專利名稱：修飾抗體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失的修飾抗體組合物、抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的多余糖鏈減少或缺失且抗體的效應(yīng)活性得到維持的修飾抗體組合物、編碼該修飾抗體分子的DNA、生產(chǎn)該 修飾抗體組合物的細(xì)胞、制造該修飾抗體組合物的方法以及使抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的多余糖鏈減少的方法。
背景技術(shù)：
抗體具有高結(jié)合活性、結(jié)合特異性和血中的高穩(wěn)定性，因此，一直在嘗試應(yīng)用抗體作為人的各種疾病的診斷、預(yù)防和治療劑(非專利文獻(xiàn)I)。另外，已經(jīng)利用基因重組技術(shù)，由非人動(dòng)物抗體制作出人嵌合抗體或人源化抗體(非專利文獻(xiàn)2 5)。人嵌合抗體中，抗體可變區(qū)由人以外的動(dòng)物的抗體構(gòu)成，恒定區(qū)由人抗體構(gòu)成。人源化抗體是指人以外的動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determiningregion,⑶R ;以下記作CTR)被取代成人抗體的⑶R的抗體。人嵌合抗體和人源化抗體解決了非人動(dòng)物抗體的免疫原性高、效應(yīng)功能低、血中半衰期短等小鼠抗體等所具有的問題，從而使單克隆抗體作為藥品的應(yīng)用成為可能(非專利文獻(xiàn)6、)。例如，在美國，多種人源化抗體已被批準(zhǔn)作為癌治療用抗體并正在銷售(非專利文獻(xiàn)10)。上述人嵌合抗體和人源化抗體實(shí)際在臨床上顯示出了某種程度的效果，但需求效果更高的抗體藥物也是事實(shí)。例如，據(jù)報(bào)道單獨(dú)施用作為抗⑶20人嵌合抗體的美羅華(Rituxan，注冊商標(biāo))(非專利文獻(xiàn)11) (IDEC公司/羅氏公司/基因泰克公司)時(shí)，在III期臨床試驗(yàn)中對復(fù)發(fā)性低度惡性非霍奇金淋巴瘤患者的有效率僅為48%(完全緩解6%、部分緩解42%)，另外，平均效果持續(xù)時(shí)間為12個(gè)月(非專利文獻(xiàn)12)。另外，據(jù)報(bào)道將美羅華(注冊商標(biāo))與化學(xué)療法(CHOP :環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿)并用時(shí)，在II期臨床試驗(yàn)中對復(fù)發(fā)性低度惡性和濾泡性非霍奇金淋巴瘤患者的有效率為95% (完全緩解55%、部分緩解45%)，但觀察到由CHOP引起的副作用(非專利文獻(xiàn)13)。據(jù)報(bào)道單獨(dú)施用作為抗HER2人源化抗體的赫賽汀(Here印tin，注冊商標(biāo))(基因泰克公司)時(shí)，在III期臨床試驗(yàn)中對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的有效率僅為15%，平均效果持續(xù)時(shí)間為9. I個(gè)月(非專利文獻(xiàn)14)。人抗體分子也稱為免疫球蛋白(以下稱為Ig)，基于其分子結(jié)構(gòu)而分為IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM 各類?？贵w藥物主要使用的人IgG(以下稱為IgG)型抗體分子由各兩條的稱為重鏈(heavy chain,以下稱為H鏈)和輕鏈(light chain,以下稱為L鏈)的多肽形成。
H鏈從N末端側(cè)起由稱為H鏈可變區(qū)(以下記作VH)、CHl、鉸鏈(Hinge)、CH2和CH3的各結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)形成。CH1、鉸鏈、CH2和CH3也一并稱為重鏈恒定區(qū)(以下記作CH)，CH2和CH3 —并稱為Fe段。L鏈從N末端側(cè)起由稱為L鏈可變區(qū)(以下記作VL)、L鏈恒定區(qū)(以下記作CL)的各結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)形成。IgG型抗體的H鏈存在IgGl、IgG2、IgG3和IgG4四個(gè)亞類。各IgG亞類的H鏈的 除富有可變性的鉸鏈以外的恒定區(qū)彼此具有約95%的氨基酸序列的同源性。盡管各IgG亞類的氨基酸序列的同源性高，但它們所具有的生物活性的強(qiáng)弱卻不同(非專利文獻(xiàn)15)。作為生物活性，可以列舉補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(complement-dependent cytotoxicity, Q)C ;以下簡記為Q)C活性)、抗體依賴性細(xì)胞毒活性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC ;以下簡記為 ADCC 活性)、吞卩遼活性等效應(yīng)功能，上述生物活性在生物體內(nèi)對排除異物和病原體發(fā)揮著重要的作用。在自然殺傷細(xì)胞(以下記作NK細(xì)胞)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等各種白細(xì)胞的表面上表達(dá)Fe y受體(以下記作Fe y R)家族。Fe YR 分為 Fe yRI、Fe y RIIa, Fe y RIIIa, Fe y RIIIb 這一類活性型 Fe YR 和Fe y RIIb這一類抑制型Fe y R0 IgG抗體、對于人而言特別是IgGl和IgG3與上述受體發(fā)生強(qiáng)結(jié)合，結(jié)果，誘導(dǎo)出白細(xì)胞的ADCC活性和吞噬活性。ADCC活性是指與抗原結(jié)合的抗體介由Fe段主要與NK細(xì)胞表面的Fe YRIIIa結(jié)合、結(jié)果因由NK細(xì)胞釋放的穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性分子而引起的細(xì)胞溶解反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)16、17)。ADCC活性一般顯示出IgGl > IgG3 >> IgG4彡IgG2的排序(非專利文獻(xiàn)18、19)。通過晶體結(jié)構(gòu)分析顯示，F(xiàn)e上的Fe Y RIIIa的結(jié)合部位存在于CH2結(jié)構(gòu)域，并且在兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合一分子Fe y RIIIa(非專利文獻(xiàn)20)。CDC活性是指與抗原結(jié)合的抗體使血清中稱為補(bǔ)體系統(tǒng)的一組血清蛋白的級聯(lián)反應(yīng)活化并最終使靶細(xì)胞溶解的反應(yīng)。CDC活性在人IgGl和IgG3中較高，一般顯示出IgG3彡IgGl >> IgG2 N IgG4的排序。補(bǔ)體系統(tǒng)分為Cf C9各成分，其大部分為經(jīng)過部分分解而表現(xiàn)出酶活性的酶前體。⑶C活性最初開始于作為Cl的成分之一的Clq與靶細(xì)胞上的抗體的Fe段的結(jié)合，各成分在前一階段成分的作用下發(fā)生部分分解，由此推進(jìn)活化的級聯(lián)反應(yīng)，最終，C5^C9在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成稱為膜攻擊復(fù)合物的孔形成聚合體，從而引起細(xì)胞的溶解反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)16、17)。通過Fe段的氨基酸取代研究暗示Clq在Fe段上的結(jié)合部位存在于CH2結(jié)構(gòu)域(非專利文獻(xiàn)21)。從臨床上使用的抗體藥物的藥效機(jī)制方面來看，也認(rèn)識到上述效應(yīng)功能的重要性。上述美羅華(注冊商標(biāo))是IgGl亞類的人嵌合抗體，在體外顯示出ADCC活性和CDC活性(非專利文獻(xiàn)22)。另外，就美羅華(注冊商標(biāo))的臨床效果而言，對表現(xiàn)ADCC活性強(qiáng)的Fe Y RIIIa基因型的患者的治療效果高(非專利文獻(xiàn)23)，施用后迅速地從血中消耗補(bǔ)體成分(非專利文獻(xiàn)24)，并且在施用后復(fù)發(fā)的患者的癌細(xì)胞中作為CDC活性抑制因子的CD59表達(dá)增加(非專利文獻(xiàn)25)等，由此暗示美羅華(注冊商標(biāo))實(shí)際上在患者體內(nèi)發(fā)揮了效應(yīng)功能。赫賽汀(注冊商標(biāo))也是IgGl亞類的人源化抗體，據(jù)報(bào)道其對表現(xiàn)ADCC活性強(qiáng)的Fe YRIIIa基因型的患者的治療效果高(非專利文獻(xiàn)26)。另外，人IgG通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞等上表達(dá)的新生兒Fe受體(neonatal Fereceptor for IgG, FcRn ;以下記作FcRn)在內(nèi)體中的低pH條件下進(jìn)行結(jié)合而避免由溶酶體引起分解，結(jié)果，具有長達(dá)7天(IgG3r21天(IgGUIgG 2、IgG 4)的血中半衰期。通過Fe的氨基酸殘基修飾的研究暗示抗體的Fe與FcRn的結(jié)合部位存在于CH2結(jié)構(gòu)域與CH3結(jié)構(gòu)域的界面處(非專利文獻(xiàn)27)?！せ谝陨媳尘翱芍?，人IgGl抗體與其他亞類相比具有更強(qiáng)的ADCC活性和⑶C活性，而且在人血中的半衰期更長等，因此，最適合作為抗體藥物。已知Clq與抗體分子的Fe段結(jié)合。Clq與人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的單體的結(jié)合常數(shù)(Ka)分別為 I. 2X104、0. 64X 104、2. 9X104、0. AAXlO4Ir1 (非專利文獻(xiàn) 28)。如上所述，在Fe段中，CH2結(jié)構(gòu)域特別重要(非專利文獻(xiàn)29)。更詳細(xì)而言，已知在人IgGl中，以EU索引(非專利文獻(xiàn)30)表示，CH2中的Leu235 (非專利文獻(xiàn)31)、Asp270、Lys322、Pro329、Pro331 (非專利文獻(xiàn)32)是重要的；在人 IgG3 中，Glu233、Leu234、Leu235、Gly236 (非專利文獻(xiàn) 33)、Lys322 (非專利文獻(xiàn) 34)等
是重要的。已經(jīng)進(jìn)行了如下嘗試通過向人IgG重鏈恒定區(qū)中導(dǎo)入氨基酸修飾來制作IgG的修飾體，提高與Clq的結(jié)合活性，從而增強(qiáng)CDC活性。Idusogie等人報(bào)道了 將具有人IgGl型恒定區(qū)和小鼠來源的可變區(qū)的抗⑶20嵌合抗體美羅華(注冊商標(biāo))的重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中EU索引第326位的Lys或第333位的Glu取代成其他氨基酸時(shí)，CDC活性最多增強(qiáng)約兩倍(非專利文獻(xiàn)35、專利文獻(xiàn)2)。Idusogie等人還指明通過將人IgG2型抗體的EU索引第326位的Lys或第333位的Glu取代成其他氨基酸，使⑶C活性為IgGl的約幾百分之一的IgG2的⑶C活性升高至IgGl的CDC活性的約1/25 (專利文獻(xiàn)3 5)。另外,Dall’Acqua等人報(bào)道了 通過對人IgGl型抗EphA2抗體的鉸鏈結(jié)構(gòu)域?qū)嵤└鞣N氨基酸修飾，結(jié)果使多個(gè)修飾體的Clq結(jié)合活性和CDC活性高于修飾前的抗體(非專利文獻(xiàn)35)。還已知有與導(dǎo)入氨基酸修飾的方法不同的、利用天然存在的序列的組合來增強(qiáng)⑶C活性的示例。Shitara等人發(fā)現(xiàn)，將人IgGl的整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域以及整個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域或N末端側(cè)的一部分CH3結(jié)構(gòu)域取代成人IgG3的序列時(shí)，Clq結(jié)合活性和CDC活性顯著高于IgGl和IgG3中的任意一種(專利文獻(xiàn)6、非專利文獻(xiàn)36)。附加在蛋白質(zhì)上的糖鏈存在N-糖苷鍵型糖鏈和0-糖苷鍵型糖鏈這兩種類型。在Asn側(cè)鏈的酰胺的N原子上結(jié)合的糖鏈為N-糖苷鍵型糖鏈，在Ser和Thr側(cè)鏈的羥基的0原子上結(jié)合的糖鏈為0-糖苷鍵型糖鏈。N-糖苷鍵型糖鏈有高甘露糖型糖鏈、復(fù)合型(復(fù)雜性糖鏈)糖鏈和混合型糖鏈(雜合型糖鏈)這三種類型。N-糖苷鍵型糖鏈的生物合成過程開始于在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中包含9分子甘露糖(Man)的多萜醇-焦磷酸-寡糖[(Glc) 3 (Man) 9 (GlcNAc) 2]附加到N-糖苷鍵型糖鏈的共有序列Asn-X-Ser/Thr(X為脯氨酸以外的所有氨基酸)的Asn殘基上。然后,被各種酶轉(zhuǎn)變成Man8型、Man7型、Man6型和Man5型的高甘露糖型，進(jìn)而合成代替甘露糖而附加有乙酰葡糖胺、半乳糖、涎酸和巖藻糖等的復(fù)合型糖鏈(非專利文獻(xiàn)37)。但是，已知N-糖苷鍵型糖鏈并非附加到蛋白質(zhì)中所有的Asn-X-Ser/Thr序列上，而且會(huì)由于周圍的氨基酸序列、立體結(jié)構(gòu)而不進(jìn)行附加。特別是已知在Asn-X-Ser/Thr的C末端側(cè)接續(xù)的氨基酸為Pro的情況下,Asn-X-Ser/Thr的Asn殘基上幾乎不會(huì)發(fā)生糖鏈附加(非專利文獻(xiàn)38、39)。已知人IgG的恒定區(qū)中，僅在CH2結(jié)構(gòu)域第297位的Asn上結(jié)合有N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈(非專利文獻(xiàn)40)，其他部位上未探知到N-糖苷鍵型糖鏈的存在。已知僅在小鼠IgG3的恒定區(qū)第471位的Asn上結(jié)合有多余的N-糖苷鍵型糖鏈(非專利文獻(xiàn)41)。
另一方面，在人IgG3型的恒定區(qū)中CH3結(jié)構(gòu)域第392 394位上存在Asn-Thr-Thr序列，但第395位的氨基酸為Pro (非專利文獻(xiàn)42)，因而實(shí)際上在IgG3的第392位的Asn上未探知到糖鏈的附加。已知人IgG的ADCC活性會(huì)隨著附加在第297位的Asn上的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的結(jié)構(gòu)(圖I中示出了典型的復(fù)合型糖鏈?zhǔn)疽鈭D)而發(fā)生變化(專利文獻(xiàn)7)。有報(bào)道稱抗體的ADCC活性依賴于與抗體結(jié)合的糖鏈的半乳糖和乙酰葡糖胺的含量而發(fā)生變化(非專利文獻(xiàn)43 46)，但給ADCC活性帶來最大影響的是還原末端的乙酰葡糖胺上a 1，6連接的巖藻糖(以下有時(shí)也記作核心巖藻糖)。具有無核心巖藻糖的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的IgG抗體與具有結(jié)合有核心巖藻糖的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的IgG抗體相比，顯示出顯著高的ADCC活性(非專利文獻(xiàn)47、48，專利文獻(xiàn)7)。作為生產(chǎn)具有無核心巖藻糖的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的抗體組合物的細(xì)胞，已知有a 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因被敲除的細(xì)胞(專利文獻(xiàn)8、9)。ADCC活性和吞噬活性等依賴于Fe Y R的活性XDC活性以及FcRn結(jié)合活性對抗體藥物的治療效果都很重要。但是，由于引發(fā)CDC活性的初期階段即Clq結(jié)合、引發(fā)ADCC活性的初期階段即與FcyR的結(jié)合、對延長血中半衰期有貢獻(xiàn)的與FcRn的結(jié)合均由抗體的Fe段介導(dǎo)，因此，在Fe上導(dǎo)入有氨基酸修飾的情況下，有可能會(huì)損害上述活性。Idusogie等人報(bào)道了 在⑶C活性增強(qiáng)的IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入有氨基酸突變的點(diǎn)突變體，ADCC活性大大降低(非專利文獻(xiàn)49)。另外，Dall’Acqua等人報(bào)道了以下現(xiàn)象在與FcRn的結(jié)合活性升高的IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入氨基酸突變時(shí)，同時(shí)會(huì)使ADCC活性降低(非專利文獻(xiàn)50)。令人感興趣的是，上述報(bào)道表明雖然Fe中與FcyRIIIa、Clq、FcRn的結(jié)合部位分別位于具有細(xì)微差異的部位，但是，使各自的結(jié)合性發(fā)生變化的氨基酸修飾會(huì)給其他結(jié)合部位帶來預(yù)料不到的影響。IgG重鏈恒定區(qū)第392位的氨基酸位于抗體分子中兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面處(非專利文獻(xiàn)51)。位于該界面處的氨基酸對兩個(gè)重鏈分子的結(jié)合發(fā)揮很大作用(非專利文獻(xiàn)52)，例如在對第392位的氨基酸進(jìn)行修飾的情況下，可能會(huì)給抗體分子的立體結(jié)構(gòu)和各種生物活性帶來預(yù)料不到的影響?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)I :歐洲專利申請公開第0327378號說明書專利文獻(xiàn)2 :美國專利申請公開第2003/0158389號說明書專利文獻(xiàn)3 :國際公開第00/42072號專利文獻(xiàn)4 :美國專利申請公開第2004/0132101號說明書專利文獻(xiàn)5 :美國專利申請公開第2005/0054832號說明書專利文獻(xiàn)6 :國際公開第2007/011041號專利文獻(xiàn)7 :國際公開第00/61739號專利文獻(xiàn)8 :國際公開第02/31140號專利文獻(xiàn)9 :國際公開第03/85107號非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Monoclonal Antibodies !Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. , (1995)非專利文獻(xiàn)2 Nature, 312, 643(1984)非專利文獻(xiàn)3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，6851 (1984)非專利文獻(xiàn)4 Nature, 321, 522 (1986)非專利文獻(xiàn)5 Nature, 332，323 (1988)非專利文獻(xiàn)6 Immunol. Today, 21, 364(2000)非專利文獻(xiàn)I Immunol. Today, 21，403(2000)非專利文獻(xiàn)8 :Ann. Allergy Asthma Immunol. , 81, 105 (1998)非專利文獻(xiàn)9 Nature Biotechnol. , 16, 1015 (1998)非專利文獻(xiàn)10 :Nature Reviews Cancer, I, 119(2001)非專利文獻(xiàn)11 Curr. Opin. Oncol.，10，548(1998)非專利文獻(xiàn)12 J. Clin. Oncol.，16，2825(1998)非專利文獻(xiàn)13 J. Clin. Oncol.，17，268 (1999)非專利文獻(xiàn)14 J. Clin. Oncol.，17，2639 (1999)非專利文獻(xiàn) 15 :Monoclonal Antibodies !Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc. , (1995)非專利文獻(xiàn)16 :Chemical Immunology, 65, 88 (1997)非專利文獻(xiàn)17 Immunol. Today, 20, 576 (1999)非專利文獻(xiàn)18 Nature, 332，323 (1988)非專利文獻(xiàn)19 :Journal ofExperimental Medicine, 166, 1351(1987)非專利文獻(xiàn)20 Nature, 406, 267 (2000)非專利文獻(xiàn)21 J. Immunol.，166，2571 (2001)非專利文獻(xiàn) 22 Oncogene, 22，7359 (2003)非專利文獻(xiàn)23 Blood, 99，754 (2002)非專利文獻(xiàn)24 J. Immunol.，172，3280 (2004)非專利文獻(xiàn)25 J. Clin. Oncol.，21，1466 (2003)非專利文獻(xiàn)26 J. Clin. Oncol.，26，1789 (2008)非專利文獻(xiàn)27 :Nature Reviews Immunology, 7, 715 (2007)
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發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中第297位的Asn上結(jié)合的糖鏈與抗體的活性、血中穩(wěn)定性相關(guān)，但第297位以外的氨基酸殘基上結(jié)合的多余糖鏈可能會(huì)對抗體恒定區(qū)介導(dǎo)的活性產(chǎn)生影響或者可能會(huì)引起作為抗體藥物的均一性的問題。因此，需要對抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的多余糖鏈進(jìn)行調(diào)控的方法。因此，本發(fā)明的課題在于提供在抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失的修飾抗體組合物。用于解決問題的方法鑒于上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過對構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基進(jìn)行選自下述氨基酸修飾中的至少一種氨基酸修飾由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基,能夠使抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的主旨如下。I. 一種修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，對構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基進(jìn)行了選自下述氨基酸修飾中的至少一種氨基酸修飾由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。2.如上述I所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列中的Asn上附加有N-糖苷鍵型糖鏈。3.如上述I或2所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，存在于EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列為EU索引第392 394位。4.如上述f 3中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，EU索引第392 394位的氨基酸殘基中至少一個(gè)氨基酸殘基被修飾成以下的氨基酸殘基，EU 索引第 392 位Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr 或 TrpEU 索引第 393 位ProEU 索引第 394 位Leu、Asn、Asp、Lys> Phe> Tyr 或 Trp05.如上述f 4中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，人IgG抗體的Fe段包含序列號I表示的氨基酸序列。6.如上述I飛中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其包含CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且該CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含人IgGl抗體來源的氨基酸序列。7.如上述1飛中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其包含EU索引第339位的Thr被修飾成Asn或Tyr的氨基酸殘基的Fe段。8.如上述廣7中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其包含EU索引第397位的Met被修飾成選自Gin、Asn、Asp和Phe中的任意一種氨基酸殘基的抗體Fe段。9. 一種DNA，其編碼上述f 8中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段的氨基酸序列。10. 一種載體，其含有上述9所述的DNA。11. 一種轉(zhuǎn)化體，其通過將上述10所述的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到。12. 一種修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段的制造方法，用于制造上述 rs中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，將上述Ii所述的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中生成并蓄積上述廣8中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物或該修飾抗體組合物片段，并從培養(yǎng)液中純化出修飾抗體組合物或該修飾抗體組合物片段。13. 一種使存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn殘基上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈減少的方法，其中，對構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297^299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基進(jìn)行選自下述氨基酸修飾中的至少一種氨基酸修飾由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。14.如上述13所述的方法，其中，存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的Asn殘基上附加有N-糖苷 鍵糖鏈。15.如上述13或14所述的方法，其中，存在于EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列為EU索引第392 394位。16.如上述13 15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，EU索引第392 394位的氨基酸殘基中至少一個(gè)氨基酸殘基被修飾成以下的氨基酸殘基，EU 索引第 392 位Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr 或 Trp
EU 索引第 393 位ProEU 索引第 394 位Leu、Asn、Asp、Lys> Phe> Tyr 或 Trp017.如上述13 16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，人IgG抗體的Fe段包含序列號I表示的氨基酸序列。18.如上述13 17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，人IgG抗體包含CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且該CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含人IgGl抗體來源的氨基酸序列。發(fā)明效果本發(fā)明的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段為抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失的修飾抗體組合物、抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的多余糖鏈減少或缺失且抗體的效應(yīng)活性得到維持的修飾抗體組合物及修飾抗體組合物片段。本發(fā)明的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段中，抗體的Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失，因此，不會(huì)由于第297位以外的氨基酸殘基上結(jié)合的多余糖鏈而給抗體恒定區(qū)介導(dǎo)的活性帶來影響，并且不會(huì)引起作為抗體藥物的均一性的問題等，因而非常有用。


圖I (a)和(b)表示N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈(復(fù)雜型糖鏈)的典型結(jié)構(gòu)。圖2(ar(c)表示作為高CDC活性型IgGl/IgG3結(jié)構(gòu)域交換抗體的113F型抗體的構(gòu)成。圖3是表示GM2-113F的SDS-PAGE圖像的圖。泳道I分析的是分子量標(biāo)記物，泳道2分析的是GM2-113F。分子量標(biāo)記物的分子量示于圖3的左端。圖4是IgGl抗體、IgG3抗體和113F型抗體的H鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的比較。粗體字表示的氨基酸殘基是IgGl抗體與IgG3抗體不同的氨基酸的配置部位。星型符號表示在本研究中進(jìn)行了氨基酸取代的殘基。圖5是表達(dá)載體的制作順序。圖5中載體的一部分用虛線畫出，這表示在PCR后未確認(rèn)H鏈恒定區(qū)以外的堿基序列。圖6 (a)和(b)是 113F 抗體、N392K、T394Y、T394F 和利妥昔單抗(rituximab)在各種濃度下對CD20轉(zhuǎn)染體KCl 156的CDC活性的測定結(jié)果。圖中縱軸表示細(xì)胞毒活性(%)，橫軸表示抗體濃度。實(shí)驗(yàn)在N=3的條件下進(jìn)行。圖7 (a) (e)是 113F 抗體、N392K、T394Y、T394F、N392K/T339Y 和利妥昔單抗在各種濃度下對CD20陽性腫瘤細(xì)胞系Raji、Daudi、ST486、EHEB和MEC-I的CDC活性的測定結(jié)果。圖中縱軸表示細(xì)胞毒活性(%)，橫軸表示抗體濃度。實(shí)驗(yàn)在N=3的條件下進(jìn)行。 圖8是使用流式細(xì)胞儀測定113F抗體、N392K、T394Y和T394F的Clq結(jié)合活性而得到的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中，使用CD20陽性腫瘤細(xì)胞Daudi，使人血清與抗體反應(yīng)后，利用FITC標(biāo)記的抗人Clq抗體來檢測Clq的結(jié)合。圖中縱軸表示平均熒光強(qiáng)度(MFI)，橫軸表示抗體濃度。實(shí)驗(yàn)在N=3的條件下進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段是對構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fe段中由卡巴特(Kabat)等人制定的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基進(jìn)行下述氨基酸修飾中的至少任意一種氨基酸修飾而得到的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。本發(fā)明中，EU索引是指“具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列”第五版(1991)中的EU索弓I。以下所示的氨基酸殘基的位置在沒有特別說明的情況下全部基于EU索引進(jìn)行表示。Asn-X-Ser/Thr序列是指容易在Asn殘基的NH2基團(tuán)上結(jié)合糖鏈的共通序列(以下記作N-糖苷鍵型糖鏈共有序列或簡記為共有序列)。本發(fā)明中，作為存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列，可以列舉第392 394位的Asn。另外，作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，具體而言，可以列舉對抗體的Fe段的EU索引第392 394位的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列進(jìn)行下述氨基酸修飾中的至少任意一種氨基酸修飾而得到的修飾抗體組合物^fAsn修飾成其他氨基酸殘基、將X修飾成Pro以及將Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，更具體而言，可以列舉抗體的Fe段的EU索引第392 394位的氨基酸殘基中至少一種氨基酸殘基被修飾成以下的氨基酸殘基的修飾抗體組合物等。EU 索引第 392 位Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr 或 TrpEU 索引第 393 位ProEU 索引第 394 位Leu、Asn、Asp、Lys> Phe> Tyr 或 Trp作為本發(fā)明的人IgG抗體的Fe段，可以列舉至少Fe段的EU索引第392位 第394位的氨基酸序列具有Asn-Thr-Thr的Fe段，具體而言，可以列舉EU索引第23廣434位為人IgGl的氨基酸序列且第435 447位為人IgG3的氨基酸序列的Fe段，更具體而言，可以列舉具有序列號I的氨基酸序列的Fe段。作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，具體而言，可以列舉包含序列號I表示的氨基酸序列的人IgG抗體的Fe段中EU索引第392位的Asn被修飾成選自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe> Tyr和Trp中的任意一種氨基酸殘基的修飾抗體組合物；EU索引第393位的Thr被修飾成Pro的修飾抗體組合物；以及EU索引第394位的Thr被修飾成選自Leu、Asn、Asp、Lys、Phe> Trp和Tyr中的任意一種氨基酸殘基的修飾抗體組合物等。作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，更具體而言，可以列舉包含序列號I表示的氨基酸序列的人IgG抗體的Fe段中EU索引第392位的Asn被修飾成Lys的修飾抗體組合物、具有序列號3的氨基酸序列的修飾抗體組合物等。 此外，作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，還可以列舉包含序列號I表示的氨基酸序列的人IgG抗體的Fe段中在上述氨基酸修飾的基礎(chǔ)上EU索引第339位的Thr被修飾成Tyr的修飾抗體組合物；在上述氨基酸修飾的基礎(chǔ)上EU索引第397位的Met被修飾成選自Gin、Asn、Asp和Phe中的任意一種氨基酸殘基的修飾抗體組合物。此外，作為本發(fā)明的修飾抗體，還可以列舉具有序列號3表示的氨基酸序列且EU索引第339位的Thr被修飾成Tyr的修飾抗體組合物、以及EU索引第397位的Met被修飾成選自Gin、Asn、Asp和Phe中的任意一種氨基酸殘基的修飾抗體組合物。本發(fā)明中，關(guān)于將構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基中的Asn、X和Ser/Thr中的任意一個(gè)氨基酸殘基修飾成何種氨基酸殘基，可以通過考慮進(jìn)行氨基酸殘基修飾的位置、修飾后的氨基酸殘基來進(jìn)行氨基酸修飾，以使氨基酸修飾的結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生新的N-糖苷鍵型糖鏈共有序列。本發(fā)明的修飾抗體組合物，通過對上述氨基酸殘基進(jìn)行修飾，使存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的Asn殘基上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈減少或缺失，并且與進(jìn)行氨基酸殘基修飾之前的抗體相比具有同等以上的效應(yīng)活性。作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，具體而言，可以列舉-.EU索引第392位的Asn上未結(jié)合糖鏈并且與進(jìn)行氨基酸殘基的修飾之前的抗體相比具有同等以上效應(yīng)活性的修飾抗體組合物。本發(fā)明中，Asn上結(jié)合的糖鏈減少或缺失是指，與進(jìn)行氨基酸殘基修飾之前的修飾抗體組合物相比，進(jìn)行氨基酸殘基修飾之后的修飾抗體組合物實(shí)質(zhì)上未結(jié)合糖鏈。實(shí)質(zhì)上未結(jié)合糖鏈?zhǔn)侵福谑褂孟率鲋姓f明的糖鏈分析方法等對糖鏈進(jìn)行分析的情況下，未檢測到結(jié)合在該氨基酸殘基修飾部位的糖鏈或者該糖鏈在檢測限以下。作為本發(fā)明的修飾抗體，只要具有突變Fe且具有與靶分子結(jié)合的活性的蛋白質(zhì)則均包括在內(nèi)。具體而言，具有突變Fe的單克隆抗體、突變Fe與抗體片段結(jié)合而成的融合蛋白、突變Fe與天然存在的配體或受體結(jié)合而成的Fe融合蛋白(也稱為免疫粘附素)、多個(gè)Fe段融合而成的Fe融合蛋白等也包括在本發(fā)明中。
作為具有與靶分子結(jié)合的活性的抗體片段，可以列舉例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、雙價(jià)抗體(Diabody)、dsFv和包含Q)R的肽等。本發(fā)明的修飾抗體是指具有突變Fe的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，突變Fe是指進(jìn)行了氨基酸修飾以使抗體Fe段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297 299位以外 的N-糖苷鍵型糖鏈共有序列上結(jié)合的糖鏈減少或缺失的Fe段。即，本發(fā)明的突變Fe是指使N-糖苷鍵型糖鏈共有序列減少或缺失以使Fe段的EU索引第297位的Asn上結(jié)合N-糖苷鍵型糖鏈并且不結(jié)合除此以外的多余N-糖苷鍵糖鏈的Fe段。另外，本發(fā)明中，抗體Fe段或簡稱Fe可以是Kabat等人[具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列，第五版(1991)]報(bào)道的、天然存在的免疫球蛋白或其同種異型的Fe氨基酸序列；或者以調(diào)控效應(yīng)活性、提高抗體的穩(wěn)定性和延長血中半衰期等為目的而進(jìn)行了氨基酸修飾的Fe氨基酸序列(國際公開第00/42072號、國際公開第2006/033386號、國際公開第2006/105338、國際公開第2005/070963號、國際公開第2007/011041號、國際公開第2008/145142號)中的任意一種氨基酸序列，只要是具有Fe段與Fe受體的結(jié)合活性的Fe段和/或具有Fe段與Fe受體介導(dǎo)的效應(yīng)活性的Fe段，則可以為任意一種Fe段。S卩，本發(fā)明的修飾抗體組合物是具有抗體Fe上結(jié)合的EU索引第297位以外的多余N-糖苷鍵型糖鏈的結(jié)合減少或缺失的突變Fe且與Fe受體的結(jié)合活性和/或效應(yīng)活性得到調(diào)控的修飾抗體組合物。本發(fā)明中，單克隆抗體是指單一克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞所分泌的抗體，該抗體僅識別一個(gè)表位(也稱為抗原決定簇)，并且構(gòu)成單克隆抗體的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))一致。本發(fā)明的修飾抗體組合物是實(shí)質(zhì)上具有單克隆抗體性質(zhì)的修飾抗體，包括在單克隆抗體中。表位可以列舉單克隆抗體所識別并結(jié)合的單一氨基酸序列、由氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)、結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列以及由結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)等。立體結(jié)構(gòu)是天然存在的蛋白質(zhì)所具有的三維立體結(jié)構(gòu)，是指在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上表達(dá)的蛋白質(zhì)所構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)?？贵w分子也稱為免疫球蛋白(以下記作Ig)，人抗體根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異而分為IgAU IgA2、IgD、IgE、IgGU IgG2、IgG3、IgG4和IgM各同種型。氨基酸序列的同源性較高的 IgGU IgG2、IgG3 和 IgG4 也統(tǒng)稱為 IgG。抗體分子由稱為重鏈(Heavy chain,以下記作H鏈)和輕鏈(Light chain,以下記作L鏈)的多肽構(gòu)成。另外，H鏈從N末端側(cè)起由H鏈可變區(qū)(也記作VH)、H鏈恒定區(qū)(也記作CH)各區(qū)域構(gòu)成，L鏈從N末端側(cè)起由L鏈可變區(qū)(也記作VL)、L鏈恒定區(qū)(也記作CL)各區(qū)域構(gòu)成。每個(gè)亞類的抗體分子的CH均分別已知a、S、e、Y和]i鏈。而且,CH從N末端側(cè)起由CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域各結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域是指構(gòu)成抗體分子的各多肽的功能性結(jié)構(gòu)單元。另外，將CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域合并稱為Fe段或簡稱Fe。CL已知C A鏈和C K鏈。
本發(fā)明中的CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和Fe段可以通過EU索引用自N末端起的氨基酸殘基的編號來確定。具體而言，CHl確定為EU索引第118 215位的氨基酸序列，鉸鏈確定為EU索引第216 230位的氨基酸序列，CH2確定為EU索引第231 340位的氨基酸序列，CH3確定為EU索引第34廣447位的氨基酸序列。作為本發(fā)明的修飾抗體組合物，特別地，也包括人嵌合抗體(以下也簡記為嵌合抗體)、人源化抗體[也稱為互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity Determining Region ;Q)R)移植抗體]和人抗體等。 嵌合抗體是指包含人以外的動(dòng)物(非人動(dòng)物)的抗體的VH和VL與人抗體的CH和CL的抗體。作為非人動(dòng)物，只要是例如小鼠、大鼠、倉鼠和兔等能夠制作雜交瘤的動(dòng)物則均可以使用。雜交瘤是指通過使對非人動(dòng)物進(jìn)行抗原免疫而獲得的B細(xì)胞與來源于小鼠等的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合而得到的、產(chǎn)生具有期望的抗原特異性的單克隆抗體的細(xì)胞。因此，構(gòu)成雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)包含非人動(dòng)物抗體的氨基酸序列。人嵌合抗體可以通過如下方法進(jìn)行制造由生產(chǎn)單克隆抗體的非人動(dòng)物細(xì)胞來源的雜交瘤獲取編碼VH和VL的cDNA，將它們分別插入到具有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中，由此進(jìn)行表達(dá)，從而制造人嵌合抗體。人源化抗體是指將非人動(dòng)物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH和VL的對應(yīng)的CDR中而得到的抗體。將VH和VL的CDR以外的區(qū)域稱為框架區(qū)(以下記作FR)。人源化抗體可以通過如下方法進(jìn)行制造構(gòu)建編碼VH的氨基酸序列的cDNA和編碼VL的氨基酸序列的cDNA，所述VH的氨基酸序列包含非人動(dòng)物抗體的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗體的VH的FR的氨基酸序列，所述VL的氨基酸序列包含非人動(dòng)物抗體的VL的CDR的氨基酸序列和任意的人抗體的VL的FR的氨基酸序列，將上述cDNA分別插入到具有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中，由此進(jìn)行表達(dá)，從而制造人源化抗體。人抗體原本是指人體內(nèi)天然存在的抗體，也包括由利用最近的基因工程、細(xì)胞工程和發(fā)育工程的技術(shù)進(jìn)步制作的人抗體噬菌體文庫和產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得到的抗體等。人體內(nèi)存在的抗體例如可以如下獲得使由人末梢血分離出的淋巴細(xì)胞感染EB病毒等，由此使其永生化，然后進(jìn)行克隆，由此可以培養(yǎng)出產(chǎn)生該抗體的淋巴細(xì)胞，并可以從培養(yǎng)物中純化出該抗體。人抗體噬菌體文庫是通過將由人B細(xì)胞制備的抗體基因插入到噬菌體基因中而使Fab、scFv等抗體片段在表面進(jìn)行表達(dá)而得到的噬菌體的文庫?？梢砸钥贵w片段對固定有抗原的底物的結(jié)合活性為指標(biāo)，從人抗體噬菌體文庫中回收表達(dá)具有期望的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體。該抗體片段還可以進(jìn)一步通過基因工程的方法轉(zhuǎn)變?yōu)榘瑑蓷l完整的H鏈和兩條完整的L鏈的人抗體分子。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指細(xì)胞內(nèi)重組有人抗體基因的動(dòng)物。具體而言，將人抗體基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞中，將該ES細(xì)胞移植到其他小鼠的早期胚胎中，然后，使其發(fā)育，由此，可以制作產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。由產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作人抗體的制作方法中，利用在人以外的哺乳動(dòng)物中實(shí)施的通常的雜交瘤制作方法獲取產(chǎn)生人抗體的雜交瘤并進(jìn)行培養(yǎng)，由此，可以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并蓄積人抗體。作為本發(fā)明的修飾抗體的VH和VL的氨基酸序列，可以是人抗體的VH和VL的氨基酸序列、非人動(dòng)物抗體的VH和VL的氨基酸序列、或者將非人動(dòng)物抗體的CDR移植到人抗體的框架中而得到的人源化抗體的氨基酸序列中的任意一種氨基酸序列。具體而言，可以列舉例如雜交瘤所產(chǎn)生的非人動(dòng)物抗體的VH和VL的氨基酸序列、人源化抗體的VH和VL的氨基酸序列以及人抗體的VH和VL的氨基酸序列等。作為本發(fā)明的修飾抗體中的CL的氨基酸序列，可以是人抗體的氨基酸序列或非人動(dòng)物抗體的氨基酸序列中的任意一種氨基酸序列，優(yōu)選人抗體的氨基酸序列的Ck或CA。作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，只要屬于免疫球蛋白則均可以使用，可以優(yōu)選使用 屬于IgG類的亞類即Y I (IgGl) > Y 2 (IgG2) > y 3 (IgG3)和y 4(IgG4)中的任意一種。另外，作為本發(fā)明的修飾抗體的CH的氨基酸序列，不僅包括天然存在的免疫球蛋白CH序列(包括各亞類的同種異型)，而且還包括天然存在的兩種以上的免疫球蛋白CH序列組合而成的嵌合型CH序列、為調(diào)控抗體的效應(yīng)活性而進(jìn)行了氨基酸殘基修飾的其他CH的氨基酸序列。作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，可以列舉具有突變Fe的CH，所述突變Fe通過對序列號I表示的氨基酸序列的Fe段中EU索引第392位的Asn、第393位的Thr和第394位的Thr進(jìn)行選自下述氨基酸修飾中的至少一種氨基酸修飾而得到將Asn修飾成Ser/Thr以外的其他氨基酸殘基、將Thr修飾成Pro以及將Thr修飾成其他氨基酸殘基。作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，具體而言，可以列舉具有包含序列號I表示的氨基酸序列的Fe段中EU索引第392位的Asn被修飾成選自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr和Trp中的任意一種氨基酸殘基的突變Fe的CH ;具有EU索引第393位的Thr被修飾成Pro的抗體Fe段的CH ；以及具有EU索引第394位的Thr被修飾成選自Leu、Asn、Asp、Lys、Phe、Trp和Tyr中的任意一種氨基酸殘基的突變Fe的CH等。作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，更具體而言，可以列舉具有包含序列號I表示的氨基酸序列的Fe段中EU索引第392位的Asn被修飾成Lys的突變Fe的CH。作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，還包括包含序列號I表示的氨基酸序列的Fe段中在上述氨基酸修飾的基礎(chǔ)上EU索引第339位的Thr被修飾成Tyr的CH ;具有EU索引第397位的Met被修飾成選自Gin、Asn、Asp和Phe中的任意一種氨基酸殘基的突變Fe的CH等。另外，作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，包括作為Fe段以外的CH結(jié)構(gòu)域的CHl以及鉸鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薎gGl的CH。另外，作為本發(fā)明的修飾抗體的CH，具體而言，可以列舉CH1和鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含IgGl抗體來源的氨基酸序列并且對包含序列號I表示的氨基酸序列的Fe段中EU索引第392位的Asn、第393位的Thr和第394位的Thr進(jìn)行了將Asn修飾成Ser/Thr以外的其他氨基酸殘基、將Thr修飾成Pro以及將Thr修飾成其他氨基酸殘基中的至少一種氨基酸修飾的CH ;對序列號2的CH中EU索引第392位的Asn、第393位的Thr和第394位的Thr進(jìn)行了將Asn修飾成Ser/Thr以外的其他氨基酸殘基、將Thr修飾成Pro以及將Thr修飾成其他氨基酸殘基中的至少一種氨基酸修飾的CH ;等。效應(yīng) 活性是指通過抗體的Fe段介導(dǎo)而產(chǎn)生的抗體依賴性的活性，已知有抗體依賴性細(xì)胞毒活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity ;ADCC活性)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(Complement-Dependent cytotoxicity activity ;CDC 活性)、巨曬細(xì)胞或樹狀細(xì)胞等吞曬細(xì)胞的抗體依賴性吞曬作用(Antibody-dependent phagocytosisactivity ；ADP 活性)等。本發(fā)明中，ADCC活性和⑶C活性可以使用公知的測定方法[Cancer ImmunoI.Immunother. , 36, 373 (1993)]進(jìn)行測定。ADCC活性是指與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體通過抗體的Fe段介導(dǎo)而與免疫細(xì)胞的Fe受體結(jié)合、由此使免疫細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞等)活化而殺傷靶細(xì)胞的活性。Fe受體(以下有時(shí)也記作FcR)是與抗體的Fe段結(jié)合的受體，其通過抗體的結(jié)合來誘導(dǎo)各種效應(yīng)活性。FcR 與抗體的亞類對應(yīng)，IgG、IgE、IgA、IgM 分別與 Fcy R、Fe e R、Fe a R、Fe ii R 特
異性結(jié)合。此外，F(xiàn)e￥1 存在卩(^1 1(0)64)、卩(^1 11(0)32)和 Fe Y RIII (CD16)各亞型，并分別存在 Fe y RIA,Fe y RIB,Fe y RIC,Fe y RIIA,Fe y RUB,Fe y RIIC,Fe y RIIIA,Fe y RIIIB各同種型。上述不同的Fe y R存在于不同的細(xì)胞上(Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)。對于人而言，F(xiàn)e Y RIIIB在中性粒細(xì)胞上特異性表達(dá)，F(xiàn)e Y RIIIA在單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和一部分T細(xì)胞上表達(dá)。通過Fe Y RIIIA介導(dǎo)的抗體的結(jié)合誘導(dǎo)NK細(xì)胞依賴性的ADCC活性。CDC活性是指與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體使血液中的包含補(bǔ)體相關(guān)蛋白族的一連串級聯(lián)反應(yīng)(補(bǔ)體活化途徑)活化、從而殺傷靶細(xì)胞的活性。另外，利用由補(bǔ)體活化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段，可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的游走和活化。CDC活性的級聯(lián)反應(yīng)通過下述反應(yīng)而開始具有與抗體的Fe段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的Clq與Fe段結(jié)合，并與兩種絲氨酸蛋白酶Clr和Cls結(jié)合，由此形成Cl復(fù)合物。本發(fā)明的使Fe段上結(jié)合的第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失而得到的修飾抗體具有與第297位以外的Asn殘基上結(jié)合有糖鏈的抗體同等以上的效應(yīng)活性、Clq結(jié)合活性、FcR結(jié)合活性、ADCC活性和/或⑶C活性。另外，本發(fā)明的修飾抗體組合物與氨基酸修飾前的抗體(也稱為親本抗體)相比，具有實(shí)質(zhì)上同等或?qū)嵸|(zhì)上同等以上的Clq結(jié)合活性、FcR結(jié)合活性、ADCC活性和/或CDC活性。與親本抗體相比具有實(shí)質(zhì)上同等以上的Clq結(jié)合活性、FcR結(jié)合活性、ADCC活性和/或CDC活性是指，同時(shí)用相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對本發(fā)明的修飾抗體和親本抗體進(jìn)行分析時(shí)，選自FcR結(jié)合活性、ADCC活性和CDC活性中的任意一種以上的活性與親本抗體的活性相比為同等或同等以上。與進(jìn)行氨基酸修飾之前的親本抗體的活性同等是指，將親本抗體的活性設(shè)為100%時(shí)，修飾抗體的活性優(yōu)選為75%，更優(yōu)選為80%，進(jìn)一步優(yōu)選為85%，更進(jìn)一步優(yōu)選為90%，更進(jìn)一步優(yōu)選為95%，更進(jìn)一步優(yōu)選為96%，更進(jìn)一步優(yōu)選為97%，更進(jìn)一步優(yōu)選為98%，特別優(yōu)選為99%，最優(yōu)選為100%以上。另外，與進(jìn)行氨基酸修飾之前的親本抗體的活性相比為同等 以上是指，修飾抗體的活性優(yōu)選為100%，更優(yōu)選為110%，進(jìn)一步優(yōu)選為120%，更進(jìn)一步優(yōu)選為130%，特別優(yōu)選為140%，最優(yōu)選為150%以上。因此，本發(fā)明的修飾抗體通過進(jìn)行將EU索引第297位以外的Asn-X_Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)共有序列中的Asn修飾成其他氨基酸殘基、將X修飾成Pro以及將Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基中的至少任意一種氨基酸修飾,能夠?qū)π揎椏贵w的Clq結(jié)合活性、FcR結(jié)合活性、ADCC活性和/或CDC活性進(jìn)行調(diào)控，并且能夠使第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的糖鏈減少或缺失。此外，本發(fā)明的修飾抗體組合物使組合物中含有的聚合體(結(jié)合體)量和/或抗體分解物量減少。聚合體是指一分子的抗體分子(單體)通過疏水鍵或氫鍵等鍵以兩個(gè)以上聚合而成的物質(zhì)，可以列舉二聚體、三聚體或幾個(gè)分子聚合而成的寡聚體以及幾個(gè)分子以上聚合而成的聚合體等。此外，有時(shí)也將聚合體表述為凝集體。另外，抗體分解物只要是可以通過酶法、非酶法產(chǎn)生的抗體分子的分解物則均可以是任何一種抗體分解物，可以列舉片段化的抗體、氧化體、脫酰胺體和異構(gòu)體等。因此，本發(fā)明的包含將EU索引第297位以外的Asn-X_Ser/Thr(X為Pro以外的氨基酸殘基)共有序列中的Asn修飾成其他氨基酸殘基、將X修飾成Pro以及將Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基中的至少任意一種氨基酸殘基修飾的修飾抗體組合物在制作/制造抗體時(shí)會(huì)減少聚合體量和/或抗體分解物量，因此，作為抗體藥物有用。作為該修飾抗體組合物，更具體而言，可以列舉對EU索引第392位進(jìn)行了修飾成Lys的氨基酸殘基修飾的修飾抗體組合物。本發(fā)明中，作為抗體片段,可以列舉例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、雙價(jià)抗體、dsFv和包含⑶R的肽等。Fab是將IgG抗體用蛋白分解酶木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到的片段中(在H鏈的第224位的氨基酸殘基處切斷)、N末端側(cè)約一半的H鏈與整個(gè)L鏈通過二硫鍵(S-S鍵)結(jié)合而成的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。F(ab’)2是將IgG用蛋白分解酶胃蛋白酶進(jìn)行處理而得到的片段中(在H鏈的第234位的氨基酸殘基處切斷)、稍稍大于Fab通過鉸鏈區(qū)的S-S鍵結(jié)合而成的片段的分子量約為10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。Fab’是將上述F(ab’ )2的鉸鏈區(qū)的S-S鍵切斷而得到的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。scFv是使用12個(gè)殘基以上的適當(dāng)?shù)碾慕宇^⑵將一條VH與一條VL連接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。雙價(jià)抗體是抗原結(jié)合特異性相同或不同的scFv形成二聚體而得到的抗體片段，是對相同的抗原具有二價(jià)抗原結(jié)合活性或者對不同的抗原具有雙特異性抗原結(jié)合活性的抗體片段。dsFv是指使VH和VL中各一個(gè)氨基酸殘基取代成半胱氨酸殘基的多肽借助該半胱氨酸殘基之間的S-S鍵結(jié)合而得到的抗體片段。包含⑶R的肽包含VH或VL的⑶R中的至少一個(gè)區(qū)域以上而構(gòu)成。包含多個(gè)⑶R的肽可以將CDR之間直接進(jìn)行結(jié)合或者借助適當(dāng)?shù)碾慕宇^而進(jìn)行結(jié)合。包含⑶R的肽可以如下制造構(gòu)建編碼本發(fā)明的修飾抗體的VH和VL的⑶R的DNA,將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此使其進(jìn)行表達(dá)，從而制造包含CDR的肽。另外，包含CDR的肽也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)或tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法來制造。
本發(fā)明的修飾抗體組合物還包括具有任何特異性的抗體，優(yōu)選為識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體、識別與變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)的抗原的抗體、識別與循環(huán)系統(tǒng)疾病相關(guān)的抗原的抗體、識別與自身免疫疾病相關(guān)的抗原的抗體或者識別與病毒或細(xì)菌感染相關(guān)的抗原的抗體，更優(yōu)選為識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體。作為腫瘤相關(guān)抗原，可以列舉例如:CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40 配體(CD40L)、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、腎上腺髓質(zhì)素、血管生成素相關(guān)蛋白4(ARP4)、極光激酶(aurora)、B7-H1、B7-DC、整合素、骨髓基質(zhì)抗原2 (BST2)、CA125、CA19.9、碳酸酐酶9(CA9)、鈣粘蛋白、cc趨化因子受體(CCR)4、CCR7、癌胚抗原(CEA)、富半胱氨酸成纖維細(xì)胞生長因子-I (CFR-I)、c-Met, c-Myc、膠原蛋白、CTA、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、CTLA-4、細(xì)胞角蛋白-18、DF3、鈣粘蛋白E、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvII I、EGFR2 (HER2)、EGFR3 (HER3)、EGFR4(HER4)、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)、內(nèi)皮糖蛋白、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)、肝配蛋白、肝配蛋白受體(Eph)、EphA2、內(nèi)皮素(endotheliase)-2(ET2)、FAM3D、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、Fe受體同系物I (FcRHl)、鐵蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子-8 (FGF-8)、FGF8受體、堿性FGF (bFGF)、bFGF受體、FGF受體(FGFR) 3、FGFR4、FLTI、FLT3、葉酸受體、卷曲蛋白同系物10 (FZD10)、卷曲蛋白受體4(FZD-4)、G250、G-CSF受體、神經(jīng)節(jié)苷脂(例如GD2、GD3、GM2和GM3等)、globo
H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙酰肝素酶I、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、HGF受體、HLA抗原(例如HLA-DR等)、HMl. 24、人乳脂球(HMFG)、hRS7、熱休克蛋白90 (hsp90)、獨(dú)特型表位、胰島素樣生長因子(IGF)、IGF受體(IGFR)、白細(xì)胞介素(例如IL-6、IL-12和IL-15等)、白細(xì)胞介素受體(例如IL-2R、IL-3R、IL-6R、IL-IOI^P IL-15R等)、整合素、免疫受體轉(zhuǎn)位相關(guān)因子-4(IRTA-4)、激肽釋放酶 I、KDR、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1、lamp-2、層粘連蛋白-5、Lewis y、涎酸化Lewis x、淋巴毒素0受體(LTBR)、LUNX、黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、間皮素、MICA、苗勒管抑制物質(zhì)II型受體(MISIIR)、粘蛋白、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)、Necl-5、Notchl、骨橋蛋白、血小板源性生長因子(TOGF)、PDGF受體、血小板因子-4(PF-4)、磷脂酰絲氨酸、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白/肽(PTHrP), NF- k B配體的受體活化因子(RANKL)、透明質(zhì)酸介導(dǎo)的細(xì)胞游走受體(RHAMM)、ROBOI、SART3、信號素4B(SEMA4B)、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(SLPI)、SM5-1、I-磷酸鞘氨醇、腫瘤相關(guān)糖蛋白-72(TAG-72)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、TGF_P、Thy-l、Tie-l、Tie2受體、T細(xì)胞免疫球蛋白域和粘蛋白域l(TM-l)、人組織因子(hTF)、Tn抗原、腫瘤壞死因子(TNF)、湯姆森-弗里登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原(TF抗原)、TNF受體、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TRAIL受體(例如DR4和DR5等)、系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 (ASCT2)、trkC、TROP-2、TWEAK受體Fnl4、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑受體(uPAR)、IV型膠原酶、尿激酶受體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(例如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3等)、波形蛋白和VLA-4等。作為識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體，可以列舉例如抗⑶2抗體[AnticancerRes.，13，331 (1993)]、抗 GD3 抗體[Cancer TmmunoI. Tmmunother. , 36, 260(1993)]>抗 GM2 抗體[Cancer Res.，54，1511 (1994)]、抗 HER2 抗體[Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89，4285(1992);歐洲專利第 882794 號說明書]、抗 CD52 抗體[Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89，4285 (1992)]、抗 CD4 抗體、抗 MAGE 抗體[British J. Cancer, 83，493 (2000)]、抗CCR4抗體(美國專利第6989145號說明書、國際公開第2009/086514號)、抗HMl. 24抗體[Molecular Immunol.，36，387 (1999);國際公開第 2002/057316 號]、抗甲狀旁 腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)抗體[Cancer, 88，2909 (2000)]、抗bFGF抗體、抗FGF-8抗體[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，9911 (1989)]、抗 bFGFR 抗體、抗 FGF-8R 抗體[J. Biol.Chem.，265，16455 (1990)]、抗 IGF 抗體[J. Neurosci. Res.，40，647 (1995)]、抗 IGF-IR 抗體[J. Neurosci. Res.，40，647(1995)]、抗 PSMA 抗體[J. Urology, 160，2396(1998)]、抗 VEGF抗體[Cancer Res.，57，4593 (1997)]、抗 VEGFR 抗體[Oncogene, 19, 2138(2000);國際公開第96/30046號]、抗c-Met抗體(美國專利第7498420號說明書)、抗⑶20抗體[美羅華(注冊商標(biāo))；Curr. Opin. Oncol. , 10, 548(1998);美國專利第5736137號說明書]、抗HER2抗體[赫賽汀(注冊商標(biāo))；美國專利第5725856號說明書]、抗HER3抗體(國際公開第2008/100624號、國際公開第2007/077028號)、抗Bip抗體(國際公開第2008/105560號)、抗CDlO抗體、抗HB-EGF抗體(國際公開第2007/142277號)、抗EGFR抗體[愛必妥(Erbitux,注冊商標(biāo))；國際公開第1996/402010號]、抗Apo_2R抗體(國際公開第98/51793號)、抗ASCT2抗體(國際公開第2010/008075號)、抗5T4抗體(美國專利申請公開第2006/0088522號說明書)、抗CA9抗體(美國專利第7378091號說明書)、抗CEA抗體[Cancer Res. , 55 (23suppl) : 5935s_5945s, (1995)]、抗 LewisY 抗體、抗葉酸受體抗體(國際公開第2005/080431號)、抗TR0P-2抗體(美國專利第6794494號說明書)、抗CD38抗體、抗CD33抗體[麥羅塔(Mylotag,注冊商標(biāo))]、抗CD22抗體(依帕珠單抗)、抗EpCAM抗體、抗A33抗體、抗IL-3Ra抗體(國際公開第2010/126066號)、抗uPAR抗體(美國專利第2008/0152587號說明書)、TRAIL2抗體(國際公開第2002/94880號)等。作為識別與變態(tài)反應(yīng)或炎癥相關(guān)的抗原的抗體，例如為抗白細(xì)胞介素6抗體[Immunol. Rev. , 127, 5(1992)]、抗白細(xì)胞介素6受體抗體[MolecularImmunol.，31，371 (1994)]、抗白細(xì)胞介素 5 抗體[Immunol. Rev.，127，5 (1992)]、抗白細(xì)胞介素5受體抗體、抗白細(xì)胞介素4抗體[Cytokine, 3，562 (1991)]、抗白細(xì)胞介素4受體抗體[J. Immunol. Methods, 217，41 (1998)]、抗白細(xì)胞介素10受體(IL-10R)抗體(國際公開第2009/154995號)、抗腫瘤壞死因子抗體[Hybridoma, 13, 183 (1994)]、抗腫瘤壞死因子受體抗體[Molecular Pharmacol.，58，237 (2000)]、抗 CCR4 抗體[Nature, 400，776，(1999)]、抗CCR5抗體、抗CCR6抗體、抗趨化因子抗體(Peri et al. , J. Immunol.Meth.，174，249-257，1994)或抗趨化因子受體抗體[J. Exp. Med.，186，1373 (1997)]，識別與循環(huán)系統(tǒng)疾病相關(guān)的抗原的抗體可以列舉抗GPIIb/IIIa抗體[J. Immunol. , 152, 2968 (1994)]、抗血小板源性生長因子抗體[Science, 253，1129(1991)]、抗血小板源性生長因子受體抗體[J. BioI. Chem.，272，17400 (1997)]、抗凝血因子抗體[Circulation, 101, 1158 (2000)]、抗 IgE 抗體[索雷爾(Xolair,注冊商標(biāo))]、抗 CD22 抗體(依帕珠單抗)、抗BAFF抗體(貝利木單抗)、抗α V β 3抗體和α 4 β 7抗體等。作為識別與病毒或細(xì)菌感染相關(guān)的抗原的抗體，可以列舉例如抗gpl20抗體[Structure, 8，385 (2000)]、抗甲型流感病毒基質(zhì)蛋白2抗體(M2 ；國際公開第2003/078600號)、抗CD4抗體[J. Rheumatology, 25，2065 (1998)]、抗CCR5抗體和抗志賀樣毒素抗體[J. Clin. Microbiol.，37，396 (1999)]等。此外，本發(fā)明的修飾抗體具有蛋白A結(jié)合活性。具有蛋白A結(jié)合活性是指修飾抗體組合物可以通過使用蛋白A來純化。蛋白A結(jié)合活性可以使用ELISA法、表面等離子體共振法等來測定。具體而言，可以通過如下方法進(jìn)行測定使抗體組合物與固相化在板上的蛋白A反應(yīng)，然后，使進(jìn)行了各種標(biāo)記的識別該抗體的抗體進(jìn)一步反應(yīng)，并對結(jié)合在蛋白A上的抗體組合物進(jìn)行定量。與IgGl抗體同等的蛋白A結(jié)合活性是指，在使用上述測定系統(tǒng)來測定本發(fā)明的修飾抗體組合物和IgGl抗體對蛋白A的結(jié)合活性時(shí)，具有與IgGl抗體實(shí)質(zhì)上同等的結(jié)合活性或親和性的活性。或者，可以通過如下方法進(jìn)行測定使抗體組合物與結(jié)合在瓊脂糖等載體上的蛋 白A在pH為約5 約8的高pH條件下進(jìn)行反應(yīng)，洗滌后，進(jìn)一步對在pH為約2 約5的低PH條件下洗脫的抗體組合物進(jìn)行定量。抗體分子的Fe段中，在第297位的Asn殘基上結(jié)合有N-糖苷鍵型糖鏈，但幾乎不知道在除此以外的Fe段的Asn殘基上結(jié)合有糖鏈。因此，通常每一分子抗體結(jié)合有兩條糖鏈。作為在Fe段的第297位的Asn殘基上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈，可以列舉在核心結(jié)構(gòu)(三甘露糖基核心結(jié)構(gòu))的非還原末端側(cè)具有一條或平行地具有多條半乳糖-N-乙酰葡糖胺(以下記作Gal-GlcNAc)的側(cè)鏈、而且在Gal-GlcNAc的非還原末端側(cè)具有涎酸、平分型N-乙酰葡糖胺等的復(fù)合型糖鏈。本發(fā)明中，核心巖藻糖(core-fucose)或α 1，6_巖藻糖是指N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈還原末端的N-乙酰葡糖胺(以下有時(shí)也記作GlcNAc)的6位與巖藻糖(以下有時(shí)也記作Fuc)的I位進(jìn)行α連接而形成的糖鏈結(jié)構(gòu)。另外，將N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈還原末端的N-乙酰葡糖胺上未結(jié)合巖藻糖的糖鏈簡稱為無巖藻糖的糖鏈或無核心巖藻糖的糖鏈。另外，本發(fā)明中，核心結(jié)構(gòu)或三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)(tri-mannosyl corestructure)是指 Man α 1-6 (Man α 1-3) Man β l~4GlcNAc β l_4GlcNAc 結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈由下述化學(xué)式表示。
權(quán)利要求
1.一種修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，對構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基進(jìn)行了選自下述氨基酸修飾中的至少ー種氨基酸修飾由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求I所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列中的Asn上附加有N-糖苷鍵型糖鏈。
3.如權(quán)利要求I或2所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，存在于EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列為EU索引第392 394位。
4.如權(quán)利要求廣3中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，EU索引第392 394位的氨基酸殘基中至少ー個(gè)氨基酸殘基被修飾成以下的氨基酸殘基， EU 索引第 392 位Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr 或 Trp EU索引第393位=ProEU 索引第 394 位Leu、Asn、Asp、Lys> Phe> Tyr 或 Trp0
5.如權(quán)利要求廣4中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，人IgG抗體的Fe段包含序列號I表示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1飛中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其包含CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且該CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含人IgGl抗體來源的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求1飛中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其包含EU索引第339位的Thr被修飾成Asn或Tyr的氨基酸殘基的Fe段。
8.如權(quán)利要求廣7中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其包含EU索引第397位的Met被修飾成選自Gin、Asn、Asp和Phe中的任意一種氨基酸殘基的抗體Fe段。
9.ー種DNA，其編碼權(quán)利要求廣8中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段的氨基酸序列。
10.ー種載體,其含有權(quán)利要求9所述的DNA。
11.一種轉(zhuǎn)化體，其通過將權(quán)利要求10所述的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到。
12.—種修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段的制造方法，用于制造權(quán)利要求r8中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，將權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中生成并蓄積權(quán)利要求rs中任一項(xiàng)所述的修飾抗體組合物或該修飾抗體組合物片段，并從培養(yǎng)液中純化出修飾抗體組合物或該修飾抗體組合物片段。
13.ー種使存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的Asn殘基上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈減少的方法，其中，對所述Asn-X-Ser/Thr序列的氨基酸殘基進(jìn)行選自下述氨基酸修飾中的至少ー種氨基酸修飾由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，存在于人IgG抗體的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的Asn殘基上附加有N-糖苷鍵糖鏈。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，存在于EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X為Pro以外的氨基酸殘基)序列為EU索引第392 394位。
16.如權(quán)利要求13 15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，EU索引第392 394位的氨基酸殘基中至少ー個(gè)氨基酸殘基被修飾成以下的氨基酸殘基，EU 索引第 392 位Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr 或 Trp EU索引第393位=ProEU 索引第 394 位Leu、Asn、Asp、Lys> Phe> Tyr 或 Trp0
17.如權(quán)利要求13 16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，人IgG抗體的Fe段包含序列號I表示的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求13 17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，人IgG抗體包含CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且該CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含人IgGl抗體來源的氨基酸序列。
全文摘要
抗體的Fc段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中第297位的Asn上結(jié)合的糖鏈與抗體的活性、血中穩(wěn)定性相關(guān)，但第297位以外的多余糖鏈可能會(huì)給抗體恒定區(qū)介導(dǎo)的活性帶來影響、或者可能會(huì)使作為抗體藥物的均一性產(chǎn)生問題。因此，需要一種對抗體的Fc段上結(jié)合的N-糖苷鍵型糖鏈中EU索引第297位以外的Asn殘基上結(jié)合的多余糖鏈進(jìn)行控制的方法。一種修飾抗體組合物及該修飾抗體組合物片段，其中，對構(gòu)成存在于人IgG抗體的Fc段的EU索引第297~299位以外的Asn-X-Ser/Thr(X為Pro以外的氨基酸殘基)序列的氨基酸殘基進(jìn)行了選自下述氨基酸修飾中的至少一種氨基酸修飾由Asn修飾成其他氨基酸殘基、由X修飾成Pro以及由Ser/Thr修飾成其他氨基酸殘基。
文檔編號C12N1/21GK102782131SQ201180012170
公開日2012年11月14日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者丹羽倫平, 土屋摩珠 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社