專(zhuān)利名稱(chēng)：腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，具體涉及ー種三探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)患兒糞便、咽式子、血液、腦脊液等樣本中腸道病毒通用型(EV)、腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CA16)分型及定量的新方法。本品以腸道病毒高度保守的5’非編碼區(qū)(UTR)為靶序列，設(shè)計(jì)腸道病毒通用引物和腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型三色熒光標(biāo)記探針，利用一歩法三色實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技木，達(dá)到早期、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)所有腸道病毒及分型的應(yīng)用目的。
背景技術(shù)：
手足ロ病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見(jiàn)傳染病，以嬰幼兒發(fā)病為主。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為 主要特征。少數(shù)患兒可出現(xiàn)中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)損害，引發(fā)腦炎、急性弛緩性麻痹、腦水腫和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡。腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackievirus) A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和腸道病毒71型(EV 71)等均能引起手足ロ病。其中以EV 71及Cox A16型最為常見(jiàn)。二者所致的手足ロ病臨床難以區(qū)別。與CA16不同，EV71不僅引起手足ロ病，而且可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦炎、腦膜炎、急性遲緩性癱瘓等，重者死亡。腸道病毒引起的手足ロ病、病毒性腦炎等疾病潛伏期一般為3 7天，沒(méi)有明顯的前驅(qū)癥狀，多數(shù)病人突然起病。早診斷、早治療至關(guān)重要。目前，對(duì)于腸道病毒引起的手足ロ病、病毒性腦炎等疾病實(shí)驗(yàn)室仍缺乏快速、敏感、特異的診斷方法。傳統(tǒng)的腸道病毒檢測(cè)有病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷，前者曾被視為腸道病毒診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作繁瑣、較為費(fèi)時(shí)，一般需4-15天，且存在操作繁瑣、敏感性低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足疾病預(yù)防的“四早”要求；而血清學(xué)診斷最常用的是中和實(shí)驗(yàn)，即用微量板法測(cè)定抗體滴度，通常用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是常常只能作為回顧性診斷的依據(jù)，而且容易與其它病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，所以抗體法無(wú)助于早期診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)為病原微生物的檢測(cè)提供了新的方向，特別近幾年興起的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。該方法通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR過(guò)程中產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并可精確計(jì)算出初始模板量。該法除定量準(zhǔn)確、檢測(cè)快速外，其最大優(yōu)點(diǎn)是采用完全閉管檢測(cè)，避免了交叉污染，廣泛被科研和臨床所接受。隨著熒光定量PCR檢測(cè)儀器的更新和染料科學(xué)的發(fā)展，不同腸道病毒屬間的檢測(cè)可用不同的熒光素標(biāo)記特異探針，運(yùn)用多重反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR( RT-qPCR)技術(shù)，可對(duì)臨床最常見(jiàn)的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Cox A16)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和對(duì)腸道病毒屬脊灰病毒、柯薩奇、?？刹《竞湍c道病毒68 71型等各型病毒株全基因組分析發(fā)現(xiàn)，各型腸道病毒5’非編碼區(qū)(UTR)存在著高度保守的區(qū)域，可以用來(lái)設(shè)計(jì)并擴(kuò)增檢測(cè)所有腸道病毒株。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型三聯(lián)同時(shí)檢測(cè)。發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由定量RT-PCR反應(yīng)液管、標(biāo)準(zhǔn)品管、陽(yáng)性對(duì)照品管、陰性對(duì)照品管和盒體組成，其中定量RT-PCR反應(yīng)液管裝有RT-PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16型熒光探針、耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、反轉(zhuǎn)錄酶(PrimeScript RTase 酶)。檢測(cè)用引物分上游引物和下游引物上游引物序列為5'-CCCTGAATGCGGCTAATCC -3'下游引物序列為5'-GAITGTCACCATAAGCAGCC -3'檢測(cè)用各分型熒光探針序列和各自的熒光素標(biāo)記物 EV 通用型熒光探針為 5' FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - 3' BHQ-IEV71 型熒光探針為 5'HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3'BHQ-lCA16 型熒光探針為 5' ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - 3' BHQ-2標(biāo)準(zhǔn)品序列為CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCACAAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTCCTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC陰性對(duì)照管為無(wú)菌注射用水樣品，陽(yáng)性對(duì)照管為EV71型滅活病毒株樣品，購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因公司。本定量試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本實(shí)用新型試劑盒使用方法毎次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌去離子水稀釋為I X IO4 —I X IO7拷貝。腸道病毒核酸RNA提取嚴(yán)格按照商品化核酸RNA提取試劑盒QIAGEN Viral RNAMini Extraction Kit (QIAGEN，CAT :52904)操作，從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病韋RNA ； 取5W提取RNA作為RT-PCR模板。擴(kuò)增檢測(cè)在三色(或以上)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，總體積25 iil，其中20. OiUPCR反應(yīng)液，5 Ul檢測(cè)樣品(提取產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性或陰性對(duì)照)；探針檢測(cè)模式設(shè)置為Reporter Dye :FAM、HEX和ROX通道，分別用于檢測(cè)EV通用型、EV71型和CA16型；反應(yīng)條件45°C 10分鐘，I個(gè)循環(huán)，94°C 2分鐘，I個(gè)循環(huán)，94°C 15秒一60°C 60秒，40個(gè)循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。突光定量結(jié)果報(bào)告I.如果檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或Ct值> 40，可判樣品為非腸道病毒(NEV)；2.如果檢測(cè)樣品Ct值彡38，且曲線(xiàn)有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，可判樣品為陽(yáng)性；3.如果檢測(cè)樣品38 < Ct值< 40，需要對(duì)樣品重新進(jìn)行核酸提取和檢測(cè)操作，若再次實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值< 38，且曲線(xiàn)有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，判樣品為陽(yáng)性；若以值> 38，可判樣品為陰性，具體是否屬于腸道病毒通用型、腸道病毒71型、柯薩齊病毒A組16型，請(qǐng)按照表I決定。
表I
待檢標(biāo)本RT-PCR結(jié)巢巢
EV C — )，EV71 (-), CAl6 (-)非煙道_ (NEV)
EV ( + ), EV71 (-) CA16 ￠-)非 EV.71、CAl6 的其它腸道病毒 EV ( + ), EV71 ( + ), CAl6 卜〕EV71 EV ( + ), EV71 (-), CA16 ( + ) CAl6本實(shí)用新型試劑盒通過(guò)ー步法同時(shí)對(duì)腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型進(jìn)行檢測(cè)分型，比起市場(chǎng)上現(xiàn)有的三個(gè)獨(dú)立分開(kāi)的檢測(cè)試劑盒，不僅節(jié)約了生產(chǎn)成本和檢測(cè)成本，同時(shí)也提高了檢測(cè)的效率和時(shí)間；另外我們引入通用引物和分型探 針設(shè)計(jì)技術(shù)，在保證沒(méi)有多對(duì)引物競(jìng)爭(zhēng)的條件下隨機(jī)自動(dòng)的達(dá)到多通道的檢測(cè)目的，上述的設(shè)計(jì)實(shí)用新型達(dá)到了效率和技術(shù)的統(tǒng)一。

圖I為本實(shí)用新型試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增圖。圖3為腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)ー步說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例I參見(jiàn)圖1，本實(shí)用新型的一種腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由定量RT-PCR反應(yīng)液I、標(biāo)準(zhǔn)品2、陽(yáng)性對(duì)照品3、陰性對(duì)照品4和盒體5組成，其中定量RT-PCR反應(yīng)液I含有RT-PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16型熒光探針、耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、反轉(zhuǎn)錄酶(PrimeScript RTase 酶)。檢測(cè)用弓丨物分上游弓丨物和下游引物，上游引物序列為5'-CCCTGAATGCGGCTAATCC -3'下游引物序列為5'-GAITGTCACCATAAGCAGCC -3'檢測(cè)用各分型熒光探針序列和各自的熒光素標(biāo)記物，EV 通用型熒光探針為 5' FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - 3' BHQ-IEV71 型熒光探針為 5'HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3'BHQ-l[0041 ] CA16 型熒光探針為 5' ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - 3' BHQ-2標(biāo)準(zhǔn)品序列為CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCACAAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTCCTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC陰性對(duì)照為無(wú)菌注射用水樣品，陽(yáng)性對(duì)照為EV71型滅活病毒株樣品，購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因公司。本定量試劑盒保存于_20°C,盡量減少反復(fù)凍融。實(shí)施例2 腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒敏感度和特異性實(shí)驗(yàn)一、材料選取病原微生物包括如下實(shí)驗(yàn)組柯薩奇病毒A組16型，腸道病毒EV71型，柯薩 奇病毒B組3型和?？刹《?0型等腸道病毒株；對(duì)照組甲型肝炎病毒，輪狀病毒，こ型炎病毒，人巨細(xì)胞病毒和肺炎支原體等，上述病源毒株均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因公司。ニ、引物及探針設(shè)計(jì)與合成對(duì)腸道病毒UTR區(qū)核酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，應(yīng)用DNA STAR等軟件分析序列的同源性和各型的差異性，設(shè)計(jì)并篩選EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16型熒光探針。上游引物序列為5'-CCCTGAATGCGGCTAATCC -3'下游引物序列為5’一 GAITGTCACCATAAGCAGCC — 3’。EV 通用型熒光探針為 5' FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - 3' BHQ-IEV71 型熒光探針為 5'HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3'BHQ-lCA16 型熒光探針為 5' ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - 3' BHQ-2均由上海生エ公司合成。三、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品制備用上述引物擴(kuò)增腸道病毒EV71型病毒株，在上游引物的擴(kuò)增位點(diǎn)引入CA16型檢測(cè)探針序列CACGCACCCTCAACCCAGG，構(gòu)建成ー個(gè)同時(shí)擁有EV通用型、EV71型和CA16型均為單拷貝的ー個(gè)重組序列片段；該片段提取純化后即用克隆系統(tǒng)插入PGEM-T-Easy克隆載體，抽提重組克隆質(zhì)粒，用分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行定量，并用無(wú)菌水以10倍比稀釋質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR的敏感度實(shí)驗(yàn)。四、檢測(cè)試劑盒特異性、敏感度和標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)系數(shù)分析采用腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒對(duì)上述常見(jiàn)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組柯薩奇病毒A組16型，腸道病毒EV71型，柯薩奇病毒B組3型和?？刹《?0型等檢測(cè)均為陽(yáng)性，且CA16型在通用型檢測(cè)通道(FAM通道)和CA16型檢測(cè)通道(R0X通道)為雙陽(yáng)性，EV71型在通用型檢測(cè)通道(FAM通道)和EV71型檢測(cè)通道(VIC通道)為雙陽(yáng)性。而對(duì)照組中的甲型肝炎病毒，輪狀病毒，こ型炎病毒，人巨細(xì)胞病毒和肺炎支原體等檢測(cè)結(jié)果均為陰性，特異性為100%;用構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后檢測(cè)敏感性達(dá)到10拷貝；用已知定量的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品IO4 IO5 IO6 IO7四個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的ct值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系(圖2、圖3)，腸道通用型、EV71型和CA16型的相關(guān)系數(shù)R2分別=0. 998,0. 996和0. 998。實(shí)施例3 腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒臨床樣本檢測(cè)應(yīng)用一、標(biāo)本檢測(cè)[0063]選取2010年5月 2010年10月手足ロ病流行期間，我院門(mén)診及住院的疑似手足ロ病患兒糞便標(biāo)本192例和咽拭子標(biāo)本215例。選取由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的，經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)瞀管理局注冊(cè)批準(zhǔn)的腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒、EV71型核酸檢測(cè)試劑盒和CA16型核酸檢測(cè)試劑盒為對(duì)照，用于評(píng)價(jià)本申請(qǐng)?jiān)噭┖械男阅苤笜?biāo)。ニ、臨床樣品對(duì)照檢測(cè)結(jié)果糞便標(biāo)本192例和咽拭子標(biāo)本215例腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒和達(dá)安公司生產(chǎn)的單聯(lián)三管對(duì)照試劑結(jié)果見(jiàn)表2、表3
表2エ92例奏便樣本
權(quán)利要求1.一種腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，由定量RT-PCR反應(yīng)液管(I)、標(biāo)準(zhǔn)品管(2)、陽(yáng)性對(duì)照品管(3)、陰性對(duì)照品管(4)和盒體(5)組成，其中定量RT-PCR反應(yīng)液管(I)裝有RT-PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16型熒光探針、耐熱DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶，陰性對(duì)照管為無(wú)菌注射用水樣品，陽(yáng)性對(duì)照管為EV71型滅活病毒株樣品。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型提供一種腸道病毒三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，由定量RT-PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照品、盒體組成，其中定量RT-PCR反應(yīng)液含有RT-PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16型熒光探針、耐熱DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶。本實(shí)用新型試劑盒通過(guò)一步法同時(shí)對(duì)腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型進(jìn)行檢測(cè)分型，比現(xiàn)有的單個(gè)檢測(cè)試劑盒，不僅節(jié)約了生產(chǎn)成本和檢測(cè)成本，同時(shí)也提高了檢測(cè)的效率和時(shí)間。并在保證沒(méi)有多對(duì)引物競(jìng)爭(zhēng)的條件下隨機(jī)自動(dòng)的達(dá)到多通道的檢測(cè)目的，達(dá)到效率和技術(shù)的統(tǒng)一。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK202519268SQ2011203640
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者吳亦棟, 尚世強(qiáng), 杜立中, 陳志敏 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)