專利名稱：涉及鑒定參與疼痛的化合物的方法和用途以及診斷痛覺的方法
涉及鑒定參與疼痛的化合物的方法和用途以及診斷痛覺的方法本發(fā)明涉及一種鑒定參與疼痛的化合物的方法、Car3核酸或Car3蛋白用于鑒定參與疼痛的化合物的用途以及涉及Car3核酸或Car3蛋白的診斷痛覺的方法。身體疼痛是一種典型的感覺經(jīng)歷，其可被描述為有害刺激或身體傷害的不愉快的意識。個體通過多種日常傷害和疼痛以及有時通過更嚴重的損傷或疾病來經(jīng)歷疼痛。為了科學和臨床目的，疼痛由國際疼痛研究協(xié)會(IASP)定義為“與實際或潛在的組織損傷有關或者就這樣的損傷描述的不愉快的感覺和情感經(jīng)歷”。任何類型的疼痛在美國都是醫(yī)生會診的最常見原因，每年促使半數(shù)美國人尋找醫(yī)療護理。其在許多醫(yī)學病況中是主要的癥狀，顯著干擾人的生活質(zhì)量和一般機能。診斷是基于以不同的方式表征疼痛，根據(jù)持續(xù)時間、強度、類型(鈍痛、灼痛、跳痛或刺痛)、來源或身體中的位置。通常不需要處理或者響應于簡單措施(例如休息或吃鎮(zhèn)痛藥)疼痛就停止，因此這稱為“急性”疼痛。但其亦可變成難治的并發(fā)展為稱為慢性疼痛的病況，其中疼 痛不再被認為是癥狀而是疾病本身。近年來，疼痛的研究已吸引了許多不同的領域，例如藥理學、神經(jīng)生物學、護理學、牙科學、物理治療和心理學。疼痛是身體防御系統(tǒng)的一部分，引起反射反應以從疼痛刺激中收縮，并幫助調(diào)節(jié)行為以在未來加大避免該特定有害情況。疼痛的醫(yī)學管理在急性疼痛和慢性疼痛之間已引起區(qū)別。急性疼痛是“正常的”疼痛，當弄傷腳趾、骨折、患有牙痛或在大量外科手術后步行時會感受到。慢性疼痛是一種“疼痛病”，日復一日，月復一月，都會感受到，并似乎不可能痊愈。通常，醫(yī)生更舒適地治療急性疼痛，除其他原因外，其通常由軟組織損傷、感染和/或炎癥引起。通常用藥物(一般是鎮(zhèn)痛藥)或用于移除原因和用于控制疼痛感覺的適當技術同時治療。在一些情況下，急性疼痛治療失敗相當?shù)乜梢鹇蕴弁础Ｓ糜谥委熖弁吹囊幌盗兴幬锸且阎?。然而，副作用和抗性是與已知鎮(zhèn)痛藥相關的常見問題。因此，美國成人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)疼痛是人們使用輔助和備選藥物的最常見原因也就不足為奇了。這證明，仍需要用于疼痛治療的新方法和靶標。出乎意料地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Car3參與疼痛。在用于鑒定參與疼痛的基因的篩查測定中，研究了疼痛敏感性不同的三種不同的近交小鼠品系。多種基因的表達與小鼠品系的疼痛敏感性相關。在這些基因中，在疼痛敏感性和表達之間顯示最相關的是Car3 (參見實施例)。因此，Car3是用于鑒定參與疼痛的化合物和用于診斷痛覺的引人關注的靶標。因此，本發(fā)明在第一和第二方面提供一種鑒定參與疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步驟
a)提供包含Car3核酸或者Car3蛋白或其功能活性變體的測試系統(tǒng)，
b)將測試系統(tǒng)與測試化合物接觸，和
c)測定測試化合物對測試系統(tǒng)的作用，
其中，當相對于對照檢測到測試化合物對測試系統(tǒng)的顯著作用時，所述測試化合物被鑒定為參與疼痛的化合物。本發(fā)明的第一方面涉及一種包含Car3核酸的測試系統(tǒng)，第二方面涉及一種包含Car3蛋白或其功能活性變體的測試系統(tǒng)?？墒褂帽景l(fā)明的測試系統(tǒng)以便闡明參與疼痛的機制。特別地，測試系統(tǒng)可用于開發(fā)、鑒定和/或表征參與疼痛的物質(zhì)，其與Car3核酸或蛋白相互作用，特別地激活或滅活Car3核酸或蛋白。鑒定的物質(zhì)可為引人關注的治療藥物，其可用于治療疼痛，尤其是神經(jīng)性疼痛。備選地，Car3可用于診斷痛覺。多種測試設計是本領域已知的，其可適合于本發(fā)明的測試系統(tǒng)。關于例示性測試的進一步詳述在本發(fā)明的方法中提供?？墒褂脺y試系統(tǒng)以便測定測試化合物對測試系統(tǒng)的作用。技術人員將能夠設計適用于特定目的測試方法的測試系統(tǒng)，例如通過加入與通行方法有關的所需要的另外物質(zhì)。除了 Car3核酸或者蛋白或其功能活性變體外，本發(fā)明的測試系統(tǒng)還可包含一種或多種另外的組分。取決于測試設計和檢測方法，測試系統(tǒng)可包含，例如已知的Car3配體、 Car3信號轉(zhuǎn)導的組分、用于檢測的工具等。技術人員將能夠使測試系統(tǒng)適應于研究設計，SP能夠選擇合適的緩沖劑、輔因子、底物、一種或多種不同的抗體、標記物、酶或任何其他必需物質(zhì)。測試系統(tǒng)可呈細胞系統(tǒng)或無細胞系統(tǒng)內(nèi)，視主要條件而定。在本發(fā)明方法的第一步中，提供包含Car3核酸(例如Car3基因或Car3 cDNA或Car3 mRNA或Car3啟動子)或蛋白的測試系統(tǒng)。Car3基因編碼金屬酶Car3。Car3亦被稱為碳酸酐酶III、碳酸脫水酶III或碳酸酐酶III，肌肉特異性或者縮寫為CA-III或CAIII。Car3蛋白(EC 4. 2. I. I)是α -碳酸酐酶家族(存在于哺乳動物中并編碼碳酸酐酶同工酶的多基因家族)的成員。哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的碳酸酐酶根據(jù)其在細胞內(nèi)的位置分為四個主要亞類，其進而由至少15種同工型組成。這些碳酸酐酶是一類催化二氧化碳可逆水合的金屬酶(催化活性H2CO3 = CO2 + H2O)。α-碳酸酐酶家族的酶的輔因子是鋅離子。鋅離子被三個組氨酸殘基(His94、His96和Hisll9)的咪唑環(huán)配位。動物中的酶的主要功能是將二氧化碳和碳酸氫鹽互變以維持血液和其他組織中的酸堿平衡并幫助運輸二氧化碳出組織。碳酸酐酶的反應速率是所有酶中最快之一，且該速率通常受其底物的擴散速率限制。該酶的不同形式的典型催化速率范圍為IO4-IO6反應/秒。在人中，Car3基因的表達是組織特異性的，蛋白在脂肪細胞和骨骼肌中以高水平存在，而在心肌和平滑肌中以低得多的水平存在。蛋白位于細胞質(zhì)中。該基因跨越10. 3 kb并包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。妊娠6周時，轉(zhuǎn)錄物在體節(jié)中以低水平積累但以高水平貫穿脊索積累。隨著妊娠繼續(xù)，Car3在所有發(fā)育的肌肉塊中變得豐富并繼續(xù)以高至中等的水平存在于脊索中。碳酸酐酶同工酶3具有使其區(qū)分于其他同工酶的數(shù)個特征，尤其是它的低特異性二氧化碳水合酶活性，其僅為Car2活性的3%。該酶在男性肝、骨骼肌和脂肪細胞中非常豐富，構成多達5%、8%和25%的這些組織的可溶性部分。Car3表達在前脂肪細胞中是可忽略的，而在分化時變得大量，但依賴分化的Car3表達的機制未被理解。迄今為止，該酶的生理功能是不清楚的，然而，據(jù)推測它可能不僅僅起碳酸酐酶的作用。已表明Car3在脂肪酸代謝中的功能。因此，Car3可促進糖酵解中間體向草酰乙酸鹽和檸檬酸鹽的迅速轉(zhuǎn)化并促進其結(jié)合到脂肪酸中。缺失Car3的敲除小鼠不具有異常的表型特征；脂肪的量及其分布是正常的。使得Car3區(qū)分于其他同工酶的另一特征是其磷酸酶活性。Car3在谷胱甘肽和它的5個半胱氨酸殘基的2個之間形成二硫鍵(稱為S-谷胱甘肽化(glutathiolation)的過程)。Car3的谷胱甘肽化在體內(nèi)發(fā)生并在衰老的過程中和急性氧化應激下增加。因此，谷胱甘肽化起可逆地調(diào)節(jié)Car3的磷酸酶活性的作用。上文提及的2個半胱氨酸殘基中的I個(大鼠中的Cys-186)的谷胱甘肽化是磷酸酶活性所需的，而另一半胱氨酸殘基(大鼠中的Cys-181)的谷胱甘肽化阻斷磷酸酶活性。因此，谷胱甘肽化是可調(diào)節(jié)Car3的可逆共價修飾，其可在細胞反應于氧化應激時起作用。已發(fā)現(xiàn)Car3促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)化和侵襲力。此外，杜興肌營養(yǎng)不良的載體的一部分具有高于正常的Car3水平。人Car3蛋白由260個氨基酸組成，具有29557 Da的分子量(參見UniProtKB/ Swiss-Prot P07451 ；CAH3_HUMAN ；SEQ ID NO: I)。顯示的序列被進一步加工為成熟形式。其在氨基酸94、96和119包含金屬結(jié)合位點。
權利要求
1.一種鑒定參與疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供包含Car3核酸的測試系統(tǒng)， b)將測試系統(tǒng)與測試化合物接觸，和 c)測定測試化合物對測試系統(tǒng)的作用， 其中，當相對于對照檢測到測試化合物對測試系統(tǒng)的顯著作用時，所述測試化合物被鑒定為參與疼痛的化合物。
2.一種鑒定參與疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供包含Car3蛋白或其功能活性變體的測試系統(tǒng)， a)將測試系統(tǒng)與測試化合物接觸，和 b)測定測試化合物對測試系統(tǒng)的作用， 其中，當相對于對照檢測到測試化合物對測試系統(tǒng)的顯著作用時，所述測試化合物被鑒定為參與疼痛的化合物。
3.權利要求I或2中任一項的方法，其中參與疼痛的化合物是天然參與Car3基因和/或Car3蛋白的信號轉(zhuǎn)導途徑的細胞化合物。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中參與疼痛的化合物改變Car3蛋白上游或下游的信號轉(zhuǎn)導。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中參與疼痛的化合物改變Car3基因上游或下游的信號轉(zhuǎn)導，特別地，其中所述化合物改變Car3基因的表達。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中參與疼痛的化合物與天然參與Car3基因和/或Car3蛋白的信號轉(zhuǎn)導途徑的細胞化合物結(jié)合，特別地，其中參與疼痛的化合物與Car3核酸或Car3蛋白結(jié)合,尤其是與Car3蛋白結(jié)合。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中參與疼痛的化合物抑制Car3基因上游或下游的信號轉(zhuǎn)導，特別地，其中所述化合物抑制Car3基因的表達。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中參與疼痛的化合物抑制Car3蛋白上游或下游的信號轉(zhuǎn)導，特別地，其中所述化合物與Car3蛋白結(jié)合。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中測試系統(tǒng)在細胞內(nèi)。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述方法是高通量法。
11.權利要求ι- ο中任一項的方法，其中疼痛是神經(jīng)性疼痛。
12.Car3核酸用于鑒定參與疼痛的化合物的用途。
13.Car3蛋白用于鑒定參與疼痛的化合物的用途。
14.權利要求12或13的用途，其中所述用途進一步定義為權利要求3-8和11中任一項的定義。
15.一種診斷痛覺的方法，其包括以下步驟 a)測定受試者的樣品中的Car3基因的表達水平，和 b)如果受試者的樣品中的Car3基因的表達水平相對于對照是增加的，那么鑒定受試者為疼痛的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定參與疼痛的化合物的方法、Car3核酸或Car3蛋白用于鑒定參與疼痛的化合物的用途以及涉及Car3核酸或Car3蛋白的診斷痛覺的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102803513SQ201180015263
公開日2012年11月28日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權日2010年1月21日
發(fā)明者M.格鮑爾, M.米夏利斯, D.丁格-普費寧多夫, A.M.舒爾特, D.齊梅克, C.梅茨-魏德曼 申請人:賽諾菲