專利名稱：心血管疾病相關(guān)高密度脂蛋白(hdl)含量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測心血管疾病相關(guān)高密度脂蛋白(HDL)含量的試劑盒，通過同時(shí)檢測與心血管疾病密切相關(guān)的血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)和LIPC蛋白(LIPC)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評估個(gè)體患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
技術(shù)背景
目前，心血管疾病仍然是西方發(fā)達(dá)國家各種死亡原因之首。在我國，心血管疾病死亡率已位居人口總死亡率的第一位。冠狀動(dòng)脈硬化粥樣硬化是冠心病的主要病理改變。多至脂蛋白和載脂蛋白都與動(dòng)脈硬化有密切聯(lián)系。血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)又稱脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白I (LTP-1)，主要功能是將高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇酯(CE)向富含載脂蛋白B (apoB)的低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)以等摩爾的比例將后者中的甘油三酯(TG)反向轉(zhuǎn)移，完成膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)中的重要步驟。除此而外它還可以影響HDL顆粒的大小和構(gòu)型，在調(diào)節(jié)各種脂質(zhì)成分的比例和脂蛋白的平衡中起重要作用。CETP基因位于16號(hào)染色體(16q21)，由25kb基因編碼，與LACT基因和結(jié)合珠蛋白基因毗鄰，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成。CETP介導(dǎo)CE和TG在HDL與VLDL及LDL之間轉(zhuǎn)移，參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程，調(diào)節(jié)血漿脂蛋白中的脂質(zhì)成分，同時(shí)在此過程中改變DHL顆粒的大小和亞型，因此CETP與動(dòng)脈粥樣硬化之間存在必然聯(lián)系。CETP在調(diào)節(jié)循環(huán)中的膽固醇水平，維持其代謝穩(wěn)態(tài)上起重要作用，CETP本身的改變可以引起冠心病發(fā)病機(jī)制某一環(huán)節(jié)中重要因素(如LDL-C，TG, HDL-C)的變化。但在脂質(zhì)代謝已發(fā)生紊亂的情況下機(jī)體也可以代償性地調(diào)節(jié)CETP的濃度和活性以適應(yīng)異常的血脂水平。雖然這種代償性可能是不完全的，但其結(jié)果卻可以使得最終不到CETP與冠心病總的相關(guān)關(guān)系。近來發(fā)現(xiàn)CETP可以介導(dǎo)動(dòng)脈壁泡沫細(xì)胞和粥樣斑塊中的膽固醇外流，提示CETP可以作為機(jī)體的一種調(diào)節(jié)方式獨(dú)立與HDL而直接與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生聯(lián)系。在不同人種，不同環(huán)境和代謝狀態(tài)下觀察到CETP基因缺陷引起了 HDL-C水平改變。月干脂肪酶基因(Hepaticlipase gene, LIPC)位于染色體15q21,包括9個(gè)外顯子，全長35kb，編碼449個(gè)氨基酸。因其存在各種多態(tài)性而致其編碼的肝脂肪酶(Hepaticlipase,HL)活性有不同程度改變，可能與冠心病相關(guān)。目前，對LIPC多態(tài)性與冠心病之間相關(guān)性研究的方法和結(jié)論如下。方法對91例冠心病入院后12小時(shí)內(nèi)，72例對照組空腹晨起靜脈采血，從全血中抽提基因組DNA，多聚酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析LIPC兩個(gè)多態(tài)性在中國漢族冠心病人群中的發(fā)生頻率和基因型分布。結(jié)果1. LIPC轉(zhuǎn)錄起始部位一480NlalII酶切位點(diǎn)C一T多態(tài)性在以冠脈造影結(jié)果分組的冠心病與正常對照組比較TT純合子基因型頻率為17.9% VS 7.7%，但無顯著性差異(P=O. 099)。亞組分析中，三支病變與健康對照組25% VS 7.7%，有顯著性差異(P=O. 03)。按照WHO關(guān)于缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)分型的冠心病與正常對照組比較TT純合子基因型頻率為15. 4% VS 8. 3%，無顯著性差異(P=O. 373)。亞組分析中，心臃梗塞與健康對照組28. 1% VS 8.3%，有顯著性差異(P=O. 023)。2. LIPC7號(hào)外顯子Mse I酶切位點(diǎn)A— c多態(tài)性病例組中發(fā)現(xiàn)I例cc純合子，4例Ac雜合子，健康對照組未發(fā)現(xiàn)CC純合子，7例Ac雜合子。兩種分類法中，此多態(tài)性與冠心病及各亞組均無顯著性差異。(P>0. 05)結(jié)論1. LIPC轉(zhuǎn)錄起始部位一480 C— TNlalII酶切位點(diǎn)TT純合子可能是心肌梗塞，冠脈三支病變等較為嚴(yán)重冠心病發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素。2. LIPC 7號(hào)外顯子Mse I酶切位點(diǎn)多態(tài)性可能與中國漢族人群冠心病發(fā)生無關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型針對目的是提供一種采用熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)檢測兩個(gè)影響高密度脂蛋白(HDL)含量的基因SNP位點(diǎn)的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管、裝有陽性對照品的一個(gè)試管、裝有陰性對照品的一個(gè)試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型一熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型二熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中，血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5’- GAAGAGTGAATGAGAT -3’下游引物序列5’- CCTTCACCTGTCGGTA -3’基因型一熒光探針序列5’-FAM - CAGACAAaCCAGAT - TAMRA -3’基因型二熒光探針序列5’-VIC- CAGACAAcCCAGAT -TAMRA -3’LIPC蛋白(LIPC)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5’- TATACCCTAAGTGGAG -3’下游引物序列5’- GACCTTGTGAATCTGA -3’基因型一熒光探針序列5’-FAM - ACCTCTGcAGTTGA - TAMRA -3’基因型二熒光探針序列5’-VIC - ACCTCTGgAGTTGA -TAMRA -3’對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為口腔粘膜細(xì)胞DNA樣品。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本實(shí)用新型試劑盒使用方法每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。擴(kuò)增檢測在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分為6個(gè)反應(yīng)管，每一個(gè)SNP位點(diǎn)檢測使用3個(gè)反應(yīng)管，其中I個(gè)反應(yīng)管為被檢測樣品，陽性對照和陰性對照各使用I個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積10 iil，其中Siil PCR反應(yīng)液，2 檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取，根據(jù)得到的二維熒光圖和實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點(diǎn)基因型。本實(shí)用新型提供的該試劑盒主要用于檢測影響高密度脂蛋白(HDL)含量的基因SNP位點(diǎn)，從而告知被檢者患病風(fēng)險(xiǎn)數(shù)值，提前預(yù)防和控制，指導(dǎo)醫(yī)師選擇正確的臨床治療方案，有利于患者進(jìn)行針對性治療。本實(shí)用新型的特點(diǎn)是該試劑盒運(yùn) 用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測兩個(gè)影響高密度脂蛋白(HDL)含量的基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點(diǎn)檢測整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對個(gè)體患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)性的評估也更便捷。

圖I為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例I參見圖1，本實(shí)用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽性對照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔、分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型一熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型二熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。實(shí)施例2I.材料血樣總DNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購于美國Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。2.引物及探針血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5，-GAAGAGTGAATGAGAT -3’下游引物序列5’- CCTTCACCTGTCGGTA -3’基因型一熒光探針序列5’-FAM - CAGACAAaCCAGAT - TAMRA _3’基因型二熒光探針序列5，-VIC-CAGACAAcCCAGAT -TAMRA -3’LIPC蛋白(LIPC)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5，-TATACCCTAAGTGGAG -3’下游引物序列5’- GACCTTGTGAATCTGA -3’基因型一熒光探針序列5’-FAM - ACCTCTGcAGTTGA - TAMRA -3’[0048]基因型二熒光探針序列5’-VIC - ACCTCTGgAGTTGA -TAMRA _3’3.樣本檢測選取30例血液樣本，其中已確定患心血管疾病的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測為12個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積lOiil，其中8iU PCR反應(yīng)液，每一個(gè)SNP位點(diǎn)檢測使用3個(gè)反應(yīng) 管，I個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I被檢測DNA,另外2個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I陽性對照和陰性對照，在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95 V、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取。
權(quán)利要求1.一種心血管疾病相關(guān)高密度脂蛋白(HDL)含量檢測試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、襯墊(2 )、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管(3 )、裝有陽性對照品的一個(gè)試管(4 )、裝有陰性對照品的一個(gè)試管(5 )組成，襯墊(2 )上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液(3 )、陽性對照品(4 )和陰性對照品(5 )。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種檢測影響高密度脂蛋白(HDL)含量的基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變從而評估個(gè)體患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)性的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽性對照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實(shí)用新型試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測兩個(gè)影響高密度脂蛋白(HDL)含量的基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將與同一疾病的兩個(gè)SNP位點(diǎn)檢測整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對個(gè)體患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)性的評估也更便捷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202440506SQ201120569498

公開日2012年9月19日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司