥T1 代植株的GUS染色照片。
圖15為照片圖，a為擬南芥野生型Ler種子，b為BrTT2_2和BoTT2正義轉化tt2_l 的T2代植株的種子，c為tt2-l突變體種子，其中標尺為600 μ m。
圖16為蕓薹屬TT2基因家族反義表達植物載體的構建與鑒定，其中a為擴增反義片段BTT2A，b為用Xmal+&icl完全雙酶切從pMD18_T_BTT2A上切下BTT2A，c為對pBTT2A 進行Xmal+&icl完全雙酶切鑒定；CK為對照質粒pCAMBIA2301G。
圖17為照片圖，PBTT2A轉化甘藍型油菜黑籽品種中油821的再生植株葉片的⑶S 染色。
圖18為電泳圖，pBTT2A轉化中油821的再生植株采用引物組合F35S3N+FBTT2A進行PCR檢測。
圖19為照片圖，pBTT2A轉化中油821后T2株系上T3種籽的種皮顏色比非轉基因對照(中)變淺。
具體實施方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
優(yōu)選實施例采用的植物材料白菜的材料為白菜型油菜亞種(B.rapa ssp. oleifera)的黑籽系06K130和黃籽系06K1M，甘藍的材料為羽衣甘藍變種(B. oleracea var. acephala)的黑籽系06K158和黃籽系06K165，甘藍型油菜的材料為典型黑籽保持系 5B、中油821、黑/黃籽近等基因系(黑籽系Li、黃籽系L2)，均由重慶市油菜工程技術研究中心提供，常規(guī)大田試驗條件種植。擬南芥tt2-l突變體(資源號CS83)，購自Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)，野生型擬南芥Ler生態(tài)型由本實驗室提供，均為室內常規(guī)培養(yǎng)。
優(yōu)選實施例采用的試劑及試劑盒RNAPCR Kit(AMV)Ver. 3. 0、DNA Ligation Kit、 pMD18_T、pMD19_T、Taq DNA 聚合g|、DNase I (RNase-free) R buffer> RNase Inhibitor> DL-2000及λ-HindIII DNA Marker購自大連寶生物(TaKaRa)生物工程有限公司；限制性內切酶 DraI、EcoRI、EcoRV, HindiII、SacI、XmaI、XbaI 等購自立陶宛 MBI Fermentas 公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit,DIG Easy Hyb、DIG Wash and Block Buffer Set,DIG Nucleic Acid Detection Kit,DIG-Iabeled DNA Molecular Weight Marker VII、尼龍膜等為德國 Roche 公司產(chǎn)品；X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3_indolyl-β-D-glucuronic acid) 禾口 Silwet L-77 購自 Sigma 公司；MS (Murashige & Skoog medium, including vitamins) 培養(yǎng)基為荷蘭Duchefa公司產(chǎn)品；DL-2000 plus、Easy-Taq酶、dNTPs等試劑購北京全式金(Transgen)生物技術有限公司；利福平(Rif)、鏈霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)、瓊脂糖、Tris.CTABJris 飽和酚(pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X_gal、 IPTG、CTAB等其它生化與分子生物學試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司。
優(yōu)選實施例采用的主要儀器PTC-200Programmable Thermal Controller PCR 儀購自美國MJ Research公司，Veriti 多重控溫PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；UVP HL-2000雜交紫外交鏈儀購自美國UVP公司，以及分子生物學和基因工程的其它常規(guī)儀器和設備。
一、白菜、甘藍、甘藍型油菜TT2基因家族的克隆
1、白菜、甘藍、甘藍型油菜基因組總DNA和總RNA的提取
每個品系取典型植株的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質量和濃度。同時，以白菜、甘藍、甘藍型油菜典型黑籽系的根、下胚軸、子葉、莖、真葉、花、蕾、莢果皮、和三個時期種子(10D、20D和30D)為材料，分別采用CTAB法提取總RNA，用DNase I去除總RNA中含有的DNA雜質，電泳檢測總RNA的質量，紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度。
電泳結果表明，用CTAB法提取的白菜、甘藍、甘藍型油菜基因組總DNA的完整性好，平均分子量略大于XHindIII DNA Marker的231Λ條帶，RNA消化完全，分光光度法檢測的純度也較高，可用于PCR擴增及Southern雜交實驗。電泳分析表明，獲得的總RNA特征條帶清晰，無明顯RNA降解和DNA污染，分光光度法檢測評價的質量也較好，能夠滿足下游實驗的要求。
2、白菜、甘藍、甘藍型油菜生殖器官RACE總cDNA第一鏈的獲得
針對白菜、甘藍、甘藍型油菜的黑籽系，每個物種均取蕾、花、10天、20天、30天的總RNA的總RNA各1 μ g混合，采用GeneRacer試劑盒按照其說明書操作，得到在3’和5’ 同時錨定有人工接頭序列的總cDNA第一鏈，并用于下一步的RACE錨定擴增。
放大擴增后的雙鏈cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，三個物種的總cDNA呈現(xiàn)出大小在200bp IOkb的拖帶(smear)，重心區(qū)域在1 4kb，最核心區(qū)在1. 5kb左右， 這說明反轉錄比較完全，得到了較高質量的cDNA。
3、白菜、甘藍、甘藍型油菜TT2基因家族5，cDNA末端和3，cDNA末端的擴增
通過Vector NTI Advance 9. O對AtTT2、水稻0sMYB3等基因進行多重比對，根據(jù) TT2保守點設計RACE的基因特異引物(GSP)正向引物FTT2C和FTT2-3，反向引物RTT2C和 RTT2-3(表1)。上述引物分別與GeneRacer kit提供的錨定引物(3，P、3，NP,5' P、5，NP) 配對，用于擴增BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的3’和5’ cDNA末端。3’ RACE的初次擴增引物組合為FBTT2A+3，P，模板為總cDNA即RACE反轉錄產(chǎn)物2 μ L。5，RACE的初次擴增引物組合為5，P+RBTT2A，模板是總cDNA即RACE反轉錄產(chǎn)物2 μ L。PCR反應的程序為94°C變性 2min ；94°C變性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，28 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。5，RACE 的巢擴引物組合為5’NP+RTT2-5，反應體系中模板是初擴產(chǎn)物0. 1 μ L。PCR反應的程序為 94°C變性 2min ；94°C變性 lmin, 55°C退火 lmin, 72°C延伸 Imin, 20 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0PCR反應的程序為94°C變性anin ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lminJ8個循環(huán)；72°C延伸lOmin。3'RACE的巢擴引物組合為FTT2_3+3’NP，反應體系中模板是初擴產(chǎn)物 0. IyL0 PCR 反應的程序為94°C變性 2min ；94°C變性 lmin, 55°C退火 lmin, 72°C延伸 Imin, 20個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族5’ RACE末端克隆的結果圖1顯示，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族5’ RACE巢式擴增在約360bp有寬帶，這與根據(jù)AtTT2序列所預測的長度基本一致?；厥諏拵?，與T載體連接后轉化DH5 α，對白斑單克隆子進行菌液PCR檢測，電泳檢測后發(fā)現(xiàn)插入片段具有豐富的長度多態(tài)性。挑選有多態(tài)性的一批代表性的陽性單克隆子，采用M13F引物進行測序。測序結果剪去GeneRaCerTMRNA Oligo殘留的30bp接頭序列后:BrTT2的5，cDNA末端序列介于224 355bp (224,319, 344 和 355bp)，BoTT2 基因的 5’cDNA 末端序列介于 227 423bp (227、243、349、355、360 和 423bp)，BnTT2基因的5，cDNA末端序列介于349 360bp (3個360bp克隆子、2個349bp克隆子)。NCBI核酸-核酸BLAST (BALSTn)表明這些片段與AtTT2具有最高的同源性，證明所得克隆子的序列為白菜、甘藍、甘藍型油菜TT2基因家族的5’末端。Vector NTI Advance 9. 0上進行的多重比對表明，盡管這些克隆子長度多態(tài)性豐富，但BrTT2、BoTT2、&iTT2基因家族5’ cDNA末端分別只代表了 1、1、2條獨立基因，但多數(shù)成員均存在可變轉錄起始位點， 還發(fā)現(xiàn)BoTT2 5，cDNA末端的423bp克隆子保留著第2內含子未剪接。
表1本研究所用引物
權利要求
1.甘藍TT2基因，其特征在于所述甘藍TT2基因因序列如SEQ ID No. 5所示，其全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示；
2.含有權利要求1所述甘藍TT2基因中任一種或多種基因或基因截短片段的重組表達載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于但并不限于所述重組表達載體為含有甘藍TT2基因保守片段BTT2A的反義RNA植物表達載體，所述BTT2A片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 10的第104 737位堿基所示。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述反義RNA植物表達載體是將BTT2A片段反義插入pCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間而得到。
5.含有權利要求2或3或4所述重組表達載體的轉化體。
6.權利要求1所述甘藍TT2基因在植物種皮顏色性狀的分子育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別涉及甘藍TT2基因家族及其應用；所述甘藍TT2的基因家族BoTT2基因；本發(fā)明還公開了上述基因在植物分子育種中的應用，通過反義抑制其在黑籽甘藍型油菜中的表達后，轉基因植株發(fā)生了種皮顏色變淺等性狀變化，具有創(chuàng)造轉基因黃籽材料的潛力。
文檔編號C12N15/63GK102492694SQ20111045980
公開日2012年6月13日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權日2010年9月15日
發(fā)明者付春, 位運糧, 呂俊, 唐章林, 張迪, 李加納, 杜娟, 柴友榮, 申敏 申請人:西南大學