專利名稱：寡聚體特異性淀粉樣蛋白β表位和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及AP寡聚體中的新構(gòu)象表位、相關(guān)抗體組合物和使用方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是常見的癡呆(紊亂的記憶和認(rèn)知)神經(jīng)變性疾病，其與主要由AP (1-40) ,A ^ (1-42)和AP (1-43)肽(也稱為淀粉樣蛋白P或AP)組成的胞外斑塊的腦積累相關(guān)，(1-40)、A3 (1-42)和A3 (1-43)肽均為淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的 蛋白水解產(chǎn)物。此外，主要由異常磷酸化的tau蛋白(神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白)組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)在瀕死神經(jīng)元中細(xì)胞內(nèi)積累。AP (1-42)是AD患者的淀粉樣蛋白斑塊中的優(yōu)勢(shì)種類。家族形式的AD可以由APP基因或者早老蛋白I或2基因中的突變引起，早老蛋白I或2的蛋白產(chǎn)物與APP加工成AP有夫。載脂蛋白E等位變體也影響散發(fā)性和家族形式的AD的發(fā)病年齡。最近，據(jù)發(fā)現(xiàn)其中的肽寡聚化的AP的特定分子種類介導(dǎo)AD和該疾病的小鼠模型中觀察到的神經(jīng)毒性的主要組分(Walsh et al. 2002)。寡聚體毒性可以通過神經(jīng)元胰島素受體的功能異常(Zhao et al. 2008)，以及通過干擾正常突觸功能，特別是在海馬中，通過谷氨酸能受體的異位激活(De Felice et al. 2007;Nimmrich et al. 2008)來顯示。已報(bào)道AP寡聚體與朊病毒蛋白PrPC的正常細(xì)胞同種型之間的納摩爾親和カ結(jié)合相互作用(Lauren et al. 2009)。而且,PrPC 與包括谷氨酸受體亞基(Khosravani et al. 2008)在內(nèi)的各種韋性信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Solforosi et al. 2004;Lefebvre-Roque et al. 2007)之間的相互作用可以導(dǎo)致A ^寡聚體毒性的統(tǒng)ー機(jī)制。清楚認(rèn)識(shí)到AP的免疫識(shí)別可以導(dǎo)致表達(dá)人突變淀粉樣蛋白前體蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的病理學(xué)和行為改善。然而，用“非選擇性”AP免疫療法治療人類有固有的危險(xiǎn)。例如，自身免疫腦膜腦炎發(fā)生在約10%的接受包含非選擇性AP免疫原的阿爾茨海默病疫苗的患者中(Gelinas et al.2004;Robinson et al.2004;Broytman and Malter 2004;Mathewsand Nixon2003) 0雖然所致的腦膜腦炎可能是由于對(duì)A P的細(xì)胞免疫激活導(dǎo)致的，但是還證實(shí)與細(xì)胞免疫應(yīng)答脫離的被動(dòng)注入的AP單克隆抗體(mAb)與腦微出血有關(guān)(Goni andSigurdsson 2005)。用AP非選擇性免疫的另ー風(fēng)險(xiǎn)是暴露在腦神經(jīng)元和循環(huán)單核細(xì)胞表面的親本蛋白APP的免疫識(shí)別(Jung et al. 1996; Jung et al. 1990)。這樣的細(xì)胞表面膜分子的識(shí)別可以引發(fā)裂解或干擾APP蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的功能，這可以包括營(yíng)養(yǎng)活性(Morimoto et al. 1998;Mileusnic et al. 2005;Mileusnic et al.2000)。肽的“非特異性”識(shí)別的另ー問題是，肽僅是毒性A3分子種類A3寡聚體的前體。據(jù)證實(shí)AP寡聚體殺死培養(yǎng)的細(xì)胞系和神經(jīng)元(Lambert et al. 2007;Lacoret al. 2007;Ronicke et al. 2008)，并且在切片培養(yǎng)和活動(dòng)物中阻斷稱為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的促進(jìn)記憶的關(guān)鍵突觸活性(Balducci et al. 2010; Shankar et al. 2008; Selkoe2008; Klyubin et al. 2005; Walsh et al. 2002; Wang et al. 2002)。已鑒定特異性 A 3 寡聚體，其與小鼠中的記憶缺陷的發(fā)病有夫，并且在純化并注入正常年輕大鼠時(shí)其再現(xiàn)小鼠中發(fā)現(xiàn)的消極行為缺陷(Lesne et al. 2006)。相似的研究已證實(shí)，PrPC可以用作A P寡聚體的受體，并且可以將在突觸LTP中斷轉(zhuǎn)導(dǎo)其毒性作用(Lauren et al. 2009)。雖然過去已產(chǎn)生針對(duì)AP肽的AP疫苗和單克隆抗體，但是目前為止尚未證實(shí)在動(dòng)物和/或人中產(chǎn)生期望的療效而不引起嚴(yán)重的副作用。對(duì)開發(fā)生物制品有治療需要，所述生物制品阻滯或減緩疾病的發(fā)展而不誘導(dǎo)對(duì)人體的消極的和潛在致死的效果。鑒于ー般人群壽命的増加以及隨著這種增加，每年診斷患有阿爾茨海默病的患者的數(shù)量的相關(guān)升高，該需要特別明顯。期望鑒定是疾病特異性表位(DSE)的免疫表位并開發(fā)特異性靶向毒性A3寡聚分子種類的免疫療法。還期望開發(fā)靶向毒性A3寡聚分子種類并避免免疫識(shí)別細(xì)胞表面的APP的免疫療法。這類DSE表位會(huì)是特異性中和靶蛋白 毒性的免疫療法和預(yù)防性疫苗的靶標(biāo)。還期望開發(fā)診斷工具以提供有發(fā)展AD的風(fēng)險(xiǎn)的群體的指示，用于區(qū)分AD與其他癡呆綜合征的差異診斷，以及用于監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記對(duì)AD療法的應(yīng)答。因此，期望提供毒性AP寡聚分子種類獨(dú)特的疾病特異性表位。發(fā)明概述本公開的目的是消除或減少用于診斷、治療或預(yù)防阿爾茨海默病的以前的表位、抗體、組合物和方法的至少ー個(gè)缺點(diǎn)。在第一方面，本公開部分基于令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，即AP中的新結(jié)構(gòu)表位，其具有用于選擇性抗體結(jié)合的有利特性。在一實(shí)施方案中，提供了來源于AP的環(huán)肽，所述環(huán)肽具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的抗體易接近的“轉(zhuǎn)向區(qū)(knuckle region)”。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種抗原肽，其包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，所述表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種抗原肽，其包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，所述表位具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: I的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。在一方面,所述抗原肽的表位對(duì)應(yīng)于寡聚AP (1-40)或寡聚ム0 (1-42)的殘基25-29。在另ー實(shí)施方案中，提供了一種分離的抗體，其特異性結(jié)合來源于AP的環(huán)肽，所述環(huán)肽包含構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚A ^的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。在另ー實(shí)施方案中，提供了一種分離的抗體，其特異性結(jié)合來源于AP的環(huán)肽，所述環(huán)肽包含構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位具有對(duì)應(yīng)于SEQID NO: I的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚
的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。在一方面，所述分離的抗體以比結(jié)合AP的非寡聚形式更大的親和カ特異性結(jié)合 的寡聚形式。在另一方面，所述分離的抗體是單克隆的。在另一方面，所述分離的抗體是人源化的。
在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種免疫綴合物，其包含與可檢測(cè)的標(biāo)記綴合的分離的抗體，所述分離的抗體特異性結(jié)合來源于A ^的環(huán)肽，所述環(huán)肽包含構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。在另一方面，提供了編碼所述分離的抗體的核酸。在另ー實(shí)施方案中，提供了一種組合物，其包含治療有效量的分離的抗體和藥學(xué)可接受的佐劑，所述分離的抗體特異性結(jié)合來源于A ^的環(huán)肽，所述環(huán)肽包含構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種抗寡聚疫苗組合物，其包含抗原肽和藥學(xué)可接受的佐劑，所述抗原肽包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，所述表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。 在另一方面，提供了一種治療或預(yù)防需要所述治療的患者中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予藥學(xué)有效量的所述分離的抗體或免疫綴合物。在另一方面，提供了治療或預(yù)防需要所述治療的患者中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予所述疫苗。在另一方面，提供了一種診斷疑似患有阿爾茨海默病的患者中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括以下步驟a)從所述患者分離生物樣品；b)使所述生物樣品與所述分離的抗體在足以允許在所述樣品中形成抗原/抗體復(fù)合物的條件下接觸一段時(shí)間；以及c)檢測(cè)所述樣品中所述抗原/抗體復(fù)合物的存在，其中所述復(fù)合物的存在表示所述患者中阿爾茨海默病的診斷。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種試劑盒，其包含所述分離的抗體以及包含連接至信號(hào)產(chǎn)生化合物的抗原的綴合物。 在另一方面,所述試劑盒包含ー種或多種檢測(cè)試劑。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種制品，其包含所述分離的抗體；包含連接至信號(hào)產(chǎn)生化合物的抗原的綴合物；以及在診斷阿爾茨海默病中使用的說明書。在另一方面，提供了所述抗體或免疫綴合物用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病的用途。在另一方面，提供了所述疫苗用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病的用途。在另ー實(shí)施方案中，提供了能夠結(jié)合環(huán)肽的分離的抗體，所述環(huán)肽來源于AP，并且具有SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的暴露于溶劑的轉(zhuǎn)向區(qū)。在一方面，這類抗體以比結(jié)合AP的非寡聚形式更大的親和カ結(jié)合AP的寡聚形式。在另ー實(shí)施方案中，提供了一種治療患有或疑似患有阿爾茨海默病的患者的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的抗體，所述抗體能夠結(jié)合來源于A3的具有包含序列SNK的氨基酸組成的環(huán)肽。在一方面，所述抗體以比結(jié)合AP的非寡聚形式更大的親和カ結(jié)合AP的寡聚形式。在另ー實(shí)施方案中，提供了ー種預(yù)防個(gè)體中AD的發(fā)展或進(jìn)展的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的抗原肽，所述抗原肽包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，所述環(huán)狀構(gòu)型具有SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚AP的轉(zhuǎn)向區(qū)。在給藥時(shí)，所述抗原肽產(chǎn)生針對(duì)寡聚AP的免疫應(yīng)答。產(chǎn)生的抗體能夠特異性結(jié)合寡聚AP。在某些實(shí)施方案中，所述抗體以比結(jié)合AP的非寡聚形式更大的親和カ結(jié)合AP的寡聚形式。當(dāng)回顧以下具體實(shí)施方案的描述連同附圖時(shí)，本公開的其他方面和特征對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)變得顯而易見。


現(xiàn)在僅通過實(shí)例的方式參考附圖描述本公開的實(shí)施方案。圖I通過圖表說明動(dòng)態(tài)光散射的結(jié)果，其顯示單體AP的動(dòng)態(tài)特性；圖2通過圖表說明動(dòng)態(tài)光散射的結(jié)果，其顯示寡聚AP的動(dòng)態(tài)特性；圖3通過圖表說明動(dòng)態(tài)光散射的結(jié)果，顯示寡聚AP的動(dòng)態(tài)特性；圖4是包含SNK表位的ニ硫化物環(huán)化肽的三維模型；圖5通過圖表說明篩選結(jié)合于包含SNK的構(gòu)象肽的抗SNK單克隆抗體的代表性分析周期的Biacore TM結(jié)果。圖6通過圖表說明Biacore 傳感圖疊加的結(jié)果，其顯示BSA綴合的包含SNK表位的線性或環(huán)狀肽與線性(3F5，3G2)、環(huán)狀(5E3，5D8)和中間體特異性(4D11，4D12)單克隆抗體的結(jié)合，以及這些抗體與合成的AP 1-42寡聚體的反應(yīng)性；圖7通過圖表說明Biacore 傳感圖疊加的結(jié)果，其顯示BSA綴合的包含SNK表位的線性或環(huán)狀肽與線性(3F5，3G2)、環(huán)狀(5E3，5D8)和中間體特異性(4D11，4D12)單克隆抗體的結(jié)合，以及這些抗體與合成的AP 1-42寡聚體的反應(yīng)性；圖8通過圖表說明Biacore 分析的結(jié)果，其顯示合成的AP 1_42寡聚體與不同濃度的環(huán)狀單克隆抗體5E3的結(jié)合；圖9為流式細(xì)胞術(shù)示蹤(flow cytometry trace),其顯示將標(biāo)記的6E10抗體和陰性對(duì)照結(jié)合至位于細(xì)胞表面的APP的細(xì)胞的比較；圖10為流式細(xì)胞術(shù)示蹤，其顯示將標(biāo)記的5E3抗體和陰性對(duì)照結(jié)合于位于細(xì)胞表面的APP的細(xì)胞的比較；圖11通過圖表說明神經(jīng)元毒性分析的結(jié)果，其顯示在不同濃度的5E3抗體的存在和不存在下與模擬對(duì)照、可溶性単體和寡聚AP 1-40溫育的細(xì)胞的細(xì)胞存活程度；圖12說明免疫印跡的結(jié)果,其顯示在TBS中勻衆(zhòng)、在Tris-Tricine凝膠中分級(jí)并且用pan-AP 6E10抗體免疫印跡的腦組織；圖13說明免疫印跡的結(jié)果,其顯示在TBS中勻衆(zhòng)、在Tris-Tricine凝膠中分級(jí)并且用5E3抗體免疫印跡的腦組織；圖14示出在抗體5E3的存在(“5E3”)或不存在(“C”)下測(cè)試AP聚合的靜態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；以及圖15說明抗體5E3的重鏈和輕鏈的核苷酸序列即5’和3’讀取。發(fā)明詳述一般來說，本公開提供了新的來源于AP的約束的肽表位以及相關(guān)抗體組合物，從本文中稱為“新表位”或“新構(gòu)象表位”。能夠結(jié)合所述新構(gòu)象表位的抗體在阿爾茨海默病的治療中可用作診斷劑和治療劑。所述新的來源的約束的肽表位可用于疫苗以預(yù)防AD和相關(guān)癡呆。能夠結(jié)合所述新構(gòu)象表位的抗體還可用于阿爾茨海默病相關(guān)癡呆的診斷、治療和預(yù)防。
在本文中未直接定義的任何術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域?qū)λ鼈兊睦斫馔ǔＯ嚓P(guān)的意思。如本文所用，術(shù)語“分離的抗體”在本文中用來指能夠結(jié)合所述新構(gòu)象表位的抗體，其基本上是純的，并且不含包括具有不同抗原特異性的其他抗體和抗體片段的外來細(xì)胞物質(zhì)。然而，特異性結(jié)合所述新構(gòu)象表位的分離的抗體可以具有對(duì)其他抗原的交叉反應(yīng)性。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地理解，對(duì)任何給定抗體可能必須優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以最大化特異性結(jié)合。術(shù)語抗體意圖包括其片段，所述片段也與本發(fā)明的新構(gòu)象表位特異性反應(yīng)?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)將抗體片段化，并且以如上文所述的相同方式篩選片段的功用。例如，可以通過用胃蛋白酶處理抗體來產(chǎn)生片段。可以將所得的片段進(jìn)一步處理以還原ニ硫鍵。如本文所用，術(shù)語“個(gè)體”指動(dòng)物，例如鳥或哺乳動(dòng)物。具體動(dòng)物包括大鼠、小鼠、狗、貓、牛、羊、馬、豬或靈長(zhǎng)類。個(gè)體還可以為人，或者稱為患者。個(gè)體還可以為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。個(gè)體還可以為嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠。如本文所用，術(shù)語“表位”指分子內(nèi)的區(qū)域，其可以被特異性抗體識(shí)別，或者其誘導(dǎo) 特異性抗體的形成。如本文所用，術(shù)語“構(gòu)象表位”指其中氨基酸序列具有特定的三維結(jié)果的表位。特異性結(jié)合構(gòu)象特異性表位的抗體識(shí)別所述構(gòu)象特異性表位的氨基酸的空間排列。如本文所用，術(shù)語“AP ”可以可選地稱為“淀粉樣蛋白P (amyloid beta) ”、“淀粉樣蛋白P (amyloid P)”或“ AP”。淀粉樣蛋白P是39_43個(gè)氨基酸的肽,看來其為阿爾茨海默病患者腦中的淀粉樣蛋白斑塊的主要成分。如本申請(qǐng)中其他地方所述,據(jù)證實(shí)A3寡聚化是阿爾茨海默病中的神經(jīng)毒性的關(guān)鍵部分。如本文所用，術(shù)語“更大的親和力”在本文中指抗體結(jié)合的程度，其中與結(jié)合靶標(biāo)Z相比，抗體X更強(qiáng)地結(jié)合靶標(biāo)Y并具有更小的解離常數(shù)，并且在這種上下文中，抗體X對(duì)靶標(biāo)Y比對(duì)Z具有更大的親和力。同樣，術(shù)語“較小的親和力”在本文中指抗體結(jié)合的程度，其中與結(jié)合靶標(biāo)Z相比，抗體X較弱地結(jié)合靶標(biāo)Y并具有較大的解離常數(shù)，并且在這種上下文中，抗體X對(duì)靶標(biāo)Y比對(duì)Z具有更小的親和カ。如本文所用，術(shù)語“AP單體”在本文中指分離的線性形式的AP (X-Y)肽，優(yōu)選基本上不參與與其他AP肽的非共價(jià)相互作用的AP (X-Y)肽形式。如本文所用，術(shù)語“AP寡聚體”在本文中指AP肽的分離形式，其中前體AP單體在少于約50個(gè)單體的有序三維機(jī)構(gòu)中非共價(jià)聚集。如本文所用，術(shù)語“A0原纖維”在本文中指分子結(jié)構(gòu)，其包含在電子顯微鏡下顯示纖維結(jié)構(gòu)的非共價(jià)關(guān)聯(lián)的個(gè)別AP (X-Y)肽的裝配。所述纖維結(jié)構(gòu)通常為“交叉P ”結(jié)構(gòu)；多聚體的大小沒有理論上限，并且原纖維可以包含數(shù)千個(gè)單體。如本文所用，術(shù)語“抗原”在本文中指包含一個(gè)或多個(gè)表位的分子，例如蛋白、多肽或其片段，所述表位會(huì)刺激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答。該術(shù)語與術(shù)語“免疫原”可交換使用。諸如抗獨(dú)特型抗體的抗體或其片段以及可以模擬抗原或抗原決定簇的合成肽模擬表位也在如本文所用的抗原的定義下。相似地，例如在DNA免疫應(yīng)用中在體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸也包括在本文的抗原的定義中。用來描述本發(fā)明的肽的命名遵循常規(guī)做法，其中氨基在每個(gè)氨基酸殘基的左邊，而羧基在每個(gè)氨基酸殘基的右邊。在代表本發(fā)明所選的具體實(shí)施方案的序列中，雖然未具體顯示，除非另有說明，氨基端和羧基端基團(tuán)應(yīng)當(dāng)理解為在生理pH值下設(shè)想的形式。在描述中，為了解釋的目的，示出許多細(xì)節(jié)以提供實(shí)施方案的全面理解。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些具體細(xì)節(jié)不是必需的。由于晶體學(xué)和NMR在溶液和固態(tài)范式中的局限性，原子水平的AP寡聚體結(jié)構(gòu)尚未在原子水平最終解決。生物化學(xué)、生物物理學(xué)和免疫化學(xué)數(shù)據(jù)顯示原纖維/寡聚體模型,其中AP寡聚體包裝在寬_的P發(fā)夾立體拉鏈結(jié)構(gòu)中(Luhrs et al. 2005; Sawaya etal. 2007; Rauk 2009)。天然存在的單體A P肽在聚集時(shí)經(jīng)歷構(gòu)象變化，包括折疊和形成發(fā)夾立體拉鏈寡聚AP結(jié)構(gòu)結(jié)果。AP (1-42)具有較大的￠-折疊聚集的傾向。寡聚A爲(wèi)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)是未知的；然而，已利用分子動(dòng)力學(xué)模擬、原子力顯微鏡和酰胺氫交換測(cè)量的組合表征了 AP寡聚體的結(jié)構(gòu)。已利用上述方法分析了 AP (1-42)和AP (1-40)寡聚體的結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知AP寡聚體的P鏈的方向，包括殘基D23和K28之間的分子間鹽橋。在這種構(gòu)型中，K28殘基基本上朝向內(nèi)部以形成D23和K28之間的這種鹽橋并穩(wěn)定發(fā)卡轉(zhuǎn)角(Lurs et al. 2005)and Rauk 2008)。
進(jìn)行本領(lǐng)域已知的建議的AP寡聚體結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，以鑒定免疫應(yīng)答可以特異性針對(duì)并可以開發(fā)AP寡聚體特異性抗體的區(qū)域。AP寡聚體模型的檢測(cè)表明3個(gè)區(qū)域具有可用于結(jié)合的暴露于溶劑的潛在的抗體易接近的殘基AP肽的mAb 6E10識(shí)別的AP寡聚體N端(殘基4-9)(鑒定為SEQID NO: 2的FRHDSG) ；mAb 4G8識(shí)別的A P寡聚體肽的N端第三中的混合極性疏水結(jié)構(gòu)域(鑒定為SEQ ID NO. 3的LVFFAEDV)(殘基17-24);以及由殘基25-29 (GSNKG)組成的AP寡聚體肽的約束的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域。包含SNK殘基26-28的約束的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域表位的發(fā)現(xiàn)是構(gòu)象約束的，并且不會(huì)存在于線性AP或APP上。預(yù)期針對(duì)這種構(gòu)象約束的表位的抗體不結(jié)合線性AP或APP，并且會(huì)是ム0寡聚體特異性抗體。進(jìn)行ニ硫化物連接的包含殘基25-29 (CGSNKGC)的環(huán)肽的分子動(dòng)力學(xué)建模的圖像采集；加入非天然半胱氨酸用于ニ硫鍵。這種建模顯示，賴氨酸28的側(cè)鏈如圖4所示朝向外部，與參考文獻(xiàn)Lurs et al. (2005)和Rauk (2008)中預(yù)測(cè)的朝向內(nèi)部的賴氨酸28側(cè)鏈相反。賴氨酸28殘基的外向朝向這ー令人驚訝的發(fā)現(xiàn)與包含殘基25-29 (CGSNKGC)的這種環(huán)肽的高免疫原性一致，賴氨酸ー側(cè)是暴露于溶劑的、大的并且通過E-氨基帶電荷。在下文的實(shí)例中顯示針對(duì)包含至少SNK殘基的構(gòu)象環(huán)狀表位的抗體有效中和AP寡聚體的毒性，參見例如圖11。賴氨酸28殘基的外向朝向這ー令人驚訝的發(fā)現(xiàn)還與真正的AP寡聚體還以抗體易接近的方式表現(xiàn)出相似的賴氨酸側(cè)鏈朝向溶劑一致。位寡聚體的轉(zhuǎn)向區(qū)中的絲氨酸26、天冬酰胺27和賴氨酸28殘基即SNK均為帶電荷的或極性的，并且比小的非極性氨基酸具有更大的免疫原性。位寡聚體的轉(zhuǎn)向區(qū)中的SNK殘基的環(huán)狀構(gòu)象形成新的構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位暴露于溶劑并可用于抗體結(jié)合。下文描述的實(shí)例證實(shí)了 AP寡聚體的構(gòu)象約束的SNK表位用于結(jié)合的可用性這ー發(fā)現(xiàn)。AP寡聚體表面的這種新的結(jié)構(gòu)約束的表位的發(fā)現(xiàn)具有選擇性抗體結(jié)合的有利特性。所述新構(gòu)象表位還可以包括位于SNK表位序列任一端的天然甘氨酸。所述新構(gòu)象表位還可以在所述表位序列的兩端包括天然甘氨酸殘基。在一方面，所述天然甘氨酸殘基對(duì)所述新構(gòu)象表位的免疫原性具有有限的貢獻(xiàn)或沒有貢獻(xiàn)，然而，所述甘氨酸殘基可以緩解肽環(huán)化中固有的ー些空間張力。在氨基酸結(jié)構(gòu)式中，每個(gè)殘基一般可以通過一字母或三字母命名表示，所述一字母或三字母命名對(duì)應(yīng)于氨基酸的俗名，按照以下表I。
表I :天然存在的肽中常見的20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸的命名和縮寫。
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體，其特異性結(jié)合來源于A β的環(huán)肽，其中所述環(huán)肽包含構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚A β的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。
2.一種分離的抗體，其特異性結(jié)合來源于A β的環(huán)肽，其中所述環(huán)肽包含構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: I的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚A β的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的分離的抗體，其中所述抗體以比結(jié)合Αβ的非寡聚形式更 大的親和力特異性結(jié)合Aβ的寡聚形式。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的分離的抗體，其中所述抗體是人源化的。
6.一種抗原肽，其包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，其中所述表位具有至少SNK的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚A β的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。
7.一種抗原肽，其包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，其中所述表位具有對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO: I的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于寡聚Aβ的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。
8.如權(quán)利要求8或9所述的抗原肽，其中所述寡聚Aβ的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)對(duì)應(yīng)于寡聚A β (1-40)或寡聚Αβ (1-42)的殘基25-29。
9.一種免疫綴合物，其包含與可檢測(cè)的標(biāo)記綴合的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗體。
10.一種組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體以及藥學(xué)可接受的佐劑。
11.一種抗寡聚疫苗組合物，其包含權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的抗原肽以及藥學(xué)可接受的佐劑。
12.—種治療或預(yù)防需要所述治療的患者中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或權(quán)利要求9所述的免疫綴合物。
13.一種治療或預(yù)防需要所述治療的患者中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求12所述的疫苗。
14.一種診斷疑似患有阿爾茨海默病的患者中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括以下步驟 a)從所述患者分離生物樣品； b)使所述生物樣品與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體在足以允許在所述樣品中形成抗原/抗體復(fù)合物的條件下接觸一段時(shí)間；以及 c)檢測(cè)所述樣品中所述抗原/抗體復(fù)合物的存在，其中所述復(fù)合物的存在表示所述患者中阿爾茨海默病的診斷。
15.—種試劑盒，其包含 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體；以及 包含連接至信號(hào)產(chǎn)生化合物的抗原的綴合物。
16.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其包含一種或多種檢測(cè)試劑。
17.—種商業(yè)包裝,其包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體； 包含連接至信號(hào)產(chǎn)生化合物的抗原的綴合物；以及 在診斷阿爾茨海默病中使用的說明書。
18.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求9所述的免疫綴合物用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病的用途。
19.如權(quán)利要求13所述的疫苗用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病的用途。
20.編碼權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體的核酸。
全文摘要
一種新的來源于Aβ的約束的肽表位、相關(guān)抗體組合物和使用方法，其中所述表位包含氨基酸序列SNK。描述了一種特異性結(jié)合包含構(gòu)象表位的環(huán)肽的分離的抗體，所述構(gòu)象表位包含氨基酸序列SNK并對(duì)應(yīng)于寡聚Aβ的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。還描述了一種抗原肽，其包含具有約束的環(huán)狀構(gòu)型的表位，所述約束的環(huán)狀構(gòu)型包含氨基酸序列SNK并對(duì)應(yīng)于寡聚Aβ的暴露于溶劑的抗體易接近的轉(zhuǎn)向區(qū)。還描述了治療、預(yù)防和診斷阿爾茨海默病的方法。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102858796SQ201180020228
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者尼爾·R·凱斯曼 申請(qǐng)人:不列顛哥倫比亞大學(xué)