專利名稱：用于治療神經(jīng)障礙的非遺傳修飾性重編程細(xì)胞的組合物和方法
用于治療神經(jīng)障礙的非遺傳修飾性重編程細(xì)胞的組合物和方法優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)要求對(duì)以下美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2010年2月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/337，522、2010年7月I日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/360，841，上述申請(qǐng)參考并入本文。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞能夠分化為多種類型的人體細(xì)胞。大部分體細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，并被認(rèn)為缺乏轉(zhuǎn)變成其它類型體細(xì)胞的能力。誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域近來的進(jìn)展已經(jīng)改變了這ー范式。體細(xì)胞可以被重編程為誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)，gp，通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)使四種轉(zhuǎn)錄因子異位表達(dá)，即0ct4(例如SEQ ID NO :1)、Sox2(例如SEQID NO :2)、Klf4(SEQ ID NO 3)以及 cMyc (例如 SEQ ID NO 4) (Okita 等，Nature 448， 313-317(2007) ;Takahashi 和 Yamanaka，Cell 126，663-676 (2006))。進(jìn)ー步發(fā)展了ー些改良的遺傳方法來產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)更低的iPSC，包括采用非整合型腺病毒來傳遞重編程基因(Stadtfeld 等，Science 322,945-949 (2008)),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重編程質(zhì)粒(Okita 等,Science322、949-953(2008))，使用piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)以及使用Cre-可切除的病毒等(Soldner等，Cell 136,964-977(2009) ;Woltjen 等，Nature 458，766-770 (2009))。此外，在某些細(xì)胞類型中利用內(nèi)源性基因表達(dá)的策略也使得重編程更容易和/或需要的外源基因更少(Aasen 等，Nat Biotechnol 26，1276-1284 (2008) ;Kim 等，Nature 454，646-650 (2008);Shi等，Cell Stem Cell 2，525-528 (2008))。而且，還發(fā)現(xiàn)了能夠增強(qiáng)重編程效率和替代某些重編程因子的小分子(Huangfu 等，Nat Biotechnol 26, 795-797 (2008) ;Huangfu 等，Nat Biotechnol 26，1269-1275 (2008) ;Li 等，Cell Stem Cell 4，16-19 (2009) ;Shi 等，Cell Stem Cell 3，568-574 (2008) ;Shi 等，Cell Stem Cell 2,525-528(2008))。然而，現(xiàn)有的所有這些方法仍然涉及使用遺傳物質(zhì)，其缺陷在于需要向目標(biāo)細(xì)胞中通過外源序列引入未知的、不需要的，或者甚至有害的基因組修飾，而且對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平也沒有足夠的控制。為了解決這些缺點(diǎn)，本領(lǐng)域需要重編程細(xì)胞的方法，其不依賴于或不引入外源遺傳物質(zhì)，如外源基因或DNA片段或包含外源DNA或基因的載體等。發(fā)明概述本披露的一方面涉及包含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入生物樣品就能夠使生物樣品發(fā)生重編程改變。在某些實(shí)施方式中，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域天然地能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入生物樣品中。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)還包含共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合或連接于效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域通過接頭共價(jià)連接于效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)能夠選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入ー種或多種特定生物樣品中，或者在生物樣品周圍特定環(huán)境中變得可轉(zhuǎn)導(dǎo)。本披露的另一方面涉及包含生物樣品和轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的組合物，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入生物材料。本披露的另一方面涉及通過將生物樣品暴露于包含轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的組合物中而重編程生物樣品的方法。本披露的另一方面涉及治療生物體中疾病或狀態(tài)的方法，包括將包含轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的藥物組合物向生物體給藥。本披露的另一方面涉及開發(fā)基于細(xì)胞的療法的方法，所述療法針對(duì)各種疾病或狀態(tài)，所述方法包括用轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)將iPSC、胚胎干細(xì)胞或祖細(xì)胞重編程為可移植體細(xì)胞或可移植祖細(xì)胞的步驟。
本披露的另一方面涉及開發(fā)疾病模型的方法，包括用轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)將iPSC、胚胎干細(xì)胞或祖細(xì)胞重編程為可移植體細(xì)胞或可移植祖細(xì)胞的步驟。本披露的另一方面涉及識(shí)別效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的方法，包括將測(cè)試效應(yīng)結(jié)構(gòu)域共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合于轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以形成測(cè)試轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，將測(cè)試分子暴露于生物樣品以及測(cè)定生物樣品的重編程水平。附圖簡(jiǎn)要說明圖I :轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的鑒定(I)。(A)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)0ct4-llR(SEQ ID NO :12)、Sox2_llR(SEQID NO :13)、Klf4-1 IR(SEQ ID NO :14)以及 cMyc_llR(SEQ ID NO : 15)、接頭SEQ ID NO :55 ;效應(yīng)結(jié)構(gòu)域0ct4(SEQ ID NO :1)、Sox2(SEQ ID NO :2)、Klf4(SEQ ID NO :3)或cMyc(SEQ IDNO 4)的蛋白表達(dá)載體的示意圖。(B)Western印跡分析測(cè)定的四種轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)(0ct4_llR、Sox2-llR、Klf4-llR和cMyc-llR)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定性。圖2:轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的鑒定(II)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)IlR標(biāo)記的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)入0G2-MEF細(xì)胞的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)。0ct4 :0ct4-llR轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEF細(xì)胞(綠色)，Sox2 :Sox2_llR轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEF細(xì)胞(紅色)，Klf4 :Klf4-llR轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEF細(xì)胞(紅色)WlcMyc :cMyc_llR轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEF細(xì)胞(綠色)。DAPI :用DAPI對(duì)細(xì)胞染色以顯示細(xì)胞核(藍(lán)色)，再將圖像合井。圖3 :轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的鑒定(III)。蛋白誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(PiPS)在化學(xué)確定的培養(yǎng)基和無(wú)滋養(yǎng)條件下克隆増殖和自我更新。圖4 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì) 0ct4_llR、Sox2_llR、Klf4_llR 和 cMyc-llR 產(chǎn)生 piPS 細(xì)胞。(A)piPS細(xì)胞產(chǎn)生的時(shí)間線。(B)第30-35天左右初始觀察的0ct4-GFP+piPS細(xì)胞集落。相代表性的相差圖；GFP :熒光圖。(C)0ct4-GFP+piPS細(xì)胞在常規(guī)mESC生長(zhǎng)條件下維持長(zhǎng)期自我更新。(D)長(zhǎng)期擴(kuò)增的PiPS細(xì)胞以緊密且凸起的集落生長(zhǎng)，強(qiáng)烈表達(dá)典型的多能標(biāo)記ALP。(E)免疫熒光檢測(cè)到piPS細(xì)胞表達(dá)其它典型的多能標(biāo)記=SEA-I (紅色)、Sox2 (紅色)、0ct4(紅色)以及Nanog(紅色)。DAPI :DAPI染色以顯示細(xì)胞核(藍(lán)色)，將圖合并。(F)RT-PCR分析piPS細(xì)胞中內(nèi)源性多能基因表達(dá)。(G)用亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序法分析0ct4啟動(dòng)子的甲基化?？招膱A和實(shí)心圓分別表示未甲基化和甲基化的CpG。圖5 piPS細(xì)胞在體外和體內(nèi)的多能性(I)。piPS細(xì)胞在體外有效地分化為三胚層的細(xì)胞Tujl :特征性的TUJI+神經(jīng)元細(xì)胞-外胚層(紅色)；Bryt :Brachyury+中胚層細(xì)胞(紅色)；以及Soxl7 :Soxl7+確定的內(nèi)胚層細(xì)胞。將圖與DAPI (藍(lán)色)染色圖合井。圖6 piPS細(xì)胞在體外和體內(nèi)的多能性(II)。(A) RT-PCR分析piPS細(xì)胞的體外分化。(B)將PiPS細(xì)胞聚集的胚胎轉(zhuǎn)移至假孕小鼠(上圖)后獲得嵌合胚胎(13.5dpc，7只中有2只，左圖)。在嵌合胚胎中分離的生殖嵴組織中，這種PiPS細(xì)胞形成了生殖細(xì)胞(0ct4-GFP 陽(yáng)性)(下圖)。圖7 :轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的蛋白表達(dá)載體的示意圖。His6:SEQ ID NO :59 ;效應(yīng)結(jié)構(gòu)域Ngn3(SEQ ID NO :8)、PDXl(SEQ ID NO 9) ；MafA(SEQ ID NO :10)或 Foxp3(SEQ IDNO :11)；接頭SEQ ID NO :55。圖8 :在小鼠中通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Ngn3-11R(SEQ ID NO :30)、His6_PDXl_llR(SEQID NO 31)和His6-MafA-llR(SEQ ID NO :32)將肝臟和胰腺外分泌細(xì)胞重編程為產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞(I)。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對(duì)照組)。小鼠 _4、小鼠-5 和小鼠-6 用 His6-Ngn3-llR、His6-PDXl-llR 和 His6_MafA_llR 處理(處理組)。A)小鼠-I肝臟的免疫熒光分析(IFA) ；B)小鼠-2肝臟的IFA分析；以及C)小鼠-3肝臟的IFA分析。
圖9 :在小鼠中通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì) His6-Ngn3-11R、His6_PDXl_llR 和 His6_MafA_llR將肝臟和胰腺外分泌細(xì)胞重編程為產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞(II)。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對(duì)照組)。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-llR處理(處理組)。A)小鼠-4肝臟的IFA分析(I) ；B)小鼠_4肝臟的IFA分析⑵；C)小鼠-5肝臟的IFA分析⑴；D)小鼠-5肝臟的IFA分析(2) ；E)小鼠-6肝臟的IFA分析(I) ；F)小鼠-6肝臟的IFA分析(2)。

圖10 :在小鼠中通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì) His6-Ngn3-llR、His6-PDXl-llR 和 His6-MafA-llR將肝臟和胰腺外分泌細(xì)胞重編程為產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞(III)。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對(duì)照組)。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-llR處理(處理組)。A)小鼠-I胰腺的IFA分析；B)小鼠-2胰腺的IFA分析⑴；C)小鼠-2胰腺的IFA分析⑵；以及D)小鼠-3胰腺的IFA分析。圖11 :在小鼠中通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì) His6-Ngn3-llR、His6-PDXl-llR 和 His6-MafA-llR將肝臟和胰腺外分泌細(xì)胞重編程為產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞(IV)。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白(BSA)處理(對(duì)照組)。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-llR處理(處理組)。A)小鼠-4胰腺的IFA分析(I) ；B)小鼠_4胰腺的IFA分析⑵；C)小鼠-5胰腺的IFA分析⑴；D)小鼠-5胰腺的IFA分析
(2)；以及E)小鼠-6胰腺的IFA分析。圖12 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Foxp3_llR(SEQ ID NO :33)將T細(xì)胞重編程為Treg細(xì)胞(IA)。缺少CD14單核細(xì)胞的PBMC中CD4和CD25蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析同型對(duì)照、PBS對(duì)照、樣品緩沖液對(duì)照以及蛋白(BSA 100iig/ml)對(duì)照。圖13 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Foxp3_llR將T細(xì)胞重編程為Treg細(xì)胞(IB)。缺少⑶14單核細(xì)胞的PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，所述PBMC用10 y g/ml>20 u g/ml 或 50 u g/ml Hisl6-Foxp3_llR 處理。圖14 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Foxp3_llR將T細(xì)胞重編程為Treg細(xì)胞(IIA)。PBMC中CD4和CD25蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析同型對(duì)照和PBS對(duì)照。圖15 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Foxp3_llR將T細(xì)胞重編程為Treg細(xì)胞(IIB)。PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析樣品緩沖液對(duì)照以及蛋白(BSA 100 u g/ml)對(duì)照。圖16 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Foxp3_llR將T細(xì)胞重編程為Treg細(xì)胞(IIC)。PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，所述PBMC用10 y g/ml或50 y g/mlHisl6-Foxp3-llR 處理。圖17 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6-Foxp3-llR將T細(xì)胞重編程為Treg細(xì)胞(IID)。PBMC中⑶4和⑶25蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，所述PBMC用100 u g/ml Hisl6-Foxp3_llR處理。圖18 :通過轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)將星型膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)為His-Dlx2-llR(b)、His-Ngn2_llR(c)、His_Dlx2_llR 和 His-Ngn2_llR(d)以及作為對(duì)照的緩沖液(a)。用Tujl抗體(緑色，與神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合)對(duì)染色的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行IFA分祈。圖像與DAPI (藍(lán)色)染色的圖片合井。圖19 :示例性效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的序列。圖20 :示例性轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域-IlR的序列。 圖21 :示例性轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)His6_效應(yīng)結(jié)構(gòu)域-IlR的序列。發(fā)明詳述本披露的一方面涉及包含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，本披露所用的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)是指非DNA或非來源于DNA的物質(zhì)或分子，其能夠穿過或轉(zhuǎn)導(dǎo)或被穿過生物樣品的膜(例如，細(xì)胞膜)，以至于轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)可以從生物樣品的外部進(jìn)入或被帶入生物樣品的內(nèi)部，并發(fā)揮重編程功能。例如，轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)可以與細(xì)胞表面受體相互作用，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用促進(jìn)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)是選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，相比于其它生物樣品，其更容易轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入特定類型的生物樣品(例如，癌或腫瘤細(xì)胞)或在生物樣品中或周圍的特定微環(huán)境(例如，癌或腫瘤周圍的微環(huán)境)中變得可轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)包含將選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)優(yōu)先遞送進(jìn)入特定類型生物樣品的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或在生物樣品周圍微環(huán)境中變得可轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，細(xì)胞靶向性肽或激活的細(xì)胞穿膜肽)。不限定于任何理論，預(yù)期轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)可以穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)對(duì)諸如翻譯、翻譯后修飾、信號(hào)通路、凋亡通路等細(xì)胞質(zhì)中的活動(dòng)進(jìn)行重編程。進(jìn)ー步預(yù)期，轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)可以穿過核膜，對(duì)DNA或染色體復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄以及RNA剪接進(jìn)行重編程或調(diào)節(jié)。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是一旦在生物樣品內(nèi)部就能夠使生物樣品發(fā)生重編程改變的基序或分子。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以與生物樣品中(如在細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞核中)的分子(例如，蛋白、DNA、RNA、糖以及脂質(zhì))相互作用，導(dǎo)致如増殖、分化、去分化、轉(zhuǎn)分化、反分化、轉(zhuǎn)決定、凋亡以及形態(tài)發(fā)生等改變。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以是1)多肽，或其片段或模擬物；2)多核苷酸，它不是一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)或包含進(jìn)生物樣品的基因組就進(jìn)行表達(dá)的基因，也不會(huì)導(dǎo)致遺傳修飾，但是卻能夠與生物樣品中的分子相互作用(例如，核酶、反義分子、siRNA或miRNA、寡核苷酸等等)；以及3)小分子或其它化學(xué)化合物(例如，化學(xué)治療藥物)。在某些實(shí)施方式中，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是天然可轉(zhuǎn)導(dǎo)的，例如roxi (例如SEQ ID NO 9)以及 NeuroD (例如 SEQ ID NO :7)。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的一個(gè)例子是多肽，如轉(zhuǎn)錄因子、染色體重塑蛋白、抗體、或其片段或模擬物。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的另ー個(gè)例子是小分子，它不是聚合物，且能夠與如蛋白、核酸或多糖等生物聚合物結(jié)合，并且改變生物聚合物的活性或功能。小分子的例子包括，但不限干，乙?；种苿?、轉(zhuǎn)錄活化劑、信號(hào)通路活化劑、信號(hào)通路抑制劑以及甲基化抑制劑。
在另ー個(gè)實(shí)施方式中，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以是至少ー種多肽，其將體細(xì)胞重編程為干細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞狀態(tài)由ー種變?yōu)榱愆`種。例如，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以是1)選自下組的多肽Klf4(例如 SEQ ID NO :3)、Sox2(例如 SEQ ID NO :2)、Lin28 (例如 SEQ ID N0:5)、0ct4(例如 SEQ ID NO :1)、cMyc (例如 SEQ ID NO 4)、Nanog (例如 SEQ ID NO 6)以及其任意組合；2)選自下組的多肽Klf4、Sox2、0ct4、cMyc及其任意組合；3)選自下組的多肽Sox2、0ct4、Lin28、Nanog及其任意組合；4)選自下組的多肽:Ngn3(例如SEQ ID NO :8)、PDX1(例如 SEQ ID NO 9)、MafA(例如 SEQ ID NO 10)、NeuroD(例如 SEQ ID NO 7)及其任意組合；5)包含 Foxp3(例如 SEQ ID NO 11)的多肽；6)選自下組的多肽0ct4、Sox2、Klf4、Lin28、Nanog'cMyc'Ngr^JDXl'MafA'NeuroD'FoxpS 及其任意組合；7)多妝 0ct4、Sox2、Klf4 以及cMyc的組合；8)多肽Ngn3、H)Xl以及MafA的組合；9)選自下組的多肽pax6、ASCLl、Brn2、MYT1L、Neurodl、Neurod6> Prdm8> Npas4、Mef2c> D lxl、Tbrl> ISLl、Foxpl、Foxp2、Nhlh2、50叉2、81114、拖81、抱85、し1 2、011§02、呢112(例如5￡0 ID NO :67)、Dlx2 (例如SEQ ID NO:68)、Zicl、NAP1L2、Nrip3> Satb2、Chd5、Smarcal、Brm(Smarca2)、Brgl (Smarca4)及其任意組合(示例性的序列如表I所示)；10)選自下組的多肽NeUrod6、Satb2、ZiCl及其任意組合；以及11)選自下組的多肽Dlx2、Ngn2及其組合。表I效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的示例性序列
權(quán)利要求
1.一種包含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?yàn)槎嚯?、小分子或多核苷酸，并且其中所述多妝選自pax6、ASCLl、Brn2、MYTlL、Neurodl、Neurod6、Prdm8、Npas4、Mef2c、Dlxl> Tbrl> ISL1、Foxpl、Foxp2、Nhlh2、Sox2、Brn4、Hesl、Hes5、Lhx2、01igo2、Ngn2、Dlx2、Zicl> NAP1L2、Nrip3、Satb2、Chd5、Smarcal> Brm> Brgl、其同源序列和其任意組合。
2.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)一步包含蛋白，所述蛋白選自0ct4、Klf4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDXU MafA> NeuroD> Foxp3、其同源序列和其任意組合。
3.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述同源序列指的是與所述蛋白中至少一個(gè)的序列至少70%相同的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述同源序列與所述蛋白中至少一個(gè)具有基本相同的活性。
5.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域共價(jià)、非共價(jià)或通過接頭相連接。
7.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是天然可轉(zhuǎn)導(dǎo)的。
8.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述效應(yīng)結(jié)構(gòu)域選自Ngn2、Dlx2、其同源序列和其任意組合。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述效應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO 67, SEQ ID NO :68、其同源序列和其組合。
10.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞穿膜肽、細(xì)胞滲透肽、激活的細(xì)胞穿膜肽、細(xì)胞靶向性肽以及聚合物。
11.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自TAT、聚精氨酸、穿膜肽、突觸足穿膜肽、VP22、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、MAP、MTS、PEP-1、精氨酸/色氨酸類似物、RRWRRWWRRffffRRW、聚胍類肽、聚胍類肽、天然蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO : 56、SEQ ID NO:57、HIV-I Rev、獸棚病毒衣殼肽、DNA結(jié)合肽、c-Fos、c_Jun、酵母GCN4以及融合HA2肽。
12.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述細(xì)胞靶向性肽是具有選自下列氨基酸序列的多肽NGR、RGD、SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ IDNO 49,SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54 和 SEQID NO 58o
13.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述聚合物選自陽(yáng)離子脂類聚合物和納米粒。
14.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)能夠選擇性地轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入一種或多種特定生物樣品中，或者能夠在所述生物樣品周圍特定環(huán)境中變得可轉(zhuǎn)導(dǎo)。
15.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述接頭具有SEQID 55所示的氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是聚精氨酸。
17.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)包含多肽，所述多肽含有選自SEQ ID NO 69, SEQ ID NO :70、其同源序列和其任意組合多肽的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)基序，所述基序不妨礙所述效應(yīng)結(jié)構(gòu)域或所述轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的功能。
19.如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述基序共價(jià)連接于所述效應(yīng)結(jié)構(gòu)域或所述轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
20.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述基序具有SEQID :59所示的氨基酸序列。
21.如權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)包含多肽，所述多肽含有選自SEQ ID NO 7U SEQ ID NO :72、其同源序列及其組合的氨基酸序列。
22.—種重編程生物樣品的方法，包括將所述生物樣品暴露于至少一種如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)中。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述生物材料來源于生物體的細(xì)胞、組織或器官。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述生物體是微生物、植物或動(dòng)物。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述生物樣品被重編程，以引起增殖、分化、轉(zhuǎn)分化、反分化、轉(zhuǎn)決定、去分化、凋亡或形態(tài)發(fā)生。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞被重編程，從第一種類型的細(xì)胞改變?yōu)榈诙N類型的細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一種類型的細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，所述第二種類型的細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述第一種類型的細(xì)胞是星型膠質(zhì)細(xì)胞，并且所述第二種類型的細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)包含多肽，所述多肽選自pax6-llR、ASCLl-I IR、Brn2_llR、MYT1L-11R、Neurodl-llR、Neurod6_llR、Prdm8_llR、Npas4-llR、Mef2c-llR、Dlxl-llR、Tbrl-llR、ISLl-llR、Foxpl-llR、Foxp2-llR、Nhlh2-llR、Sox2-llR、Brn4-11R、Hesl-llR、Hes5_llR、Lhx2_llR、01igo2_llR、Ngn2_llR、Dlx2_llR、Zicl-llR、NAP1L2-11R、Nrip3_llR、Satb2_llR、Chd5_llR、Smarcal-llR、Brm-IlR 和Brgl-IlRo
30.一種包含權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的藥物組合物。
31.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物進(jìn)一步包含表觀遺傳試劑。
32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述表觀遺傳試劑包括曲古抑菌素A、丙戊酸或氮雜-2’ -脫氧胞苷。
33.一種包含生物樣品和權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的組合物，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入所述生物樣品。
34.一種將權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療生物體的神經(jīng)障礙。
35.如權(quán)利要求34所述的用途，其中所述神經(jīng)障礙選自缺血性和出血性中風(fēng)、脊髓損傷、腦損傷、亨廷頓病、阿爾茨海默癥、帕金森病、精神分裂癥、自閉癥、共濟(jì)失調(diào)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、葛雷克氏癥、萊姆病、腦膜炎、偏頭痛、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、神經(jīng)病變、疼痛、腦損傷、腦功能障礙、脊髓損傷、外圍神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、顱神經(jīng)紊亂、自主神經(jīng)系統(tǒng)疾病、痙攣疾病例如癲癇、運(yùn)動(dòng)障礙疾病例如帕金森病、睡眠障礙、頭痛、下背部和頸部疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、譫妄與失智癥例如阿爾茨海默癥、頭暈和眩暈、木僵和昏迷、顱腦外傷、中風(fēng)、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化癥和其他脫髓鞘疾病、腦部或脊髓感染和朊蛋白類疾病。
36.一種治療生物體的疾病或狀態(tài)的方法，包括從所述生物體中取出生物樣品；將所述生物樣品暴露于如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)；并將所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)過的所述生物樣品移植回所述生物體。
37.一種開發(fā)基于細(xì)胞的療法的方法，所述療法針對(duì)各種疾病或狀態(tài)，所述方法包括 通過將iPSC、胚胎干細(xì)胞或祖細(xì)胞暴露于至少一種如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)中而使所述iPSC、所述胚胎干細(xì)胞或所述祖細(xì)胞重編程為可移植的體細(xì)胞或可移植的祖細(xì)胞； 將所述可移植的體細(xì)胞或祖細(xì)胞移植進(jìn)生物樣品或生物體中；以及 評(píng)估所述可移植的體細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療效果。
38.一種開發(fā)疾病模型的方法,包括 將iPSC、胚胎干細(xì)胞或祖細(xì)胞暴露于至少一種如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)中而使之重編程為可移植的體細(xì)胞或可移植的祖細(xì)胞； 將所述可移植的體細(xì)胞或祖細(xì)胞移植進(jìn)生物樣品或生物體中；開發(fā)具有所述可移植的 體細(xì)胞或祖細(xì)胞的疾病模型。
39.一種開發(fā)藥物篩選或毒性模型的方法,包括 通過暴露于至少一種權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)而使體細(xì)胞、祖細(xì)胞或多潛能細(xì)胞重編程為iPSC ； 通過或不通過暴露于所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)而從iPSC產(chǎn)生衍生細(xì)胞；并且用所述iPSC和/或所述iPSC衍生的細(xì)胞來篩選不同化合物的效果和/或毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及重編程其他細(xì)胞(比如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)成為神經(jīng)細(xì)胞的組合物和方法，所述重編程不引入外源基因。本發(fā)明尤其涉及能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入生物樣品的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)不是基因、也不會(huì)導(dǎo)致遺傳修飾。本發(fā)明還涉及用轉(zhuǎn)導(dǎo)組合物重編程生物樣品的通路或治療疾病的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102753690SQ201180008446
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者包駿, 吳時(shí)麗, 朱勇 申請(qǐng)人:帷幄生物技術(shù)公司