專利名稱：重組病毒的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保持所需純度的重組病毒的制造方法、用于得到該重組病毒的轉(zhuǎn)移載體及其制造方法，特別涉及在制造重組桿狀病毒時目的以外的重組體的產(chǎn)生得到抑制的重組病毒的制造方法、用于得到該重組病毒的轉(zhuǎn)移載體及其制造方法。
背景技術(shù)：
作為可將免疫原性外源蛋白質(zhì)作為融合抗原而呈遞在病毒粒子上的病毒粒子基因，已知桿狀病毒gp64基因、水皰性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞體病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因、或者小鼠肝炎病毒S蛋白質(zhì)基因。另一方面，作為針對感染癥、癌等的疫苗用免疫原性外源蛋白質(zhì)抗原，已知瘧疾抗 原、流感病毒抗原、結(jié)核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住白細(xì)胞蟲抗原，以及CEA、WT1、MAGE等癌抗原。此外，已知存在于人活體內(nèi)的IL-2、IL-12、IL-6、或IFN-Y等細(xì)胞因子基因與免疫原性外源蛋白質(zhì)基因進(jìn)行融合的免疫原性蛋白質(zhì)。使這些病毒粒子基因與免疫原性基因融合，表達(dá)的融合抗原在疫苗用途中得到利用。另一方面，使用了桿狀病毒的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)已在目標(biāo)蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)中得到利用。此外，近年來，可知桿狀病毒不僅可將外源性基因?qū)胫晾ハx細(xì)胞，也可將外源性基因?qū)胫敛溉閯游?，發(fā)現(xiàn)了基因治療載體的可能性。例如，在專利文獻(xiàn)I中公開了一種重組桿狀病毒表達(dá)載體，其具有由在來自桿狀病毒的初期基因啟動子中包含編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域與在來自后期基因的啟動子中包含編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域構(gòu)成的多個獨立的啟動子。此外，在專利文獻(xiàn)2中公開了一種利用使用桿狀病毒的基因重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，公開了一種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中，使結(jié)合桿狀病毒的gp64基因與編碼所需蛋白質(zhì)的基因而得到的融合基因表達(dá)，以使所需蛋白質(zhì)與病毒粒子融合的形式進(jìn)行生產(chǎn)，將融合有所需蛋白質(zhì)的病毒粒子進(jìn)行回收，將所需蛋白質(zhì)從該病毒粒子上切斷。在專利文獻(xiàn)3中公開了一種經(jīng)改良的導(dǎo)入基因的表達(dá)方法，其中，將外源性DNA的核苷酸密碼子的使用頻率優(yōu)化，變成表達(dá)外源性DNA序列的宿主細(xì)胞的密碼子使用頻率，將所需蛋白在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在專利文獻(xiàn)4中，為了利用酵母得到由與子宮頸癌有關(guān)的HPV31L1基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，公開了一種合成多核苷酸，其不含有由酵母識別的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄終止信號，編碼密碼子得到優(yōu)化的HPV31L1以使得在酵母細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)。在專利文獻(xiàn)5中，對于以蛋白質(zhì)的表達(dá)為目的而優(yōu)化核苷酸序列的方法及其裝置，公開了一種適合表達(dá)的宿主細(xì)胞系的密碼子優(yōu)化方法。在專利文獻(xiàn)6中，對于為了用作殺蟲劑而將非同源性肽的信號序列與編碼殺蟲性毒素的基因攝入其基因組內(nèi)的重組小菜蛾桿狀病毒，為了編碼殺蟲性毒素的密碼子優(yōu)化基因可通過昆蟲細(xì)胞蛋白質(zhì)更有效率地利用，公開了一種用替代密碼子置換的編碼殺蟲性毒素的表達(dá)盒。在專利文獻(xiàn)7中公開了一種編碼在細(xì)菌李斯特菌中表達(dá)的融合蛋白質(zhì)的重組核酸分子，對于如下核酸分子、表達(dá)盒、及包含表達(dá)載體的細(xì)菌、以及包含該細(xì)菌的疫苗組合物進(jìn)行了公開，所述核酸分子包含編碼細(xì)菌本來的肽的信號序列的第一多核苷酸和編碼外源性抗原的多肽的第二多核苷酸，該第一多核苷酸為針對細(xì)菌中的表達(dá)而使密碼子得到優(yōu)化的第一多核苷酸，該第二多核苷酸位于與第一多核苷酸相同的翻譯閱讀框中，在此重組核酸分子編碼包含肽的信號序列及多肽的融合蛋白質(zhì)。而且，公開了針對細(xì)菌中的表達(dá)而編碼外源性抗原多肽的第二多核苷酸被密碼子優(yōu)化的重組核酸分子。如上所述，目前，出于提高或降低目標(biāo)蛋白質(zhì)在宿主中的表達(dá)效率的目的，進(jìn)行了基因的密碼子變換。本發(fā)明人等先前報告了如下內(nèi)容制作使編碼免疫抗原性蛋白質(zhì)的氨基酸的多核苷酸與編碼表達(dá)細(xì)胞的病毒粒子的蛋白質(zhì)的多核苷酸進(jìn)行融合的轉(zhuǎn)移載體，例如進(jìn)行與桿狀病毒等的所需病毒DNA的同源重組，將制得的重組病毒用作疫苗等醫(yī)藥組合物(專利 文獻(xiàn)8)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I:日本專利第3366328號公報專利文獻(xiàn)2:日本特開2002-253263號公報專利文獻(xiàn)3:國際公開第2006/024867號小冊子專利文獻(xiàn)4:國際公開第2004/084831號小冊子專利文獻(xiàn)5:國際公開第2004/059556號小冊子專利文獻(xiàn)6:國際公開第1999/58705號小冊子專利文獻(xiàn)7:國際公開第2005/071088號小冊子專利文獻(xiàn)8:國際公開第2007/091624號小冊子

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過抑制在制造重組病毒特別是制造重組桿狀病毒時引起的目的之外的重組病毒的產(chǎn)生從而高純度地制造發(fā)揮所需免疫抗原性且可用作疫苗等醫(yī)藥品的方法，及用于制造該重組病毒的轉(zhuǎn)移載體的制造方法。如上所述，本發(fā)明人等以前進(jìn)行了如下專利申請，即在昆蟲細(xì)胞中和脊椎動物細(xì)胞中可將所需免疫原性外源蛋白質(zhì)與構(gòu)成病毒粒子的蛋白質(zhì)作為融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體及用其制得的重組桿狀病毒(專利文獻(xiàn)8)，但是在使用該轉(zhuǎn)移載體而制造重組桿狀病毒時，有時編碼目標(biāo)免疫抗原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域缺失的目的之外的重組桿狀病毒(以下，也稱作“變異病毒”)包含在制得的重組桿狀病毒中，有可能引起包含目標(biāo)重組桿狀病毒的醫(yī)藥品的純度降低。因此，本發(fā)明人等針對該問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將與轉(zhuǎn)移載體連結(jié)的融合基因中編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列進(jìn)行比較，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，和/或以使構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列，在使用該轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA—起共轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行時，可顯著抑制上述變異病毒的產(chǎn)生，結(jié)果可高純度地制造所需重組桿狀病毒。SP，本發(fā)明涉及下述1) 21)。I) 一種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列。2)—種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列。 3)根據(jù)上述I)的方法，其中，進(jìn)行下述(a) (C)和/或(d廣Ce):(a)對于編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式進(jìn)行多核苷酸序列的改變，得到包含編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序；(b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序；(C)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或者插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序；(d)合成對構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失而形成的該蛋白質(zhì)的部分多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸，或合成以該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序；(e)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。4)根據(jù)上述I)或2)的方法，其中，融合基因是在其上游包含編碼來自病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的信號序列的多核苷酸的融合基因。5)根據(jù)上述I)或2)的方法，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因、水皰性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞體病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白質(zhì)基因中的任一種。6)根據(jù)上述I)或2)的方法，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因。7)根據(jù)上述I)或2)的方法，其中，編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因是選自瘧疾抗原、流感病毒抗原、結(jié)核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住白細(xì)胞蟲抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是選自這些抗原基因組中的至少一種與細(xì)胞因子的融合抗原的基因。8)根據(jù)上述I)或2)的方法，其中，轉(zhuǎn)移載體是在能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子與桿狀病毒的啟動子連結(jié)而得的雙重啟動子的下游連結(jié)融合基因的轉(zhuǎn)移載體。
9)根據(jù)上述8)的方法，其中，所述能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子是選自巨細(xì)胞病毒啟動子、SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延伸因子I a啟動子、肌動蛋白啟動子、泛素啟動子、白蛋白啟動子及MHC類啟動子中的任一種，桿狀病毒的啟動子是選自多角體啟動子、PlO啟動子、IEl啟動子、p35啟動子、p39啟動子及gp64啟動子中的任一種。10)—種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是在包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒DNA區(qū)域之間插入有編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，將與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域進(jìn)行融合的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)的病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列，以相對于天然來源的同一病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列同源性降低的方式進(jìn)行改變，和/或以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變該多核苷酸序列。11) 一種重組桿狀病毒的制造方法，其特征在于，是使用了連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體的重組桿狀病毒的制造方法，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，將所述轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至昆蟲 宿主細(xì)胞中，所述轉(zhuǎn)移載體如下形成對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變其多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分缺失的方式改變其多核苷酸序列。12)—種轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相t匕，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列。13)—種轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相t匕，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列。14)根據(jù)上述12)的轉(zhuǎn)移載體，是通過進(jìn)行下述(a) (C)和/或(d) (e)而制得的(a)對于編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式進(jìn)行多核苷酸序列的改變，得到包含編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序；(b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序；(c)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序；(d)合成對構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失而形成的該蛋白質(zhì)的部分多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸，或合成以該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序；
(e)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。15)根據(jù)上述12)或13)的轉(zhuǎn)移載體，其中，融合基因是在其上游連結(jié)有編碼來自病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的信號序列的多核苷酸的融合基因。16)根據(jù)上述12)或13)的轉(zhuǎn)移載體，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因、水皰性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞體病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白質(zhì)基因中的任一種。17)根據(jù)上述12)或13)的轉(zhuǎn)移載體，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因。18)根據(jù)上述12)或13)的轉(zhuǎn)移載體，其中，編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因是選自瘧疾抗原、流感病毒抗原、結(jié)核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅熱病毒抗原、登革熱病毒抗 原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住白細(xì)胞蟲抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是選自這些抗原基因組中的任一種與細(xì)胞因子的融合抗原的基因。19)根據(jù)上述12)或13)的轉(zhuǎn)移載體，是在能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子與桿狀病毒的啟動子連結(jié)而得的雙重啟動子的下游連結(jié)融合基因的轉(zhuǎn)移載體。20)根據(jù)上述19)的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子是選自巨細(xì)胞病毒啟動子、SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延伸因子I a啟動子、肌動蛋白啟動子、泛素啟動子、白蛋白啟動子及MHC類啟動子中的任一種，桿狀病毒的啟動子是選自多角體啟動子、PlO啟動子、IEl啟動子、P35啟動子、p39啟動子及gp64啟動子中的任一種。21)—種轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，是在包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒DNA區(qū)域之間插入有編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)移載體，將與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域進(jìn)行融合的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)的病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列，以相對于天然來源的同一病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列同源性降低的方式進(jìn)行改變，和/或以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變該多核苷酸序列。若使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體，則在利用同源重組技術(shù)而制作所需重組病毒的共轉(zhuǎn)染時，可抑制編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域缺失的產(chǎn)生物(變異病毒DNA)的生成，可由靶標(biāo)細(xì)胞高純度地制造所需重組病毒。即，根據(jù)本發(fā)明，可高效率地制造可用作瘧疾、流感病毒、結(jié)核、肝炎等感染癥、癌、自身免疫性疾病等的治療和/或預(yù)防藥或者可用作細(xì)胞醫(yī)藥、疫苗制劑的重組病毒，特別是重組桿狀病毒。


圖I是示出繼代培養(yǎng)的桿狀病毒的純度降低與變異病毒DNA的增加的圖。圖2是示出在病毒溶液中存在的變異病毒為gp64基因的變異病毒的圖。圖3是示出在由編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的病毒DNA區(qū)域以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式得到改變、或者上述DNA區(qū)域一部分缺失的DNA區(qū)域構(gòu)成的融合構(gòu)建物中，未檢測或者難以檢測變異病毒的圖。
圖4是示出在由編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的病毒DNA區(qū)域一部分缺失的DNA區(qū)域構(gòu)成的融合構(gòu)建物中無論抗原基因的不同與否都難以檢測變異病毒的圖。圖5是示出在由編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的病毒DNA區(qū)域以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式得到改變、或者上述DNA區(qū)域一部分缺失的DNA區(qū)域構(gòu)成的融合構(gòu)建物中得到高純度的重組桿狀病毒的圖。圖6是示出無論單啟動子和雙重啟動子的不同與否都出現(xiàn)變異病毒的圖。圖7是示出即使在納入以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列的gp64基因的桿狀病毒中，也可使所需基因與來自gp64基因的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)的圖。圖8是確認(rèn)在圖7中使用的重組桿狀病毒中不產(chǎn)生變異病毒的圖。
具體實施方式

就本說明書中利用氨基酸、肽、堿基序列、核酸等的代號的表示而言，按照IUPAC-IUB 的規(guī)定[IUPAC-1UB Communication on Biological Nomenclature, Eur.J. Biochem. ,138:9 ( 1984)]、“用于制作包含堿基序列或氨基酸序列的說明書等的指南”(專利廳編)及在該領(lǐng)域中的慣用符號。在本說明書中，所謂DNA分子意思是不僅包含雙鏈DNA，而且還包含構(gòu)成該雙鏈DNA的正義鏈和反義鏈這樣的各單鏈DNA，此外并不受其長度所限制。因此，只要未特別言及，在編碼本發(fā)明的免疫原性外源蛋白質(zhì)的多核苷酸(DNA分子)中包含如下中的任意種類包含基因組DNA的雙鏈DNA及包含cDNA的單鏈DNA (正義鏈)以及具有與該正義鏈互補的序列的單鏈DNA (反義鏈)及合成DNA、它們的片段。此外，在本說明書中，多核苷酸、DNA分子無論功能區(qū)域有何區(qū)別，均可包含表達(dá)抑制區(qū)域、編碼區(qū)域、前導(dǎo)序列、外顯子及內(nèi)含子中的至少一種。此外，在多核苷酸中包含RNA和DNA。在由特定氨基酸序列構(gòu)成的多肽和由特定DNA序列構(gòu)成的多核苷酸中，包含它們的片段、同源體、衍生體及變異體。例如，在變異體DNA中包含天然存在的等位基因變異體；非天然存在的變異體；進(jìn)行缺失、取代、添加及插入的變異體等。在本發(fā)明中，在利用同源重組技術(shù)由轉(zhuǎn)移載體制作所需重組病毒的工序中，對于有時在分析時出現(xiàn)的預(yù)想之外的PCR產(chǎn)物，有時特別將編碼免疫抗原性蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域缺失而得的產(chǎn)生物稱作變異病毒DNA。在本發(fā)明中，所謂“構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的多核苷酸序列的改變”，可舉出以構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式使多核苷酸的序列同源性降低的情形，例如，可舉出目視觀察遺傳密碼表等而任意選擇編碼天然來源的氨基酸的密碼子，或者利用計算機(jī)軟件而進(jìn)行機(jī)械性選擇，選擇與編碼天然來源的氨基酸的密碼子不同的密碼子，使天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列與整體序列同源性降低。以下，對于本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體、重組病毒特別是重組桿狀病毒進(jìn)行說明。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體是插入有包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的融合基因、且在該融合基因的上游及下游具有可與桿狀病毒DNA發(fā)生同源重組的DNA的質(zhì)粒。此外，就轉(zhuǎn)移載體而言，作為啟動子，需要至少擁有可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒的啟動子，但是不僅可擁有單一啟動子，也可擁有脊椎動物啟動子(哺乳動物啟動子和鳥類啟動子)與桿狀病毒的啟動子連結(jié)而成的雙重啟動子。作為脊椎動物啟動子(能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子),可例示哺乳動物啟動子、鳥類啟動子等啟動子。作為哺乳動物啟動子(能在哺乳動物細(xì)胞中起作用的啟動子)，可例示巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延伸因子I a啟動子、肌動蛋白啟動子、泛素啟動子、白蛋白啟動子、MHC類啟動子等。作為鳥類啟動子，可例示肌動蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、延伸因子啟動子、泛素啟動子、白蛋白啟動子。作為桿狀病毒啟動子,可例示多角體(Polh)啟動子、plO啟動子、IEl啟動子、p35啟動子、p39啟動子、gp64啟動子等。此外，作為雙重啟動子，可很好地例示作為脊椎動物啟動子的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、CMV啟動子得到改良的CAG啟動子、或泛素(UBB)的啟動子與CMV增強(qiáng)子接合而成的啟動子與作為桿狀病毒啟動子的多角體(Polh)啟動子連結(jié)而得的啟動子。
被連結(jié)的脊椎動物啟動子特別是哺乳動物啟動子與桿狀病毒啟動子的兩個啟動子的多核苷酸序列可直接連結(jié)，也可在相互的啟動子的DNA序列之間存在插入DNA序列。
此外，被連結(jié)的脊椎動物啟動子特別是哺乳動物啟動子與桿狀病毒啟動子在啟動子區(qū)域中均可配置在接近表達(dá)基因的位置，在后述實施例中，以桿狀病毒啟動子位于與哺乳動物啟動子相比更接近表達(dá)基因的位置的結(jié)構(gòu)進(jìn)行制作。構(gòu)成本發(fā)明融合基因的DNA的編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列可通過與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變核苷酸而得的多核苷酸序列、或者以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變核苷酸而得的多核苷酸序列(進(jìn)而，可使該多核苷酸序列以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式得到改變)而進(jìn)行特定。針對編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)(包含其氨基酸的一部分缺失的部分多肽)的多核苷酸序列進(jìn)行的以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式的改變可通過將包含編碼利用病毒粒子的構(gòu)成成分得到的蛋白質(zhì)的病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列與天然來源的多核苷酸序列進(jìn)行比較而進(jìn)行，但是從可抑制共轉(zhuǎn)染時的編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域缺失的產(chǎn)生物(變異病毒DNA)的生成而制作高純度的重組病毒的方面考慮，優(yōu)選以在改變前后整體堿基序列的同源性成為85%以下、進(jìn)而成為80%以下、進(jìn)而成為70%以下的方式進(jìn)行來決定多核苷酸序列信息。在此，就多核苷酸序列的同源性而言，利用Lipman-Pearson法(Science, 227,1435, (1985))等進(jìn)行計算即可,例如,使用遺傳信息處理軟件Genetyx-Win (Ver. 5. I. I ;軟件開發(fā))的同源性分析(Search homology)程序,將Unit size to compare (ktup)設(shè)為2進(jìn)行分析，由此算出。此外，作為病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)，如桿狀病毒GP64蛋白質(zhì)這樣，使用桿狀病毒的病毒構(gòu)成蛋白質(zhì)時，在病毒基因組DNA中存在編碼該蛋白質(zhì)的天然DNA序列(內(nèi)源性病毒DNA序列)，因此需要通過與該多核苷酸序列比較，以構(gòu)成天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，針對天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列，使整體多核苷酸序列的同源性降低。
天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列的不改變該氨基酸序列的核苷酸的改變可參考公知的遺傳密碼表進(jìn)行識別，從而進(jìn)行特定，或者可使用軟件等，從而對在作為以醫(yī)藥組合物給藥的對象的人細(xì)胞中考慮到表達(dá)改良的各基因的多核苷酸序列進(jìn)行特定。包含將天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列進(jìn)行該氨基酸序列不改變的核苷酸的改變而得到的多核苷酸序列的融合基因的多核苷酸序列例如可例示由實施例I的序列號34的多核苷酸序列所示的多核苷酸序列。該多核苷酸序列在改變前后，序列的同源性降低至77%以下，在該情況下，能更可靠地抑制共轉(zhuǎn)染時的免疫抗原性基因的DNA區(qū)域缺失的變異病毒DNA的產(chǎn)生，可使所需融合蛋白質(zhì)在病毒粒子上進(jìn)行表達(dá)(參照實施例7、
8、及 10)。此外，所謂“以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變核苷酸”是指生成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的多肽(部分多肽)的多核苷酸序列的改變，可舉出使編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的天然(來源)的多核苷酸的堿基的一部分缺失的情況。此外，在該改變的多核苷酸中，可進(jìn)一步進(jìn)行構(gòu)成部分多肽的氨基酸不改變的多 核苷酸序列的改變。在此，作為部分多肽，只要是在昆蟲細(xì)胞中可表達(dá)作為能成為病毒粒子的構(gòu)成成分的蛋白質(zhì)即可，例如，可舉出去除病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的氨基酸而長度相對于全長氨基酸序列成為例如55 1%、優(yōu)選35 1%、更優(yōu)選15 1%的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，可舉出與融合的免疫原性外源蛋白質(zhì)的全長序列相比長度短的多肽。例如，若舉出將桿狀病毒GP64蛋白質(zhì)用作病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)時的示例，則如后述實施例所示，包含信號序列(20個氨基酸序列)的全長序列為512個氨基酸序列長，與此相對，免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列長為330個氨基酸(殘基)長時，以成為由261個氨基酸序列長(51%)構(gòu)成的融合體、由66個氨基酸序列長(13%)構(gòu)成的融合體的方式改變核苷酸時，可相當(dāng)抑制變異病毒DNA的出現(xiàn)，可得到所需高純度的DNA融合體。因此，在將桿狀病毒GP64蛋白質(zhì)用作病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)時，可舉出將除了信號序列(1-20 )以外的構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸(21-512 )的N末端側(cè)的氨基酸去除例如251個、446個而得的部分肽，更具體而言，可舉出由272-512、467-512的氨基酸構(gòu)成的部分肽。應(yīng)予說明，GP64蛋白質(zhì)的氨基酸序列的GenBank登錄號為AAA66758(序列號62)。作為編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因，可舉出編碼能夠成為病毒粒子的構(gòu)成成分的蛋白質(zhì)的基因，例如，可例不出桿狀病毒GP64蛋白質(zhì)(GenBank Accession No. L22858)、水皰性口炎病毒糖蛋白G (VSVG:GenBank Accession No. M27165)、單純皰疫病毒糖蛋白(K0S:GenBank Accession No. K01760)、I 型人免疫缺陷病毒 gpl20 (GenBank AccessionNo. U47783)、人呼吸道合胞體病毒膜糖蛋白(GenBank Accession No. M86651 )、A型流感病毒血凝素蛋白質(zhì)(GenBank Accession No. U38242)等的基因、或者與桿狀病毒近緣的病毒包膜蛋白等的基因，其中，優(yōu)選桿狀病毒GP64蛋白質(zhì)基因。上述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的制造可通過如下方式容易地制造獲得，即，基于對于編碼天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸序列的基因，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得到的多核苷酸、或編碼構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的該蛋白質(zhì)的部分多肽的多核苷酸(包含以構(gòu)成該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸)的核酸序列信息，進(jìn)行合成(DNA化學(xué)合成法)等。構(gòu)成本發(fā)明的融合基因的DNA的編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸序列可利用編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的天然來源的核酸序列信息進(jìn)行特定，但是與上述病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)同樣，對于該多核苷酸序列，可以是以構(gòu)成天然來源的免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸，可通過基于該多核苷酸序列的核酸序列信息進(jìn)行合成(DNA化學(xué)合成法)等而容易地制造獲得。編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的基因的多核苷酸序列與構(gòu)成免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的多核苷酸序列的核苷酸改變可參照公知的遺傳密碼表進(jìn)行識別而進(jìn)行特定，或者也可通過使用Gene Designer (DNA2. 0社；Gene Designer ；https://www. dna20. com/index. php pageID=220),或 Optimizer (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)的軟件，對考慮了在脊椎動物細(xì)胞、進(jìn)而是哺乳動物細(xì)胞、特別是人細(xì)胞中的表達(dá)改良的各基因的多核苷酸序列進(jìn)行特定。在本發(fā)明中，作為編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，在為哺乳動物的情況下，可例 示編碼人、牛、馬、豬、羊、猴、小鼠、狗、貓等的感染癥等的抗原蛋白質(zhì)的基因，在為鳥類的情況下，可例示雞、鴨、鴿子、火雞、珍珠雞、鸚鵡等的感染癥等的抗原基因(例如禽流感S抗原)，在此，所謂“外源性”基因是指從外部導(dǎo)入的基因，即使同一基因位于細(xì)胞內(nèi)，也屬于“外源性”基因。報告了上述哺乳動物與鳥類的感染癥的關(guān)聯(lián)的病原體基因可從保存登記有Genbank等的病原體基因的公共數(shù)據(jù)庫的機(jī)構(gòu)容易地獲得。其中，在為哺乳動物的情況下，具體而言，可例示編碼用于預(yù)防、治療瘧疾、流感病毒、結(jié)核等感染癥、自身免疫性疾病、癌等的作為包含疫苗療法在內(nèi)的免疫療法的免疫原的抗原蛋白質(zhì)的基因。在此，作為編碼瘧疾抗原的氨基酸序列的基因，可例示編碼CSP蛋白質(zhì)、MSPl蛋白質(zhì)、LSAl蛋白質(zhì)、SERA蛋白質(zhì)、TRAMP蛋白質(zhì)、AMAl蛋白質(zhì)等蛋白質(zhì)的基因。作為編碼流感病毒抗原的氨基酸序列的基因，可例示編碼HA抗原(血凝素抗原)、NA抗原(神經(jīng)氨酸酶抗原)、M2抗原(基質(zhì)蛋白抗原)、NP抗原(核衣殼蛋白抗原)等蛋白質(zhì)的基因。作為編碼針對結(jié)核的抗原蛋白質(zhì)的氨基酸序列的基因，可例示編碼HSP65(65_kDaheat shock protein)、a 抗原(Antigen85A、Antigen85B、Antigen85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51、Mtb8. 8、Mtb9. 9、Mtb32、Mtb39 及 Mtbll 等蛋白質(zhì)的基因。作為編碼針對癌的抗原蛋白質(zhì)的氨基酸序列的基因，可例示編碼CEA、WT1、MAGE,HER2/neu、SART等蛋白質(zhì)的基因。此外，在本發(fā)明中，就編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因而言，除了如上所述的存在于人活體外的免疫抗原以外，存在于人活體內(nèi)的細(xì)胞因子基因，例如IL-12基因、IL-6基因、IL-6受體基因、IL-2基因、IL-18基因、IFN- y基因、M-CSF基因等細(xì)胞因子基因，或者具有免疫原性的任意抗原與上述抗原蛋白質(zhì)的基因用基因重組技術(shù)進(jìn)行融合而得的融合基因，只要從外部導(dǎo)入，也可作為編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行操作。應(yīng)予說明，在本發(fā)明中利用的多核苷酸序列并不限定于編碼具有上述免疫原性的抗原蛋白質(zhì)的多肽的多核苷酸序列的全長序列，只要由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有抗原性，就可以是編碼部分氨基酸序列或者反復(fù)的部分氨基酸序列的多核苷酸序列，或者編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列彼此融合的部分氨基酸序列的多核苷酸序列。上述中編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的天然來源的多核苷酸序列，或者以構(gòu)成該天然來源的免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變的多核苷酸序列，可通過直接合成與該序列相當(dāng)?shù)腄NA (DNA化學(xué)合成法)而容易地制造獲得。在該制造中，可應(yīng)用常規(guī)的基因工程學(xué)方法[例如，參照 Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab.Press (1989);續(xù)生化學(xué)實驗講座“基因研究法I、II、III”，日本生物化學(xué)會編(1986)等]。此外，作為該多核苷酸的合成方法，可例示磷酸三酯法、亞磷酰胺法等的化學(xué)合成方法[J. Am. Chem. Soc.，89，4801 (1967);同 91，3350 (1969) ;Science, 150,178 (1968)；Tetrahedron Lett.，22,1859 (1981);同 24，245 (1983)]及它們的組合方法。更具體而言，該多核苷酸可利用亞磷酰胺法或者三酯法進(jìn)行化學(xué)合成，也可利用市售的自動寡聚核苷酸合成裝置進(jìn)行合成。雙鏈片段可通過合成互補鏈，在適當(dāng)?shù)臈l件下使化學(xué)合成該互補鏈而得的單鏈退火或者使用適當(dāng)?shù)囊镄蛄泻虳NA聚合酶對化學(xué)合成該互補鏈而得的單鏈進(jìn)行添加而得到。 此外，編碼天然來源的免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸可利用基因工程學(xué)的方法進(jìn)行制造，更具體而言，可從表達(dá)編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的適當(dāng)起源開始，按照常規(guī)方法制備cDNA庫，使用編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA所特有的適當(dāng)探針、對表達(dá)物的抗體，從該庫中選擇所需克隆，由此實施[參照Proc. Natl.Acad. Sci.，USA.，78，6613 (1981) ；Science, 222, 778 (1983)等]。在上述中，作為基因組DNA的起源，可例示表達(dá)編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA的各種細(xì)胞、組織、來自這些的培養(yǎng)細(xì)胞等。特別是，優(yōu)選以流感病毒感染細(xì)胞提取物、瘧疾原蟲感染的感染紅血球提取物、結(jié)核菌提取物等為起源。來自該起源的全部DNA、RNA的提取和分離、mRNA的分離和精制、cDNA的獲得及其克隆等均可按照常規(guī)方法進(jìn)行實施。編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA的制造，如上所述，使用以上述提取物為起源并將免疫原組織、細(xì)胞的mRNA提取、分離、精制而得的各免疫原的cDNA庫進(jìn)行實施，除此以外，例如也可以使用噬菌體庫來進(jìn)行，所述噬菌體庫如下制備提取上述各免疫原的mRNA后，將Poly A添加至該RNA中后，收集添加有該Poly A的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶來制造cDNA，在該cDNA的兩端添加限制性內(nèi)切酶部位后，納入噬菌體中。將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA從cDNA庫中篩選的方法也沒有特別限制，可按照常規(guī)方法進(jìn)行。作為具體的方法，例如可例示通過使用了針對由cDNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特異性抗體(例如，抗瘧疾抗體、抗流感病毒抗體、抗結(jié)核菌抗體)的免疫篩選而選擇對應(yīng)的cDNA克隆的方法；使用與目標(biāo)DNA序列選擇性結(jié)合的探針的噬菌斑雜交法；菌落雜交法等；及它們的組合。作為在上述各雜交法中使用的探針，通常是基于與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA序列相關(guān)的信息而化學(xué)合成的DNA片段等。此外，已經(jīng)獲得的編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因及其片段的DNA序列也可有利地用作上述探針。進(jìn)而，也可將基于免疫原性外源性基因的DNA序列信息而設(shè)定的正義引物和反義引物用作上述篩選用探針。作為探針使用的DNA (核苷酸)是與免疫原性外源性基因的DNA序列對應(yīng)的部分DNA (核苷酸)，具有至少15個的連續(xù)的DNA、優(yōu)選具有至少20個的連續(xù)的DNA，更優(yōu)選具有至少30個的連續(xù)的DNA。還可將用于制造上述DNA的陽性克隆本身也用作探針。在獲得編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA時，可優(yōu)選地利用根據(jù)PCR法[Science, 230,1350 (1985)]的DNA/RNA擴(kuò)增法。特別是，在難以從庫中得到全長的cDNA時，優(yōu)選米用 RACE 法[Rapid amplification of cDNA ends ;實驗醫(yī)學(xué)，12(6), 35( 1994)],特別是 5’ -RACE 法[M. A. Frohman, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA. ,8,8998 (1988)]
坐寸o用于PCR法的引物可基于編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA序列信息而適當(dāng)設(shè)定，按照常規(guī)方法進(jìn)行合成。應(yīng)予說明，作為該引物，如后述實施例所示，也可使用在納入有編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA而得的載體質(zhì)粒的該DNA的兩端添加的DNA部分(SP6啟動子引物和17終止子引物)。應(yīng)予說明，用PCR法擴(kuò)增的DNA片段的分離精制可按照常規(guī)方法例如凝膠電泳法 等進(jìn)行實施。如上述得到的編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA或者各種DNA片段可按照常規(guī)方法例如可按照雙脫氧鏈中止法[Proc. Natl. Acad. Sci.，USA.，74，5463 (1977)]、Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法[Methods in Enzymology, 65,499 (1980)]等，并簡便地使用市售的測序試劑盒等，確定其DNA序列。本發(fā)明的融合基因的多核苷酸序列可以為由將這些上述2種基因直接連結(jié)而成的多核苷酸序列構(gòu)成，也可在這些基因之間存在插入DNA序列(但是，在該情況下，需要以下游側(cè)的基因與上游側(cè)的基因不發(fā)生移碼的方式進(jìn)行配置)。所需免疫原性外源蛋白質(zhì)的抗原呈遞區(qū)域優(yōu)選與病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)進(jìn)行融合，因此需要以不將所需免疫原性外源蛋白質(zhì)從病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)上分開地與該蛋白質(zhì)融合的形態(tài)進(jìn)行使用。例如，在本實施例所例示的重組病毒中，就桿狀病毒GP64蛋白質(zhì)而言，N末端在粒子外側(cè)露出，C末端在粒子內(nèi)側(cè)露出，因此若使所需免疫原性外源蛋白質(zhì)與GP64蛋白質(zhì)的N末端側(cè)融合，則在昆蟲細(xì)胞中其整體作為病毒粒子的構(gòu)成成分在病毒蛋白質(zhì)粒子的外側(cè)露出，從而抗原呈遞變得更容易，可以說更適于作為疫苗制劑的目的。此外，本發(fā)明的包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的融合基因優(yōu)選是在其上游包含編碼用于促進(jìn)表達(dá)的蛋白質(zhì)向宿主外的分泌的信號肽(信號序列)的多核苷酸。信號序列優(yōu)選為表達(dá)的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的信號序列，但是也可為在病毒可增殖的細(xì)胞內(nèi)起作用的蛋白質(zhì)的信號序列。作為信號序列，在使用來自表達(dá)的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的信號序列時，本發(fā)明的融合基因能夠成為在編碼信號序列的多核苷酸與編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸序列之間夾持(插入)編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸序列的結(jié)構(gòu)體。即，作為本發(fā)明的優(yōu)選融合基因，是在編碼包含信號序列的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的該信號序列的多核苷酸與編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的多核苷酸之間插入編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸序列的結(jié)構(gòu)體，可舉出將編碼包含信號序列的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列的天然來源的多核苷酸序列的核苷酸以構(gòu)成天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式而使多核苷酸序列改變而得的融合基因。 換言之，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體中包含下述轉(zhuǎn)移載體，即，是在包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒DNA區(qū)域之間插入編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域而得的轉(zhuǎn)移載體，與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域融合的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)的病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列相對于天然來源的同一病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列，以同源性降低的方式改變該多核苷酸序列而得的轉(zhuǎn)移載體，和/或以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列而得的轉(zhuǎn)移載體。就上述融合基因向轉(zhuǎn)移載體的導(dǎo)入而言，可以預(yù)先形成本發(fā)明的融合基因的多核苷酸序列，將此納入載體，也可首先將任一方的基因的多核苷酸序列納入載體，接著，將其它基因的多核苷酸序列納入載體而在載體內(nèi)形成融合基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體是上述融合基因連結(jié)在單獨的桿狀病毒的啟動子的下游而形成的，或者連結(jié)在一方為脊椎動物啟動子特別是哺乳動物啟動子而另一方為桿狀病毒的啟動子的連結(jié)起來的雙重啟動子的下游而形成的。分別使用已經(jīng)具有本發(fā)明轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)成的一部分即脊椎動物啟動子特別是哺 乳動物啟動子、桿狀病毒啟動子等的啟動子區(qū)域與編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的市售表達(dá)載體，用限制性內(nèi)切酶任意切除，納入其它啟動子等，在該載體的克隆區(qū)域，插入編碼所需免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因與上述本發(fā)明的改變的編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因(對于天然來源的編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸，或者編碼構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的該蛋白質(zhì)的部分多肽的多核苷酸(包含以該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸))融合而得的融合基因的多核苷酸序列，或者將編碼所需免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因與已經(jīng)納入質(zhì)粒中的本發(fā)明的改變的編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行連結(jié)即可。在此，編碼上述具有免疫原性的抗原蛋白質(zhì)的多肽的多核苷酸序列未限定其全長序列，只要由多核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有抗原性，也可以為編碼部分氨基酸序列或者反復(fù)的部分氨基酸序列的多核苷酸序列、或者編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列彼此融合的部分氨基酸序列的多核苷酸序列。上述中編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因(包含以構(gòu)成該免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列的多核苷酸)與改變的編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的連結(jié)可在改變的編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的N末端側(cè)插入編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因等，插入必需的構(gòu)成要素。此外，可使用具有已經(jīng)滿足如下質(zhì)粒載體的一部分構(gòu)成的市售的質(zhì)粒進(jìn)行制造，該質(zhì)粒載體具有在本發(fā)明的昆蟲細(xì)胞與脊椎動物細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞兩者的細(xì)胞中可將編碼所需免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因表達(dá)作為抗原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。此外，可插入用于在脊椎動物細(xì)胞內(nèi)利用酶使融合蛋白質(zhì)開裂的肽的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體可在啟動子區(qū)域的上游配置用于使脊椎動物、特別是哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性上升的增強(qiáng)子。此外，在融合表達(dá)的基因的下游，例如具有在脊椎動物細(xì)胞中有效的兔P球蛋白終止子之類的脊椎動物終止子區(qū)域以使得轉(zhuǎn)錄結(jié)束。若舉出本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體的一個具體例，則為形成如下結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移載體，即作為脊椎動物啟動子特別是哺乳動物啟動子的CAG啟動子與作為桿狀病毒啟動子的多角體(Polh)啟動子被連結(jié)，在其下游，作為融合基因，插入有流感病毒抗原基因或熱帶熱瘧疾抗原基因(該多核苷酸序列可為以構(gòu)成天然來源的免疫原性外源蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式進(jìn)行改變的多核苷酸序列)與以構(gòu)成gp64的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列的gp64基因、或者編碼構(gòu)成gp64的氨基酸的一部分缺失的gp64的部分多肽的基因(包含以構(gòu)成gp64的部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列的基因)。作為示例，可舉出 pCAP-HAl/Vietnam/51、pCAP-HAl/Vietnam/10U pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467, pCAP-HAI/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467、pCAP-HAl/Vietnam/OG、pCAP-CO/fulI/OG, pCAP-C0/76/0G、pCAP_C0/205/0G、及 pCAP-C0/76/467 等，對于其中特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)移載體，示出其構(gòu)成堿基序列(表I)。表 I
威基序列/ (尺寸bp)
轉(zhuǎn)移載體0.0.瓦原性外~ 病毒粒子 __源性蛋白質(zhì)__構(gòu)成蛋白質(zhì)
pCAP-HAl/Vietnani/272—~ GPM (1-20) HA/Vet (17-346)GP84 (272-512)
60bp990bp723bp
_序列編號53 序列編號54_序列編號59___
pCAP-HAl/Vietnam/467GP64(l-20)HA/Vet (17-346)GP64 (467-512)
60bp990bp138bp
_序列編號53_序列編號54序列編號60_
pCAP-HAl/Vietnam/OG GP64 (1-20)^ HA/Vet (17-346) ~~"GP64 (21-512)
60bp990bp1476bp
_序列編號53 序列編號54_序列編號61_
pCAP-CO/full/OGGP64(l-20)PfCSP (1-397)GP64 (21-512)
6ObP1191 bp1476bp
序列編號53 序列編號55序列編號61
「 n pCAP-CO/76/OGGP64(l-20)PfCSP (76-373)GP64 (21-512)
LQ131」60bp894bp1476bp
_序列編號53 序列編號56_序列編號61 一
—PCAP-C0/205/0GGP64 (1-20} PfCSP {205-373}GP64 (21-512)
60bp507bp1476bp
_序列編號53 序列編號57_序列編號61_
pCAP-CO/76/467石洲4 (卜20) PfCSP (76-373)' GP64 ￠467-512)
60bp894bp138tp
__序列編號53 序列編號56 _序列編號60_
pCAP-HAl/Aflhui/272 "GP64 (1-20) HA/Aish ￠17-345)GP64 (272-512)
60bp987bp723bp
__序列編號53 序列編號58_序列編號59_
pCAP-HAl/Anhui/467 "GP64 (1-20)HA/Anh (17-345)GP64 (467-512)
60bp987bp138bp
_序列編號53 序列編號58_序列編號60
pCAP-IIAl/Anhui/OGGP64 (1-20)HA/Anh (17-345)GP64 (21-512)~
BObp 987bp 1476bp_ 丨序列編號53丨序列編號58_I序列編號61這樣，可制造本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體，若示出其順序的一例，則可舉出進(jìn)行下述(a) (C)和/或(d廣Ce)的工序。(a)對于編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因，與天然來源的多核苷酸序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式進(jìn)行多核苷酸序列的改變，得到包含編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序；(b)基于上述工序(a)中得到的核酸序列信息而合成多核苷酸的工序；(c)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至上述工序(b)中合成的多核苷酸的工序；(d)合成對構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失而形成的該蛋白質(zhì)的部分多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸，或合成以該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序；(e)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至上述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。本發(fā)明的重組桿狀病毒可通過將上述轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞而得到。桿狀病毒是在對昆蟲引起感染的昆蟲病原病毒中擁有環(huán)狀雙鏈DNA作為基因的DNA病毒中的一類(桿狀病毒科)。其中，被稱作核多角體病病毒(Nucleopolyhedrovirus:NPV)的一類病毒在感染后期在感染細(xì)胞的核內(nèi)形成被稱作多角體的封入體。即使插入欲表達(dá)的外源性基因來代替多角體基因，病毒也沒有問題地感染，增 殖，大量產(chǎn)生所需免疫原性外源性基因產(chǎn)物，因此近年來應(yīng)用于所需蛋白質(zhì)的制造。作為該桿狀病毒，可例示出苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornica multiple nucleopolyhedrovirus ;AcNPV)、以及家香核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ;BmNPV)、黃杉毒蛾核型多角體病病毒(Orgyiapseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus ;0pNPV)、舞毒蛾核型多角體病病毒(Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus ;LdNPV)。在本發(fā)明中使用的桿狀病毒DNA只要是發(fā)生與本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體的同源重組的桿狀病毒DNA即可。在此，作為桿狀病毒DNA，可以是野生型、變異型、或者重組桿狀病毒DNA中的任意種類。桿狀病毒DNA可使用市售品，例如，可使用從AcNPV中除去多角體蛋白基因的BacVector-1000DNA> BacVector-2000DNA (Novagen 公司制)等。為了引起同源重組，轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA的重量比可例如以I: f 10:1左右進(jìn)行混合。作為轉(zhuǎn)移載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入法及利用其的轉(zhuǎn)化法，未特別限定，可采用通常成為該領(lǐng)域中公知的慣用技術(shù)的各種方法，例如可按照通常的基因重組技術(shù)(例如，Science,224,1431 (1984) ；Biochem. Biophys. Res. Comm. ,130, 692 (1985) ；Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 80, 5990 (1983))進(jìn)行制備。轉(zhuǎn)移載體的表達(dá)方法可參考大野等的“蛋白實驗操作規(guī)程I功能分析編，細(xì)胞工程學(xué)另冊，實驗操作規(guī)程系列，1997年，秀潤社”來制造。此外，昆蟲細(xì)胞的操作方法、基因重組、共轉(zhuǎn)染的常規(guī)方法可使用與公知的昆蟲細(xì)胞的重組病毒制作法同樣的方法(松浦善治，蛋白核酸酶，37，211-222(1992)，松浦善治，細(xì)胞，33(2)30-34 (2001))。應(yīng)予說明，共轉(zhuǎn)染可使用市售的載體轉(zhuǎn)染試劑盒(BacVector TransfectionKits ；Novagen公司制),按照該載體轉(zhuǎn)染試劑盒所附的操作說明書進(jìn)行實施。更具體而言，通過將按照上述制造的轉(zhuǎn)移載體與用于進(jìn)行同源重組的桿狀病毒DNA在以來自Spodoptera frugiperda的Sf9細(xì)胞、Sf 21細(xì)胞、來自粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的Tn5細(xì)胞(High Five細(xì)胞Invitrogen公司制)等的昆蟲細(xì)胞為宿主細(xì)胞的細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染而進(jìn)行。
利用共轉(zhuǎn)染工序同時導(dǎo)入到昆蟲細(xì)胞后，培養(yǎng)后，從上述培養(yǎng)上清制作病毒的菌斑，使之懸浮于培養(yǎng)液中，進(jìn)行渦旋，使病毒從瓊脂中溶出，離心分離，得到包含重組病毒的溶液。例如，可按照上述重組桿狀病毒的制造方法，使用pCAP-HAl/Vietnam、pCAP-HAl/Vietnam/51 > pCAP-HAl/Vietnam/101、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201 >pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467, pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467、pCAP-HAl/Vietnam/OG、pCAP-CO/ful 1/0G、pCAP-CO/76/OG、PCAP-C0/205/0G、及pCAP-CO/76/467的轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA在Sf9昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，得到 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/10 I、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/20 I、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/467、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-CO/full/OG、AcNPV-CAP-CO/76/OG、AcNPV-CAP-⑶/205/0G、及AcNPV-CAP-C0/76/467的重組桿狀病毒。
作為其它重組桿狀病毒的制作方法，還可使用如下方法在納入全部桿狀病毒基因組的噬菌體(Bacmid)中，利用轉(zhuǎn)座子，在大腸菌體內(nèi)高效率地插入外源性基因的方法。利用該方法，可僅通過從菌體中提取具有病毒基因的Bacmid并轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞中，就可容易地制造并回收重組桿狀病毒。這樣，制得的轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA —起被轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞等昆蟲細(xì)胞中，可得到重組桿狀病毒。所得重組桿狀病毒可用公知的病毒精制法進(jìn)行精制。例如，對Sf9細(xì)胞等昆蟲細(xì)胞(I X IO7個/IOcm皿)，接種0. 5^1. Oml的由上述重組桿狀病毒的制造方法得到的Stock病毒(通常1\107_8 血/1111)，感染數(shù)天(4天)后，回收培養(yǎng)上清，然后離心分離(25000印111，60分鐘，4°C的條件)，將所得病毒顆粒混懸于PBS等緩沖液中。對所得混懸液施加10飛0%的蔗糖密度梯度離心分離，作為病毒帶進(jìn)行回收。將回收物進(jìn)一步混懸于PBS中后，接著進(jìn)行離心分離，將所得精制重組體病毒顆粒在PBS等的緩沖液中于4°C進(jìn)行保存。應(yīng)予說明，上述得到的精制重組桿狀病毒的感染性可使用Sf9細(xì)胞等昆蟲細(xì)胞，利用菌斑分析進(jìn)行測定(Fields VIROLOGY 4th Edition，p29_32，2001)。所得重組桿狀病毒可按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，利用該培養(yǎng)，免疫原性外源蛋白質(zhì)與病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)融合的融合物(表達(dá)物)在昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或者細(xì)胞膜上進(jìn)行表達(dá)、生產(chǎn)(蓄積、分泌)。作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可根據(jù)采用的宿主細(xì)胞而適宜地選擇利用慣用的各種培養(yǎng)基，培養(yǎng)也可在適于宿主細(xì)胞生長的條件下實施。以下，為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明，舉出實施例。這些實施例僅為例示，并非限定本發(fā)明。實施例實施例I:轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒及其制造法(I)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBACsurf_HAl/PR8的制作(1.1)質(zhì)粒 pBACsurf-Hsp65 的構(gòu)建
以結(jié)核菌H37Rv的基因組DNA為模板，使用引物phsp65_Fl (5，-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3’(序列號 I) ；BgIII 位點用下劃線表示)與 phsp65_Rl(5 ’ -AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3 ’(序列號2) ；NotI用下劃線表示)，進(jìn)行PCR。精制PCR產(chǎn)物后，用限制性內(nèi)切酶BgIII與NotI切斷，插入到用限制性內(nèi)切酶BamHI 與 NotI 切斷的 pcDNA3. I ( + ) (Invitrogen 公司)中，構(gòu)建質(zhì)粒 pcDNA_Ighsp65。以pcDNA-Ighsp65 為模板，使用引物 phsp65_F2(5’ -CACCCCTGCAGG[ACTACA AGGACGACGATGACA AG]GAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3’(序列號3) ；Sse8387I, EcoRI位點用下劃線表示，F(xiàn)LAG序列用[]表示)與 phsp65_R2(5，-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3，(序列號 4);XmaI 位點用下劃線表示)，進(jìn)行PCR，將所得Hsp65基因DNA片段在pENTR/D-T0P0( Invitrogen公司)中進(jìn)行克隆后，用限制性內(nèi)切酶Sse8387I與XmaI切斷，插入到用限制性內(nèi)切酶PstI與XmaI切斷的 pBACsurf-CSP (Yoshida et al. Virology 316 ; 161-70, 2003),構(gòu)建質(zhì)粒 pBACsurf_Hsp65。(I. 2)質(zhì)粒 pBACsurf_HAl/PR8 的構(gòu)建從流感病毒PR8/34株感染的MDCK細(xì)胞上清中，使用QIAamp MiniElute VirusSpin Kit(QIAGEN公司)，提取 RNA，使用弓丨物HA-f (5’ -CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3，(序列號5);SbfI位點用下劃線表示)與HA-r (5，-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3，(序列號6) ；SbfI位點用下劃線表示)，進(jìn)行RT-PCR，將流感病毒HA基因片段在pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen公司)中進(jìn)行克隆。將所得質(zhì)粒命名為pCR-Blunt-HA。以pCR-Blunt-HA 為模板，使用弓丨物 pHA-Fl (5’ -CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3’(序列號 7);EcoRI 位點用下劃線表示)與 pHA-Rl (5，-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3’(序列號8) ；XmaI位點用下劃線表示)，進(jìn)行PCR，將所得H1N1/HA1基因DNA片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI與XmaI切斷，插入到用限制性內(nèi)切酶EcoRI與XmaI處理的pBACsurf-Hsp65 中，構(gòu)建質(zhì)粒 pBACsurf_HAl/PR8。(2)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PCAP-HA1/PR8的制作以 pBACsurf-HAl/PR8 為模板，使用 Polh-f Rsr 11 (5 ’ -GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3’(序列號 9);RsrII 位點用下劃線表示)與 GP64_r DraIII (5，-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3 (序列號 10);DraIII 位點用下劃線表示)，進(jìn)行 PCR。將所得DNA片段用限制性內(nèi)切酶RsrII與DraIII進(jìn)行處理，插入到用限制性內(nèi)切酶RsrII與DraIII切斷pTriEx-1. I (Novagen公司)而得的載體中，構(gòu)建質(zhì)粒pCAP_HAl/PR8。(3)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 pCAP-HAl/Vietnam、pCAP-HAl/Vietnam/51、pCAP-HAl/Vietnam/101、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467 的構(gòu)建從流感病毒H5N1/Vietnam的血凝素的HAl區(qū)域的氨基酸序列制作人工合成基因序列(序列號11)。以該人工序列為模板，使用VN-Fl (5，-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3，(序列號 12);PstI 位點用下劃線表示)與 VN-R4 (5，-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3，(序列號13) ;XmaI位點用下劃線表示),進(jìn)行PCR,用限制性內(nèi)切酶PstI與Xmal切斷,插入至用限制性內(nèi)切酶PstI與Xmal處理的pCAP-HAl/PR8中。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-HAl/Vietnam。進(jìn)而，以pCAP-HAl/PR8 為模板，使用 gp64 (51) -f (5，-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3’(序列號14);Xmal位點用下劃線部分表示)、或者gp64 (101)-f (5’_GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3J (序列號 15);Xmal 位點用下劃線部分表示)、或者gp64 (154) -f (5，-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3，(序列號 16) ；Xmal 位點用下劃線部分表示)、或者 gp64 (201) -f (5，-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3’(序列號17);Xmal位點用下劃線部分表示)、或者gp64 (272)-f (5，-GACTCCCCGGGTCGAGCACCGAGTCAAGAAG-3’(序列號 18);Xmal 位點用下劃線表示)、或者 gp64 (467)-f (5’_GACTC￡CCGGGACATCACTTCCATGGCTGAA-3，(序列號 19);Xmal 位點用下劃線表示)與 GP64_r DraIII(5，-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3^ (序列號 20) ；Dralll 位點用下劃線表示)，進(jìn)行PCR，將所得的各個DNA片段用限制性內(nèi)切酶Xmal與DraIII切斷，插入到用限制性內(nèi)切酶XmaI與DraIII處理的pCAP-HAl/Vietnam中。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-HAl/Vietnam/51 > pCAP-HAl/Vietnam/101、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467。
應(yīng)予說明，流感病毒A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)血凝素的氨基酸序列的GenBank 登錄號為 AAW80717。(4)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467的構(gòu)建由流感病毒H5Nl/Anhui/l/05的血凝素的HAl區(qū)域的氨基酸序列制作人工合成基因序列(序列號21)。以該人工序列為模板，使用AH-FlC5，-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3，(序列號 22);PstI 位點用下劃線表示)與 AH-R4 (5，-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3，(序列號23) ；XmaI位點用下劃線表示)，進(jìn)行PCR，將所得DNA片段分別用限制性內(nèi)切酶PstI與Xmal切斷，插入到用限制性內(nèi)切酶PstI與Xmal處理的pCAP-HAl/Vietnam，pCAP-HAl/Vietnam/272, pCAP-HAl/Vietnam/467 中。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為 pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAI/Anhui/272、pCAP-HAI/Anhui/467。應(yīng)予說明，流感病毒A/H5N1/Anhui的血凝素的氨基酸序列的GenBank登錄號為ABD28180。(5)所需基因未與gp64基因融合的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建pCAP-bGal 的構(gòu)建對pCMV-SPORT-P Gal (Invitrogen 公司制)模板，使用上游引物 bGal-F PstIF189-105 (ACTGCTGCAGATGTCGTTTACTTTGACCAACAAG)(序列號 24)、下游引物 bGal_Rev(Dra3) (ACTGCACTTAGTGTTTTTGACACCAGACCAACTGG)(序列號 25)，進(jìn)行 PCR，將所得 DNA 片段在pCAP-HA I/Anhui的PstI、DraIII位點進(jìn)行克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-bGal。pCAP-Rluc 的構(gòu)建以pRL-SV40 (Promega 公司制)為模板，使用上游引物 Rluc FPstI F189-134 (ACTGCTGCAGATGACTTCGAAAGTTTATGATCC)(序列號 26)、下游引物 Rluc R DraIII F189-134CACTGCACTTAGTGTTAITGTTCAITITTGAGAACT)(序列號 27)，進(jìn)行 PCR，將所得 DNA 片段在 pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位點進(jìn)行克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-Rluc。pCAP-Luc 的構(gòu)建
以pLuc-MCS (stratagene 公司制)為模板，使用上游引物 Rluc FPstI F189-105(ACTGCTGCAGATGGGAGCTCGAATTCCAGCTTG)(序列號 28)、下游引物 Rluc-Rev2F189_127 (ACTGCACTTAGTGTTACAATTTGGACTTTCCGCCC)(序列號 29)，進(jìn)行 PCR，將所得 DNA 片段在 pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位點進(jìn)行克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-Luc。pCAP-AFP 的構(gòu)建以pQBI25_fAl (MP Biomedicals 公司制)為模板，使用上游引物 AFP-F F189-77(ACGCCTGCAGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTCTTCA)(序列號 30)、下游引物 AFP_Rev2F189_127 (ACTGCACTTAGTGTCAATCGATGTTGTACAGTTCA)(序列號 31 )，進(jìn)行 PCR，將所得 DNA 片段在 pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位點進(jìn)行克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-AFP。pCAP-Neo 的構(gòu)建 以pcDNA3.l( + )(Invitrogen公司制)為模板，使用上游引物Neo-F SbfI F189-105(ACTGCCTGCAGGTGATTGAACAAGATGGATTGCAC)(序列號 32)、下游引物 Neo-Rev2F189_127(ACTGCACTTAGTGTCAGAAGAACTC GTCAAGAAGG)(序列號 33)，進(jìn)行 PCR，將所得 DNA 片段在pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位點進(jìn)行克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-Neo。(6)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 pCAP-HAl/Vietnam/OG 的制作(6. I)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pCAP-OG的制作將用限制性內(nèi)切酶SpeI與DraIII切斷pCAP-HAl/Vietnam，導(dǎo)入同樣用限制性內(nèi)切酶SpeI與DraIII切斷的人工合成gp64基因序列(序列號34)而構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-OG。(6. 2)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 pCAP-HAl/Vietnam/OG 的制作將用限制性內(nèi)切酶PstI與XmaI切斷pCAP-HAl/Vietnam而產(chǎn)生的包含HAl基因的片段插入到用限制性內(nèi)切酶PstI與XmaI消化的pCAP-OG中，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCAP-HAl/Vietnam/OG。(7)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 pCAP-C0/full/0G、pCAP-C0/76/0G、pCAP_C0/205/0G、及pCAP-CO/76/467 的制作從Plasmodium falciparum 3D7株的CSP的氨基酸序列制作人工合成基因序列(序列號 35，;PfCSP (3D7)_opt)。以該人工序列為模板，使用 PfCSP_opt_f (5 -GACTCTGCA￡ATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3’，PstI 位點用下劃線部分表示，序列號 36)與 PfCSP_opt_r(397)(5’ -CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3’，XmaI 位點用下劃線部分表示，序列號 37)、PfCSP_opt-f (76) (5，-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3’，PstI 位點用下劃線部分表示，序列號 38)與 PfCSP_opt-r (373) (5，-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCMTATCATTAGC-3’，XmaI 位點用下劃線部分表示，序列號 39)、及PfCSP_opt_f(205)(5’ -GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3’，PstI 位點用下劃線部分表示，序列號 40)與 PfCSP_opt-r (373) (5，-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3’，XmaI位點用下劃線部分表示，序列號39)，進(jìn)行PCR，將所得DNA片段分別用PstI與 XmaI 切斷，插入到用 PstI 與 XmaI 處理的 pCAP-HAl/Anhui 或者 pCAP-HAl/Anhui/467 中。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為 pCAP-C0/full、pCAP-CO/76、pCAP-CO/76/467、pCAP-C0/205。應(yīng)予說明，Plasmodium falciparum 3D7株的CSP的氨基酸序列的GenBank登錄號為 NC 000521。
實施例2本發(fā)明重組桿狀病毒及其制造法重組桿狀病毒如下制作使用重組桿狀病毒制作試劑盒(BacVector-2000Transfection Kit, Novagen公司)，將在上述實施例I中構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pBACsurf-HAl/PR8、pCAP_HAl/PR8、pCAP-HAl/Vietnam、pCAP-HAl/Vietnam/51、pCAP-HAl/Vietnam/ΙΟ 、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467、pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467、pCAP-HAl/Vietnam/OG、pCAP-bGal、pCAP-Rluc、pCAP-Luc、pCAP-AFP、及pCAP-Neo中的各個轉(zhuǎn)移載體與BacVector-2000DNA在Sf9細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(co-transfection)。將制得的重組桿狀病毒分別命名為AcNPV-Pol-HAl/PR8、AcNPV-CAP_HAl/PR8、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/10UAcNPV-CAP-HAl/Vietnam/154、AcNP V_CAP-HA1/Vietnam/201、AcNP V-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui、AcNPV-CAP-HA I/ Anhui/272、AcNPV-CAP-HA I/Anhui/46 7、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-bGal、AcNPV-CAP-Rluc、AcNPV-CAP-Luc、AcNPV-CAP-AFP、及 AcNPV-CAP-Neo。對于制得的重組桿狀病毒，以在每150mm細(xì)胞培養(yǎng)用板(SUMIL0N:秋田SumitomoBakelite公司制)中成為2X107個細(xì)胞的方式培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，使各個上述重組桿狀病毒以感染重復(fù)度約O. I進(jìn)行感染。5天后，將培養(yǎng)液在10000 X g、4° C進(jìn)行25分鐘離心，回收，進(jìn)而用Beckman超離心機(jī)(SW28Swing Rotor)在25000rpm、4° C進(jìn)行90分鐘離心，從而得到病毒粒子。實施例3重組桿狀病毒的繼代培養(yǎng)將在上述實施例2中得到的各重組桿狀病毒與實施例2同樣地用BacVector-2000試劑盒(Novagen公司制)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)5天后，回收上清，進(jìn)行2次菌斑純化。使第2次的分離菌斑對播種在48孔板上的Sf9細(xì)胞進(jìn)行感染，培養(yǎng)5天后，回收上清。使該上清在25cm2燒瓶中以感染重復(fù)度約0. I進(jìn)行感染，培養(yǎng)7天后回收上清(以此為P2stock病毒)。使P2stock病毒進(jìn)一步以感染重復(fù)度約0. I對Sf9細(xì)胞進(jìn)行感染，以培養(yǎng)7天的培養(yǎng)上清為P3Stock病毒。應(yīng)予說明，在轉(zhuǎn)染與48孔感染時，使用BacVectorInsect Cell Medium (Novagen公司制)的培養(yǎng)基，在菌斑純化中使用I. 3XSf900II 培養(yǎng)基(Invitrogen 公司制)，在 25cm2 燒瓶時，使用 TNM-FHInsect cellmedium (Becton, Dickinson and Company 公司制)。實施例4從重組桿狀病毒中的病毒基因組DNA的回收，及病毒DNA的PCR分析在病毒溶液50 μ I 中加入 DNA 提取緩沖液(50mM Tris-HCl (pH8. 0),20mM EDTA,0. IM NaCl，1%SDS>400 μ I與蛋白酶K (20mg/ml)8 μ 1，于50°C進(jìn)行3小時溫育。將溶液冷卻至室溫后，進(jìn)行458 μ I的苯酚 氯仿(TE飽和苯酚氯仿=1:1，和光純藥公司制)處理，從所得上清中利用乙醇沉淀而回收病毒基因組DNA。(I)病毒DNA的PCR分析以從病毒回收的病毒基因組DNAlng為模板,進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)循環(huán)將94°C反應(yīng)2分鐘、98°C 10秒、60°C 30秒、及68°C 5分鐘進(jìn)行30個循環(huán)后，返回至4°C。然后，從PCR反應(yīng)液中將10 μ I裝載至瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳，利用溴化乙錠染色將DNA進(jìn)行染色。在PCR反應(yīng)中使用的引物的各組合如下所示，為上游引物 Pol h-F (5，-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’(序列號 41))及下游引物 Pol A-f (5，-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3’(序列號 42))、上游引物 CAG-F-FseI (5，-CTAGTTATTAATAGTAAT-3’(序列號 43))及下游引物 GP64-R2 (5，-CATCGCCACGATTTGTTGCAC-3’(序列號 44))、上游引物 Polh-F (5，-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’(序列號 41)及下游引物 GP64-R2(5，-CATCGCCACGATTTGTTGCAC-3’(序列號 44))。對于PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中的提取，將用溴化乙錠染色的凝膠照射UV，切出所映出的目標(biāo)DNA帶,使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen公司制),從凝膠中提取DNA。此外，對于PCR產(chǎn)物的DNA的序列確定，從凝膠中提取用PCR擴(kuò)增的目的DNA，將提取物直接用作序列分析的模板，或者使用Zero Blunt T0T0PCR克隆試劑盒(Invitrogen 公司制)進(jìn)行一次克隆，用作序列分析的模板。在模板中，使用5-300ng的DNA,用BigDyeTerminator v3. I (BigDye Terminator v3. I ；Applied Biosystems 公司制)，進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。在引物中，使用 Pol h-F (5，-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’(序列號 41))，Pol A-f(5，-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3’(序列號 42))。測序儀使用Applied Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems 3130x1 Genetic Analyzer ；Applied Biosystems 公司制X接著,在后述實施例的Southern blot分析中，為了檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的病毒DNA片段，準(zhǔn)備HA1/VN探針(可檢測抗原基因HAl與gp64基因的融合基因)、gp64探針(可檢測抗原基因HAl與gp64基因的融合基因、抗原基因從該融合基因脫落而成的基因(變異病毒DNA)及內(nèi)源性的gp64基因)、及啟動子探針(可檢測抗原基因HAl與gp64基因的融合基因、及抗原基因從該融合基因脫落而成的基因。若為上述gp64探針，則無法與從天然來源的gp64基因的多核苷酸序列改變的多核苷酸的病毒DNAjf gp64基因的DNA序列縮短而成的病毒DNA進(jìn)行結(jié)合，因此制作該探針)，利用PCR進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增。應(yīng)予說明，測定擴(kuò)增的基因片段的濃度，針對IOml的雜交緩沖液，將50-100ng的基因片段用作各探針。(2)用于實施例5的探針的制作I為了得到HA1/VN探針的DNA片段，使用10 μ M的上游引物VN-F2(5，-GTGTCCAGCGCCTGCCCCTACCAGG-3’(序列號 45))及 10 μ M 的下游引物 VN-R3(5，-CCGTACTCCAGTTCTGACTTCATG-3’(序列號 46))、作為模板 DNA 的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCAP-HAl/vietanam，進(jìn)行PCR。為了制作gp64探針，使用10 μ M的上游引物GP64-271-F (5，-ACCGAGTCAAGAAGCGGCC-3’(序列號 47))及 ΙΟμΜ 的下游引物 pol A-f(5’-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3，(序列號 42))、作為模板 DNA 的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pCAP_HAl/PR8，進(jìn)行PCR0利用這些PCR，得到用于制作探針的基因片段。各DNA片段的核酸序列如序列號50、51所示。使用這些基因片段，利用AlkPhos Direct Labelling and Detection SystemCGEHealthcare公司制)試劑盒制作探針。(3)用于實施例8的探針的制作II
HA1/VN探針、gp64探針使用與上述實施例5相同的探針。為了制作啟動子探針，使用 ΙΟμΜ 的上游引物 CAP-PromF F213-22 (5 ’ -GCCTCTGCTAACCATGTTCATGC-3 ’(序列號48))及 ΙΟμΜ 的下游引物 CAP-PromRF213-22 (5 ’-CTTGCTTGTGTGTTCCTTATTGAAGCC-3 ’(序列號49))、作為模板DNA的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCAP-HAl/Vietnam，進(jìn)行PCR。這樣，得到所需HA1/VN探針的DNA片段、gp64探針的DNA片段、及用于制作啟動子探針的基因片段。各DNA片段的核酸序列如序列號50、51及52所示。使用這些基因片段，利用AlkPhos Direct Labelling and Detection SystemCGEHEALTHCARE公司制)試劑盒，制作探針。如實施例3所示，繼代培養(yǎng)重組病毒，通過Western印跡觀察到利用PCR確認(rèn)病毒DNA的產(chǎn)生量與所需抗原表達(dá)量減少。因此，為了研究該表達(dá)量降低的原因，用包含啟動子序列與抗原序列的引物對(CAG-F-FseI x GP64-R2)，進(jìn)行以從病毒制備的病毒基因組DNA為模板(5 μ I)的PCR。PCR 后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖I所示，與推定尺寸(上段)不同尺寸地呈現(xiàn)預(yù)想之外的帶(下段)。從凝膠切出該預(yù)想之外的帶，確認(rèn)序列，結(jié)果確認(rèn)了不包含抗原基因的啟動子的序列與gp64基因的序列連結(jié)而成的序列。由此啟示了在重組病毒中存在抗原基因脫落的變異病毒。作為陽性對照，使用質(zhì)粒pCAP-HAl/PR8 (泳道1、2)。此外，即使將來自SF9細(xì)胞的基因組DNAlOOng用于模板，也不能得到這樣的帶(泳道8)，因此，考慮所得預(yù)想之外的帶為來自重組桿狀病毒的可能性。這也確認(rèn)了成為醫(yī)藥的有效成分的重組病毒的純度降低。應(yīng)予說明，就瓊脂糖凝膠電泳而言，在相對于模板量5 μ I為50 μ I的反應(yīng)液中，將10 μ I裝載于瓊脂糖凝膠中。圖I為在退火溫度60°C進(jìn)行PCR的結(jié)果。泳道I示出以5pg的質(zhì)粒pCAP_HAl/PR8為模板進(jìn)行PCR的結(jié)果，泳道2示出以O(shè). 5pg的質(zhì)粒pCAP_HAl/PR8為模板進(jìn)行PCR的結(jié)果，泳道3示出以分子量標(biāo)記(Ikb Plus DNA ladder (Invitrogen社))為模板進(jìn)行PCR的結(jié)果，泳道4示出以從P2ST0CK病毒制備的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR的結(jié)果，泳道5 7分別示出以將用于泳道4的病毒進(jìn)行I代繼代后制備而成的病毒(P3Stock病毒)的DNA為模板進(jìn)行PCR的結(jié)果。實施例5利用Southern Blot分析的變異病毒的確認(rèn)將由在上述實施例3中經(jīng)繼代培養(yǎng)的重組桿狀病毒AcNPV-CAP-HAl/Vietnam的P3Stock病毒進(jìn)一步進(jìn)行I代繼代培養(yǎng)的病毒得到的病毒DNA0. 2 μ g用限制性內(nèi)切酶SwaI(NEB公司制)及XbaI (NEB公司制)進(jìn)行消化，使用全量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠用O. 25M的HCl溶液、改性緩沖液(O. 5M NaOH, I. 5MNaCl)、中和緩沖液(IMTris-HCl (pH7. 5), I. 5M NaCl)進(jìn)行處理,使用 Turbo blotter (Wattmann 公司制)，將 DNA轉(zhuǎn)移至膜片，利用UV交聯(lián)(1200X100uj/cm2)，使DNA固定在膜片中。接著，將膜片浸潰于雜交緩沖液中，進(jìn)行預(yù)雜交(雜交緩沖液10ml/6X Ilcm膜片)(65。。，30 分鐘)。應(yīng)予說明，就雜交緩沖液而言，按照所附說明書使用在AlkPhos DirectLabelling and Detection System (GE HEALTHCARE)試劑盒中所附的雜交緩沖液。在上述雜交液中，加入在實施例4中制作的HA1/VN探針、及gp64探針，于65°C進(jìn)行4小時以上的雜交。雜交后，清洗膜片，使用CDP-star檢測試劑(GE HEALTHCARE公司制)，進(jìn)行帶的檢測。在檢測信號之后，進(jìn)行重探測的操作，進(jìn)而使用Ikb plus DNAladder探針(將Ikb plus DNA ladder (Invitrogen 公司制)20_100ng 用 AlkPhos Direct Labelling andDetection System (GE HEALTHCARE公司制)試劑盒進(jìn)行標(biāo)示而制得的探針)進(jìn)行再次雜交，確認(rèn)帶的尺寸。其結(jié)果如圖2 (A)及(B)所示。圖2中，(A)示出使用HA1/VN探針的結(jié)果，(B)示出使用gp64探針的結(jié)果，泳道I示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam 的克隆 1，泳道 2 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam 的另一克隆(克隆2),泳道3示出分子量標(biāo)記(Ikb plus DNA ladder (Invitrogen公司制))，泳道4示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam 的克隆 1，泳道 5 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam 的克隆 2，泳道6 不出分子量標(biāo)記(lkb plus DNA ladder (Invitrogen 公司制))。
其結(jié)果是，如圖2 (A)所示，HA基因被檢出該尺寸，在圖2 (B)中不僅檢出HAl與gp64基因的融合基因的帶與內(nèi)源性gp64基因的帶(均為正常病毒)，而且檢出HAl基因缺損的gp64基因的帶(變異病毒)。由此可知變異病毒存在于病毒溶液中。實施例6用于避免變異病毒產(chǎn)生的gp64基因修飾體的Southern分析由于可知上述變異病毒的存在，因此作為用于避免變異病毒產(chǎn)生的GP64修飾體，制作使用在實施例I中制作的轉(zhuǎn)移載體(包含編碼天然來源的GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的多核苷酸序列與以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式使多核苷酸序列的同源性降低至約77%的多核苷酸的質(zhì)粒載體)制作的重組桿狀病毒(AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG)。為了進(jìn)一步詳細(xì)分析，使用具有部分縮短GP64的一部分的序列的幾個GP64修飾體，進(jìn)行同樣的PCR實驗。S卩，將在上述實施例3中經(jīng)繼代培養(yǎng)的P3Stock病毒AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/0G、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HA I /V i e tnam/10 UAcNPV-CAP-HAl/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/20U AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、及AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/46 7按照實施例4而得到病毒DNA，使用各引物，進(jìn)行病毒DNA的PCR分析。其結(jié)果如圖3所示。圖3中，泳道I示出分子量標(biāo)記(lkb plus DNA ladder (Invitrogen公司制))，泳道 2 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG 的病毒 DNA 的帶，泳道 3 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam的病毒DNA的帶，泳道4示出AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51的病毒DNA的帶，泳道 5 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/ΙΟ 的病毒 DNA 的帶，泳道 6 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/154的病毒DNA的帶，泳道7示出AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/201的病毒DNA的帶，泳道 8 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 的病毒 DNA 的帶，而且泳道 9 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467的病毒DNA的帶。由圖3可知，將AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG的gp64基因的多核苷酸序列與編碼天然來源的GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的多核苷酸序列進(jìn)行比較，就以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式使編碼其的多核苷酸的序列同源性降低至約77%的修飾體與縮短以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分(分別缺失49%、87%氨基酸序列而成的)缺失的方式使多核苷酸序列改變的 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 及 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/46 7 的 gp64 基因的一部分的修飾體而言，幾乎未確認(rèn)變異病毒的檢出，或者未確認(rèn)檢出。實施例7用于避免變異病毒產(chǎn)生的gp64基因修飾體構(gòu)建物的Southern分析上述結(jié)果，為了避免或者抑制變異病毒的產(chǎn)生，將gp64基因的核苷酸與編碼天然來源的GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的多核苷酸序列進(jìn)行比較，構(gòu)建以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸的修飾體的轉(zhuǎn)移載體，或構(gòu)建以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸縮短gp64基因的一部分的修飾體的轉(zhuǎn)移載體，從而可知可避免變異病毒的檢出，或者幾乎不能確認(rèn)檢出。因此，進(jìn)一步對于將免疫抗原蛋白代替成其它流感抗原的情況，對于在構(gòu)建縮短gp64基因的一部分的修飾體的轉(zhuǎn)移載體的情況下的變異病毒產(chǎn)生,進(jìn)行研究。S卩，將在上述實施例3中繼代培養(yǎng)的P3Stock病毒AcNPV-CAP-HAI/Vietnam、AcNPV-CAP-HA I /V i e t nam/ 2 7 2, AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272、及 AcNPV-CAP-HAl/Anhui/467 按照實施例 4 得到病毒 DNA，使用 各引物，進(jìn)行病毒DNA的PCR分析。其結(jié)果如圖4所示。圖4中，泳道I不出分子量標(biāo)記(lkb plus DNA ladder (Invitrogen公司制))，泳道 2 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam 的病毒 DNA 的帶，泳道 3 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/272 的病毒 DNA 的帶，泳道 4 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/46 7 的病毒 DNA 的帶，泳道 5 示出 AcNPV-CAP-HAl/Anhui 的病毒 DNA 的帶，泳道 6 示出 AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272的病毒DNA的帶，泳道7示出AcNPV-CAP-HAl/Anhui/467的病毒DNA的帶，而且泳道8示出過去檢測變異病毒的AcNPV-CAP-HAl/Vietnam (陽性對照)的帶，泳道擴(kuò)13分別示出以使用在所需基因中未融合gp64基因的轉(zhuǎn)移載體(pCAP-bGal，pCAP-Rluc、pCAP-Luc、pCAP-AFP、pCAP-Neo)而制作的桿狀病毒 AcNPV-CAP-bGal、AcNPV-CAP-R-Luc、AcNPV-CAP-Luc、AcNPV-CAP-AFP及AcNPV-CAP-Neo的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR時的DNA的帶，而且泳道14 不出分子量標(biāo)記(lkbplus DNA ladder (Invitrogen 公司制))。由圖4可知，將GP64蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的氨基酸序列長分別在基因水平上縮短至 51%、13% 而修飾的 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272、及 AcNPV-CAP-HA I/Anhui/46 7，與將 GP64 蛋白質(zhì)的氨基酸序列長在基因水平上縮短前的構(gòu)建物相比，來自變異病毒的帶明顯減少(泳道3、4、6、7 )。此外，在具有編碼未融合gp64基因的外源性蛋白的基因的5個克隆(泳道擴(kuò)13)中，未檢出這樣的變異病毒。進(jìn)而，即使將免疫抗原蛋白替代成其它流感抗原時，也未確認(rèn)變異病毒的檢出。實施例8利用Southern Blot分析的重組病毒及變異病毒量的確認(rèn)將從在上述實施例3中繼代培養(yǎng)的P3Stock病毒進(jìn)一步再I代繼代培養(yǎng)而成的重組桿狀病毒 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA I/Vie tnam/OG、及野生型桿狀病毒(AcNPV)中得到的病毒 DNA用限制性內(nèi)切酶SwaI (NEB公司制)及XbaI (NEB公司制)進(jìn)行消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使2yg的病毒DNA用限制性內(nèi)切酶SwaI (NEB公司制)及XbaI (NEB公司制)進(jìn)行消化后，進(jìn)行乙醇沉淀。將所得顆粒溶解在TE緩沖液中，用O. 8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分解。接著，將凝膠用O. 25M的HCl溶液、改性緩沖液(O. 5M NaOH, I. 5M NaCl)、中和緩沖液(1M Tris-HCl (pH7. 5), I. 5M NaCl)進(jìn)行處理,使用 Turbo blotter (Whatman 公司制)，將凝膠中含有的DNA轉(zhuǎn)移至膜片，利用UV交聯(lián)(1200X100uj/cm2)，使DNA固定在膜片上。
接著，將膜片浸至雜交緩沖液中，于65°C進(jìn)行30分鐘預(yù)雜交(雜交緩沖液10ml/6Xllcm膜片)。應(yīng)予說明，就雜交緩沖液而言，按照所附的說明書使用AlkPhosDirect Labelling and Detection System (GEHEALTHCARE 公司制)試劑盒所附的雜交緩沖液。在上述雜交液中，加入在實施例4中制作的啟動子探針，于65°C進(jìn)行4小時以上的雜父。雜交后，使用CDP-star檢測試劑(GE HEALTHCARE公司制)，進(jìn)行帶的檢測。在檢測信號之后，進(jìn)行重探測的操作，進(jìn)而用lkb plus DNA ladder探針再次進(jìn)行雜交，確認(rèn)帶的尺寸。其結(jié)果分別如圖5及表2所示。圖5中，泳道I示出對照的pCAP-HAl/Vietnam質(zhì)粒的濃度IX IO8拷貝(O. 84ng)，泳道2示出對照的質(zhì)粒的濃度3 X IO7拷貝(O. 252ng)，泳道3示出對照的質(zhì)粒的濃度I X IO7 拷貝(O. 084ng),泳道4示出野生型桿狀病毒的病毒DNA的帶，泳道5示出AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/OG的病毒DNA的帶，泳道6示出AcNPV-CAP-HA I/Vietnam的病毒DNA的帶，泳道 7 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 的病毒 DNA 的帶，泳道 8 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467的病毒DNA的帶。由圖5可知，與編碼天然來源的GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的多核苷酸序列進(jìn)行比較，對于以構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變編碼GP64蛋白質(zhì)的氨基酸的多核苷酸序列而成的本發(fā)明的重組桿狀病毒(AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG)、相當(dāng)縮短構(gòu)成GP64蛋白質(zhì)的氨基酸序列的N末端側(cè)的一部分的修飾體(AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467)，未檢出變異病毒。然而，在 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 中檢出來自變異病毒的帶。因此，從正常病毒的帶和變異病毒的帶與質(zhì)粒對照的濃度比，將變異病毒的出現(xiàn)量進(jìn)行定量化。其結(jié)果如表2所示。表2
突變率
__W_ND No detection如表2所示可知，在未使gp64基因的多核苷酸序列的同源性降低的AcNPV-CAP-HAl/Vietnam中，約9%的病毒變異，在僅縮短GP64蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的氨基酸序列的 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 中，0. 8% 的病毒發(fā)生變異。而且，在 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、相當(dāng)縮短GP64蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的氨基酸序列的AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467中，變異病毒在檢測限以下，因此為ND (No detection)。SP，可知，在 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/467 中，變異病毒產(chǎn)生得到抑制，可高純度維持以表達(dá)免疫抗原基因與gp64基因融合的融合物的重組桿狀病毒為醫(yī)藥有效成分的醫(yī)藥物質(zhì)。純度降低的融合物的一方即免疫抗原的表達(dá)量降低涉及給予的抗原的致敏量的降低，作為結(jié)果，存在治療效果不充分的問題，但是通過應(yīng)用本發(fā)明的制造方法，可解決這些問題。實施例9使用桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞的Western印跡分析對于轉(zhuǎn)移載體的啟動子為單啟動子與雙重啟動子時變異病毒產(chǎn)生量是否不同，進(jìn)行比較試驗。使用在實施例2中制作的具有單啟動子的重組桿狀病毒AcNPV-Pol-HAl/PR8與具有雙重啟動子的重組桿狀病毒AcNPV-CAP-HA I/PR8，使菌斑產(chǎn)生，分別挑選8個菌斑，使其一部分對48孔板中散布的Sf9細(xì)胞進(jìn)行感染，使之對在48孔板(Corning公司制)上培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞進(jìn)行感染。在感染5天后，回收上清，對在板上殘留的Sf9細(xì)胞加入包含12的2X SDS 樣品緩沖液(5mM Tris_HCl(pH7. 0),20% 甘油、4%SDS、0. 004%BPB(溴酚藍(lán))，10%2-巰基乙醇)，溶解細(xì)胞，移入微量離心管后，煮沸5分鐘。對該溶液進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至Immubilon-P膜片(Millipore公司制)后，進(jìn)行使用抗GP64抗體(eBioscience,稀釋5000倍)與二次抗體Goat Anti-Mouse IgG (H+DHRP結(jié)合物(BI0RAD公司制，稀釋5000倍)的Western印跡，檢測GP64與抗原的融合蛋白和內(nèi)源性的GP64蛋白。應(yīng)予說明，就SDS-PAGE電泳緩沖液而言，使用25mM Tris、192mM甘氨酸、及1%SDS，在印跡緩沖液中，使用48mM Tris (pH9. 2)、39mM甘氨酸、O. 038%SDS、及20%甲醇，在檢測試劑中，使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測ECL plus (GE HEALTHCARE公司制)。Western分析的結(jié)果如圖6所示。圖6左圖中，泳道1-8示出轉(zhuǎn)移載體具有雙重啟動子的構(gòu)建物的重組病毒AcNPV-CAP-HA I/PR8的克隆廣8，泳道9_16示出轉(zhuǎn)移載體具有作為單一啟動子的多角體啟動子的構(gòu)建物的重組病毒AcNPV-Pol-HAl/PR8的克隆廣8。此外，將使用上述由分離的克隆制備的病毒DNA的PCR分析的結(jié)果分別示于圖6右上圖及右下圖。在圖6右的上下圖中，泳道17及27示出分子量標(biāo)記,泳道18-24示出具有雙重啟動子的構(gòu)建物的重組病毒AcNPV-CAP-HAl/PR8的克隆2 8 (克隆I在其它實驗中使用，因此不包含在此)，泳道28-34示出轉(zhuǎn)移載體具有單一啟動子的多角體的構(gòu)建物的重組病毒AcNPV-PoI-HAI/PR8的克隆2 8 (克隆I在其它實驗中使用，因此不包含在此)，泳道25、35示出陽性對照，而且泳道26、36分別示出陰性對照。其結(jié)果，若比較AcNPV-CAP-HA I/PR8及AcNPV-Po I-HAI/PR8，則確認(rèn)與啟動子的種類無關(guān)地出現(xiàn)變異病毒。實施例10利用納入人痕疾(Plasmodium falciparum)的CSP抗原的桿狀病毒進(jìn)行的改變gp64基因密碼子的桿狀病毒的性狀分析將包含瘧疾抗原的重組桿狀病毒(將P3Stock病毒進(jìn)一步繼代培養(yǎng)的病毒)AcNPV-C0/full/0G、AcNPV-C0/76/0G、AcNPV_C0/205/0G、及 AcNPV-CO/76/467 進(jìn)行精制，將用2 X SDS樣品緩沖液改性的病毒供給到SDS-PAGE，轉(zhuǎn)錄至膜片后，進(jìn)行使用了抗GP64抗體(e-Bioscience公司制，稀釋5000倍)與二次抗體羊抗小鼠IgG (H+L)HRP結(jié)合物(Bio-rad公司制，稀釋5000倍)的免疫染色，檢測GP64蛋白與抗原的融合蛋白和內(nèi)源性的GP64蛋白。此外，為了高靈敏度地檢測GP64蛋白與抗原的融合蛋白，進(jìn)行使用了抗CSP抗體MRA-183(MR4，稀釋10000倍)與二次抗體二次抗體羊抗小鼠IgG (H+L) HRP結(jié)合物(Bio-rad公司制，稀釋5000倍)的免疫染色，檢測GP64蛋白與抗原的融合蛋白。
圖7中，1-4示出使用抗GP64抗體的免疫染色的結(jié)果，5-8示出使用抗CSP抗體的免疫染色的結(jié)果，I、5 裝載 AcNPV-CAP-CO/ful 1/0G，2、6 裝載 AcNPV-CAP-CO/76/OG，3、7 裝載AcNPV-CAP-C0/205/0G，4、8 裝載 AcNPV-CAP-CO/76/467。這樣與內(nèi)源性 GP64 蛋白相對的量因抗原而有差別，但即使在取代gp64基因的密碼子時，也可在全部的克隆中確認(rèn)GP64蛋白與抗原的融合蛋白的表達(dá)。

為了確認(rèn)在這些重組病毒中未出現(xiàn)變異病毒，從各個病毒中制備基因組DNA，使用Pol h-f引物和Pol A-f引物進(jìn)行PCR。其結(jié)果如圖8所示。泳道I使用lkb Plus DNAladder,泳道 2 使用 AcNPV-CAP-CO/full/OG，泳道 3 使用 AcNPV-CAP-CO/76/OG，泳道 4 使用AcNPV-CAP-C0/205/0G，泳道5使用AcNPV-CAP-CO/76/467，泳道6使用作為陰性對照的AcNPV-CAP-HA I /V i e tnam/OG,泳道 7 使用作為陽性對照的 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam。其結(jié)果顯示除了陽性對照以外，未檢出變異病毒。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列。
2.一種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，進(jìn)行下述(a) (C)和/或(d) Ce): (a)對于編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式進(jìn)行多核苷酸序列的改變，得到包 含編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序； (b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序； (C)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或者插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序； (d)合成對構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失而形成的該蛋白質(zhì)的部分多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸，或合成以該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序； Ce)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，融合基因是在其上游包含編碼來自病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的信號序列的多核苷酸的融合基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因、水皰性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞體病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白質(zhì)基因中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因是選自瘧疾抗原、流感病毒抗原、結(jié)核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住白細(xì)胞蟲抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是選自這些抗原基因組中的至少一種與細(xì)胞因子的融合抗原的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，轉(zhuǎn)移載體是在將能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子與桿狀病毒的啟動子連結(jié)而得到的雙重啟動子的下游連結(jié)融合基因的轉(zhuǎn)移載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子是選自巨細(xì)胞病毒啟動子、SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延伸因子I a啟動子、肌動蛋白啟動子、泛素啟動子、白蛋白啟動子及MHC類啟動子中的任一種，桿狀病毒的啟動子是選自多角體啟動子、PlO啟動子、IEl啟動子、P35啟動子、p39啟動子及gp64啟動子中的任一種。
10.一種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是在包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒DNA區(qū)域之間插入有編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，將與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域進(jìn)行融合的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)的病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列，以相對于天然來源的同一病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列同源性降低的方式進(jìn)行改變，和/或以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變該多核苷酸序列。
11.一種重組桿狀病毒的制造方法，其特征在于，是使用了連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體的重組桿狀病毒的制造方法，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，將所述轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至昆蟲宿主細(xì)胞中， 所述轉(zhuǎn)移載體如下形成對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變其多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分缺失的方式改變其多核苷酸序列。
12.—種轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列。
13.一種轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，是連結(jié)有融合基因的轉(zhuǎn)移載體，所述融合基因包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因、和編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)移載體，是通過進(jìn)行下述(a廠(C)和/或(d廠(e)而制得的， (a)對于編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因而言，與天然來源的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式進(jìn)行多核苷酸序列的改變，得到包含編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序； (b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序； (c)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序； (d)合成對構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失而形成的該蛋白質(zhì)的部分多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸，或合成以該部分多肽的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序； Ce)將編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的多核苷酸連結(jié)或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，融合基因是在其上游連結(jié)有編碼來自病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的信號序列的多核苷酸的融合基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因、水皰性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞體病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白質(zhì)基因中的任一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因為桿狀病毒gp64基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因是選自瘧疾抗原、流感病毒抗原、結(jié)核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住白細(xì)胞蟲抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是選自這些抗原基因組中的至少一種與細(xì)胞因子的融合抗原的基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)移載體，是在將能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子與桿狀病毒的啟動子連結(jié)而得的雙重啟動子的下游連結(jié)融合基因的轉(zhuǎn)移載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述能在脊椎動物細(xì)胞中起作用的啟動子是選自巨細(xì)胞病毒啟動子、SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延伸因子I a啟動子、肌動蛋白啟動子、泛素啟動子、白蛋白啟動子及MHC類啟動子中的任一種，桿狀病毒的啟動子是選自多角體啟動子、P10啟動子、IEl啟動子、P35啟動子、p39啟動子及gp64啟動子中的任一種。
21.一種轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，是在包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒DNA區(qū)域之間插入有編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)移載體，將與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的DNA區(qū)域進(jìn)行融合的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)的病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列，以相對于天然來源的同一病毒DNA區(qū)域的多核苷酸序列同源性降低的方式進(jìn)行改變，和/或以構(gòu)成病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變該多核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供高純度地制造發(fā)揮所需免疫抗原性且可用作疫苗等醫(yī)藥品的重組桿狀病毒的方法、以及用于制造該重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體及其制造方法。一種轉(zhuǎn)移載體的制造方法，其特征在于，是連結(jié)有包含至少一種編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因與編碼免疫原性外源蛋白質(zhì)的基因的融合基因而成的轉(zhuǎn)移載體的制造方法，對于所述編碼病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因，與來自于天然的病毒粒子構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因序列相比，以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸不改變的方式改變多核苷酸序列，和/或以構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸的一部分缺失的方式改變多核苷酸序列。
文檔編號C12N15/117GK102822336SQ201180007698
公開日2012年12月12日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者川崎昌則, 稻垣勝也, 水腰真己 申請人:大塚制藥株式會社