專利名稱：用真菌過氧酶區(qū)域選擇性羥化脂族烴類化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有過氧酶(peroxygenase)活性的多肽用于脂族烴類化合物的位點特異性羥化的用途。背景發(fā)現(xiàn)來自傘菌類擔子菌菌株Agrocybe aegerita (菌株TM-A1)、稱為AaP的過氧酶氧化芳族醇和醛。AaP過氧酶從A.aegerita TM Al通過數(shù)個步驟的離子層析和SDS-PAGE 純化，其分子量和N端14氨基酸序列在2D電泳之后確定，但并未分離編碼的基因(Ullrich等，2004，Appl. Env. Microbiol. 70(8):4575-4581)。WO 2006/034702 公開了使用 Agrocybe aegerita TM Al 的 AaP 過氧酶對未活化的烴如萘、甲苯和環(huán)己烷進行酶羥化的方法。這亦描述于Ullrich和Hofrichter, 2005, FEBSLetters 579:6247-6250。WO 2008/119780 公開了來自 Agrocybe aegerita、灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea)、Laccaria bicolor和幅毛鬼傘(Coprinus radians)的八種不同的過氧酶，在本申請中亦示為SEQ ID NO: 1-8。DE 103 32 065 Al 公開了通過使用 Agrocybe aegerita TM Al 的 AaP 過氧酶從醇通過中間形成醛酶法制備酸的方法。報道了迅速和選擇性分光光度法直接檢測AaP過氧酶芳族羥化的方法(Kluge等，2007，Appl Microbiol Biotechnol 75:1473-1478)。公知將氧官能團直接區(qū)域選擇性導入有機分子(加氧)在化學合成中構成問題。脂族糖的選擇性羥化的催化是特別困難的。其產(chǎn)物可在廣泛種類的不同合成中用作重要的中間物。具體而言，烷的化學強化相對復雜，需要強烈的/毒性化學品/催化劑，并導致一系列不希望的副產(chǎn)物。已知一種胞內(nèi)酶，甲烷單加氧酶(ΜΜ0，EC 14. 13. 25)，使一些烴化合物的末端碳氧合/羥化。所述MMO酶由數(shù)個蛋白質組分組成，并由甲基營養(yǎng)型細菌(例如莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus))形成；其需要復合的電子供體如NADH或NADPH,輔助蛋白(黃素還原酶，調(diào)節(jié)蛋白)和分子氧(O2)。MMO的天然底物是甲烷，其氧化為甲醇。作為特別非特異性的生物催化劑，除甲烷之外，MMO還氧合/羥化一系列其他底物如正烷烴及其衍生物，環(huán)烷烴，芳族化合物，一氧化碳和雜環(huán)化合物。該酶在生物技術中的應用目前尚不可能，因為其像大部分胞內(nèi)酶一樣，難于分離；其具有低穩(wěn)定性；且其所需的共底物相對昂貴
發(fā)明內(nèi)容
在第一個方面，本發(fā)明的發(fā)明人提供了在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類化合物的任一末端的2或3位進行羥化的方法，所述脂族烴類化合物具有至少3個碳并具有在2或3位附接于碳的氫，所述方法包括將所述脂族烴類化合物與過氧化氫和具有過氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO:9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。在一個實施方案中，所述脂族烴類化合物是脂肪酸。在另一個實施方案中，提供了在脂質的酰基的末端的2或3位進行羥化的方法，其包括將所述脂質與過氧化氫和具有過氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。定義過氧酶活性術語“過氧酶活性”在本文中定義為使用過氧化氫羥化萘的能力，亦稱作“非特異性過氧酶”，EC I. 11. 2. I。其為血紅素硫醇鹽蛋白(heme-thiolate protein)。該類型的酶包括由傘菌類擔子菌分泌的糖蛋白。它們催化從H2O2將氧原子插入廣泛種類的底物，包括芳環(huán)如萘、甲苯、菲、花和對硝基苯酹，頑固的(recalcitrant)雜環(huán)化合物如批啶、二苯并呋喃，多種醚(導致O-去烷基化)，和烷如丙烷、己烷和環(huán)己烷。其他可由過氧酶催化的反應包括輕化、環(huán)氧化、N-氧化、硫氧化(sulfooxidation)、0_和N-去燒基化、溴化和單電子氧化。它們對于氯幾乎無或無活性。就本發(fā)明而言，過氧酶活性根據(jù)Kluge等(2007，ApplMicrobiolBiotechnol75:1473-1478)描述的分光光度方法確定。本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8的成熟多肽的過氧酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術語“分離的多肽”用于本文指從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽如通過SDS-PAGE確定，為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，其含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多O. 5%的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99. 5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。
成熟多肽術語“成熟多肽”在本文中定義為具有過氧酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽具有基于N端肽測序數(shù)據(jù)(Ullrich等,2004, Appl. Env. Microbiol. 70 (8) :4575-4581)(其闡明AaP過氧酶的成熟蛋白的開始部分)的SEQ ID NO: I的位置I至330中所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽具有示于SEQ ID NO:2中位置I至328的氨基酸序列。同一性由參數(shù)“同一性”描述的兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000，Trendsin Genetics 16:276-277)的Needle程序，優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本中執(zhí)行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443-453)來確定。使用的任選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extension penalty)0. 5和EBL0SUM62取代矩陣(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle標記為“最高同一性(longestidentity) ” (使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性，并計算如下(相同的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見上文)的Needle程序，優(yōu)選3. 0. O或更高版本中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，見上文)來測定。使用的任選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL取代矩陣(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))修飾術語“修飾”在本文中意指對由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8或其同源序列的成熟多肽組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼此種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可為取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸，以及替代一個或多個(幾個)氨基酸側鏈。
發(fā)明詳述具有過氧酶活性的多肽(過氧酶)本發(fā)明涉及具有過氧酶活性的分離的多肽(其優(yōu)選為重組產(chǎn)生的)的用途，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NOiUSEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 的多肽具有至少 50% 同一性，優(yōu)選至少 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 或 98% 同一性。在一個優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含由一個或多個下述基序表示的氨基酸序列，優(yōu)選包含兩個或更多個，三個或更多個，四個或更多個，五個或六個下述基序基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。在另一個實施方案中，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有取代、缺失和 / 或插入一個或幾個氨基酸的 SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2，SEQID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 的成熟多肽。還在另一個實施方案中，第一個方面的多肽包含SEQ ID NO: 1,SEQ IDN0:2,SEQ IDNO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列或其具有過氧酶活性的片段，或由所述氨基酸序列或片段組成；優(yōu)選所述多肽包含SEQ IDNO: 1，SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID N0:8的成熟多肽或由所述成熟多肽組成。優(yōu)選地,氨基酸改變對性質是較不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性；通常為I至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或結合域(binding domain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivty)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill, 1979,于TheProteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、VGl/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同于基本氨基酸的化學結構。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫腦氨酸、3_ 和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。或者，氨基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells, 1989, Science 244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，過氧酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol. Chem. 271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如de Vos等，1992，Science 255:306-312 ；Smith等，1992，J.Mol· Biol. 224:899-904 ；fflodaver 等，1992, FEBSLett. 309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關。
能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuff Iing)方法，然后是有關的篩選方法，例如由 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988，Science 241:53-57 ；Bowie 和Sauer, 1989, Proc. NGtl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 ；W0 95/17413;或 WO 95/22625 公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991, Biochem. 30:10832-10837 ;美國專利號 5，223，409 ；W0 92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46:145 ；Ner等，1988，DNA 7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結構的多肽。SEQ ID NO: I, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5, SEQ IDNO:6, SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選I。優(yōu)選第一個方面的多肽由包含于大腸桿菌NN049991中的質粒中所含的多核苷酸編碼，所述大腸桿菌NN049991在2008年3月14日根據(jù)布達佩斯條約的條款以登錄號DSM21289保藏于DSMZ ;或者所述多肽由包含于大腸桿菌NN049992中的質粒中所含的多核苷酸編碼，所述大腸桿菌NN049992在2008年3月14日根據(jù)布達佩斯條約的條款以登錄號DSM 21290 保藏于 DSMZ。另一個優(yōu)選實施方案涉及本發(fā)明第一個方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ IDNO: I的氨基酸I至330。還有另一個優(yōu)選實施方案涉及本發(fā)明第一個方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸I至328。
還有另一個優(yōu)選實施方案涉及本發(fā)明第一個方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至344。過氧化氫過氧酶所需的過氧化氫可作為過氧化氫的水溶液,或作為用于原位產(chǎn)生過氧化氫的過氧化氫前體提供。任何在溶解時釋放可由過氧酶使用的過氧化物的固體實體均可用作過氧化氫的來源。當溶解于水或合適的水基介質時產(chǎn)生過氧化氫的化合物包括但不限于金屬過氧化物，過碳酸，過硫酸，過磷酸，過氧酸，烷基過氧化物，?；^氧化物，過氧酯(peroxyesters),尿素過氧化物,過硼酸和過氧羧酸,或它們的鹽。過氧化氫的另一種來源是過氧化氫生成酶系統(tǒng)，如氧化酶和氧還酶的底物。氧化酶和底物的組合的實例包括但不限于氨基酸氧化酶(參見例如US6，248，575)和合適的氨基酸，葡糖氧化酶(參見例如WO 95/29996)和葡萄糖，乳酸氧化酶和乳酸，半乳糖氧化酶(參見例如WO 00/50606)和半乳糖，以及醛糖氧化酶(參見例如WO 99/31990)和合適的醛 糖。通過研究EC I. I. 3.，EC I. 2. 3.，EC I. 4. 3.和 EC I. 5. 3.或類似的類型(根據(jù)International Union of Biochemistry),本領域技術人員可容易地識別此類氧化酶和底物的組合的其他實例?？稍诒景l(fā)明的方法開始時或過程中添加過氧化氫或過氧化氫源，例如作為過氧化氫的一次或多次單獨添加，或連續(xù)地作為補料分批添加。過氧化氫的通常量對應于0. OOlmM至25mM水平，優(yōu)選0. 005mM至5mM的水平，且特別是0. 01至ImM過氧化氫的水平。過氧化氫亦可以對應于0. ImM至25mM的水平，優(yōu)選0. 5mM至15mM的水平，更優(yōu)選ImM至IOmM的水平，且最優(yōu)選2mM至8mM過氧化氫的水平的量使用。表面活性劑本發(fā)明的方法可包括施用表面活性劑(例如作為洗滌劑配制物的一部分或作為濕潤劑)。適合于施用的表面活性劑可以是非離子的(包括半極性的)、陰離子的、陽離子和/或兩性離子的；優(yōu)選所述表面活性劑是陰離子的(如線性烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate)、α -烯經(jīng)橫酸酯(alpha-olefinsulfonate)、燒基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂)或非離子的(如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多聚糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-?；鵑-烴基衍生物(“葡糖酰胺”))，或其混合物。當包括在本發(fā)明方法中時，表面活性劑的濃度通常為按重量計約0. 01%至約10%，優(yōu)選約0. 05%至約5%，和更優(yōu)選約0. 1%至約1%。脂族經(jīng)類化合物(aliphatichydrocarbons)在本發(fā)明方法中羥化的烴是脂族烴類化合物，所述脂族烴類化合物具有至少3個碳的鏈，并具有在2或3位附接于碳的氫。優(yōu)選地，所述脂族烴類化合物是烷或烯；更優(yōu)選地，所述脂族烴類化合物是烷，如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，或其異構體。所述脂族烴類化合物是直鏈或支化的，但非環(huán)化的，因為位點特異性羥化對環(huán)烴類化合物是不可能的。支化的烴類化合物對應于直鏈烴類化合物的異構體。
所述脂族烴類化合物是取代或未取代的。優(yōu)選地，所述脂族烴類化合物是未取代的，如非活化的烴類化合物。當脂族烴類化合物是取代的時(附接有官能團)，優(yōu)選的取代基為鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺酰基、甲?；⒁阴；⒓籽趸?、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲?；桶被酋；?；更優(yōu)選的取代基為氯、羥基、羧基和磺酰基；且最優(yōu)選的取代基為氯和羧基。所述脂族烴類化合物可具有多至10個取代基，多至8個取代基，多至6個取代基，多至4個取代基，多至2個取代即或多至一個取代基的取代。在一個優(yōu)選實施方案中，所述脂族烴類化合物是脂肪酸(取代基是羧基)。脂肪酸的實例包括但不限于丁酸(酪酸)，戊酸(纈草酸)，己酸(羊油酸)，庚酸(葡萄花酸)，辛酸(羊脂酸)，壬酸(天竺葵酸)，癸酸(羊蠟酸)，十二酸(月桂酸)，十四酸(肉豆蘧酸)，
十六酸(棕櫚酸)，十八酸(硬脂酸)，二十酸(花生酸)，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在第二個方面，所述脂族烴類化合物是脂質如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯，磷脂或鞘脂的?；?；且羥化發(fā)生在?；┒说?或3位。所述?；仨毦哂兄辽僖粋€與末端的2或3位的碳附接的氫。所述?；蔀轱柡?或不飽和的，并可任選地附接有官能團(取代基)。?；膶嵗ǖ幌抻诙∷?酪酸)，戊酸(纈草酸)，己酸(羊油酸)，庚酸(葡萄花酸)，辛酸(羊脂酸)，壬酸(天竺葵酸)，癸酸(羊蠟酸)，十二酸(月桂酸)，十四酸(肉豆蘧酸)，十六酸(棕櫚酸)，十八酸(硬脂酸)，二十酸(花生酸)，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的?；问?。方法和用途本發(fā)明提供了使用過氧酶和過氧化氫在脂族烴類化合物的2或3位進行位點特異性羥化的方法。該脂族烴類化合物必須包括至少3個碳的鏈，且脂族烴類化合物的任一(一個或多個)端可用作起始點以確定哪個碳為2或3位。所述脂族烴類化合物必須在2或3位具有至少一個附接于碳的氫(其被羥化)。在一個優(yōu)選實施方案中，在2或3位的碳(用過氧酶羥化)是不飽和的(在進行羥化之前)。相應地，在第一個方面，本發(fā)明提供了在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類化合物任一端(一個或多個端)的2或3位進行羥化的方法，所述脂族烴類化合物具有至少3個碳，并在2或3位具有附接于碳的氫，所述方法包括將所述脂族烴類化合物與過氧化氫和具有過氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQID NO:4，SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
本發(fā)明的方法可用于多種目的，如大量化學合成(生物催化)，增加脂族烴類化合物的水溶性，生物治療，和食品特征的修飾。本發(fā)明的方法亦可用于多種工業(yè)工藝，其中所述羥化反應是有益的。此種用途的一個實例是紙漿和紙產(chǎn)品的制造，其中存在于木質(樹脂)中的烷和其他相關的脂族烴類化合物可導致紙漿和紙制造工藝中的沉積問題。這些疏水化合物是紙漿和紙制造工藝中所謂樹脂沉積物(Pitch deposit)的前體。樹脂沉積導致低品質紙漿，并可導致紙漿廠運轉的停工。涉及具有高提取物含量的紙漿的特定問題包括流動性問題，紙中的污點和孔洞，以及紙張破裂(sheet break)。用過氧酶處理可增加所述化合物的溶解性,并由此減輕問題。還有另一種本發(fā)明的方法的用途是，即用于油或煤精煉，其中過氧酶催化的羥化可用于改變烴類化合物的溶解性、粘性和/或燃燒特征。具體而言，所述處理可導致接受該處理的烴類化合物的煙點、著火點(kindling point)、燃點(fire point)和沸點(boilingpoint)的變化。在大量化學品、農(nóng)業(yè)化學品(包括農(nóng)藥)、特種化學品和藥物的合成中，本發(fā)明的 方法顯然在將羥基基團選擇性導入底物，由此影響修飾的化合物的可溶性方面是重要的。此外，所述選擇性羥化為通過有機化學合成和化學酶合成領域中已知的方法進行進一步修飾提供了位點。將天然氣徹底加工以去除高級烷烴。此類高級烷烴的羥化可用于改善其水溶性，并因此便于通過洗滌天然氣流來去除所述高級烷烴?？稍诰谢蛟诰珶掃^程中進行去除。油廢物的羥化會顯著改善生物可降解性，并可應用于涉及來自精煉廠的廢水處理和污染的地面或水的生物治療的方面。在第二個方面，本發(fā)明提供了在脂質的?；哪┒说?或3位進行羥化的方法，所述方法包括將所述脂質與過氧化氫和具有過氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQID NO:4，SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI :[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。脂肪?；牧u化通常改善脂質的水溶性。相應地，本發(fā)明的方法可用于通過將衣物(laundry)與過氧酶和過氧化氫源和任選的表面活性劑相接觸而從衣物去除或減少含油或脂質的污跡，如巧克力。本發(fā)明的方法可用具有過氧酶活性的固定化的多肽(過氧酶)進行。本發(fā)明的方法可在水性溶劑(反應介質)，多種醇、醚、其他極性或非極性溶劑，或其混合物中進行。通過研究用于本發(fā)明的方法的脂族烴類化合物的特征，本領域技術人員可容易地識別溶劑的合適實例。通過提高或降低羥化進行的壓力，可在反應溫度將溶劑(反應介質)和脂族烴類化合物維持在液相中。
根據(jù)本發(fā)明的方法可在O至90攝氏度,優(yōu)選5至80攝氏度,更優(yōu)選10至70攝氏度，甚至更優(yōu)選15至60攝氏度，最優(yōu)選20至50攝氏度，以及特別是20至40攝氏度的溫
度進行。本發(fā)明的方法可采用10秒至(至少)24小時，優(yōu)選I分鐘至(至少)12小時，更優(yōu)選5分鐘至(至少)6小時，最優(yōu)選5分鐘至(至少)3小時，且特別是5分鐘至(至少)I小時的處理時間。在另一個方面，本發(fā)明的方法可用于通過將衣物與過氧酶和過氧化氫源以及任選的表面活性劑相接觸而從衣物減少不愉快的氣味。本發(fā)明的方法導致衣物中丁酸(酪酸)的量的減少。丁酸在衣物洗滌過程中，當某些動物脂肪和植物油由例如洗滌劑脂肪酶水解以產(chǎn)生游離脂肪酸(包括丁酸)時形成。丁酸具有極端不愉快的氣味。過氧酶將丁酸羥化為2-羥基丁酸(α -羥基丁酸)或3-羥基丁酸(β -羥基丁酸)。除非另行指明，使用的命名法是標準IUPAC命名法。 本發(fā)明進一步通過下述實施例描述，但不應視為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例來自Agrocybe aegerita的具有過氧酶活性的多肽,示為SEQ ID N0:2,在下述實施例中稱作AaeAPO。實施例IιΗ己烷的羥化己烷的酶羥化在含有作為水性酶溶液(10 μ I)添加的2U πιΓ1 (O. 31nmol) AaeAPO的醇底物(正己烷，>97%，Sigma Aldrich)中進行。在I小時期間通過注射泵添加H2O2 (4mM)。實驗以200 μ I規(guī)模(總體積)在用磁力攪拌器攪拌的Iml玻璃小瓶中完成。通過直接注射反應混合物由GC-MS(Varian)分析產(chǎn)物。對照以相同方式處理，只是添加水(IOyl)替代酶溶液。具有活性酶(AaeAPO)和正己烷的樣品的氣相色譜和質譜顯示高量2_己醇和3-己醇的形成；不含酶的對照不含任何這些峰。實施例2ιΗ癸烷的羥化酶轉化(200 μ I總體積中)在補充2UmF1 (O. 31nmol) AaeAPO的純正癸烷(>97%,Sigma Aldrich)中完成。在2小時期間通過注射泵添加H2O2(8mM)并用磁力攪拌器攪拌樣品。產(chǎn)物通過GC-MS測量。對照以相同方式處理，只是添加水(10μ1)替代酶。具有活性酶(AaeAPO)和正癸烷的樣品的氣相色譜和質譜顯示高量的兩種正烷醇，3-癸醇和2-癸醇的形成；不含酶的對照不含任何這些峰。實施例3月桂酸的酶羥化 月桂酸的酶羥化使用4ml的總反應混合物進行，所述反應混合物含有50mM磷酸鉀緩沖液，40v/v%乙腈，ImM月桂酸(>98%純,將Aldrich W261408溶解于乙腈),0. Olmg過氧酶蛋白/ml (如SEQ ID NO:4所示的過氧酶)，并根據(jù)下表添加2mM抗壞血酸。反應通過將對應于O. 5mM濃度的過氧化氫添加于反應混合物中而起始。將反應混合物在35°C使用加熱塊溫育60分鐘。在30分鐘溫育之后添加過氧化氫的二次添加至ImM的總濃度。反應通過在水浴中在85°C進行5分鐘的熱處理停止。通過在100°C在分流模式(split mode)以10:1的比例注射(氦以25ml/分鐘的恒定流速用作載氣)由GC-FID (Varian 3900)測量產(chǎn)物。施加溫度梯度以10°C /分鐘的速率加熱至200°C，然后以500C /分鐘的速率進行至360°C。結果記錄為峰面積(參見表I)。表I
處理月桂酸(面積@3. 2分鐘)產(chǎn)物(面積@4. 3分鐘)
過氧酶+H2O2無峰無峰
月桂酸+H2O2+抗壞血酸1601191
月桂酸+過氧酸+H2O2+抗壞血酸14406395. 5產(chǎn)物峰在過氧酶的存在下出現(xiàn)。產(chǎn)物的洗脫時間相對于12-羥基十二烷酸(其為2-羥基月桂酸和3-羥基月桂酸的異構形式)略有偏移。因此，該洗脫時間符合預期的在2或3位羥化的產(chǎn)物。實施例4棕櫚酸的酶羥化棕櫚酸的酶羥化使用4ml的總反應混合物進行，所述反應混合物含有50mM磷酸鉀緩沖液，40v/v%乙腈，ImM棕櫚酸(>99%純Sigma P0500)和O. Olmg過氧酶蛋白/ml (如SEQID N0:4所示的過氧酶)。反應通過將對應于ImM濃度的過氧化氫添加于反應混合物中而起始。將反應混合物在35°C使用加熱塊溫育1、2、3和10分鐘。反應通過在水浴中在85°C進行5分鐘的熱處理停止。通過在100°C在分流模式(split mode)以10:1的比例注射(氦以25ml/分鐘的恒定流速用作載氣)由GC-FID (Varian 3900)測量產(chǎn)物。施加溫度梯度以10°C /分鐘的速率加熱至200°C，然后以50°C /分鐘的速率進行至360°C。結果記錄為峰面積(參見表2)。表2
溫育時間(分鐘)棕櫚酸(面積)產(chǎn)物(面積)
~O1799.5^il
~ 1481.282 8
2979. I191.3產(chǎn)物峰在I分鐘的溫育之后已經(jīng)出現(xiàn)，并在兩分鐘溫育之后增加。洗脫譜(profile)相對于16-羥基十六烷酸(其為2-羥基棕櫚酸和3-羥基棕櫚酸的異構形式)略有偏移。因此，該洗脫時間符合預期的在2或3位羥化的產(chǎn)物。
權利要求
1.一種在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類化合物的任一末端的2或3位進行羥化的方法，所述脂族烴類化合物具有至少3個碳并具有在2或3位附接于碳的氫，所述方法包括將所述脂族烴類化合物與過氧化氫和具有過氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含 a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和 b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示 基序 I : [FL]XX[YF] S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO:9)； 基序 II G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序 III RXXRI [QE] [DEQ] S [IM] ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)； 基序 V :P[H)K] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)； 基序 VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
2.權利要求I的方法，其中所述羥化的2和3位的碳在與過氧酶相接觸前是未取代的。
3.權利要求1-2任一項的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少55%同一性，優(yōu)選至少60%同一性，更優(yōu)選至少65%同一性,更優(yōu)選至少70%同一性,更優(yōu)選至少75%同一性,更優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，并且特別是至少95%同一性。
4.權利要求1-3任一項的多肽，包含如下或由如下組成SEQID NO: I, SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列，或其具有過氧酶活性的片段。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述脂族烴類化合物的取代基選自下組鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺?；?、甲?；?、乙?；⒓籽趸?、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲酰基和氨磺?；?。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中所述取代基選自下組氯、羥基、羧基和磺?；?，特別是氯和羧基。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中所述脂族烴類化合物是未取代的。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中所述脂族烴類化合物是直鏈的。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述脂族烴類化合物是烷。
10.權利要求9的方法，其中所述烷是丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，或其異構體。
11.權利要求1-4任一項的方法，其中所述脂族烴類化合物是脂肪酸。
12.一種在脂質的?；哪┒说?或3位進行羥化的方法，所述方法包括將所述脂質與過氧化氫和具有過氧酶活性的多肽相接觸，其中所述多肽包含 a)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和 b)氨基酸序列，其由一種或多種下述基序所表示基序 I : [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N(SEQ ID NO :9)； 基序 II G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序 III RXXRI [QE] [DEQ] S[IM]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)； 基序 V :P[H)K] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)； 基序 VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
13.權利要求12的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4, SEQ ID N0:5, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的成熟多肽具有至少55%同一性，優(yōu)選至少60%同一性，更優(yōu)選至少65%同一性，更優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，更優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，并且特別是至少95%同一性。
14.過氧酶用于在脂族烴類化合物任一端的2或3位進行羥化的用途。
15.權利要求14的用途，其中所述脂族烴類化合物是脂肪酸，烷或脂質的?；?。
16.過氧酶用于從衣物減少不愉快的氣味的用途，包括將衣物與過氧酶和過氧化氫源相接觸。
17.過氧酶用于從衣物減少或去除的含油或脂質的污跡的用途，其是通過將衣物與過氧酶和過氧化氫源相接觸而進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在取代或未取代的、直鏈或支化的脂族烴類化合物的2或3位進行羥化的酶方法。
文檔編號C12P7/04GK102822348SQ201180016868
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權日2010年3月28日
發(fā)明者M.霍夫里克特, K.希布納, R.烏爾里克, M.基恩, S.彼得, H.倫德, L.卡魯姆 申請人:諾維信公司