專利名稱：含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及生物納米領(lǐng)域，特別涉及含有微球面陣列的培養(yǎng)皿。
背景技術(shù)：
以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物檢測是近二十年來藥物篩選領(lǐng)域發(fā)展起來的藥用效應(yīng)或毒理效應(yīng)的重要功能篩選手段。在這一篩選體系中，細(xì)胞作為一種生物傳感器被整合到篩選平臺中，既可以作為高通量篩選(high throughput screening, HTS)也可以作為高容量篩選(high content screening, HCS)的檢測手段。較之于生物化學(xué)檢測手段，細(xì)胞篩選方法具有從功能的角度獲取待篩選分子藥用效應(yīng)或毒理效應(yīng)的優(yōu)勢，然而其篩選成本卻顯著地低于動物實驗。在現(xiàn)有的細(xì)胞藥物篩選體系中，細(xì)胞培養(yǎng)通常采用普通平面培養(yǎng)皿。盡管已有的培養(yǎng)基及化學(xué)添加劑已經(jīng)能夠滿足人體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)要求，然而采用平面培養(yǎng)皿的培養(yǎng)技術(shù)卻很明顯地忽略了體內(nèi)細(xì)胞生存的微觀環(huán)境物理特性。在體情況下，細(xì)胞生存于三維的細(xì)胞基質(zhì)中，而且這一支撐基質(zhì)具有復(fù)雜的表面拓?fù)湮⒔Y(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)基底與體內(nèi)生存條件的差異導(dǎo)致了培養(yǎng)細(xì)胞功能狀態(tài)較之于體內(nèi)不可避免的差異。對于藥物篩選而言，這可能是篩選通量低下、篩選結(jié)果與后期動物實驗結(jié)果不符的重要原因。另一方面，通過培養(yǎng)皿基底物理特性，如拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征，的設(shè)計改變篩選細(xì)胞的功能響應(yīng)性，將為提高細(xì)胞藥物篩選效能提供新的技術(shù)途徑。近年來，組織工程與細(xì)胞工程的發(fā)展為藥物篩選技術(shù)的革新提供了新的機(jī)遇。如， 三維培養(yǎng)技術(shù)的建立為在體外模擬體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境提供了有效的工程化手段。這里最成功的例子可能是三維腫瘤微球被用于體外腫瘤細(xì)胞的多重抗藥性研究。另一方面，培養(yǎng)基底拓?fù)湮⒔Y(jié)構(gòu)與培養(yǎng)細(xì)胞生長行為的關(guān)系已經(jīng)有三十多年的研究歷史。早期的研究大量集中在成纖維細(xì)胞與骨細(xì)胞的研究，其研究結(jié)果已經(jīng)被用于組織工程植入體的構(gòu)建。細(xì)胞培養(yǎng)基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由于影響細(xì)胞的形態(tài)及功能行為，因而是模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的重要途徑。對于神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞及腺體細(xì)胞等依賴于離子通道功能活動的可興奮細(xì)胞而言，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)境因為影響細(xì)胞的粘附、鋪展及幾何形態(tài)將對離子通道的功能響應(yīng)性可能產(chǎn)生明顯的影響，這在離子通道靶向藥物的篩選中具有重要的應(yīng)用前景。電壓依從式鈣離子通道(voltage dependent calcium channel, VDCC)是細(xì)胞重要的離子通道。由于其參與細(xì)胞的眾多生理過程以及在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病中的重要作用，VDCC在制藥業(yè)已經(jīng)成為藥物篩選的重要靶效應(yīng)通道。以VDCC為靶效應(yīng)通道的細(xì)胞藥物篩選體系首先要求所采用目標(biāo)細(xì)胞具有VDCC的表達(dá)及相應(yīng)的VDCC功能響應(yīng)性。VDCC 功能響應(yīng)性的強(qiáng)弱或大小直接影響到藥物的篩選效能，如篩選通量以及有關(guān)藥物效應(yīng)和毒性的信息內(nèi)含量。對于以神經(jīng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的VDCC靶通道藥物篩選，細(xì)胞的VDCC功能響應(yīng)性低下是制約篩選效能提高的重要因素。引起神經(jīng)細(xì)胞VDCC功能響應(yīng)性低下的因素可能包括(1)所使用神經(jīng)細(xì)胞VDCC表達(dá)水平低下；(2)所采用分化條件不利于神經(jīng)細(xì)胞VDCC 的充分表達(dá)并成熟；(3)細(xì)胞的其他離子通道功能或膜電位水平異常。盡管采用基因工程的方法可以達(dá)到增強(qiáng)VDCC功能響應(yīng)性從而構(gòu)建篩選細(xì)胞的目的，但基因操作過程對于篩選結(jié)果的影響卻值得進(jìn)一步評價。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本實用新型的目的之一在于提供培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿的基底含球面致密陣列型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該培養(yǎng)基底的拓?fù)湮⒔Y(jié)構(gòu)能支持所培養(yǎng)細(xì)胞的粘附及鋪展，進(jìn)而增強(qiáng)篩選細(xì)胞VDCC的功能響應(yīng)性。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型的技術(shù)方案為含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體1和培養(yǎng)皿蓋板2，所述培養(yǎng)皿本體1 的基底3設(shè)有至少一個微球面陣列4，所述微球面陣列4中微球5的直徑為微米或納米級。進(jìn)一步，所述微球面陣列4為球面直徑0. 51-1. 98微米的微球5緊密排列而成，所述微球面陣列4中的兩相鄰微球5的間距小于0. 5微米；進(jìn)一步，所述微球5為微全球5-A和/或微半球5-B ；進(jìn)一步，所述微球面陣列4的面積至少大于單個靶細(xì)胞的面積；進(jìn)一步，所述微球面陣列4的面積為0. 25cm2 ；進(jìn)一步，所述培養(yǎng)皿還包括進(jìn)液管7和出液管8，培養(yǎng)皿蓋板2上設(shè)有連接孔6，所述進(jìn)液管7和出液管8從連接孔6伸入培養(yǎng)皿內(nèi)；進(jìn)一步，所述出液管8伸入培養(yǎng)皿內(nèi)的一端與基底3接觸；進(jìn)一步，培養(yǎng)皿蓋板2上的連接孔設(shè)有密封墊圈9。微球面陣列培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鈣離子熒光染料染色后，以普通熒光顯微鏡、 激光共聚焦顯微鏡、孔板讀數(shù)器或其他鈣離子熒光記錄裝置采集細(xì)胞鈣離子熒光信號，在信號采集過程中用高鉀溶液施以去極化刺激，得增強(qiáng)的電壓依從式鈣離子通道熒光響應(yīng)性。本實用新型的有益效果在于本培養(yǎng)皿采用傾斜條件下的分步蝕刻方法制備而成，其微球面直徑為微米或納米級，制備的微球面陣列可以達(dá)到0. 10到0. 25 cm2的大面積范圍，達(dá)到培養(yǎng)皿應(yīng)用的要求，其生產(chǎn)成本低，操作簡單；本培養(yǎng)皿能顯著增加神經(jīng)細(xì)胞 VDCCs功能響應(yīng)性含有微球面陣列的培養(yǎng)皿在神經(jīng)干細(xì)胞分化第0天、7天、14天時，較普通培養(yǎng)皿能顯著提高靶細(xì)胞的VDCC熒光響應(yīng)性；運用本培養(yǎng)皿增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法為藥物篩選提供了新方法和思路。

為了使本實用新型的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本實用新型作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為含有微球面陣列的培養(yǎng)皿本體的示意圖；圖2為含有微球面陣列的培養(yǎng)皿蓋板的示意圖；圖3為含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底示意圖；圖4為含有微半球球面陣列的培養(yǎng)皿基底示意圖；圖5為ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞在平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿和微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿中的掃描電鏡照片。圖示在細(xì)胞接種后第2天(分化第0天)細(xì)胞于平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿(a)、1. 98 μ m微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿(b)和0. 51 μ m微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿(c)的生長狀況，標(biāo)尺示25 μ m。
具體實施方式
為了使本實用新型的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本實用新型的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例1含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的制備一材料準(zhǔn)備1. 35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，美國);細(xì)胞培養(yǎng)六孔板(Nest Biotech Co.，Ltd, 中國)2.直徑為25 mm的圓形蓋玻片(上海精輪工業(yè)上玻璃有限公司，中國。或Fisher Scienti c,美國)3.聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories, Inc.,美國?；?aladdin,中國)，直徑分別為0.51微米和1.98士0.20微米。4. 2. 5%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)皿一個，剪碎后稱取聚苯乙烯 2. 5克，加入IOOmL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?. 10. 16%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)皿一個，剪碎后稱取聚苯乙烯10. 16克，加入IOOmL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?. 1.7%的聚苯乙烯微球工作懸液10%的聚苯乙烯微球懸液(供貨濃度)40 μ L蒸餾水200 μ L混勻后得濃度為1. 7%的微球工作懸液。7.傾斜平臺，自制。8.聚二甲基硅氧燒 ^x)ly(dimethylsiloxane)，PDMS] (Sylgard 184，Dow Corning,美國)二、含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的設(shè)計及制備1.含有微球面陣列的培養(yǎng)皿設(shè)計本實用新型的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿本體1，詳見圖1 ；培養(yǎng)皿蓋板2詳見圖2。 應(yīng)當(dāng)指出，本設(shè)計按照普通35mm培養(yǎng)皿進(jìn)行設(shè)計描述。如改變培養(yǎng)皿及孔板尺寸或具有多個重復(fù)單元結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)皿孔板(如6孔板、12孔板等)而具備本實用新型的權(quán)利保護(hù)特征的培養(yǎng)皿及孔板設(shè)計依然屬于本專利的權(quán)利保護(hù)范圍。 1)含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體1和培養(yǎng)皿蓋板2，所述培養(yǎng)皿本體 1的基底3設(shè)有至少一個微球面陣列4，所述微球面陣列4中微球的直徑為微米或納米級。2)所述微球面陣列4為球面直徑0. 51-1. 98微米的微球5緊密排列而成，所述微球面陣列4中的兩相鄰微球5的間距小于0. 5微米；3)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述微球面5為微全球5-A和/或微半球 5-B ；其中，微全球是指微型的球體，微半球是指微型的半球體；4)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述微球面陣列4的面積至少大于單個靶細(xì)胞的面積；[0045]5)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述微球面陣列4的面積為0. 25cm2 ；6)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述培養(yǎng)皿還包括進(jìn)液管7和出液管8，所述進(jìn)液管7和出液管8從培養(yǎng)皿板蓋2上的連接孔6伸入培養(yǎng)皿內(nèi)。在不開啟培養(yǎng)皿蓋板的靜置的條件下，采用負(fù)壓作用下可以借助出液管8引流出培養(yǎng)皿本體1的全部液體；在非檢測的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)皿也可以不使用進(jìn)液管和出液管，直接通過揭開培養(yǎng)皿蓋板進(jìn)行換液；7)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述出液管8伸入培養(yǎng)皿內(nèi)的一端與基底3 接觸；8)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿蓋板2上的連接孔設(shè)有密封墊圈9。 密封墊圈9固定出液管8及進(jìn)液管7與軟質(zhì)硅膠管的連接。液體引流管及進(jìn)樣管使得在熒光檢測過程中可以在靜置條件下完成液體更換、清洗及加樣，避免了移動培養(yǎng)皿引起被檢測視野變化對熒光檢測的影響。含有微球面陣列的培養(yǎng)皿本體詳見圖1 ；含有微球面陣列的培養(yǎng)皿蓋板詳見圖2 ；含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底詳見圖3 ；含有微半球球面陣列的培養(yǎng)皿基底詳見圖4 ；上述微球面直徑可以為微米級或亞微米級。上述培養(yǎng)皿也可直接設(shè)計為基底3表面有微球面陣列4的構(gòu)造。2、含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的制備步驟應(yīng)當(dāng)指出，作為優(yōu)先實施示例，這里以35mm培養(yǎng)皿及六孔板為例描述具有微球面陣列基底的培養(yǎng)皿及孔板的制備過程。以其它尺寸或其他途經(jīng)實現(xiàn)的微全球球面或微半球球面致密陣列基底培養(yǎng)皿或孔板也在本專利權(quán)限保護(hù)之內(nèi)。現(xiàn)就本部分實施步驟描述如下。①取35mm培養(yǎng)皿一個，在培養(yǎng)小室底部中央開出一直徑IOmm的圓形小孔。除培養(yǎng)皿外，其他六孔板、十二或其他孔板均可以實現(xiàn)。②取25mm圓形蓋玻片，以2. 5%的聚苯乙烯溶液在約6000轉(zhuǎn)/分的條件下旋轉(zhuǎn)涂層40秒，對蓋玻片進(jìn)行薄型聚苯乙烯裱襯，涂層厚度約0. 1微米。③取25mm圓形蓋玻片，以10. 16%的聚苯乙烯溶液在約2000轉(zhuǎn)/分的條件下旋轉(zhuǎn)涂層30秒，對蓋玻片進(jìn)行厚型聚苯乙烯裱襯，涂層厚度約5微米。④取步驟②所獲得的經(jīng)薄型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片，以分步等離子蝕刻在傾斜角度的條件下制備微球陣列。具體步驟為(a)薄型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片以等離子氧蝕刻 60-80秒；(b)將30-50微升濃度為1. 7%的聚苯乙烯微球工作懸液分布于經(jīng)聚苯乙烯涂層的蓋玻片表面；(c)分布有聚苯乙烯微球工作懸液的蓋玻片放置于傾斜平臺，傾斜約10°， 靜置30分鐘顯微鏡下檢查微全球球面陣列形成情況；(d)重復(fù)步驟(b)和(c)，直至形成大片的微全球球面陣列為止；(e)為穩(wěn)定聚苯乙烯微球與涂層表面的粘結(jié)，將上述微全球球面陣列于104°C烘箱中焙干35分鐘。⑤將上述步驟④制備的含微全球球面陣列的蓋玻片嵌入并粘結(jié)于上述步驟①所制備的開孔培養(yǎng)皿或孔板底部，獲得含微全球球面致密陣列基底的培養(yǎng)皿或孔板。[0062]為獲得含微全球球面致密陣列基底培養(yǎng)皿或孔板，步驟④和⑤可以先后交換，即可以先粘結(jié)薄型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片于開孔的培養(yǎng)皿或孔板底部，構(gòu)成平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿，再在底表面進(jìn)行微全球球面陣列的制備，得含微全球球面致密陣列基底的培養(yǎng)皿。⑥將PDMS預(yù)聚體與固化劑按10 1的比例混合均勻澆注于步驟④所制備的含微全球球面致密陣列的蓋玻片上，真空抽氣30 min,于60°C的加熱板條件下固化2小時，將固化的PDMS剝離即得到PDMS球面陣列負(fù)模。⑦取步驟③所制備的厚型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片，置于103°C的加熱板上，以步驟⑥所制備的PDMS球面陣列負(fù)模在亞玻璃態(tài)溫度條件下進(jìn)行進(jìn)行加壓。20分鐘后，取出厚型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片及PDMS球面陣列負(fù)模，室溫冷卻，剝離PDMS球面陣列負(fù)模即得含微半球球面陣列的基底。⑩將步驟⑦制備的含微半球球面陣列的基底嵌入并粘結(jié)于上述步驟①所制備的開孔培養(yǎng)皿或孔板底部，獲得含微半球球面陣列基底的培養(yǎng)皿或孔板。微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿和微半球球面陣列基底培養(yǎng)皿均為增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的培養(yǎng)皿。從普通細(xì)胞尺寸(10-20微米)及本實用新型的球面直徑尺度(0. 51-1. 98微米)看，只要細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞不能深入到球面之間間隙的尺寸及球面直徑均可，且微全球球面陣列和微半球球面陣列應(yīng)為相同功能的細(xì)胞培養(yǎng)表面。③按圖2以及“含有微球面陣列的培養(yǎng)皿設(shè)計”部分所描述的結(jié)構(gòu)和尺寸制備培養(yǎng)皿蓋板。⑩步驟⑤和步驟⑥所制備的含微球面陣列的培養(yǎng)皿本體經(jīng)等離子氧蝕刻150秒以增加表面粗糙度后即可用于細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞藥物篩選的檢測。該等離子蝕刻步驟也可在步驟ill和步驟制備的球面陣列嵌入并粘結(jié)于開孔培養(yǎng)皿及孔板之前進(jìn)行。將制備好的培養(yǎng)皿進(jìn)行消毒殺菌處理后，可用于細(xì)胞培養(yǎng)及檢測。實施例2含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法將以上含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及電壓依從式鈣通道功能響應(yīng)性的評價，證實本方法的實施效果。應(yīng)當(dāng)指出，對于微半球球面陣列的培養(yǎng)皿而言，神經(jīng)細(xì)胞感知的拓?fù)湮h(huán)境與微全球球面陣列完全一樣，因為細(xì)胞的尺度及生長行為決定了細(xì)胞不可能貼附于微球與微半球的底部從而感知這一部分幾何形態(tài)的差異。發(fā)明者完全有理由推測半球球面致密陣列與微全球球面致密陣列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有相同的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。一、材料準(zhǔn)備1. ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞(Millipore公司，美國)2. 多聚鳥氨酸(poly-L-ornithine hydrobromide) (Sigma產(chǎn)品，美國)3.濃度為40 μ g/mL的多聚鳥氨酸裱襯液取多聚鳥氨酸供貨安培瓶(含多聚鳥氨酸凍干制劑50mg)，加入5mL滅菌蒸餾水， 渦旋混勻制成濃度為lOmg/mL的儲備液。上述儲備液分裝為16 μ L/印pendorf管。取上述含16 μ L多聚鳥氨酸儲備液的印pendorf管，加入4mL的滅菌蒸餾水，渦旋混勻制成濃度為40 μ g/mL的多聚鳥氨酸裱襯液。4.鼠基底膜層粘連蛋白[來自EHS鼠肉瘤(Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma) ] (Sigma 產(chǎn)品，美國)5.濃度為5 μ g/mL的鼠基底膜層粘連蛋白裱襯液將濃度為lmg/mL (供貨濃度)的鼠基底膜層粘連蛋白儲備液分裝為IOyL/ 印pendorf管。取上述含10 μ L鼠基底膜層粘連蛋白儲備液的印pendorf管，加入2mL的滅菌蒸餾水，渦旋混勻制成濃度為5 μ g/mL的鼠基底膜層粘連蛋白裱襯液。6.濃度為200mM的L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich產(chǎn)品，美國)7. B27 添加劑(Invitrogen 產(chǎn)品，美國)8.濃度為10 μ g/mL的重組人白血病抑制因子(recombinant human leukemia inhibitory factor, LIF) (Chemicon 產(chǎn)品，美國)9. Neurobasal 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 anvitrogen 產(chǎn)品，美國)10.堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) (Sigma-Aldrich 產(chǎn)品，美國)11.牛血清白蛋白(bovine serum albumine，BSA)(鹽城賽寶生物科技有限公司， 中國)12. bFGF 儲備液稱取牛血清白蛋白lg，加入IOOmL Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以0. 2微米孔徑濾膜無菌過濾后制得含1%BSA的Neurobasal培養(yǎng)基。取bFGF供貨安培瓶(內(nèi)含25 μ g bFGF凍干制劑)，加入0. 5 mL含1%BSA的 Neurobasal培養(yǎng)基，制得濃度為50 μ g/mL的bFGF儲備液。13.神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液濃度為200mM的L-谷氨酰胺0. 5 mLB27 添加劑LOmL濃度為10 μ g/mL 的 LIF50 μ L濃度為50 μ g/mL的bFGF儲備液20 μ L以Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至50 mL上述擴(kuò)增培養(yǎng)液含添加劑的終濃度為L-谷氨酰胺2 mM ；bFGF 20 η g/mL ； LIF 10 ng/mL ；B-27 添加劑 2%。14.神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液濃度為200mM的L-谷氨酰胺0. 5 mLB27 添加劑1. 0 mL濃度為10 μ g/mL 的 LIF50 μ L以Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至50 mL上述擴(kuò)增培養(yǎng)液含添加劑的終濃度為L-谷氨酰胺2 mM ；LIF 10 ng/mL ；B-27添加劑2%。15. 0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液(pH7. 2)甲液二甲胂酸鈉4. ^g，加蒸餾水至100ml乙液0·2Ν鹽酸[0105]取甲液50mL、乙液4. 2mL,以蒸餾水定容至200mL，即得pH為7. 2的0. 2M 二甲胂酸
鹽緩沖液。16. 0. IM的二甲胂酸鹽緩沖液(pH7. 2)取上述0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液50mL，以蒸餾水定容至IOOmL即可。17. 8% 的戊二酸儲備液(Electron Microscopy Sciences 產(chǎn)品，美國)18.含2%戊二醛的0. IM 二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7. 2)采用如下配方8%的戊二醛儲備液5 mL蒸餾水5 mL0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液 IOmL19. 4%的四氧化鋨儲備液取四氧化鋨lg，以蒸餾水定容至25mL。20.含1%四氧化鋨的0. IM 二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7. 2)采用如下配方4%的四氧化鋨儲備液5 mL蒸餾水5 mL0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液 IOmL21.梯度脫水用不同濃度的乙醇采用如下配方
權(quán)利要求1.含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體(1)和培養(yǎng)皿蓋板(2)，其特征在于所述培養(yǎng)皿本體(1)的基底(3 )設(shè)有至少一個微球面陣列(4 )，所述微球面陣列(4 )中微球(5 ) 的直徑為微米或納米級。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球面陣列(4) 為直徑為0. 51-1. 98微米的微球(5)緊密排列而成，所述微球面陣列(4)中的兩相鄰微球 (5)的間距小于0.5微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球(5)為微全球(5-A )和/或微半球(5-B )。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球面陣列(4) 的面積至少大于單個靶細(xì)胞的面積。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球面陣列(4) 的面積為0. 25cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述培養(yǎng)皿還包括進(jìn)液管(7)和出液管(8)，皿蓋板(2)上設(shè)有連接孔(6)，所述進(jìn)液管(7)和出液管(8)從連接孔(6)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述出液管(8)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)的一端與基底C3)接觸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于培養(yǎng)皿蓋板(2)上的連接孔設(shè)有密封墊圈(9)。
專利摘要本實用新型涉及生物納米領(lǐng)域，特別涉及含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體1和培養(yǎng)皿蓋板2，所述培養(yǎng)皿本體1的基底3表面設(shè)有至少一個微球面陣列4，所述微球面陣列4的球面直徑為微米或納米級；本培養(yǎng)皿采用傾斜條件下的分步蝕刻方法制備而成，制備的微球面陣列面積達(dá)到培養(yǎng)皿應(yīng)用的要求，其生產(chǎn)成本低，操作簡單；運用本培養(yǎng)皿增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法為藥物篩選提供了新方法和思路。
文檔編號C12M1/00GK202030741SQ20112003810
公開日2011年11月9日 申請日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者吳澤志, 宋兆全, 廖彥劍, 朱滿根, 林雨, 梁福榮, 金良, 黃豈蘋 申請人:重慶大學(xué)