專利名稱：基因開關(guān)組合物及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地講涉及基因表達(dá)的調(diào)控。發(fā)明背景·
四環(huán)素操縱子系統(tǒng)包含阻遏物和操縱子元件，其最初從細(xì)菌中分離得到。所述操縱子系統(tǒng)受到存在的四環(huán)素的嚴(yán)格控制，并且自身調(diào)控tetA和tetR基因的表達(dá)水平。tetA的產(chǎn)物從細(xì)胞中除去四環(huán)素。tetR的產(chǎn)物為結(jié)合至操縱子元件的阻遏物，在不存在四環(huán)素的情況下Kd為約IOpM,從而阻止tetA和tetR的表達(dá)。已經(jīng)修改了這個系統(tǒng)以控制其它受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，和/或用于其它生物中(主要用于動物系統(tǒng)中)。基于Tet的操縱子系統(tǒng)已經(jīng)在植物中具有有限的用途，這至少部分地為由于誘導(dǎo)劑的問題，其通常為抗生素化合物，并且對光敏感。需要調(diào)控生物質(zhì)受關(guān)注的序列的表達(dá)。提供了基因開關(guān)組合物及響應(yīng)化合物如磺酰脲類化合物調(diào)控表達(dá)的方法。發(fā)明概述提供了涉及使用磺酰脲類介導(dǎo)的基因表達(dá)控制的組合物和方法。組合物包括磺酰脲類響應(yīng)化學(xué)開關(guān)，其中所述基因表達(dá)受磺酰脲類化合物的調(diào)控。組合物也包括編碼多肽的多核苷酸、阻抑型啟動子、以及構(gòu)建體、載體、原核和真核細(xì)胞、和生物，包括包含任何組分、和/或通過任何方法產(chǎn)生的植物、植物細(xì)胞和種子。也提供了調(diào)控細(xì)胞或生物中受關(guān)注的多核苷酸表達(dá)的方法、以及改變基因組(包括植物或植物細(xì)胞中的基因組)的方法。本發(fā)明包括以下實(shí)施方案。I.用于調(diào)控植物中或種子中包含的植物細(xì)胞中的表達(dá)的方法，所述方法包括(a)提供包含磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)的植物細(xì)胞，所述基因開關(guān)控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，其中所述植物細(xì)胞為耐磺酰脲類植物細(xì)胞；以及；(b)提供調(diào)控所述基因開關(guān)的磺酰脲類化合物，其中所述磺酰脲類化合物通過葉施用、灌根施用、出苗前施用、出苗后施用、或種子處理施用來提供。2.實(shí)施方案I的方法，其中所述受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)改變所述植物細(xì)胞的表型。3.實(shí)施方案I或2的方法，其中所述受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)改變所述植物細(xì)胞的基因型。4.實(shí)施方案1-3中任一項的方法，其中提供所述磺酰脲類化合物激活所述受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。
5.實(shí)施方案1-4中任一項的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物或雙子葉植物。6.實(shí)施方案5的方法,其中所述植物細(xì)胞來自玉米、稻、高粱、甘鹿、大麥、燕麥、小麥、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、煙草、向日葵、紅花、或苜蓿。7.實(shí)施方案1-6中任一項的方法，其中所述磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)包含可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的阻抑型啟動子，其中所述阻抑型啟動子包含tet操縱子。8.實(shí)施方案1-7中任一項的方法，其中所述磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)包含選自SEQ ID NO :855、856、857、858、859 和 860 的阻抑型啟動子、或與 SEQ ID NO :855、856、857、
858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的阻抑型啟動子。
9.實(shí)施方案1-8中任一項的方法，其中所述磺酰脲類化合物包括嘧啶基磺酰脲類化合物、三嗪基磺酰脲類化合物、或噻唑基脲類化合物。10.實(shí)施方案9的方法，其中所述磺酰脲類化合物包括氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆、或砜嘧磺隆。11.實(shí)施方案1-10中任一項的方法，其中所述受關(guān)注的多核苷酸編碼特異性地結(jié)合至靶核酸序列的多肽。12.實(shí)施方案11的方法，其中所述多肽為重組酶、整合酶、核酸酶、歸巢內(nèi)切核酸酶、或鋅指核酸酶。13.實(shí)施方案1-12中任一項的方法，其中所述磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)包含磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物，其包含SEQ ID NO :3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ ID NO3-419中的任一種具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。14.磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，其中所述受關(guān)注的多核苷酸編碼特異性地結(jié)合DNA序列的多肽，或編碼切割DNA序列的多肽。15.實(shí)施方案14的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述編碼的多肽為重組酶、整合酶、核酸酶、歸巢內(nèi)切核酸酶、或鋅指核酸酶。16.實(shí)施方案14或15的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述磺酰脲類基因開關(guān)包含磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物，其中所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物可操作地連接至在所述植物中有活性的啟動子，其中所述啟動子為組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、或阻抑型啟動子。17.實(shí)施方案16的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中(a)所述組成型啟動子為MTH啟動子、EFla啟動子、PIP啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、或35S CaMV啟動子；(b)所述組織優(yōu)選的啟動子為分生組織優(yōu)選的啟動子、胚芽優(yōu)選的啟動子、葉優(yōu)選的啟動子、根優(yōu)選的啟動子、花藥優(yōu)選的啟動子、花粉優(yōu)選的啟動子、或花優(yōu)選的啟動子；(C)所述發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子為早期胚芽啟動子、晚期胚芽啟動子、發(fā)芽優(yōu)選的啟動子、或衰老優(yōu)選的啟動子；(d)所述誘導(dǎo)型啟動子為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、熱應(yīng)激啟動子、干旱脅迫啟動子、光誘導(dǎo)型啟動子、滲壓劑誘導(dǎo)型啟動子、或金屬誘導(dǎo)型啟動子；或者，(e)所述阻抑型啟動子為四環(huán)素阻抑型啟動子、或乳糖阻抑型啟動子。
18.實(shí)施方案16或17的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述受關(guān)注的多核苷酸或所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物可操作地連接至包含至少一種四環(huán)素操縱子序列的阻抑型啟動子。19.實(shí)施方案18的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述阻抑型啟動子為組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、或發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子。20.實(shí)施方案19的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述阻抑型啟動子為35S CaMV啟動子、肌動蛋白啟動子、EFlA啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。21.實(shí)施方案20的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述阻抑型啟動子包含如SEQID NO :855、856、857、858、859、860 或 862 中所示的多核苷酸序列、或與 SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的多核苷酸序列。
22.實(shí)施方案16的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物包含SEQ ID NO :3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ IDNO :3-419中的任一種具有至少85 %的序列同一性的氨基酸序列。23.轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因種子，其包含實(shí)施方案14-22中任一項的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)。24.實(shí)施方案23的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因種子，其中所述轉(zhuǎn)基因植物、所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或所述轉(zhuǎn)基因種子來自單子葉植物或雙子葉植物。25.實(shí)施方案24的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因種子，其中所述單子葉植物或雙子葉植物來自玉米、稻、高粱、甘蔗、大麥、燕麥、小麥、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、煙草、向日葵、紅花、或苜蓿。26.重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含阻抑型啟動子，其中所述阻抑型啟動子在植物細(xì)胞中是有活性的，并且所述阻抑型啟動子包括可操作地連接至至少一種操縱子序列的肌動蛋白啟動子、EFlA啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。27.實(shí)施方案26的重組多核苷酸，其中所述阻抑型啟動子包含如SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860 或 862 中所示的多核苷酸序列、或與 SEQ ID NO :855、856、857、858、
859、860或862具有至少95%的序列同一性的多核苷酸序列。28.用于調(diào)控細(xì)胞中的表達(dá)的方法，所述方法包括(a)提供包含受調(diào)控的基因開關(guān)的細(xì)胞，所述基因開關(guān)控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，其中所述基因開關(guān)包含實(shí)施方案26或27的阻抑型啟動子；以及；(b)提供調(diào)控所述基因開關(guān)的配體化合物，其中配體化合物包括四環(huán)素、磺酰脲類、或它們的任何類似物。29.重組多核苷酸，其包含可操作地連接至編碼磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物的多核苷酸的阻抑型啟動子。30.實(shí)施方案29的重組多核苷酸，其中所述編碼的磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物包含SEQ ID NO :3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ IDNO :3-419中的任一種具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。31.實(shí)施方案29的重組多核苷酸，其中所述阻抑型啟動子為可操作地連接至至少一種操縱子序列的肌動蛋白啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。
32.實(shí)施方案29-31中任一項的重組多核苷酸，其中所述阻抑型啟動子包含如SEQID NO :855、856、857、858、859、860 或 862 中所示的多核苷酸序列、或與 SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的多核苷酸序列。附圖
簡述圖I :概述了多代磺酰脲類阻遏物改組庫的來源多樣性、庫設(shè)計、hit多樣性和群偏差。破折號(指示在該庫中的該位點(diǎn)處未導(dǎo)入不同氨基酸。X指示寡核苷酸庫設(shè)計用于在該庫中的該位點(diǎn)處導(dǎo)入全部不同氨基酸(20個氨基酸中的任何一個)。以粗體表示的殘基指示在選擇期間的偏差，較大的字體指示在選擇群中的偏差程度較大。括號中的殘基指示選擇的突變。系統(tǒng)發(fā)育的多樣性集合源自34個四環(huán)素阻遏物序列的大家族。圖2 :例示啟動子操縱子設(shè)計。圖片A示出在將tet操縱子置于序列中之前和之后的dMMV啟動子。圖片B不出在將tet 呆縱子直于序列中之如和之后的EF1A2啟動子。圖3 :例示在加入tet操縱子之前和之后的啟動子活性。每幅圖的y_軸為通過熒光素酶測定法測得的相對光照單位。圖片A比較35SCaMV啟動子+/-tet操縱子。圖片B比較MMV啟動子+/-tet操縱子。圖片C比較EF1A2啟動子+/-tet操縱子。圖片D比較dMMV啟動子+/-tet操縱子。圖4 :例示阻遏物和/或配體調(diào)控包含tet操縱子的啟動子。每幅圖的y_軸為通過熒光素酶測定法測得的相對光照單位。圖5 :提供了基因開關(guān)元件、組合物和組合的實(shí)例。Pro指示任何啟動子，Pro/Op指示任何阻抑型啟動子，POI為受關(guān)注的多核苷酸,并且RS指示重組位點(diǎn)。圖6 示例性的自動調(diào)控構(gòu)建體。圖7 :瞬時表達(dá)的對照和自動調(diào)控構(gòu)建體。圖8 :瞬時表達(dá)的對照和自動調(diào)控構(gòu)建體。圖9 :在煙草的轉(zhuǎn)基因自動調(diào)控品系中dsRED活化對胺苯磺隆的劑量響應(yīng)。發(fā)明詳述化學(xué)調(diào)控的表達(dá)工具已經(jīng)證明對研究基因功能和多種生物系統(tǒng)中的調(diào)控是有價值的。當(dāng)不能特異性地調(diào)控轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因由于負(fù)效應(yīng)而不能連續(xù)表達(dá)時，這些系統(tǒng)允許測試受關(guān)注的任何基因在培養(yǎng)體系或完整生物體中的表達(dá)效應(yīng)。這些系統(tǒng)本質(zhì)上提供進(jìn)行“脈沖”或“脈沖-追蹤”基因表達(dá)測試的機(jī)會?；瘜W(xué)開關(guān)介導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)允許在活化或滅活靶序列后立即測試基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、和/或代謝物組學(xué)響應(yīng)。這些類型的測試不能用組成型的、發(fā)育的、或組織特異的表達(dá)系統(tǒng)來容易地完成。化學(xué)開關(guān)技術(shù)也可提供用于基因治療的手段。化學(xué)開關(guān)系統(tǒng)可在商業(yè)上應(yīng)用，例如用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)。對于農(nóng)業(yè)目的，期望能夠控制環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或基因流，例如抗除草劑性基因，尤其在其中靶作物的雜草近親存在的情況下更是如此。此外，具有活性化學(xué)開關(guān)機(jī)構(gòu)家族將能夠進(jìn)行單轉(zhuǎn)基因作物的性狀目錄管理，例如，根據(jù)客戶需求經(jīng)由特定化學(xué)活化可使用一個生產(chǎn)品系遞送選擇的性狀。此外，使用化學(xué)物質(zhì)控制雜交保持能夠流水化雜交種子的生產(chǎn)。廣泛用于動物系統(tǒng)的基于Tet阻遏物(TetR)的基因開關(guān)系統(tǒng)已經(jīng)在植物基因系統(tǒng)中具有有限的使用，這部分是由于活化劑配體的問題。四環(huán)素阻遏物已經(jīng)經(jīng)重新設(shè)計以特異性地識別磺酰脲類化合物而不是四環(huán)素化合物，同時保留了特異性的結(jié)合四環(huán)素操縱子序列的能力。通過基于理性建模的多輪庫設(shè)計和改組，已經(jīng)開發(fā)出了磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物(SuR)。提供了涉及使用磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物的組合物和方法。化學(xué)開關(guān)或基因開關(guān)包括兩個組件。一個組件包括編碼阻遏物的多核苷酸，第二組件包括可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的阻抑型/誘導(dǎo)型啟動子。受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)任選地通過提供合適的化學(xué)配體進(jìn)行控制。阻抑型/誘導(dǎo)型啟動子(下文稱為阻抑型啟動子)包含至少一個操縱子序列，阻遏物多肽特異性地結(jié)合至其上，所述阻遏物控制該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。有用的阻遏物包括在不存在化學(xué)配體的情況下特異性地結(jié)合操縱子的那些、在化學(xué)配體的存在下特異性地結(jié)合操縱子的具有逆表型的那些、以及融 合到激活因子或結(jié)構(gòu)域上以控制活性的那些?；蜷_關(guān)的活性可通過選擇開關(guān)中使用的元件的組合進(jìn)行控制。這些包括但不限于可操作地連接至阻遏物的啟動子、阻遏物、可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的阻抑型啟動子、以及任選地受關(guān)注的多核苷酸。還通過施用的化學(xué)配體的選擇、劑量、條件、和/或時間提供控制。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)能夠進(jìn)行較嚴(yán)格的控制、在不同組織或細(xì)胞中進(jìn)行控制、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中阻遏物可操作地連接至組成型啟動子。在一些實(shí)例中阻遏物可操作地連接至非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中基因開關(guān)還可包括附加的元件。在一些實(shí)例中，一個或多個附加的元件可提供如下手段通過其受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)能夠進(jìn)行較嚴(yán)格的控制、在不同組織或細(xì)胞中進(jìn)行控制、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中那些元件包括位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶、或它們的組合。在一些實(shí)例中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是切除側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，切除產(chǎn)生啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。例如基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和位點(diǎn)特異性重組酶，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是切除側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，切除產(chǎn)生阻抑型啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些實(shí)例中，側(cè)接重組位點(diǎn)的序列包含重組酶表達(dá)盒。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、或胚芽中表達(dá)。在一些實(shí)例中所述切除發(fā)生在親本、細(xì)胞、組織、或組織培養(yǎng)物中使得子代遺傳切除后的產(chǎn)物。
在一些實(shí)例中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、可操作地連接至側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的受關(guān)注多核苷酸的啟動子、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是切除側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在另一個實(shí)例中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是倒置側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，倒置產(chǎn)生啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中所 述倒置發(fā)生在親本、細(xì)胞、組織、或組織培養(yǎng)物中使得子代遺傳倒置后的產(chǎn)物。例如基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和位點(diǎn)特異性重組酶，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是倒置側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，倒置產(chǎn)生阻抑型啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些情況下，側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列為受關(guān)注的多核苷酸。在一些情況下，側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列為阻抑型啟動子。在一些實(shí)例中，提供了重組酶表達(dá)盒，其中所述重組酶可操作地連接至非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中所述倒置發(fā)生在親本、細(xì)胞、組織、或組織培養(yǎng)物中使得子代遺傳倒置后的產(chǎn)物。在一些實(shí)例中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、可操作地連接至側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的受關(guān)注多核苷酸的啟動子、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是倒置側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)?；酋ｋ孱惙磻?yīng)性阻遏物(SuR)包括任何阻遏物多肽，其與操縱子序列的結(jié)合受包含磺酰脲類化合物的配體的控制。在一些實(shí)例中，所述阻遏物在不存在磺酰脲類配體的情況下特異性地結(jié)合操縱子。在一些實(shí)例中，所述阻遏物在存在磺酰脲類配體的情況下特異性地結(jié)合操縱子。在存在配體的情況下結(jié)合至操縱子的阻遏物有時稱為反式阻遏物。在一些實(shí)例中組合物包括特異性地結(jié)合四環(huán)素操縱子的SuR多肽，其中所述特異性地結(jié)合受磺酰脲類化合物的調(diào)控。在一些實(shí)例中組合物包括分離的磺酰脲類阻遏物(SuR)多肽，其包含對野生型四環(huán)素阻遏物配體結(jié)合域的至少一個氨基酸取代，其中所述SuR多肽或其多聚體特異性地結(jié)合包含操縱子序列的多核苷酸，其中阻遏物-操縱子的結(jié)合通過存在或不存在磺酰脲類化合物進(jìn)行調(diào)控。在一些實(shí)例中，組合物包括包含配體結(jié)合域的分離磺酰脲類阻遏物，所述結(jié)合域包含對融合到異源操縱子DNA結(jié)合域的野生型四環(huán)素阻遏物配體結(jié)合域的至少一個氨基酸取代，所述異源操縱子DNA結(jié)合域特異性地結(jié)合包含操縱子序列或其衍生物的多核苷酸，其中阻遏物-操縱子的結(jié)合通過存在或不存在磺酰脲類化合物進(jìn)行調(diào)控。可使用任何操縱子DNA結(jié)合域，包括但不限于來自阻遏物的操縱子DNA結(jié)合域，包括tet、lac、trp、phd、arg、LexA、phiChl 阻遏物、lambda Cl 和 Cro 阻遏物、卩遼菌體 X 阻遏物、MetJ、phirltrro> phi434 Cl 和 Cro 阻遏物、RafR、gal、ebg、uxuR、exuR、ROS> SinR、PurR、FruR、P22C2、TetC、AcrR、Betl、Bm3Rl、EnvR、QacR、MtrR、TcmR、Ttk、YbiH、YhgD 和 mu Ner、或Interpro家族中的DNA結(jié)合域，包括但不限于IPR001647、IPR010982和IPROl 1991。在一些實(shí)例中組合物包括分離的磺酰脲類阻遏物(SuR)多肽，其包含對野生型四環(huán)素阻遏物的至少一個氨基酸取代，其中所述SuR多肽或其多聚體特異性地結(jié)合包含四環(huán)素操縱子序列的多核苷酸，其中阻遏物-操縱子的結(jié)合通過存在或不存在磺酰脲類化合物 進(jìn)行調(diào)控。野生型阻遏物包括四環(huán)素類A、B、C、D、E、G、H、J和Z阻遏物。發(fā)現(xiàn)TetR(A)類的一個實(shí)例在Tnl721轉(zhuǎn)座子上并且以GenBank登錄號Χ61307保藏，以gi48198交叉引用，具有編碼蛋白登錄號CAA43639，以gi48195和UniProt登錄號Q56321交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(B)類的一個實(shí)例在TnlO轉(zhuǎn)座子上并且以GenBank登錄號X00694保藏，以gi43052交叉引用，具有編碼蛋白登錄號CAA25291，以gi43052和UniProt登錄號P04483交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(C)類的一個實(shí)例在pSClOl質(zhì)粒上并且以GenBank登錄號M36272保藏，以gil50945交叉引用，具有編碼蛋白登錄號AAA25677，以gil50946交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(D)類的一個實(shí)例在奧道奈茲沙門氏菌(Salmonella ordonez)中and dep并且以GenBank登錄號X65876保藏，以gi49073交叉引用，具有編碼蛋白登錄號CAA46707，以gi49075和UniProt登錄號P0ACT5及P09164交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(E)類的一個實(shí)例分離自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子TnlO并且以GenBank登錄號M34933保藏，以gil55019交叉引用，具有編碼蛋白登錄號AAA98409，以gil55020交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(G)類的一個實(shí)例分離自鰻弧菌(Vibrio anguillarium)并且以GenBank登錄號S52438保藏，以gi262928交叉引用，具有編碼蛋白登錄號AAB24797，以gi262929交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(H)類的一個實(shí)例在分離自多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)的質(zhì)粒pMVlll上并且以GenBank登錄號U00792保藏，以gi392871交叉引用，具有編碼蛋白登錄號AAC43249，以gi392872交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(J)類的一個實(shí)例分離自奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)并且以GenBank登錄號AF038993保藏，以gi4104704交叉引用，具有編碼蛋白登錄號AAD12754，以gi4104706交叉引用。發(fā)現(xiàn)TetR(Z)類的一個實(shí)例在分離自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的質(zhì)粒pAGI上并且以GenBank登錄號AF121000保藏，以gi4583389交叉引用，具有編碼蛋白登錄號AAD25064，以gi4583390交叉引用。在一些實(shí)例中野生型四環(huán)素阻遏物為B類四環(huán)素阻遏物。在一些實(shí)例中野生型四環(huán)素阻遏物為D類四環(huán)素阻遏物。在一些實(shí)例中磺酰脲類阻遏物(SuR)多肽包含在野生型四環(huán)素阻遏物的配體結(jié)合域中的一個氨基酸取代。在B和D類野生型TetR蛋白中，氨基酸殘基6-52代表DNA結(jié)合域。殘留的蛋白質(zhì)涉及配體結(jié)合和隨后的變構(gòu)。對于B類TetR，殘基53-207代表配體結(jié)合域，而殘基53-218包含D類TetR的配體結(jié)合域。在一些實(shí)例中SuR多肽包含在野生型TetR(B)蛋白的配體結(jié)合域中的一個氨基酸取代。在一些實(shí)例中SuR多肽包含在野生型TetR(B)蛋白SEQ ID NO :I的配體結(jié)合域中的一個氨基酸取代。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽包含一個氨基酸或氨基酸的任何組合，其對應(yīng)于選自如圖I中所示的氨基酸多樣性的等同氨基酸位點(diǎn)，其中如圖I中所示的氨基酸殘基位點(diǎn)對應(yīng)于野生型TetR(B)的氨基酸編號。在一些實(shí)例中，分離的SuR多肽包含配體結(jié)合域，其包含至少 10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，55 %，60 %，65 %，66 %，67 %，68 %，69 %，70 %，71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 % , 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %,86 %，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 %的如圖I中所示的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)對應(yīng)于使用野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中，分離的SuR多肽包含至少10%，20%，30%，40%，50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %,
77%, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %,92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的如圖I中所示的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)對應(yīng)于使用野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中野生型 TetR(B)為 SEQ ID NO :1。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽包含配體結(jié)合域，其包含在某一殘基位點(diǎn)處的氨基酸取代，所述殘基位點(diǎn)選自位點(diǎn) 55、60、64、67、82、86、100、104、105、108、113、116、134、135、138、139、147、151、170、173、174、177和它們的任何組合，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)和取代對應(yīng)于使用野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽還包含在選自109、112、117、131、137、140、164和它們的任何組合的殘基位點(diǎn)處的氨基酸取代。在一些實(shí)例中野生型TetR(B)為SEQ ID NO :1。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有與如SEQ ID NO 1的氨基酸殘基53-207所例示的野生型TetR(B)的配體結(jié)合域至少約50% 60%，65%，66%，67%，68%，69%，70%，71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % , 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %,86 %，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)配體結(jié)合域的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法使用GAP算法和BL0SUM62計分矩陣，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有與如SEQ ID NO :1例示的野生型TetR(B)至少約 50% 60%，65%，66%，67%，68%，69%，70%，71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，
78%, 79 %, 80 %, 81 % , 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,93 %，94%，95%，96 %，97 %，98 %或99%的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)多肽的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法使用GAP算法和BL0SUM62計分矩陣，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Length Weight2。組合物包括分離的SuR多肽，其具有與選自SEQ ID NO :3_419的SuR多肽的配體結(jié)合域至少約 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % ,91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)配體結(jié)合域的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法使用GAP算法和BLOSUM62計分矩陣，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為 GAPffeight 8 和 Length Weight 2。在一些實(shí)例中，分離的SuR多肽具有與選自SEQ ID NO :3_419的SuR多肽至少約 50 % 60 %，65 %，66 %，67 %，68 %，69 %，70 %，71 %，72 %，73 %，74 %，75 %，76 %，77 %， 78%, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93%，94%，95%，96 %，97 %，98 %或99%的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)多肽的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法使用GAP算法和BL0SUM62計分矩陣，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Length Weight2。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與L7-1A04(SEQ IDNO :220)、L1-22(SEQ ID NO :7)、Ll-29 (SEQ ID NO : 10)、Ll-02 (SEQ IDNO :3)、Ll-07 (SEQ ID NO :4)、L1-20(SEQ ID NO :6)、Ll-44(SEQ IDNO : 13)、L6-3A09(SEQ ID NO :402)、L6-3H02(SEQ IDNO 94)、L7-4E03 (SEQ ID NO :403)、L10_84(B12) (SEQ ID NO :404)、或 L13_46(SEQID NO 405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少200、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、或 750 的 BLAST 二進(jìn)制值(bit score)，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與L7-1A04(SEQ ID NO :220)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少374的BLAST 二進(jìn)制值、與Ll-22 (SEQ ID NO 7)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少387的BLAST 二進(jìn)制值、與Ll-29 (SEQ ID NO 10)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少393的BLAST 二進(jìn)制值、與Ll-07 (SEQ ID NO 4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少388的BLAST 二進(jìn)制值、與L6-3A09(SEQ ID NO :402)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少381的BLAST 二進(jìn)制值、與L7-4E03(SEQ ID NO :403)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少368的BLAST二進(jìn)制值、或與L13-46 (SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少320的BLAST 二進(jìn)制值，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與L7-1A04(SEQ ID NO :220)、L1-22(SEQ ID NO 7),Ll-29(SEQ ID NO 10),Ll-02(SEQ ID NO 3),Ll-07(SEQ ID NO :4)、L1-20(SEQ ID NO :6)、Ll-44(SEQ ID NO :13)、L6-3A09(SEQ ID NO :402)、L6-3H02(SEQ IDNO 94)、L7-4E03 (SEQ IDNO :403)、L10_84(B12) (SEQ ID NO :404)、或 L13_46(SEQ ID NO 405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,
71%, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %,
86%，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 的序列同一性，其中所述序列同一性通過BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與L7-1A04(SEQ IDNO 220)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少88%的序列同一性、與L1-22(SEQ ID NO:7)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少92%的序列同一性、與Ll-07 (SEQ ID NO :4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少93%的序列同一性、與L1-20(SEQ ID NO 6)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少93%的序列同一性、與L1-44(SEQID NO :13)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少93%的序列同一性、與L6-3H02(SEQ ID NO :94)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少90%的序列同一性、與L10-84(B12) (SEQ ID NO :404)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少86%的序列同一性、或與L13-46(SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少86%的序列同一性，其中所述序列同一性通過BLAST比對利用BLOSUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中使用全序列比對方法利用GAP算法和BLOSUM62計分矩陣測定百分比同一性，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與 L7-1A04(SEQ IDNO :220)、L1_22(SEQ ID NO :7)、Ll-29 (SEQID NO 10), Ll-02 (SEQ IDNO 3), Ll-07 (SEQ ID NO :4)、Ll-20 (SEQ ID NO 6), Ll-44 (SEQIDNO :13)、L6-3A09(SEQ ID NO :402)、L6_3H02(SEQ ID NO :94)、L7_4E03(SEQ ID NO :403)、L10-84 (B12) (SEQ ID NO :404)、或L13-46 (SEQID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少 400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、750、800、850、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、10 80、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、或 1200 的 BLAST 相似性評分，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與Ll-29 (SEQ ID NO 10)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少1006的BLAST相似性評分、與Ll-07 (SEQ ID NO 4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少996的BLAST相似性評分、與L6-3A09 (SEQ ID NO :402)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少978的BLAST相似性評分、與L7-4E03 (SEQ ID NO :403)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少945的BLAST相似性評分、或與L13-46 (SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少819的BLAST相似性評分，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與 L7-1A04(SEQ ID NO :220)、L1_22(SEQ ID NO 7),Ll-29(SEQ ID NO 10),Ll-02(SEQ IDNO :3)、Ll-07 (SEQ ID NO :4)、Ll-20 (SEQ ID NO :6)、Ll-44 (SEQ ID NO : 13)、L6-3A09 (SEQID NO 402)、L6-3H02(SEQ ID NO :94)、L7_4E03(SEQ IDNO :403)、L10_84(B12)(SEQ ID NO 404)、或L13-46(SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_60、e_70、e_75、e_80、e_85、e_90、e_95、e_100、e_105、e_106、e_107、e_108、e_109、e_110、e_lll、e_112、e-113、e-114、e-115、e-116、e-117、e-118、e-119、e-120、或 e_125 的 BLAST e_ 值評分，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能夠與Ll-02 (SEQ ID NO 3)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e-112的BLAST e_值評分、與Ll-07 (SEQ ID NO :4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e-111的BLAST e_值評分、與Ll-20 (SEQ ID NO 6)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e-111的BLAST e_值評分、與L6-3A09 (SEQ ID NO :402)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e-108的BLAST e_值評分、與L7-4E03 (SEQ ID NO :403)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e-105的BLAST e_值評分、或與L13-46 (SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e-90的BLAST e_值評分，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中所述多肽選自SEQ ID NO :3_419。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽包含配體結(jié)合域，其來自選自SEQ IDN0:3_419的多肽。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽包含選自SEQ IDNO :3-419的氨基酸序列。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽選自SEQ IDNO :3-419，并且磺酰脲類化合物選自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆、砜嘧磺隆和噻吩磺隆。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物大于O. InM和小于10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物至少O. 1ηΜ、0. 5ηΜ、InM、10ηΜ、50ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ、I μ Μ、5 μ Μ、7 μ M 但是小于 10 μ M 的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物至少O. 1ηΜ、0. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM但是小于I μΜ的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物大于ΟηΜ、但是小于O. ΙηΜ、O. 5ηΜ、ΙηΜ、10ηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ、1 μ Μ、5 μ Μ、7 μ M或10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中所述磺酰脲類化合物是氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆、砜嘧磺隆和/或噻吩磺隆。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對操縱子序列大于O. InM和小于10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對操縱子序列至少O. 1ηΜ、0. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、 5011] 、10011]\1、25011]\1、50011]\1、75011]\1、14]\1、5 4]\1、7 4]\1但是小于 10 μ M 的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對操縱子序列至少0. 1ηΜ、0. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ但是小于I μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽具有對操縱子序列大于 ΟηΜ、但是小于 0. 1ηΜ、0· 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ、I μ Μ、5 μ Μ、7 μ M或10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中所述操縱子序列為Tet操縱子序列。在一些實(shí)例中所述Tet操縱子序列為TetR(A)操縱子序列、TetR(B)操縱子序列、TetR(D)操縱子序列、TetR(E)操縱子序列、TetR(H)操縱子序列、或它們的功能衍生物。分離的SuR多肽特異性地結(jié)合磺酰脲類化合物?；酋ｋ孱惙肿影酋ｋ宀糠?-S(0)2NHC(O)NH(R)-)。在磺酰脲類除草劑中，磺酰脲部分的磺?；酥苯踊蛲ㄟ^氧原子或任選取代的氨基或亞甲基連接至通常取代的環(huán)狀或無環(huán)的基團(tuán)上。在磺酰脲橋基對面的末端，氨基(其可能具有取代基如甲基(R為CH3)代替氫)連接至雜環(huán)基團(tuán)上，通常為對稱的嘧啶或三嗪環(huán)，具有一個或兩個取代基如甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基和鹵素。磺酰脲類除草劑可為游離酸或鹽的形式。在游離酸形式中，橋基上的磺酰胺氮不是去質(zhì)子化的(即，_S(0)2NHC(0)NH(R)-)，而在鹽形式中，橋基上的磺酰胺氮是去質(zhì)子化的(即，_S(0)2NC(0)NH(R)-)，并且存在陽離子，通常為堿金屬或堿土金屬陽離子，最常見的為鈉或鉀的陽離子?；酋ｋ孱惢衔锇ɡ缫韵骂惖幕衔锶玎奏せ酋ｋ孱惢衔?、三嗪基磺酰脲類化合物、噻唑基脲類化合物和藥品如抗糖尿病藥物，以及它們的鹽和其它衍生物。嘧啶基磺酰脲類化合物的實(shí)例包括酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺胺磺隆、煙嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、環(huán)氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺?；锹?、三氟啶磺隆和它們的鹽及衍生物。三嗪基磺酰脲類化合物的實(shí)例包括氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、胺苯磺隆、碘磺隆、甲基碘磺隆、甲磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、噻磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆和它們的鹽及衍生物。噻唑基脲類化合物的實(shí)例包括丁噻隆、磺噻隆、特丁噻草隆、噻氟隆、噻苯隆和它們的鹽及衍生物?？固悄虿∷幬锏膶?shí)例包括乙酰苯磺酰環(huán)己脲、氯磺丙脲、甲糖寧、甲磺氮草脲、格列甲嗪、格列齊特、格列本脲(優(yōu)降糖)、格列喹酮、格列美脲和它們的鹽及衍生物。在一些實(shí)例中分離的SuR多肽特異性地結(jié)合多于一種的磺酰脲類化合物。在一些實(shí)例中磺酰脲類化合物選自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、噻磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆和砜嘧磺隆。組合物還包括編碼SuR多肽的分離多核苷酸，所述SuR多肽特異性地結(jié)合四環(huán)素操縱子，其中所述特異性地結(jié)合受磺酰脲類化合物的調(diào)控。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼磺酰脲類阻遏物(SuR)多肽，其包含在野生型四環(huán)素阻遏物的配體結(jié)合域中的氨基酸取代。在B和D類野生型TetR蛋白中，氨基酸殘基6-52代表DNA結(jié)合域。殘留的蛋白質(zhì)涉及配體結(jié)合和隨后的變構(gòu)。對于B類TetR，殘基53-207代表配體結(jié)合域，而殘基53-218包含D類TetR的配體結(jié)合域。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含在野生型TetR(B)蛋白的配體結(jié)合域中的氨基酸取代。在一些實(shí)例中多核苷酸編碼SuR多肽，其包含在SEQ ID N01的野生型TetR(B)蛋白的配體結(jié)合域中的氨基酸取代。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，所述多肽包含選自如圖I中所示的 氨基酸多樣性的一個氨基酸或氨基酸的任何組合，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)對應(yīng)于使用例示為SEQ ID NO: I的野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中，分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含配體結(jié)合域，其包含至少10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，55 %，60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 % ,79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的如圖I中所示的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)對應(yīng)于使用野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中，分離的多核苷酸編碼 SuR 多肽，其包含至少 10%，20%，30%，40%，50%，55%，60%，65%，66%，
67%, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %,
82%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %,97^,98^,99%或100%的如圖I中所示的氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)對應(yīng)于使用野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中野生型TetR(B)為SEQ IDNO :1。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含配體結(jié)合域，所述配體結(jié)合域包含在某一殘基位點(diǎn)處的氨基酸取代，所述殘基位點(diǎn)選自位點(diǎn)55、60、64、67、82、86、100、104、105、108、113、116、134、135、138、139、147、151、170、173、174、177 和它們的任何組合，其中所述氨基酸殘基位點(diǎn)和取代對應(yīng)于使用野生型TetR(B)的氨基酸編號的等同位點(diǎn)。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，所述多肽還包含在殘基位點(diǎn)處的氨基酸取代，所述殘基位點(diǎn)選自109、112、117、131、137、140、164以及它們的任何組合。在一些實(shí)例中野生型TetR(B)多肽序列為SEQ ID NO :1。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其具有與如SEQ IDNO 1的氨基酸殘基 53-207 所示的配體結(jié)合域至少約 50 % 60 %，65 %，66 %，67 %，68 %，69 %，70 %，71 %，
72%, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 % ,
87%，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)配體結(jié)合域的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法是GAP和BL0SUM62計分矩陣，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其具有與SEQ IDNO 1至少約50%60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %,
79%, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94%，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)多肽的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法是GAP和BL0SUM62計分矩陣，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和LengthWeight 2。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包括在嚴(yán)格雜交條件下選擇性雜交編碼SuR多肽的多核苷酸的核酸序列。選擇性雜交的多核苷酸是與對非靶序列的雜交相比，對靶序列的
結(jié)合水平為背景至少2倍的多核苷酸。嚴(yán)格條件是序列依賴性的和條件依賴性的。典型的嚴(yán)格條件是其中鹽濃度為約O. 01至I. 0M, pH 7. 0-8. 3，溫度為30°C，用于短探針(例如10-50個核苷酸)，或約60°C，用于長探針(例如大于50個核苷酸)。嚴(yán)格條件可包括甲酰胺或其它去穩(wěn)定劑。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在37°C于40-45%甲酰胺、IM NaClU%SDS中雜交，以及在55-60°C下用O. 5X至I X SSC洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在37°C于50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，以及在60_65°C用O. I X SSC洗滌。特異性受到雜交后洗滌條件的影響，通常經(jīng)由離子強(qiáng)度和溫度來影響。對于DNA-DNA 雜交體，T111 可以用 Meinkoth & Wahl (1984) AnalBiochem 138 :267-284 的公式計算出近似的=T111 = 81. 5°C +16. 6 (log M)+0.41(% GC) -O. 61(% form)-500/L ;其中 M 為單價陽離子的體積摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L為以堿基對表示的雜交體的長度。對核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可在見于下列文獻(xiàn)Tijssen, Laboratory Techniques inBiochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic AcidProbes,第 I 部分，第 2 章“Overview ofprinciples of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays，，，Elsevier, New York(1993);以及 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等人編輯，GreenePublishing and ffiley-Interscience, New York (1995) 在一些實(shí)例中，編碼SuR多肽的分離的多核苷酸在中等嚴(yán)格條件或高等嚴(yán)格條件下特異性地雜交SEQ ID NO =420-836的多核苷酸。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含氨基酸序列，其能夠與L7-1A04(SEQ ID NO :220)、Ll-22 (SEQ ID NO 7), Ll-29 (SEQ IDNO 10), Ll-02 (SEQ IDNO 3)、Ll-07(SEQ ID NO :4)、Ll-20(SEQ IDNO :6)、Ll-44(SEQ ID NO :13)、L6-3A09(SEQID NO 402)、L6-3H02 (SEQID NO :94)、L7-4E03 (SEQ ID NO :403)、L10_84(B12) (SEQ IDNO 404)、或L13-46 (SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少200、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、或 750 的BLAST 二進(jìn)制值(bit score)，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與L7-1A04(SEQ ID NO :220)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少374的BLAST 二進(jìn)制值、與L1-22(SEQ ID NO :7)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少387的BLAST 二進(jìn)制值、與Ll-29 (SEQ IDNO :10)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少393的BLAST 二進(jìn)制值、與L1-07(SEQ ID NO :4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少388的BLAST 二進(jìn)制值、與L6-3A09 (SEQ ID NO :402)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少381的BLAST 二進(jìn)制值、與L7-4E03(SEQ ID NO :403)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少368的BLAST 二進(jìn)制值、或與L13-46(SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少320的BLAST 二進(jìn)制值，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與L7-1A04 (SEQ ID NO:220)、L1-22(SEQID NO :7)、L1_29(SEQ ID NO 10),Ll-02(SEQ ID NO 3),Ll-07(SEQ IDNO 4)、Ll-20 (SEQ ID NO :6)、Ll-44 (SEQ ID NO :13)、L6-3A09 (SEQ IDNO :402)、L6-3H02 (SEQID NO 94)、L7-4E03 (SEQ ID NO :403)、L10_84(B12) (SEQ ID NO :404)、或 L13_46(SEQ IDNO 405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少50% 60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %,70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85%，86 %，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 %的序列同一性，其中所述序列同一性通過BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與L7-1A04(SEQ ID NO :220)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少88%的序列同一性、與L1-22(SEQ ID NO :7)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少92 %的序列同一性、與L1-07(SEQ IDNO 4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少93%的序列同一性、與L1-20(SEQ ID NO :6)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少93 %的序列同一性、與L1-44(SEQ ID NO 13)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少93 %的序列同一性、與L6-3H02(SEQ ID NO :94)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少90 %的序列同一性、與L10-84(B 12) (SEQ ID NO :404)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少86%的序列同一性、或與L13-46(SEQ IDNO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少86%的序列同一性，其中所述序列同一性通過BLAST比對利用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中使用全序列比對方法利用GAP算法和BL0SUM62計分矩陣測定百分比同一性，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Lengthffeight 2。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與 L7-1A04(SEQ ID NO :220)、L1_22(SEQ ID NO 7),Ll-29(SEQ ID NO 10),Ll-02(SEQ IDNO :3)、Ll-07 (SEQ ID NO :4)、Ll-20 (SEQ ID NO :6)、Ll-44 (SEQ ID NO : 13)、L6-3A09 (SEQID NO :402)、L6-3H02(SEQ ID NO :94)、L7_4E03(SEQ ID NO :403)、L10_84(B12)(SEQ IDNO 404)、或L13-46(SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、600、750、800、850、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、或 1200 的 BLAST 相似性評分，其中 BLAST 比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與Ll-29 (SEQ ID NO 10)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少1006的BLAST相似性評分、與L1-07(SEQ IDNO 4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少996的BLAST相似性評分、與L6-3A09 (SEQ ID NO :402)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少978的BLAST相似性評分、與L7-4E03 (SEQ ID NO :403)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少945的BLAST相似性評分、或與L13-46 (SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少819的BLAST相似性評分，其中所述BLAST比對使用BLOSUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SUR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與 L7-1A04(SEQ ID NO :220)、Ll-22 (SEQ ID NO :7)、Ll-29 (SEQIDNO 10), Ll-02 (SEQ ID NO 3), Ll-07 (SEQ ID NO 4), Ll-20 (SEQ IDNO 6), Ll-44 (SEQ IDNO 13)、L6-3A09 (SEQ ID NO :402)、L6-3H02 (SEQID NO :94)、L7-4E03 (SEQ ID NO :403)、L10-84(B12) (SEQ ID NO :404)、或 L13-46 (SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少 e_60、e_70、e_80、e_85、e_90、e_95、e_100、e_105、e_106、e_107、e_108、e_109、e-110、e-111、e-112, e_113、e_114、e_115、e_116、e_117、e_118、e_119、e_120、或 e_125的BLAST e-值評分，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列能夠與L1-02(SEQID NO 3)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_112的BLAST e_值評分、與L1-07(SEQ ID NO 4)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_lll的BLAST e_值評分、與L1-20(SEQ ID NO 6)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_lll的BLAST e_值評分、與L6-3A09 (SEQ ID NO :402)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_108的BLAST e_值評分、 與L7-4E03(SEQ ID NO :403)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_105的BLAST e_值評分、或與L13-46(SEQ ID NO :405)的多肽序列進(jìn)行最佳比對以產(chǎn)生至少e_90的BLAST e_值評分，其中所述BLAST比對使用BL0SUM62矩陣、空位存在罰分11和空位延伸罰分I。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼選自SEQ ID NO 3-419的多肽。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含SEQ ID NO =420-836的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的配體結(jié)合域來自選自SEQID NO :3-419的多肽。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽，其包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO :3-419。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽選自SEQ ID NO :3_419，并且磺酰脲類化合物選自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆和噻磺隆。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含SEQ ID NO =420-836的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸。在一些實(shí)例中分離的SuR多核苷酸編碼SuR多肽，其具有對磺酰脲類化合物大于O. InM和小于10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物至少 O. ΙηΜ、O. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ、I μ Μ、5 μ Μ、7 μ M 但是小于10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物至少O. ΙηΜ、O. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ但是小于 I μ M 的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽具有對磺酰脲類化合物大于ΟηΜ、但是小于0. 1ηΜ、0. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ、1μΜ,5μΜ,7μΜ^ 10 μ M 的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中所述磺酰脲類化合物為氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆和/或噻吩磺隆化合物。在一些實(shí)例中分離的SuR多核苷酸編碼SuR多肽，其具有對操縱子序列大于0. InM和小于10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽具有對操縱子序列至少 0. 1ηΜ、0. 5ηΜ、1ηΜ、10ηΜ、50ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ、1μΜ、5μΜ、7μΜ 但是小于10 μ M的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽具有對操縱子序列至少0. ΙηΜ、0. 5ηΜ、1ηΜ、10ηΜ、50ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、500ηΜ、750ηΜ 但是小于 I μΜ 的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例中編碼的SuR多肽具有對操縱子序列大于ΟηΜ、但是小于0. 1ηΜ、0. 5ηΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、250nM、500nM、750nM、1μΜ、5μΜ、7μΜ*10μΜ 的平衡結(jié)合常數(shù)。在一些實(shí)例
中所述操縱子序列為Tet操縱子序列。在一些實(shí)例中tet操縱子序列為TetR(A)操縱子序列、TetR(B)操縱子序列、TetR(D)操縱子序列、TetR(E)操縱子序列、TetR(H)操縱子序列或它們的功能衍生物。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸編碼SuR多肽、重組酶、或受關(guān)注的性狀，其包含密碼子組成特征，代表特定宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞細(xì)胞器的密碼子優(yōu)選要求。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含原核生物優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含細(xì)菌優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中所述細(xì)菌為大腸桿菌或農(nóng)桿菌屬。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含質(zhì)體優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含真核生物優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含核優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含植物優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含單子葉植物優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含玉米、稻、高粱、大麥、小麥、裸麥、柳枝稷、甘蔗、草坪草和/或燕麥優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含雙子葉植物優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含大豆、向日葵、紅花、蕓苔屬、苜蓿、擬南芥屬、煙草屬植物和/或棉優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含酵母優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中 分離的多核苷酸包含哺乳動物優(yōu)選的密碼子。在一些實(shí)例中分離的多核苷酸包含昆蟲優(yōu)選的密碼子。組合物也包括與編碼SuR多肽、表達(dá)盒、復(fù)制子、載體、T_DNA、DNA庫、宿主細(xì)胞、組織和/或生物的多核苷酸完全互補(bǔ)的分離的多核苷酸，所述生物包含編碼SuR多肽的多核苷酸和/或互補(bǔ)序列或衍生物。在一些實(shí)例中所述多核苷酸穩(wěn)定地?fù)饺胨拗骷?xì)胞、組織和/或生物的基因組。在一些實(shí)例中所述宿主細(xì)胞為原核生物細(xì)胞，包括大腸桿菌和農(nóng)桿菌屬菌株。在一些實(shí)例中所述宿主為真核生物，包括例如酵母、昆蟲、植物和哺乳動物。也提供了包含至少一個操縱子序列的阻抑型啟動子。從這些啟動子開始的表達(dá)受結(jié)合所述操縱子序列的阻遏物的控制，其中阻遏物與操縱子的結(jié)合受存在或不存在化學(xué)配體的調(diào)控。在一些實(shí)例中，阻抑型啟動子包含至少一個tet操縱子序列。阻遏物包括tet阻遏物和磺酰脲類調(diào)控的阻遏物。tet阻遏物與tet操縱子的結(jié)合受四環(huán)素化合物及其類似物的調(diào)控?；酋ｋ孱惙磻?yīng)性阻遏物與tet操縱子的結(jié)合受磺酰脲類化合物及其類似物的控制。在一些實(shí)例中，所述阻抑型啟動子包含tet操縱子序列，其位于TATA框的5’或3’0-30個核苷酸的范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中，tet操縱子序列位于TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或Ont范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中tet操縱子序列可與TATA框序列部分重疊。在一些實(shí)例中tet操縱子序列為SEQ ID NO :848。在一些實(shí)例中所述啟動子在植物細(xì)胞中有活性。在一些實(shí)例中所述啟動子為組成型啟動子。在其它實(shí)例中所述啟動子為非組成型啟動子。在一些實(shí)例中所述非組成型啟動子為組織優(yōu)選的啟動子。在一些實(shí)例中組織優(yōu)選的啟動子主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種子、胚乳、或胚芽中表達(dá)。在一些實(shí)例中所述啟動子為植物肌動蛋白啟動子、香蕉條紋病毒啟動子(BSV)、MMV啟動子、增強(qiáng)MMV啟動子(dMMV)、植物P450啟動子、或延伸因子Ia(EFlA)啟動子。在一些實(shí)例中所述啟動子為植物肌動蛋白啟動子(SEQ IDNO :849)、香蕉條紋病毒啟動子(BSV) (SEQ ID NO :850)、紫茉莉花葉病毒啟動子(MMV) (SEQ ID NO :851)、增強(qiáng)MMV啟動子(dMMV) (SEQ IDNO :852)、植物P450啟動子(MPl) (SEQ ID NO :853)、或延伸因子 Ia(EFlA)啟動子(SEQ ID NO :854)。在一些實(shí)例中，所述阻抑型啟動子包含兩個tet操縱子序列，其中所述第I tet操縱子序列位于TATA框5’0-30nt范圍內(nèi)，而第2tet操縱子序列位于TATA框3’ 0-30nt范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中，第一和/或第二 tet操縱子序列位于TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或 Ont 范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中第一和/或第二 tet操縱子序列可部分地與TATA框序列重疊。在一些實(shí)例中所述第一和/或第二 tet操縱子序列為SEQ ID N0:848。在一些實(shí)例中，阻抑型啟動子包含三個tet操縱子序列，其中所述第Itet操縱子序列位于TATA框5’ 0_30nt范圍內(nèi)，第2tet操縱子序列位于TATA框3’ 0-30nt范圍內(nèi)，而第3tet操縱子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS) 0_50nt范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中，第I和/或第2tet操縱子序列位于TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或Ont范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中，第3tet操縱子序列位于TSS的 50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或 Ont范圍內(nèi)。在一些實(shí)例中第3tet操縱子位于TSS的5’。在一些實(shí)例中第3tet操縱子序列可與TSS序列部分重疊。在一些實(shí)例中所述第I、第2和/或第3tet操縱子序列為SEQ IDN0:848。在一些實(shí)例中所述啟動子為植物肌動蛋白啟動子(actin/Op) (SEQ ID NO :855)、 香蕉條紋病毒啟動子(BSV/Op) (SEQ IDNO :856)、紫茉莉花葉病毒啟動子(MMV/0p) (SEQ IDNO 857)、增強(qiáng)MMV啟動子(dMMV/Ορ) (SEQ ID NO :858)、植物P450 啟動子(MPl/0p) (SEQ IDNO :859)、或延伸因子la(EFlA/0p)啟動子(SEQ IDNO :860)。在一些實(shí)例中所述啟動子包含的多核苷酸序列具有與SEQ IDNO :885、856、857、858、859、或860至少約50% 60%，65%，66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %,81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,96^,97^,98%或99%的序列同一性，其中所述啟動子保留阻抑型啟動子的活性。在一個具體實(shí)例中，所述啟動子包含的多核苷酸序列具有與SEQ ID N0:885、856、857、858、859、或860至少95%的序列同一性，其中所述啟動子保留阻抑型啟動子的活性。具有“阻抑型啟動子活性”的啟動子將指導(dǎo)可操作地連接的多核苷酸的表達(dá)，其中它指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的能力依賴存在或不存在化學(xué)配體(即，四環(huán)素化合物、磺酰脲類化合物)和阻遏物。還提供了使用基因開關(guān)組合物和/或其元件的方法。在一個實(shí)例中，提供了調(diào)控宿主細(xì)胞中受關(guān)注多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的方法，所述方法包括提供包含可操作地連接至阻抑型啟動子的受關(guān)注多核苷酸的細(xì)胞，所述啟動子包含至少一個四環(huán)素操縱子序列；提供SuR多肽并且提供磺酰脲類化合物，從而調(diào)控受關(guān)注的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄?？墒褂萌魏嗡拗骷?xì)胞，包括例如原核細(xì)胞如細(xì)菌，以及真核細(xì)胞，包括酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)例中提供所述SuR多肽包括使細(xì)胞接觸表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在細(xì)胞中有功能的啟動子，其可操作地連接至編碼SuR多肽的多核苷酸。在一些實(shí)例中使用所述方法以激活受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被激活、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中受關(guān)注的多核苷酸主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被減少、抑制、或阻止，這可能受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生抑制，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在另一個實(shí)例中，提供了調(diào)控宿主細(xì)胞中受關(guān)注多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的方法，所述方法包括提供包含可操作地連接至阻抑型啟動子的受關(guān)注多核苷酸的細(xì)胞，所述啟動子包含至少一個四環(huán)素操縱子序列；提供TetR多肽并且提供四環(huán)素化合物 ，從而調(diào)控受關(guān)注的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)例中所述阻抑型啟動子為植物肌動蛋白啟動子、香蕉條紋病毒啟動子(BSV)、MMV啟動子、增強(qiáng)MMV啟動子(dMMV)、植物P450啟動子、或延伸因子Ia(EFlA)啟動子。在一些實(shí)例中所述啟動子為植物肌動蛋白啟動子(actin/Op) (SEQ ID NO :855)、香蕉條紋病毒啟動子(BSV/Op) (SEQ ID NO :856)、紫茉莉花葉病毒啟動子(MMV/0p) (SEQIDNO 857)、增強(qiáng) MMV 啟動子(dMMV/Ορ) (SEQ ID NO :858)、植物 P450 啟動子(MPl/0p) (SEQID NO :859)、或延伸因子la(EFlA/0p)啟動子(SEQID NO :860)。在一些實(shí)例中所述啟動子包含的多核苷酸序列具有與SEQID NO :885、856、857、858、859、或860至少約50% 60%,
65%, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %,
80%, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,
95%，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性，其中所述啟動子保留阻抑型啟動子的活性。在一個具體實(shí)例中，所述啟動子包含的多核苷酸序列具有與SEQ ID N0:885、856、857、858、859、或860至少95%的序列同一性，其中所述啟動子保留阻抑型啟動子的活性?？墒褂萌魏嗡拗骷?xì)胞，包括例如原核細(xì)胞如細(xì)菌，以及真核細(xì)胞，包括酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)例中提供所述TetR多肽包括使細(xì)胞接觸表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在細(xì)胞中有功能的啟動子，其可操作地連接至編碼TetR多肽的多核苷酸。在一些實(shí)例中使用所述方法以激活受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被激活、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中受關(guān)注的多核苷酸主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被減少、抑制、或阻止，這可能受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生抑制，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。方法包括嚴(yán)格和/或特異性地控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。通過選擇開關(guān)中使用的元件組合調(diào)控嚴(yán)格性和/或特異性。這些包括但不限于可操作地連接至阻遏物的啟動子、阻遏物、可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的阻抑型啟動子、以及任選地受關(guān)注的多核苷酸。還通過施用的化學(xué)配體的選擇、劑量、條件和/或時間提供控制。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)能夠進(jìn)行較嚴(yán)格的控制、在不同組織或細(xì)胞中進(jìn)行控制、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中阻遏物可操作地連接至組成型啟動子。在一些實(shí)例中阻遏物可操作地連接至非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到調(diào)控 。這些方法提供了改變細(xì)胞、組織、植物和/或種子的表型和/或基因型的手段。改變的基因型包括對植物基因組中任何序列的任何可遺傳的改變。改變的表型包括其中單元、組織、植物和/或種子表現(xiàn)出與其未改變狀態(tài)不同的特性或性狀的任何情況。改變的表型包括但不限于不同的生長習(xí)性、改變的花的顏色、改變的相對成熟度、改變的產(chǎn)量、改變的能育性、改變的花期、改變的病害耐受性、改變的昆蟲耐受性、改變的除草劑耐受性、改變的脅迫耐受性、改變的水耐受性、改變的耐旱性、改變的種子特性、改變的形態(tài)、改變的農(nóng)學(xué)特性、改變的代謝、改變的基因表達(dá)譜、改變的倍數(shù)性、改變的作物質(zhì)量、改變的飼料質(zhì)量、改變的青貯飼料質(zhì)量、改變的加工特性等。在一些實(shí)例中，所述方法使用基因開關(guān)，其可包含附加的元件。在一些實(shí)例中，一個或多個附加的元件可提供如下手段通過其受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)能夠進(jìn)行較嚴(yán)格的控制、在不同組織或細(xì)胞中進(jìn)行控制、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中那些元件包括位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶、或它們的組合。在一些方法中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件為切除側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，切除產(chǎn)生啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到調(diào)控。在其它方法中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和位點(diǎn)特異性重組酶，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是切除側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，切除產(chǎn)生阻抑型啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些實(shí)例中，側(cè)接重組位點(diǎn)的序列包含重組酶表達(dá)盒。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到調(diào)控。在一些實(shí)例中所述切除發(fā)生在親本中使得子代遺傳切除后的產(chǎn)物。在一些實(shí)例中，基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、可操作地連接至側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的受關(guān)注多核苷酸的啟動子、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是切除側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到調(diào)控。在另一個實(shí)例中，所述方法包括提供基因開關(guān)，其包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和可操作地連接至位點(diǎn)特異性重組酶的阻抑型啟動子，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是倒置側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，倒置產(chǎn)生啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些實(shí)例中，可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子為非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到調(diào)控。在一些實(shí)例中所述倒置發(fā)生在親本中使得子代遺傳倒置后的產(chǎn)物。 在其它方法中，提供的基因開關(guān)可包含編碼阻遏物的多核苷酸、連接至受關(guān)注的多核苷酸的啟動子、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列、和位點(diǎn)特異性重組酶，所述重組酶特異性地識別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)并實(shí)施重組事件。在一些實(shí)例中，重組事件是倒置側(cè)接重組位點(diǎn)的序列。在一些實(shí)例中，倒置產(chǎn)生阻抑型啟動子和受關(guān)注的多核苷酸之間可操作的連接。在一些情況下，側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列為受關(guān)注的多核苷酸。在一些情況下，側(cè)接位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的序列為阻抑型啟動子。在一些實(shí)例中，提供了重組酶表達(dá)盒，其中所述重組酶可操作地連接至非組成型啟動子，包括但不限于組織優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻抑型啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、或具有多于一種這些特性的啟動子。在一些實(shí)例中受關(guān)注的多核苷酸主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中所述倒置發(fā)生在親本中使得子代遺傳倒置后的產(chǎn)物。在其它實(shí)例中，提供了用于改變基因型或表型的方法。在一些實(shí)例中，所述方法包括提供包含可操作地連接至阻抑型啟動子的受關(guān)注多核苷酸的細(xì)胞，所述啟動子包含至少一個四環(huán)素操縱子序列；提供SuR多肽并提供磺酰脲類化合物，從而改變細(xì)胞的基因型和/或表型。可使用任何宿主細(xì)胞，包括例如原核細(xì)胞如細(xì)菌，以及真核細(xì)胞，包括酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)例中提供所述SuR多肽包括使細(xì)胞接觸表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在細(xì)胞中有功能的啟動子，其可操作地連接至編碼SuR多肽的多核苷酸。在一些實(shí)例中使用所述方法以激活受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被激活、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中受關(guān)注的多核苷酸主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被減少、抑制、或阻止，這可能受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生抑制，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在另一個實(shí)例中，提供了改變宿主細(xì)胞的基因型或表型的方法，所述方法包括提供包含可操作地連接至阻抑型啟動子的受關(guān)注多核苷酸的細(xì)胞，所述啟動子包含至少一個四環(huán)素操縱子序列；提供TetR多肽并且提供四環(huán)素化合物，從而調(diào)控受關(guān)注的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)例中所述阻抑型啟動子為植物肌動蛋白啟動子、香蕉條紋病毒啟動子(BSV)、麗V啟動子、增強(qiáng)MMV啟動子(dMMV)、植物P450啟動子、或延伸因子Ia(EFlA)啟動子。在一些實(shí)例中所述啟動子為植物肌動蛋白啟動子(actin/Op) (SEQ ID NO :855)、香蕉條紋病毒啟動子(BSV/Op) (SEQID NO :856)、紫茉莉花葉病毒啟動子(MMV/0p) (SEQ ID NO:857)、增強(qiáng)MMV啟動子(dMMV/Ορ) (SEQ ID NO :858)、植物P450啟動子(MPl/0p) (SEQ ID NO 859)、或延伸因子la(EFlA/0p)啟動子(SEQ IDNO :860)。在一些實(shí)例中所述啟動子包含的多核苷酸序列具有與 SEQ IDNO :885、856、857、858、859、或 860 至少約 50%,60%,65%,
66%, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %,
81%, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,96^,97^,98%或99%的序列同一性，其中所述啟動子保留阻抑型啟動子的活性。在一個具體實(shí)例中，所述啟動子包含的多核苷酸序列具有與SEQ ID NO :885、856、857、858、859、或860至少95%的序列同一性，其中所述啟動子保留阻抑型啟動子的活性?？墒褂萌魏嗡拗骷?xì)胞，包括例如原核細(xì)胞如細(xì)菌，以及真核細(xì)胞，包括酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)例中提供所述TetR多肽包括使細(xì)胞接觸表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在細(xì)胞中有功能的啟動子，其可操作地連接至編碼TetR多肽的多核苷酸。在一些實(shí)例中使用所述方法以激活受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被激活、受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中受關(guān)注的多核苷酸主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中表達(dá)。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)在不同組織或細(xì)胞中被減少、抑制、或阻止，這可能受限于選擇的組織或細(xì)胞類型、受限于特定的發(fā)育階段、受限于特定的環(huán)境條件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在根、葉、莖、花、穗絲、花藥、花粉、分生組織、種系、種子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)主要在特定時間發(fā)生抑制，其包括但不限于種子或植物發(fā)育階段、營養(yǎng)生長階段、再生階段、環(huán)境條件響應(yīng)時、害蟲或病原體響應(yīng)時、化合物響應(yīng)時、或它們的任何組合。在一些實(shí)例中，所述磺酰脲類化合物為嘧啶基磺酰脲類化合物(例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、煙嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、環(huán)氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺?；锹『腿せ锹?;三嗪基磺酰脲類化合物(例如氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、碘磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆)；或噻唑基脲類化合物(例如氯酯磺草胺、雙氯磺草安、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺)。例如所述磺酰脲類化合物可為氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆、或砜嘧磺隆。在一些實(shí)例中所述磺酰脲類化合物為胺苯磺隆。在一些實(shí)例中提供的胺苯磺隆的濃度為約 O. 001,0. 002,0. 003,0. 004,0. 005,0. 006,0. 007,0. 008,0. 009,0. 01,0. 02,0. 03、O. 04、0· 05、0· 06、0· 07、0· 08、0· 09、0· 10、0· 15、0· 2、0· 25、0· 3、0· 35、0· 4、0· 45、0· 5、0· 55、O. 6、0· 65、0· 7、0· 75、0· 8、0· 85、0· 9、0· 95、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9. 0,9. 5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、200 或 500μ g/mL。在一些實(shí)例中，所述 SuR 多肽具有配體結(jié)合域,其與SEQ ID NO :205-419的SuR多肽至少50%，60%，65%，66%，67%，
68%, 69 %, 70 % , 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %,
83%, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %,98%或99%的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)多肽的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法是GAP和BL0SUM62計分矩陣，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些實(shí)例中所述多肽具有配體結(jié)合域，其來自選自SEQ ID NO :205-419的多肽。在一些實(shí)例中所述多肽選自SEQ ID N0:205-419。在一些實(shí)例中所述多肽由SEQ ID NO :622-836的多核苷酸編碼。在一些實(shí)例中所述磺酰脲類化合物為氯磺隆。在一些實(shí)例中提供的氯磺隆的濃度為約 O. 01,0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 10,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3,0. 35、O. 4、0· 45、0· 5、0· 55、0· 6、0· 65、0· 7、0· 75、0· 8、0· 85、0· 9、0· 95> I. 0、1· 5、2· 0、2· 5、3· O、3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0,9. 5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、200 或 500 μ g/mL 在一些實(shí)例中，所述SuR多肽具有配體結(jié)合域，其與SEQ ID NO :14-204的SuR多肽至少50%，60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 % , 78 %,
79%, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比對方法經(jīng)多肽的全長進(jìn)行測定。在一些實(shí)例中全序列比對方法是GAP和BL0SUM62計分矩陣，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默認(rèn)參數(shù)為GAP Weight 8和LengthWeight 2。在一些實(shí)例中所述多肽具有配體結(jié)合域，其來自選自SEQ ID NO :14-204的多肽。在一些實(shí)例中所述多肽選自SEQ ID NO :14-204。在一些實(shí)例中所述多肽由SEQ ID NO:431-621的多核苷酸編碼。嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)的能力提供了控制工程化性狀表達(dá)和分配的手段。此類系統(tǒng)可防止轉(zhuǎn)基因流入非轉(zhuǎn)基因作物或其它植物。提供了化學(xué)調(diào)控的基因開關(guān)、基因開關(guān)組件和使用方法。使用蛋白建模、DNA改組和篩選轉(zhuǎn)化四環(huán)素阻遏物以特異性地識別磺酰脲類化合物。對于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，磺酰脲類化合物可在韌皮部流動并且為可商購獲得的，從而為用作開關(guān)配體化學(xué)物質(zhì)提供了良好的基礎(chǔ)。在多輪建模和DNA改組后，已經(jīng)產(chǎn)生了特異性識別SU化學(xué)物質(zhì)的阻遏物，其幾乎與野生型TetR識別同源誘導(dǎo)劑相當(dāng)。這些多肽包含真實(shí)的磺酰脲類阻遏物(SuR)，其已經(jīng)經(jīng)確認(rèn)在植物中展示SuR開關(guān)系統(tǒng)的功能。雖然在農(nóng)業(yè)環(huán)境中得到例證，這些方法和組合物可廣泛用于其它環(huán)境和生物。一般來講，其中所用的化學(xué)物質(zhì)快速透過并且被生物中的所有細(xì)胞類型察覺，但是不干擾任何內(nèi)源性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的基因開關(guān)系統(tǒng)將是最有用的。其它特性包括傳感器組件的行為，例如調(diào)控嚴(yán)格性和在存在或不存在誘導(dǎo)劑情況下的響應(yīng)。一般來講，在不存在誘導(dǎo)劑的情況下具有“關(guān)閉”狀態(tài)的嚴(yán)格調(diào)控并且在存在誘導(dǎo)劑的情況下具有快速強(qiáng)烈響應(yīng)的開關(guān)系統(tǒng)為優(yōu)選的。TnlO-操縱子的表達(dá)由tet阻遏物與其操縱子序列的結(jié)合調(diào)控(Beck等人，(1982)J Bacteriol 150 :633-642 ；ffray & Reznikoff(1983)J Bacterioll56 :1188-1191)。四環(huán)素阻遏物對tet操縱子的高度特異性、四環(huán)素及其衍生物的高效率誘導(dǎo)、誘導(dǎo)劑的低毒性、以及四環(huán)素易于透過大多數(shù)細(xì)胞的能力是在真核細(xì)胞的體細(xì)胞基因調(diào)控中應(yīng)用tet系統(tǒng)的基礎(chǔ)，所述真核細(xì)胞來自動物(Wirtz & Clayton (1995) Science 268:1179-1183; Gossen 等人，(1995) Science 268 :1766-1769)、人(Deuschle 等人，(1995)Mol Cell Biol15 :1907-1914 ;Furth 等人，(1994) PNAS91 :9302-9306 ;Gossen & Bujard (1992) PNAS 89:5547-5551 ;Gossen 等人，(1995) Science 268 :1766-1769)和植物細(xì)胞培養(yǎng)物(Wilde 等人，(1992)EMBO J 11 :1251-1259 ;Gatz 等人，(1992)Plant J 2 :397-404 ;Roder 等人，
(1994)Mol Gen Genet 243 :32-28 ;Ulmasov 等人，(1997)Plant MolBiol 35:417-424)。已經(jīng)設(shè)計出了四環(huán)素操縱子/阻遏物系統(tǒng)的許多變型。例如，通過將阻遏物融合到轉(zhuǎn)錄反式激活結(jié)構(gòu)域如單純皰疹病毒VP16和tet阻遏物上，開發(fā)出了基于將tet阻遏物轉(zhuǎn)化成激活因子的一個系統(tǒng)(tTA，Gossen& Bujard(1992)PNAS 89:5547-5551)。在這個系統(tǒng)中，在不存在四環(huán)素的情況下通過將tTA結(jié)合至tet操縱子序列上激活小型啟動子，并且四環(huán)素滅活反式作用子并抑制轉(zhuǎn)錄。這個系統(tǒng)已經(jīng)被用于植物(Weinmann等人，(1994)Plant J 5 :559-569)、大鼠心臟(Fishman等人，(1994) J ClinInvest 93 :1864-1868)和小鼠(Furth等人，(1994)PNAS 91:9302-9306)。然而，有跡象顯示嵌合tTA融合蛋白在進(jìn)行有效的基因調(diào)控所需的水平上對細(xì)胞有毒性(Bohl等人，(1996)Nat Med 3:299-305)。包含啟動子的有用tet操縱子還包括本領(lǐng)域已知的那些(參見例如Matzke等人，(2003)Plant Mol Biol Rep 21 :9-19 ；Padidam(2003)Curr OpPlant Biol 6 :169-177 ；Gatz & Quail (1988)PNAS 85 :1394-1397 ;Ulmasov 等人，(1997)Plant Mol Biol 35:417-424 ;Weinmann 等人，(1994)Plant J5 :559-569)?？蓪⒁粋€或多個 tet 操縱子序列添加到啟動子上以產(chǎn)生四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子。在一些實(shí)例中已經(jīng)將至多7個tet操縱子導(dǎo)入小型啟動子序列的上游，并且以反式施用的TetR: :VP16融合激活結(jié)構(gòu)域僅在不存在誘導(dǎo)劑的情況下激活表達(dá)(Weinmann 等人，(1994)Plant J5 :559-569 ;Love 等人，(2000)PlantJ 21 :579-588)。開發(fā)了使用CaMV 35S啟動子的用于植物的廣泛測試的四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)(Gatz 等人，(1992) Plant J 2 :397-404)，其具有導(dǎo)入到接近 TATA 框(3X0pT 35S)的三個tet操縱子。3X0pT 35S啟動子一般在煙草屬植物和馬鈴薯中具有功能，然而據(jù)報道也在番茄和擬南芥中有毒性和不良的植物表型(Gatz (1997) Ann Rev Plant Physiol Plant MolBiol 48 :89-108 ;Corlett 等人，(1996) Plant Cell Environ 19 :447-454)。另一個因素是四環(huán)素相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)在光照下快速降解，其趨于限制它在實(shí)驗室條件下的測試用途。化學(xué)調(diào)控的基因開關(guān)的一個特性為其對同源配體的敏感性。當(dāng)如本文所述使用負(fù)控制的系統(tǒng)時，一個潛在地改善配體響應(yīng)的方法為自動調(diào)控阻遏物的表達(dá)。數(shù)學(xué)上已經(jīng)預(yù)測負(fù)性自動調(diào)控將不僅減少基因表達(dá)的變動，而且增強(qiáng)涉及阻遏物分子的調(diào)控回路中的信號響應(yīng)時間(Savageau(1974)Nature 252:542-549)。這一原則在使用合成基因回路的大腸桿菌中得到證明(Rosenfeld等人，(2002)J Mol Biol 323:785-793)。最近Nevozhay等人將這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到較低等的真核生物(酵母)，他們通過比較建成的具有和不具有自動調(diào)控的四環(huán)素阻遏物和熒光蛋白報告基因系統(tǒng)的合成基因網(wǎng)絡(luò)完成上述工作(Nevozhay(2009)Proc NatlAcad Sci USA 106:5123-5128)。阻遏物的模塊化構(gòu)造和螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合域的共性允許產(chǎn)生具有改變的DNA結(jié)合特異性的SuR多肽。例如，可通過融合SuR配體結(jié)合域到可供選擇的DNA結(jié)合域上改變DNA結(jié)合特異性。例如，可將來自TetR D類的DNA結(jié)合域融合到SuR配體結(jié)合域上以產(chǎn)生SuR多肽，其特異性地結(jié)合包含D類四環(huán)素操縱子的多核苷酸。在一些實(shí)例中可使用DNA結(jié)合域變體或衍生物。例如，可使用來自TetR變體的DNA結(jié)合域，所述變體特異性地識·別 tetO-4C 操縱子或 tetO-6C 操縱子(Helbl & Hillen (1998) J Mol Biol 276:313-318;Helbl等人，(1998) J MolBiol 276:319-324。當(dāng)在相同細(xì)胞中選擇兩個不同的操縱子特異性阻遏物變體作為目標(biāo)以防止異源二聚化時，由螺旋α 8和α 10在兩個亞基中形成的四螺旋束可被取代以確保二聚反應(yīng)特異性(例如Rossi等人，(1998)Nat Genet 20:389-393;Berens & Hillen(2003)Eur J Biochem270 :3109-3121)。在另一個實(shí)例中，來自 LexA 阻遏物的DNA結(jié)合域與GAL4融合，其中這個雜交蛋白識別大腸桿菌和酵母中的LexA操縱子(Brent & Ptashne (1985) Cell 43:729-736)。在另一個實(shí)例中，434阻遏物的所有推定的DNA結(jié)合或DNA識別R-基被P22阻遏物的相應(yīng)位點(diǎn)取代。雜交阻遏物434R[ a 3 (P22R)]的操縱子結(jié)合特異性在體內(nèi)和體外進(jìn)行測試，并且每個測試顯示這一 434的靶向改變將DNA結(jié)合特異性從434 操縱子變?yōu)?Ρ22 操縱子(Wharton & Ptashne (1985) Nature 316:601-605)。通過產(chǎn)生特異性識別嵌合P22/434操縱子序列的野生型434R和434R[ a 3 (P22R)]的異源二聚體進(jìn)一步發(fā)展了這一研究(Hollis等人，(1988)PNAS 85:5834-5838)。在另一個實(shí)例中,AraC蛋白N-末端的半部分與LexA阻遏物DNA結(jié)合域融合。所得AraC:LexA嵌合二聚體結(jié)合LexA操縱子并以阿拉伯糖響應(yīng)方式阻遏LexA操縱子β -半乳醣苷酶融合基因的表達(dá)(Bustos & Schleif (1993)PNAS 90 :5638-5642)。為了使用方便和獲得高通量，常期望在微生物中篩選/選擇期望的改性核酸，例如在細(xì)菌如大腸桿菌或單細(xì)胞真核生物如酵母，包括釀酒酵母(S. cerevisiae)、裂殖酵母(S. pombe)、畢赤酵母(P. pastoris)或原生生物如南極冰藻(Chlamydomonas)、或在模型細(xì)胞系統(tǒng)如SF9、Hela、CH0、BMS、BY2、或其它細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行篩選。在某些情況下，可期望在植物細(xì)胞或植物中進(jìn)行篩選，包括植物細(xì)胞或外植體培養(yǎng)系統(tǒng)或模型植物系統(tǒng)如擬南芥屬或煙草屬植物。在一些實(shí)例中通過篩選表達(dá)單獨(dú)的或作為基因融合構(gòu)建體一部分的不同改性核酸宿主細(xì)胞組提高生產(chǎn)能力?？蓪⑷魏物@示顯著活性的組進(jìn)行去卷積以鑒定表達(dá)期望活性的單克隆。提供了包含一個或多個核酸序列如基因開關(guān)、包含至少一個tet操縱子的植物啟動子、編碼SuR多肽的多核苷酸、和/或受關(guān)注的多核苷酸的重組構(gòu)建體。所述構(gòu)建體包含載體，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等，其中已經(jīng)插入了多核苷酸。在一些實(shí)例中，所述構(gòu)建體還包含調(diào)控序列，包括例如可操作地連接至所述序列的啟動子。合適的載體是為人們所熟知的并且包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；復(fù)制子；噬菌體DNA ;桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；源自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)的病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、雙生病毒、TMV、PVX、其它植物病毒、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒及多種其它病毒或質(zhì)粒。所述載體可任選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因以提供用于選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型性狀。通常選擇性標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素或抗除草劑性。合適的基因包括編碼抗生素奇放線菌素或鏈霉素抗性(例如aadA基因)、鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因、卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII或NPTIII)基因、潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因的那些基因。附加的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶或真核細(xì)胞培養(yǎng)物的新霉素抗性和四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。編碼除草劑抗性的基因包括抑制谷氨酰胺合酶作用的那些基因，例如提供對草甘膦抗性的草胺膦或basta (例如bar基因)、EPSPS、G0X、或GAT，提供對磺酰脲類除草劑抗性的突變體ALS (乙酰乳酸合酶)、或任 何其它已知基因。在細(xì)菌系統(tǒng)中許多表達(dá)載體為可用的。此類載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體如 BLUESCRIPT(Stratagene) ;pIN 載體(VanHeeke & Schuster (1989) JBiol Chem 264:5503-5509) ;pET 載體(Novagen, Madison ffis.)等。相似地，在釀酒酵母(S. cerevisiae)中可使用多種包含組成型或誘導(dǎo)型啟動子如α因子、醇氧化酶和PGH的載體以產(chǎn)生多肽。參見 Ausubel & Grant 等人，(1987)Meth Enzymol 153 :516_544?？稍诓溉閯游锼拗骷?xì)胞中使用多種表達(dá)系統(tǒng)，包括基于病毒的系統(tǒng)如腺病毒和勞氏肉瘤病毒(RSV)系統(tǒng)?？墒褂萌魏螖?shù)量的商業(yè)或公開可用的表達(dá)系統(tǒng)或它們的衍生物。在植物細(xì)胞中可通過整合進(jìn)植物染色體或細(xì)胞器或來自游離體或病毒核酸的細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)盒驅(qū)動表達(dá)。已經(jīng)描述了多個植物來源的調(diào)控序列，包括指導(dǎo)以組織特異性方式表達(dá)的序列，例如TobRB7、馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)B33、GRP基因啟動子、rbcS_3A啟動子等。作為另外一種選擇，可通過瞬時表達(dá)植物病毒載體的外來序列獲得高水平的表達(dá)，例如TMV、BMV、復(fù)染色體病毒包括WDV等。用于在高等植物中表達(dá)核酸的典型載體為已知的，包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體，如 Rogers 等人，(1987)Meth Enzymol 153 :253-277所述。示例性的根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)載體包括質(zhì)粒 PKYLX6 和 pKYLX7，如 Schardl 等人，(1987) Gene 61和 Berger 等人，(1989) PNAS86 :8402-8406 所述，以及質(zhì)粒 pB 101. 2 (例如購自 Clontech Laboratories, Palo Alto,Calif.的質(zhì)粒)?？墒褂枚喾N已知的植物病毒作為載體，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、復(fù)染色體病毒、雀麥花葉病毒和煙草花葉病毒。基因開關(guān)、啟動子、TetOp阻抑型植物啟動子、重組酶、和/或SuR可用于控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。受關(guān)注的多核苷酸可為任何所關(guān)注序列，包括但不限于轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、翻譯調(diào)控元件、著絲粒元件、端粒元件、編碼多肽的序列、編碼mRNA的序列、編碼tRNA的序列、編碼rRNA的序列、編碼引導(dǎo)基因沉默的序列、核酶、融合蛋白、復(fù)制載體、可篩選的標(biāo)記等。受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)可用于誘導(dǎo)編碼RNA和/或多肽的表達(dá)，或反過來抑制編碼RNA、RNA靶序列和/或多肽的表達(dá)。在具體的實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸包含引導(dǎo)基因沉默的序列，包括但不限于編碼RNAi前體、編碼活性RNAi劑、miRNA、反義多核苷酸、核酶、或任何其它沉默分子以及它們的組合的序列。在具體的實(shí)例中，所述多核苷酸序列可包含編碼植物激素、植物防御蛋白、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生物結(jié)合蛋白、期望輸入性狀、期望輸出性狀、脅迫抗性基因、抗除草劑性基因、病害/病原體抗性基因、雄性不育、發(fā)育基因、調(diào)控基因、DNA修復(fù)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、生物合成多肽、或受關(guān)注的任何其它多核苷酸和/或多肽、以及它們的組合的多核苷酸。生物合成多肽為涉及細(xì)胞中的任何生物、細(xì)胞、代謝、合成和/或分解代謝途徑的任何多肽。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸編碼的多肽特異性地結(jié)合靶核酸序列，其實(shí)例包括但不限于編碼重組酶、整合酶、切除酶、轉(zhuǎn)座酶、阻遏物、逆阻遏物、活化劑、核酸酶、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、歸巢內(nèi)切核酸酶、鋅指蛋白、鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、連接酶等的多核苷酸。在一些實(shí)例中，多肽特異性地結(jié)合靶核酸序列，其切除由序列組合物和/或接近的特定序列組合物限定的特定序列或靠近特定序列的至少一條鏈(例如IIS型限制性核酸酶，如FokI)。例如受關(guān)注的多核苷酸能夠編碼在特定序列切割DNA核酸分子的多肽。在一些實(shí)例中，受關(guān)注的多核苷酸編碼的多核苷酸特異性地結(jié)合目標(biāo)核酸序列，其實(shí)例包括但不限于反義多核苷酸、miRNA前體、miRNA等。 特異性結(jié)合指分子結(jié)合、雙聯(lián)、或雜交到特定目標(biāo)分子上，其結(jié)合水平顯著高于與非目標(biāo)分子的結(jié)合水平。一般來講，特異性結(jié)合水平比非特異性背景結(jié)合水平高至少2倍。特異性結(jié)合包括化學(xué)分子、多肽、或多核苷酸與任何目標(biāo)化學(xué)制品、靶多肽、或靶多核苷酸的結(jié)合。組合物和方法可使用任何啟動子。例如，多核苷酸編碼SuR多肽、重組酶、受關(guān)注的多核苷酸、或任何能可操作地連接至組成型、組織優(yōu)選的、誘導(dǎo)型、發(fā)育的、暫時的和/或空間調(diào)控的或其它啟動子的其它序列，包括來自在植物細(xì)胞中有功能的植物病毒或其它病原體的那些。植物中使用的多種啟動子參見Potenza等人，(2004) In Vitro CellDev BiolPlant 40:1-22。示例性的啟動子包括但不限于35S CaMV啟動子(Odell等人，
(1995)Nature 313 :810-812)、S-腺苷甲硫氨酸合酶啟動子(SAMS)(例如在 US 7，217，858和US2008/0026466中公開的那些)、紫茉莉花葉病毒啟動子(例如Dey & Maiti (1999)Plant Mol Biol 40 :771-782 ；Dey &Maiti (1999)Transgenics 3 :61-70)、延伸因子啟動子(例如US2008/0313776和US2009/0133159)、香蕉條紋病毒啟動子、肌動蛋白啟動子(例如 McElroy 等人，(1990)Plant Cell 2 :163-171)、TobRB7 啟動子(例如 Yamamoto等人，(1991)Plant Cell 3 :371)、馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)啟動子(例如馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)B33, Martin 等人,(1997)PlantJ 11 :53-62)、核酮糖 I, 5-二磷酸羧化酶啟動子(例如rbcS-3A，參見例如Fluhr等人，(1986) Science 232:1106-1112，和 Pellingrinischi 等人，(1995)Biochem Soc Trans 23 :247-250)、泛素啟動子(例如Christensen 等人，(1992)Plant Mol Biol 18 :675-689,和 Christensen &Quail (1996)Transgen Res 5 :213-218)、金屬硫蛋白啟動子(例如 US2010/0064390)、Rab17 啟動子(例如Vilardell等人，(1994)Plant MolBiol 24 :561-569)、伴球蛋白啟動子(例如Chamberland 等人，(1992)PlantMol Biol 19 :937-949)、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)啟動子(例如 Alexandersson 等人，(2009)Plant J 61 :650-660)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LTP)啟動子(例如 US2009/0158464、US2009/0070893、和 US2008/0295201)、Y -玉米醇溶蛋白基因啟動子(Gamma-zein)啟動子(例如 Uead 等人，(1994)Mol CellBiol 14:4350-4359)、Ykafarin啟動子(例如Mishra等人，(2008)Mol BiolRep 35 :81-88)、球蛋白啟動子(例如Liu等人，(1998)Plant Cell R印17 :650-655)、豆球蛋白啟動子(例如US7211712)、早期胚乳啟動子(EEP)(例如 US2007/0169226 和 US2009/0227013)、B22E 啟動子(例如 Klemsdal 等人，(1991)Mol Gen Genet 228 :9-16)、油質(zhì)蛋白啟動子(例如 Plant 等人，(1994)Plant MolBiol 25 :193-205)、早期豐富蛋白(EAP)啟動子(例如US 7，321，031)、晚期胚胎形成豐富(LEA)蛋白(例如 Hval，Straub 等人，(1994)Plant Mol Biol 26 :617-630 ;Dhn 和 WSI18，Xiao &Xue (2001) Plant Cell Rep 20 :667-673)、In2_2 啟動子(De Veylder 等人，(1997)Plant Cell Physiol 38 :568-577)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)啟動子(例如 W093/01294)、PR 啟動子(例如 Cao 等人，(2006)Plant Cell R印6 :554_560，和 Ono 等人，(2004)BiosciBiotech Biochem 68 :803-807)、ACE1 啟動子(例如Mett等人，(1993)Proc Natl Acad SciUSA90 :4567-4571)、甾類化合物反應(yīng)性啟動子(例如Schena等人，(1991)ProcNatl AcadSci USA 88 :10421-10425，和 McNellis 等人，(1998) Plant J14 :247-257)、乙醇誘導(dǎo)型啟動子(例如 AlcA，Caddick 等人，(1988)NatBiotechnol 16 :177-180)、雌二醇誘導(dǎo)型啟動子(例如Bruce等人，(2000)Plant Cell 12 :65-79)、XVE雌二醇誘導(dǎo)型啟動子(例如Zao·等人，(2000)Plant J 24 :265-273)、VGE甲氧蟲酰肼誘導(dǎo)型啟動子(例如Padidam等人，(2003)Transgen Res 12 :101-109)、或TGV地塞米松誘導(dǎo)型啟動子(例如Bohner等人，(1999)Plant J 19 :87-95)?？色@得任何多核苷酸(包括分離或重組的受關(guān)注的多核苷酸)、編碼SuR的多核苷酸、重組酶位點(diǎn)、編碼重組酶的多核苷酸、調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子、啟動子、和包含TetOp序列的啟動子，并且通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法測定它們的核苷酸序列?？苫瘜W(xué)合成全長多核苷酸或者從化學(xué)合成的寡核苷酸裝配而成(Kutmeier等人，(1994)BioTechniques 17:242)。從寡核苷酸進(jìn)行裝配通常涉及合成重疊寡核苷酸、退火并連接那些寡核苷酸以及PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物。作為另外一種選擇，可分離或從合適來源產(chǎn)生多核苷酸，所述來源包括從組織或細(xì)胞中產(chǎn)生的cDNA庫、基因組庫、或從宿主中通過使用序列3’和5’末端特定引物的PCR擴(kuò)增直接分離、或通過使用受關(guān)注的多核苷酸特異性的核苷酸探針。然后可使用標(biāo)準(zhǔn)方法將通過PCR生成的擴(kuò)增核酸分子克隆進(jìn)可復(fù)制的克隆載體中。還可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法操縱所述多核苷酸，包括重組DNA技術(shù)、載體構(gòu)建、誘變和PCR(參見例如Sambrook等人，(1990)Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpringHarbor, NY ；Ausubel 等人，Eds. (1998)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons, NY)。當(dāng)多核苷酸、多肽或其它組分部分或完全地從其正常結(jié)合的組分(其它蛋白、核酸、細(xì)胞、合成試劑等)中分離出來時，它們是“分離的”。當(dāng)核酸或多肽為人工制成的或工程化得到、或源自人工或工程化的蛋白或核酸時，它們是“重組的”例如，插入載體或任何其它異源位置如重組生物的基因組，使得它不與通常側(cè)接天然存在的多核苷酸的核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的多核苷酸為重組多核苷酸。在體外或體內(nèi)從重組多核苷酸中表達(dá)的蛋白質(zhì)為重組多肽的實(shí)例。同樣地，天然不存在的多核苷酸序列，例如天然存在的基因的變體為重組序列。例如，本發(fā)明包括包含阻抑型啟動子的重組多核苷酸，所述啟動子包含可操作地連接至編碼磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物的多核苷酸的至少一個操縱子序列或阻抑型啟動子。在一些實(shí)例中，重組多核苷酸可包含可操作地連接至編碼磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物的多核苷酸的阻抑型啟動子，其中所述阻抑型啟動子包含一個tet操縱子。在一些實(shí)例中，編碼的磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物包含SEQID NO :3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ IDNO :3-419中的任一種具有至少85% (例如至少85%，90%，95%，97%，99%，100% )的序列同一性的氨基酸序列。阻抑型啟動子可包含可操作地連接至至少一種操縱子序列的肌動蛋白啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。在一些實(shí)例中，阻抑型啟動子包含如SEQ IDNO :855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或如本文所述與SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的多核苷酸序列。一旦多核苷酸或多肽接近至少一個細(xì)胞內(nèi)部，可使用將序列導(dǎo)入細(xì)胞或生物的任
何方法。將序列導(dǎo)入植物的方法是已知的并且包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、瞬時轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的方法、以及有性繁殖。穩(wěn)定摻入指示導(dǎo)入的多核苷酸被整合進(jìn)基因組并且能夠被子代遺傳。瞬時轉(zhuǎn)化指示導(dǎo)入的序列不整合進(jìn)基因組，使得子代不能從宿主得到遺傳?？墒褂萌魏问侄握先魏位蜷_關(guān)元件或它們的組合，例如可操作地連接至包含TetOp的啟動子的SuR和受關(guān)注的多核苷酸，包括例如穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、瞬時轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合、有性雜交或它們的任何組合。轉(zhuǎn)化規(guī)程以及用于將多肽或多核苷酸序列導(dǎo)入植物內(nèi)的規(guī)程可以根據(jù)被作為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的植物或植物細(xì)胞的類型而改變。將多肽和多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞的合適方法包括顯微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4 :320_334和美國專利6，300，543)、電穿孔(Riggs等人，(1986)PNAS 83 :5602_5606、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利 5，563，055 和 5，981，840)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski 等人，(1984) EMBOJ 3 2717-2722)、彈道粒子加速(美國專利 4，945，050,5, 879，918,5, 886，244 和 5，932，782 ；Tomes 等人，(1995) in Plant Cell, Tissue and Organ Culture !Fundamental Methods,ed. Gamborg & Phillips (Springer-Verlag, Berlin) ;McCabe 等人，(1988) Biotechnology6:923-926)。也參見 Weissinger 等人，(1988) Ann Revgenet 22 :421-477 ;Sanford 等人，(1987)ParticulateScience and Technology 5 :27-37 ；Christou 等人，(1988)Plant Physiol87 :671-674 ;Finer 和 McMullen(1991) In Vitro Cell Dev Biol27P 175-182(soybean) ；Singh 等人，(1998)Theor Appl Genet 96 :319-324 ;Datta 等人，(1990)Biotechnology 8 :736-740 ;Klein 等人，(1988)PNAS85 :4305-4309 ;Klein 等人，(1988)Biotechnology 6 :559-563 ;美國專利 5，240，855,5, 322，783 和 5，324，646 ；Klein 等人，(1988)Plant Physiol91 :440-444 ；Fromm 等人，(1990)Biotechnology8 :833-839 ；Hooykaas-VanSlogteren 等人，(1984)Nature 311 :763-764 ;美國專利 5, 736, 369 ；Bytebier 等人，(1987)PNAS 84 :5345-5349 ;De Wet 等人，(1985) TheExperimentalManipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman 等人，(Longman, New York),第 197-209 頁;Kaeppler 等人，(1990)Plant Cell Rep 9 :415-418 ;Kaeppler 等人，(1992)Theor Appl Genet 84 :560-566 ;D' Halluin 等人，(1992)PlantCell 4 :1495-1505 ；Li 等人，(1993)Plant Cell Rep 12 :250-255 ;Christou 和 Ford(1995)Ann Bot 75 :407-413 和Osjoda等人，(1996)Nat Biotechnoll4 :745_750。作為另外一種選擇，可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來將多核苷酸導(dǎo)入植物內(nèi)。經(jīng)由病毒DNA或RNA分子將多核苷酸導(dǎo)入植物的方法是已知的，參見例如美國專利5，889，191、5，889，190、5，866，785、5，589，367、5,316,931 ;和 Porta 等人，(1996)Mol Biotech5 :209-221。術(shù)語植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、從中可再生出植物的植物細(xì)胞或植物組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、在植物或植物部分中完整的植物塊和植物細(xì)胞如胚芽、花粉、胚珠、種子、胚乳、分生組織、葉、花、莖、果實(shí)、仁、穗、殼、莢、桿、根、根尖、花藥等。也包括再生植株的子代、變體和突變體再生植株。 在一些實(shí)例中，可通過轉(zhuǎn)化質(zhì)體或弓I導(dǎo)SuR轉(zhuǎn)錄物或多肽進(jìn)入質(zhì)體將SuR導(dǎo)入質(zhì)體。取決于所需的產(chǎn)物和/或用途，可使用轉(zhuǎn)化核或質(zhì)體的任何方法。質(zhì)體轉(zhuǎn)化提供如下優(yōu)點(diǎn)包括高轉(zhuǎn)基因表達(dá)、對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的控制、表達(dá)多順反子信息的能力、經(jīng)由同源重組的位點(diǎn)特異性整合、消除轉(zhuǎn)基因沉默和位點(diǎn)效應(yīng)、經(jīng)由單親質(zhì)體基因遺傳和在細(xì)胞器中對表達(dá)多肽的螯合作用控制轉(zhuǎn)基因傳染，這能夠消除對細(xì)胞質(zhì)組件可能的不利影響(例如參見包括 Heifetz (2000)Biochimie 82 :655-666 ;Daniell 等人，(2002)Trends PlantSci 7 :84-91 ；Maliga(2002)Curr Op Plant Biol5 :164-172 ；Maliga(2004)Ann Rev Plant Biol 55-289-313 ;Daniell 等人，(2005) Trends Biotechnol 23 :238-245 ;以及 Verma 和Daniell(2007)PlantPhysiol 145 :1129-1143)。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法和組合物是為人們所熟知的，例如，轉(zhuǎn)化方法包括(Boynton等人，(1988) Science 240 :1534-1538 ；Svab 等人，(1990)PNAS87 :8526-8530 ；Svab 等人，(1990)Plant Mol Biol 14 :197-205 ;Svab 等人，(1993)PNAS 90 :913-917 ;Golds 等人，(1993)Bio/Technology 11 :95-97 ;0，Neill 等人，(1993)Plant J 3 :729-738 ；Koop 等人，(1996) Plantal99 :193-201 ;Kofer 等人，(1998) In Vitro Plant 34 :303-309 ;Knoblauch等人，(1999)Nat Biotechnol 17 :906-909);以及質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體、兀件和選擇(Newman等人，(1990)Genetics 126 :875-888 ；Goldschmidt-Clermont, (1991)Nucl Acids Res 19 4083-4089 ;Carrer，等人，(1993)Mol Gen Genet241 :49-56 ;Svab 等人，(1993)PNAS 90:913-917 ;Verma 和 Daniell(2007)Plant Physiol 145:1129-1143)。用于控制質(zhì)體中的基因表達(dá)的方法和組合物是為人們所熟知的，包括(McBride等人· (1994)PNAS 91 :7301-7305 ;I ossl s人，(2005)Plant CellPhysiol 46 :1462-1471 ；Heifetz (2000) Biochemie 82 655-6bb Surzycki 等人，(2007) PNAS 104 :17548-17553 ;美國專利5，576，198和5，925，806 ；W0 2005/0544478)，以及將多核苷酸和/或多肽導(dǎo)入質(zhì)體的方法和組合物，包括翻譯融合到轉(zhuǎn)運(yùn)肽中(例如，Comai等人，(1988) J Biol Chem263 15104-15109)。SuR多核苷酸和多肽經(jīng)由易于進(jìn)入細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)劑提供調(diào)控質(zhì)體基因表達(dá)的手段。例如，使用用于葉綠體的T7表達(dá)系統(tǒng)(McBride等人，(1994) PNAS 91 :7301-7305)，SuR可用于控制核T7聚合酶表達(dá)。作為另外一種選擇，可將SuR調(diào)控的啟動子整合進(jìn)質(zhì)體基因組并可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸和表達(dá)并從核基因組輸入的SuR、或整合進(jìn)所述質(zhì)體。在所有情況下，磺酰脲類化合物用于有效地調(diào)控受關(guān)注的多核苷酸?；酋ｋ孱惢衔锟筛鶕?jù)本領(lǐng)域任何已知的適用方法來施用。例如磺酰脲類化合物可用于葉施用、灌根施用、出苗前施用、出苗后施用、或種子處理施用。阻抑型啟動子經(jīng)由易于進(jìn)入細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)劑提供調(diào)控質(zhì)體基因表達(dá)的手段。TetR或SuR調(diào)控的啟動子包括但不限于SEQ IDNO =855-860或如本文所述的啟動子，其具有與SEQ ID NO :855-860至少95%的序列同一性，可將其整合進(jìn)質(zhì)體基因組并可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸和表達(dá)并從核基因組輸入的阻遏物、或整合進(jìn)所述質(zhì)體。在所有情況下，四環(huán)素化合物或磺酰脲類化合物用于有效地調(diào)控受關(guān)注的多核苷酸。任何類型的細(xì)胞和/或生物，無論是原核的或真核的，可與基因開關(guān)組件、基因開關(guān)組合物和/或方法一起使用。例如，任何細(xì)菌細(xì)胞系統(tǒng)可用所述組合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如大腸桿菌、農(nóng)桿菌屬和其它細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備和噬菌體使用的方法詳見例如CurrentProtocols in MolecularBiology (Ausubel 等人(eds. ) (1994) a joint venture betweenGreenePublishing Associates, Inc. and John Wiley 和 Sons, Inc.)?；蜷_關(guān)組件、基因開關(guān)組合物和/或系統(tǒng)可與任何真核細(xì)胞系一起使用，包括酵母、原生生物、藻類、昆蟲細(xì)胞、禽類細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。例如，多種商業(yè)和/或公開可用的釀酒酵母菌株是可用的，用于轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞的質(zhì)粒同樣如此。例如，菌株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection) (ATCC, Manassas, VA)并且包括YeastGenetic Stock Center目錄，其在1998年移至ATCC。其它酵母品系如裂殖酵母 (S. pombe)和畢赤酵母(P. pastoris)等也是可用的。例如，酵母轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備等方法詳見例如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，(eds. ) (1994) a jointventure between Greene PublishingAssociates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,具體見Unit 13)。酵母的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化、電穿孔和醋酸鋰方法。酵母的一種通用高效轉(zhuǎn)化方法在Gietz和Woods ((2002) Methods Enzymol 350 :87-96)中進(jìn)行了描述，該方法使用醋酸鋰、PEG 3500和載體DNA?；蜷_關(guān)組件和/或基因開關(guān)組合物可用于哺乳動物細(xì)胞如CH0、HeLa, BALB/c、成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞等。多種可商購獲得的感受態(tài)細(xì)胞系和質(zhì)粒是為人們所熟知的并且易得的，例如得自ATCC (Manassas, VA)。用于轉(zhuǎn)化和哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分離多核苷酸可通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如哺乳動物和其它真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備、及病毒使用的方法詳見例如 Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel 等人，(eds.)(1994)a joint venture between GreenePublishing Associates,Inc. and John Wiley &Sons, Inc.,具體見Unit 9)。例如，多種方法是可用的,例如磷酸I丐轉(zhuǎn)染、電穿孔、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、以及病毒技術(shù)。任何植物物種可與基因開關(guān)組件、基因開關(guān)組合物、和/或方法一起使用，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。植物的實(shí)例包括但不限于玉米(Zea mays)、蕓苔屬物種(例如油菜、蕪菁、芥菜)、蓖麻、棕櫚、苜猜(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、裸麥(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgar)、小米(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、龍爪稷(Eleusinecoracana)、向日葵(Helianthus annuus)、紅花(Carthamus tinctorius)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草屬植物(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉(Gossypiumbarbadense、Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffea 屬物種)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘(Citrus 屬物種)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蓮(Musa 屬物種)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficuscasica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、撤攬(Oleaeuropaea)、番木瓜果(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亞堅果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘鹿(Saccharum屬物種)、擬南芥、燕麥(Avena屬)、大麥(Hordeum屬)、豆科植物如瓜爾豆、刺槐豆、葫蘆巴、四季豆、豇豆、綠豆、蠶豆、小扁豆和鷹嘴豆、蔬菜、觀賞植物、草本植物和針葉樹。蔬菜包括西紅柿(Lycopersicon esculentum)、萵苣(例如Lactucasativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利馬豆(Phaseolus Iimensis)、豌豆(Pisium 屬物種、Lathyrus屬物種)、和黃瓜屬物種如黃瓜(C. sativus)、香瓜(C. cantalupensis)和甜瓜(C. melo)。觀賞植物包括杜匿$花(Rhododendron屬物種)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、薔薇(Rosa屬物種)、郁金香(T ulipa屬物種)、水仙花(Narcissus 屬物種)、矮牽?；?Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品紅(Euphorbia pulcherrima)和菊花。針葉樹包括松樹，例如火炬松(Pinus taeda)、濕地松(Pinus elliotii)、美國黃松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和福射松(Pinus radiata)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii);異葉鐵杉(Tsuga canadensis)、北美云杉(Picea glauca)、紅杉(Sequoiasempervirens)、冷杉如銀揪(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)以及雪松如西岸紅雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黃檜(Chamaecyparisnootkatensis)。已經(jīng)轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞和/或組織可使用常規(guī)方法在植物中生長(參見例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Rep 5 :81-84)。然后這些植物可生長并自花授粉、回交和/或遠(yuǎn)交，并且所得子代具有鑒定的期望特性。可培養(yǎng)兩代或更多代以確保特性得到穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子。提供了用這種方法轉(zhuǎn)化的種子，其具有基因開關(guān)組件、阻遏物、阻抑型啟動子、基因開關(guān)系統(tǒng)、受關(guān)注的多核苷酸、重組酶、重組事件最終產(chǎn)物、和/或編碼穩(wěn)定摻入它們的基因組的SuR的多核苷酸。還可表征具有穩(wěn)定摻入DNA構(gòu)建體的植物和/或種子的表達(dá)、農(nóng)學(xué)特性和拷貝數(shù)。序列同一性可用于比較兩個多核苷酸或多肽序列的一級結(jié)構(gòu)、描述第一序列相對于第二序列的一級結(jié)構(gòu)、和/或描述序列關(guān)系如變體和同源物。序列同一性測量兩個序列當(dāng)比對最大符合性時的相同殘基數(shù)?？墒褂糜嬎銠C(jī)實(shí)施的算法分析序列關(guān)系。兩個或更多個多核苷酸或兩個或更多個多肽間的序列關(guān)系可通過計算序列的最佳比對并給比對的匹配和空位評分來確定，這產(chǎn)生百分比序列同一性和百分比序列相似性。多核苷酸關(guān)系也可基于比較其每個編碼的多核苷酸的進(jìn)行描述。用于比較或分析序列的許多程序和算法是已知的。除非另作說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10(GCG，Accelrys, San Diego, CA)獲得的值,使用以下參數(shù)核苷酸序列的％同一'丨生和％相似性使用GAPWeight 50和Length Weight 3,以及nwsgapdna. cmp計分矩陣；氨基酸序列的核苷酸序列的％同一性和％相似性使用GAP Weight 8和LengthWeight 2，以及BL0SUM62計分矩陣(Henikoff & Henikoff (1992)PNAS89 :10915-10919)。GAP 使用 Needleman &Wunsch (1970) J Mol Biol48 :443-453的算法，以找出兩個完整序列之間使匹配數(shù)最大化和空位數(shù)最小化的比對結(jié)果。作為另外一種選擇，多核苷酸和/或多肽可使用其它序列工具進(jìn)行評估。例如，可使用BLAST比對工具評估多核苷酸和/或多肽。局部比對空位簡單地由一對序列片段組成，比較每個序列。Smith-Waterman或Sellers算法的變型將找到評分不能通過延伸或修剪改善的所有片段對，它們稱為高分片段對(HSP)。BLAST比對的結(jié)果包括統(tǒng)計測量以指出BLAST評分可期望僅出自偶然的可能性。原始評分S從與每個比對序列相關(guān)聯(lián)的空位和取代數(shù)計算得到，其中較高的相似性評分指示較顯著的比對結(jié)果。取代評分通過查找表提供(參見PAM，BLOSUM)?？瘴辉u分通常計算為G(空位開放罰分)和L(空位延伸罰分)的總數(shù)。對于空位的長度n，空位罰分將為G+Ln?？瘴涣P分G和L為經(jīng)驗值，但是習(xí)慣上為G選擇高值(10-15)并且為L選擇低值(1-2)。二進(jìn)制值S’源自原始比對評分S，其中使用的評分系統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)特性已經(jīng)被納入計算。針對所述評分系統(tǒng)對二進(jìn)制值進(jìn)行歸一化，因此它們可用于比較不同搜索的比對評分。E值或期望值描述具有相似評分的序列將在數(shù)據(jù)庫中偶然出現(xiàn)的可能性。預(yù)測具有等同評分或比S更好的評分的不同比對的數(shù)量，期望所述評分在數(shù)據(jù)庫搜索中偶然出現(xiàn)。E值越小，比對結(jié)果越顯著。例如，具有e_117的E值的比對意味著具有類似評分的序列幾乎不可能完全偶然地出現(xiàn)。此外，需要隨機(jī)氨基酸對比對的期望評分為負(fù)值，否則長比對將趨于具有獨(dú)立的高評分，無論比對的片段是否相關(guān)。此外，BLAST算法使用合適的取代矩陣、核苷酸或氨基酸并且對于空位比對使用空位形成和延伸罰分。例如，多肽序列的BLAST比對和比較通常使用BLOSUM62矩陣、空位存在罰分11和空 位延伸罰分I完成。除非另外指明，BLAST分析的報告評分使用BLOSUM62矩陣、空位存在 罰分11和空位延伸罰分I完成。UniProt蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫為功能和結(jié)構(gòu)蛋白數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，并且提供穩(wěn)定的、全面的、完整分類的、注解豐富和精確的蛋白質(zhì)序列知識庫，其具有廣泛的交叉引用和科學(xué)界可自由訪問的查詢界面。UniProt位點(diǎn)具有一個工具UniRef，其提供的蛋白質(zhì)集具有與數(shù)據(jù)庫中的受關(guān)注蛋白質(zhì)序列50%、90%或100%的序列同一性。例如使用TetR(B) (UniProt參考P04483)提供18個蛋白質(zhì)的集合，它們具有與P04483 90%的序列同一性。四環(huán)素阻遏物的特性、結(jié)構(gòu)域、基序和功能是為人們所熟知的，它們是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和測定法評估的任何來源的阻遏物(包含一個或多個氨基酸取代)。D類TetR蛋白的結(jié)構(gòu)包含10個α螺旋，其具有連接環(huán)和轉(zhuǎn)角。3個N-末端螺旋形成DNA-結(jié)合HTH結(jié)構(gòu)域，其與其它DNA結(jié)合蛋白中的HTH基序取向相反。該蛋白的核心由螺旋5-10形成，包含二聚體界面結(jié)構(gòu)域，并且每個單體包含用于配體/結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合袋和二價陽離子輔因子(Kisker等人，(1995) J Mol Biol 247 :260-180 ;0rth 等人，(2000)Nat Struct Biol 7 :215-219)。任何氨基酸變化可包含非保守或保守氨基酸取代。保守取代一般指交換一個氨基酸與另一個具有相似化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)特性的氨基酸(參見例如Dayhoff等人，(1978)Atlas ofProteinSequence and Structure, Natl Biomed Res Found, Washington, DC)。已經(jīng)根據(jù)評估的特性開發(fā)了不同的類似氨基酸類別，所述特性如酸性對堿性、極性對非極性、兩親性等，并且當(dāng)評估任何取代或取代組合的可能效應(yīng)時，可使用它們。已經(jīng)鑒定和/或溯源了多個TetR變體并且廣泛地研究了它們。在四環(huán)素阻遏物系統(tǒng)中，已經(jīng)廣泛使用多種突變、修改形式和/或它們的組合的效應(yīng)廣泛地表征和/或改變四環(huán)素阻遏物的特性，例如輔因子結(jié)合、配體結(jié)合常數(shù)、動力學(xué)和解離常數(shù)、操縱子結(jié)合序列限制、協(xié)同性、結(jié)合常數(shù)、動力學(xué)和解離常數(shù)以及融合蛋白活性和特性。變體包括在四環(huán)素或其類似物的存在下具有結(jié)合操縱子序列的反式表型的TetR變體、具有改變的操縱子結(jié)合特性的變體、具有改變的操縱子序列特異性的變體和具有改變的配體特異性及融合蛋白的變體。參見例如 Isackson &Bertrand(1985)PNAS 82 :6226-6230 ；Smith &Bertrand (1988) J Mol Biol203 :949-959 ;Altschmied 等人，(1988) EMBO J 7 :4011-4017 ；Wissmann 等人，(1991)EMBO J 10 :4145-4152 ;Baumeister 等人，(1992) J Mol Biol226 1257-1270 ;Baumeister 等人，(1992)Proteins 14 :168-177 ;Gossen &Bujard(1992)PNAS89 :5547-5551 ;Wasylewski 等人，(1996) J Protein Cheml5 :45-58 ;Berens 等人，(1997)J Biol Chem 272 :6936-6942 ;Baron 等人，(1997)Nucl Acids Res 25 :2723-2729 ;Helbl& Hillen(1998) J Mol Biol276 :313-318 ;Urlinger 等人，(2000)PNAS 97:7963-7968;Kamionka 等人，(2004)Nucl Acids Res 32:842-847 ；Bertram 等人，(2004) J MolMicrobiolBiotechnol 8 :104-110 ;Scholz 等人，(2003) J Mol Biol 329:217-227;和US2003/0186281。
實(shí)施例提供以下實(shí)施例以示出了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，但是不應(yīng)將其視為限制或換句話講受任何方面、實(shí)施方案、元件或它們的任何組合的限制。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說任何方 面、實(shí)施方案、元件、或它們的任何組合的修改形式是顯而易見的。實(shí)施例I :磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物(SuR)A.計算模型D類四環(huán)素阻遏物的3-D晶體結(jié)構(gòu)(分離自大腸桿菌；結(jié)合TET的二聚體，1DU7 (Orth等人，(2000) Nat Struct Biol 7:215-219);和結(jié)合DNA 的二聚體，IQPI (Orth等
人，(2000) Nat Struct Biol 7 :215-219),用作通過計算機(jī)用噻磺隆(Ts,Harmony & )分子在配體結(jié)合袋中取代四環(huán)素(TET)分子的設(shè)計架構(gòu)。TET和磺酰脲類(SU) —般是大小類似的并且具有基于芳族環(huán)的結(jié)構(gòu)，其具有氫鍵供體和受體。然而，在四環(huán)素家族和SU家族分子之間存在顯著差異。TET是內(nèi)部剛性的并且是相當(dāng)平的，具有一個有羥基和酮基的高氫鍵面，IogP -O. 3?；酋ｋ孱?SU)具有較高的柔性和芳香性，有一個通常連接取代苯、吡啶、或噻吩(在Harmony1I情況下)的核心磺酰基-脲部分，一側(cè)具有取代的嘧啶或另一側(cè)具有l(wèi)，3，5-三嗪。雖然具有不同的功能基團(tuán)，Harmony1;的IogP與TET的IogP相似(在pH 7為 O. 02)。最好構(gòu)成的Harmony 分子通過在計算機(jī)上在TetR結(jié)合袋中的
分子建模進(jìn)行定位?；谶@個模型，測定出十七個氨基酸殘基位點(diǎn)(來自單體A的60、64、82、86、100、104、105、113、116、134、135、138 和 139 以及來自單體 B 的位點(diǎn) 147、151、174 和
177，使用TetR(B)編號)足夠接近對接的:Harmony“以進(jìn)入結(jié)合表面。使用計算機(jī)側(cè)鏈優(yōu)化以設(shè)計在17個位點(diǎn)的每一個處的氨基酸組，認(rèn)為這些位點(diǎn)是與SU結(jié)合最相容的。庫位點(diǎn)處的氨基酸選擇通過空間和物理化學(xué)方面的考慮進(jìn)行確定，從而使配體對接到模型配體袋中。這產(chǎn)生在17個位點(diǎn)(4、5、4、4、5、3、8、11、10、10、8、8、7、9、6、7和5)具有氨基酸的庫，設(shè)計的總庫大小為4X1013。選擇來自TnlO的野生型B類TetR作為起始分子以產(chǎn)生改組衍生物(SEQ ID NO 2)。它與在計算機(jī)設(shè)計中使用的序列略有不同(P0ACT4，D類，對于其高分辨率晶體結(jié)構(gòu)1DU7是可用的)，但是僅輕微的影響配體結(jié)合。商業(yè)合成編碼TetR的起始多核苷酸并且加入限制性位點(diǎn)以方便庫構(gòu)造和進(jìn)一步的操縱(DNA2. O, Menlo Park, California, USA)。加入的限制性位點(diǎn)包括5’末端的NcoI位點(diǎn)、配體結(jié)合域(LBD) 5’的SacI位點(diǎn)和在終止密碼子之后的AscI位點(diǎn)。庫構(gòu)造可定位在 480bp的DNA片段內(nèi)，該片段包含配體結(jié)合區(qū)域以避免在其它區(qū)域如DNA結(jié)合域中的非故意的突變。合成基因可操作地連接阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子Pbad的下游，使用NcoI/AscI以產(chǎn)生TetR表達(dá)載體pVER7314。在編碼區(qū)5’末端的NcoI位點(diǎn)添加所述編碼區(qū)導(dǎo)致甘氨酸插入到氨基酸位點(diǎn)一(SEQ IDNO 2)的N-末端甲硫氨酸之后。除非另外指明，這一序列用作所有測定法中的野生型TetR對照，并且觀察到的活性等同于無絲氨酸插入的TetR(SEQID N0:1)。然而，所有提到的氨基酸位點(diǎn)和設(shè)計并觀察到的改變使用野生型TetR(B)氨基酸編號(207aa)，例如 SEQ ID NO :1。B.庫設(shè)計由于在許多彼此貼近的位點(diǎn)處的大量設(shè)計的取代，計算的庫(表1，設(shè)計庫)不易用小量簡并密碼子編碼。為此原因，在實(shí)驗室中加工并測試的序列庫特征在于在6/17位點(diǎn)處的設(shè)計氨基酸組、在1/17位點(diǎn)處的略微擴(kuò)大、以及在10/17位點(diǎn)處的完全簡并(NNK密碼子)(表I)。T這導(dǎo)致高得多的序列多樣性，總計3 X IO19個序列。·表I :
殘基I野生型殘基I設(shè)計庫
60 LALKMALKM
64 HANQHLANQHL
82NANSTANST
86FMFWYMFWY
100~ HHMFWY全部 20 個 aa
104~RARGARG
105~PANDGPSTV全部 20 個 aa
Τ 3~LARNDQEKMSTV~ARNDQEKMSTVIPLGH
Τ 6~QARNQEIKMTV 全部 20 個 aa
134~LARILKMFWYV 全部 20 個 aa
135~SARNQHKSTARNQHKST
138~GAHKMFSYW全部 20 個 aa
139~ HARQHLKY全部 20 個 aa147~[elARQEHLKMY| 全部 20 個 aa
151 ~ HAQHKIL全部 20 個 aa
174~ IARQELKM全部 20 個 aa
177~ FARLKM全部 20 個 aa通過重疊延伸設(shè)計并裝配庫I寡核苷酸(Ness等人，(2002)NatBiotech 20:1251-1255)以生成由SacI/AscI限制性位點(diǎn)界定的PCR片段。裝配所有庫片段的條件如下將構(gòu)成庫的寡核苷酸歸一化以濃縮成ΙΟμΜ，然后混合相同的體積以產(chǎn)生ΙΟμΜ集合。庫片段的PCR擴(kuò)增在六個相同的25μ I反應(yīng)體系中進(jìn)行,其包含1μΜ匯集的庫寡核苷酸；O. 5 μ M各種拯救引物L(fēng)1 :5’和LI :3’和200 μ M dNTP，在Herculase II引導(dǎo)反應(yīng)中(Stratagene, La Jolla, CA，USA)。PCR條件為98°C I分鐘(初始變性)，隨后為25個如下循環(huán)95°C變性20秒，在45°C和55°C (梯度)之間退火45秒，然后在72°C延伸模板30秒。最終在72°C延伸5分鐘，完成反應(yīng)。通過用SacI/AscI消化從P_-tetR表達(dá)載體 PVER7314中切除野生型TetR(B)。pVER7314主鏈片段用小牛腸磷酸酶處理并純化，然后完全延伸的庫片段集( 500bp)用SacI/AscI限制性酶消化并插入以生成LI質(zhì)粒庫。給得自庫LI的大約50個隨機(jī)克隆測序并將信息匯集以進(jìn)行質(zhì)量控制。結(jié)果顯示提供了幾乎所有靶向多樣性組的氨基酸(數(shù)據(jù)未示出)。測序結(jié)果顯示17%的序列包含終止密碼子。這小于預(yù)測的27% (例如10個具有1/32密碼子的位點(diǎn)為終止密碼子，I-(31/32)1° 27%)。此外，序列分析顯示13%的克隆具有移碼，這是由于重疊延伸過程中的錯誤。因此，總體上大約30%的庫由編碼截短多肽的克隆組成。C.篩詵律立為了測試庫與噻磺隆(Ts)反應(yīng)的稀有克隆，開發(fā)了基于大腸桿菌的靈敏基因篩選。該篩選是建立的測定體系的修改形式(Wissmann等人，(1991)Genetics 128 225-232)。該篩選由阻遏物預(yù)篩選及隨后的誘導(dǎo)篩選組成。對于阻遏物預(yù)篩選，開發(fā)了一種基因級聯(lián)，從而使編碼卡那霉素抗性的nptIII基因處于Iac啟動子的控制之下。Iac啟動子受到Lac阻遏物的阻遏，該蛋白由IacI編碼，其表達(dá)繼而受到tet啟動子(PtetR)的控制。tet啟動子受到TetR的阻遏，其阻止LacI的產(chǎn)生并因此最終使卡那霉素的表達(dá)受到抑制。因為tet調(diào)節(jié)子具有雙啟動子，一個啟動子用于tetR, —個啟動子用于tetA,相同的菌株用編碼報告酶β -半乳醣苷酶的大腸桿菌IacZ基因進(jìn)行工程化，該酶處于tetA啟動子(PtetA)的控制之下。雙調(diào)節(jié)子編碼IacI和lacZ，然后它由強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子界定大腸桿菌 RNA 核糖體操縱子終止子 rrnB T1-T2 (Ghosh 等人，(1991) J Mol Biol 222 :59-66)和大腸桿菌RNA聚合酶亞基C終止子rpoC，使得在任一個tet啟動子方向的偽轉(zhuǎn)錄閱讀將不會干擾任何其它轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。在功能TetR的存在下，所述菌株表現(xiàn)出lac_表型并且菌落能夠容易地被新型化學(xué)物質(zhì)與X-gal誘導(dǎo)，其中誘導(dǎo)提供增強(qiáng)的藍(lán)色菌落顏色。此外，在液體培養(yǎng)物中用新型化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)能夠通過使用β-半乳醣苷酶測定法與色度或熒光底物一起進(jìn)行定量測量。
為了使SU化合物更好地滲入大腸桿菌(Robert LaRossa-DuPont personalcommunication),宿主菌株tolC基因座用收到的Plac-nptlll報告基因敲除。強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子T22來自鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)噬菌體P22，它位于Iac啟動子的上游以防止條件型卡那霉素抗性標(biāo)記的下調(diào)遺漏表達(dá)。最終工程化菌株的名稱為大腸桿菌KM3。將改組tetR LBD的種群克隆進(jìn)基于ApVColEl的載體pVER7314中，該載體在Pbad啟動子之后。t這被設(shè)計用于使人們能夠通過改變生長培養(yǎng)基中的阿拉伯糖濃度來精密控制 TetR 的表達(dá)(Guzman 等人，(1995) J Bacteriol 177 :4121-4130)。盡管受到 Pbad 啟動子的控制，TetR蛋白在缺乏加入的阿拉伯糖的情況下的表達(dá)水平足以能夠選擇有卡那霉素抗性的菌株KM3。然而，可通過加入阿拉伯糖增加表達(dá)，例如如果期望測定嚴(yán)格性發(fā)生改變時。P.庫篩詵在裝配LI寡核苷酸并收集載體PVER7314后，在不存在目標(biāo)配體(“apo_阻遏物”)將所得庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株KM3中并置于包含50 μ g/mL羧芐青霉素的LB平板上以選擇庫質(zhì)粒，并且該平板包含60 μ g/mL的卡那霉素以選擇活性阻遏物種群。這個選擇種群的 DNA序列分析指示這個步驟高度富集了多個庫位點(diǎn)。此外，這個步驟消除了具有早熟終止密碼子和/或移碼突變的克隆。隨后，在HarmonyR (Ts)的存在下篩選這些apo-阻遏物序列以獲得阻遏物活性的改變，這通過將來自384-孔樣式的液體培養(yǎng)物的Knf預(yù)選種群重復(fù)接種到M9瓊脂上，所述瓊脂包含O. 1%的甘油作為碳源，O. 04%的酸水解酪素(以防止由施用磺酰脲類引起的支鏈氨基酸缺乏)，50μ g/mL的羧節(jié)青霉素用于質(zhì)粒維持,O. 004% X-gal用于檢測β -半乳醣苷酶活性，以及20 μ g/mL的+/-SU誘導(dǎo)劑Ts。從一組接近20，000個菌落中鑒定初始hits，篩選所述菌落以獲得在30°C孵育2天后對Ts的響應(yīng)。然后在相同條件下但是在96-孔樣式中鑒定的十四個推定hits再進(jìn)行測試。DNA序列分析揭示克隆L1-3和L1-19是相同的并且最強(qiáng)的響應(yīng)11^8仏-2、-3(19)、-5、-9、-11和-20)在多個庫位點(diǎn)處具有顯著的豐度，說明直接或間接地涉及配體相互作用。然后再篩選相同庫以再鑒定10個hits，從而克隆總數(shù)達(dá)到23個。隨后在相同平板測定樣式中用一組九個登記為商用的磺酰脲類(SU)化合物(表2)篩選全部23個推定hits，發(fā)現(xiàn)其中11個hits對其它SU配體響應(yīng)顯著(表3)。對于這一實(shí)驗，編碼Llhits或wt TetR(SEQ IDNO 2)的大腸桿菌克隆以96-孔樣式排列并且印在包含或不包含20 μ g/ml的測試SU化合物的M9X-gal測定培養(yǎng)基中。在30°C下生長48小時后將所述平板數(shù)碼拍照并將菌落顏色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成半乳醣苷酶活性的相對值。使用的誘導(dǎo)劑20ppm的噻吩磺隆(Ts)、甲磺隆(Ms)、甲B密磺隆(Sm)、胺苯磺隆(Es)、苯磺隆(Tb)、氯嘧磺隆(Ci)、煙嘧磺隆(Ns)、砜嘧磺隆(Rs)、氯磺隆(Cs)，并用0. 4 μ M的去水四環(huán)素(ate)作為陽性對照以誘導(dǎo)wt TetR0 一些磺酰脲類化合物，尤其是氯嘧磺隆、胺苯磺隆、和氯磺隆是比起始配體HarmonyKE強(qiáng)的活化劑。表2 SU化合物
_____商業(yè)應(yīng)用_
P塞石黃隆(Ts)Harmony"谷物、玉米、大豆
甲磺隆(Ms)__Ally"__谷物、牧草_
甲嘧磺隆(Sm)__Oust⑧__植物管理_
胺苯續(xù)隆(Es)Mustergl低齊酸菜籽(canola)
苯磺隆(Tb)__Express"__谷物、向日葵
氯嘧磺隆(Ci)__Classic"__K3-_
煙嘧磺隆(Ns)__Accentgl__^_
現(xiàn)σ密橫隆(Rs)Matrix 1玉米、番恭、馬鈴薯
氯磺隆(Cs)Gleanlfe谷物

表3
__誘導(dǎo)劑
克隆無 Ts Ms Sm Es Tb CiNs RsCs ate
L1-2 1.0 1.6 1.9 4.7 5.8 1.7 13.61.3 1.34.1 1.2
L1-7 0.0 0.1 0.2 6.4 0.1 0.2 16.50.1 0.23.1 0.0
L1-9 0.3 1.1 1.2 0.6 11.8 0.4 9.8O j 0.423.6 0.3
Ll-20 1,4 2.6 12.4 6.0 15.0 2.6 13,51.6 2.022.0 2.0
Ll-22 0.1 0.0 0.1 17.2 0.3 0.3 10.40.2 0.10.2 0.0
LI-24 0.1 0.3 0.4 3.1 0.2 1.6 22.10.3 0.33.3 0.1
LI-28 0.0 0.1 18.8 1.1 0.8 0.3 14.60.1 0.25.8 0.0
Ll-29 0.0 0.0 13.5 2.7 1.7 0.3 20.90.1 0.115.8 0.0
Ll-31 0.3 0.9 0.5 0.9 13.7 0.1 1.10.5 0.41.4 0.4
Ll-38 9.5 16.7 14.7 18.3 14.8 15.8 15.38.7 9.514.0 6.4
Ll-44 0.2 1.9 2.9 0.4 2.4 0.4 6.70.4 0.312.0 0.2
TetR 丨 00 丨 0.0 I 0.0 I 0.1 0.0 0.1 0.10.1 0.10.0 25.0

對庫I的初始篩選也檢測了具有反式阻遏物活性(SEQ IDNO =412-419)的庫成員， 其中所述多肽在SU配體的存在下結(jié)合操縱子。這些hits示出了在無SU配體的情況下的 β -半乳醣苷酶表達(dá)，當(dāng)加入所述配體如噻吩磺隆時所述表達(dá)大幅減少。隨后在如上所述 的相同平板測定樣式中用一組九個登記為商用的磺酰脲類(SU)化合物(表3)篩選這些 hits,發(fā)現(xiàn)其中8個hits對其它SU配體響應(yīng)顯著(表4)。
表4

____誘導(dǎo)劑
克隆空白 Ts Ms Sm Es Tb Ci Ns Rs Cs ate L1-18 1.34 1.13 0.79 0.94 0.37 1.65 0.36 1.44 2.55 1.22 2.35 L1-21 2.88 0.79 0.89 2.39 0.61 2.13 0.07 2.74 2.31 0.89 2.81 LI -25 1.17 0.64 0.32 0.63 0.13 1.72 0.1 I 1.21 1.08 0.28 1.22 L1-33 7.59 5.51 4.29 5.02 2.11 4.71 0.76 5.34 10.32 3.74 8.25 L1-34 2.37 2.97 1.47 2.00 1.33 2.26 0.43 2.91 2.30 0.85 3.68 L1-36 1.52 0.48 0.38 0.50 0.20 0.57 0.21 1.81 1.84 0.24 1.70 L1-39 3.65 1.42 0.75 0.91 0.60 0.97 0.49 3.03 4.72 0.89 4.92 L1-41 4.05 1.46 0.56 0.67 0.18 1.41 0.39 2.75 4.05 0.61 4.21 TetR 0.00 0.08 0.08 0.23 0.06 0.13 0.18 0.18 0.20 0.15 10.45E.關(guān)聯(lián)第一輪改組結(jié)果與結(jié)構(gòu)模型在多數(shù)庫位點(diǎn)發(fā)生顯著的富集，其中富集包括偏愛特定氨基酸以及偏排斥特定氨基酸。初始篩選涉及用于鑒定阻遏物和去阻遏物功能的兩個階段。富集發(fā)生在篩選的兩個階段。在第一階段，位點(diǎn)通過選擇“apo阻遏物”，即，在缺乏配體的情況下阻遏基因轉(zhuǎn)錄的蛋白富集。在第二階段，位點(diǎn)通過選擇“活化劑”，即，在配體的存在下允許基因轉(zhuǎn)錄的蛋白富集。位點(diǎn)可通過選擇判據(jù)、兩個判據(jù)、或不選擇判據(jù)富集。對阻遏物活性的第一輪篩選結(jié)果如下所述

權(quán)利要求
1.用于調(diào)控植物中或種子中包含的植物細(xì)胞中的表達(dá)的方法，所述方法包括 (a)提供包含磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)的植物細(xì)胞，所述基因開關(guān)控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，其中所述植物細(xì)胞為耐磺酰脲類植物細(xì)胞；以及； (b)提供調(diào)控所述基因開關(guān)的磺酰脲類化合物，其中所述磺酰脲類化合物通過葉施用、灌根施用、出苗前施用、出苗后施用、或種子處理施用來提供。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)改變所述植物細(xì)胞的表型。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)改變所述植物細(xì)胞的基因型。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中提供所述磺酰脲類化合物激活所述受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物或雙子葉植物。
6.權(quán)利要求5的方法,其中所述植物細(xì)胞來自玉米、稻、高粱、甘鹿、大麥、燕麥、小麥、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、煙草、向日葵、紅花、或苜蓿。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)包含可操作地連接至受關(guān)注的多核苷酸的阻抑型啟動子，其中所述阻抑型啟動子包含tet操縱子。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)包含選自SEQIDNO :855、856、857、858、859和860 的阻抑型啟動子、或與 SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的阻抑型啟動子。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述磺酰脲類化合物包括嘧啶基磺酰脲類化合物、三嗪基磺酰脲類化合物、或噻唑基脲類化合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述磺酰脲類化合物包括氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、煙嘧磺隆、或砜嘧磺隆。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述受關(guān)注的多核苷酸編碼特異性地結(jié)合至靶核酸序列的多肽。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述多肽為重組酶、整合酶、核酸酶、歸巢內(nèi)切核酸酶、或鋅指核酸酶。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其中所述磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)包含磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物，所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物包含SEQID NO 3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ ID NO :3-419中的任一種具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
14.磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，所述基因開關(guān)控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，其中所述受關(guān)注的多核苷酸編碼特異性地結(jié)合DNA序列的多肽，或編碼切割DNA序列的多肽。
15.權(quán)利要求14的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述編碼的多肽為重組酶、整合酶、核酸酶、歸巢內(nèi)切核酸酶、或鋅指核酸酶。
16.權(quán)利要求14或15的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述磺酰脲類基因開關(guān)包含磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物，其中所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物可操作地連接至在所述植物中有活性的啟動子，其中所述啟動子為組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、或阻抑型啟動子。
17.權(quán)利要求16的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中 (a)所述組成型啟動子為MTH啟動子、EFla啟動子、PIP啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、或35S CaMV啟動子； (b)所述組織優(yōu)選的啟動子為分生組織優(yōu)選的啟動子、胚芽優(yōu)選的啟動子、葉優(yōu)選的啟動子、根優(yōu)選的啟動子、花藥優(yōu)選的啟動子、花粉優(yōu)選的啟動子、或花優(yōu)選的啟動子； (C)所述發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子為早期胚芽啟動子、晚期胚芽啟動子、發(fā)芽優(yōu)選的啟動子、或衰老優(yōu)選的啟動子； (d)所述誘導(dǎo)型啟動子為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、熱應(yīng)激啟動子、干旱脅迫啟動子、光誘導(dǎo)型啟動子、滲壓劑誘導(dǎo)型啟動子、或金屬誘導(dǎo)型啟動子；或者， (e)所述阻抑型啟動子為四環(huán)素阻抑型啟動子、或乳糖阻抑型啟動子。
18.權(quán)利要求16或17的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述受關(guān)注的多核苷酸或所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物可操作地連接至包含至少一種四環(huán)素操縱子序列的阻抑型啟動子。
19.權(quán)利要求18的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述阻抑型啟動子為組成型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、或發(fā)育階段優(yōu)選的啟動子。
20.權(quán)利要求19的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述阻抑型啟動子為35SCaMV啟動子、肌動蛋白啟動子、EFlA啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。
21.權(quán)利要求20的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述阻抑型啟動子包含如SEQIDNO :855、856、857、858、859、860 或 862 中所示的多核苷酸序列、或與 SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的多核苷酸序列。
22.權(quán)利要求16的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)，其中所述磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物包含SEQ ID NO :3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ IDNO :3-419中的任一種具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
23.轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因種子，其包含權(quán)利要求14-22中任一項的磺酰脲類調(diào)控的基因開關(guān)。
24.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因種子，其中所述轉(zhuǎn)基因植物、所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或所述轉(zhuǎn)基因種子來自單子葉植物或雙子葉植物。
25.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因種子，其中所述單子葉植物或雙子葉植物來自玉米、稻、高粱、甘蔗、大麥、燕麥、小麥、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、煙草、向日葵、紅花、或苜蓿。
26.重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含阻抑型啟動子，其中所述阻抑型啟動子在植物細(xì)胞中是有活性的，并且所述阻抑型啟動子包括可操作地連接至至少一種操縱子序列的肌動蛋白啟動子、EFlA啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。
27.權(quán)利要求26的重組多核苷酸，其中所述阻抑型啟動子包含如SEQID NO :855、856、857、858、859、860 或 862 中所示的多核苷酸序列、或與 SEQ ID NO :855、856、857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一'丨生的多核苷酸序列。
28.用于調(diào)控細(xì)胞中的表達(dá)的方法，所述方法包括 (a)提供包含受調(diào)控的基因開關(guān)的細(xì)胞，所述基因開關(guān)控制受關(guān)注的多核苷酸的表達(dá)，其中所述基因開關(guān)包含權(quán)利要求26或27的阻抑型啟動子；以及； (b)提供調(diào)控所述基因開關(guān)的配體化合物，其中配體化合物包括四環(huán)素、磺酰脲類、或它們的任何類似物。
29.重組多核苷酸，其包含可操作地連接至編碼磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物的多核苷酸的阻抑型啟動子。
30.權(quán)利要求29的重組多核苷酸，其中所述編碼的磺酰脲類反應(yīng)性阻遏物包含SEQIDNO 3-419中任一種的氨基酸序列，或與SEQ IDNO :3-419中的任一種具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求29的重組多核苷酸，其中所述阻抑型啟動子為可操作地連接至至少一種操縱子序列的肌動蛋白啟動子、MMV啟動子、dMMV啟動子、MPl啟動子、或BSV啟動子。
32.權(quán)利要求29-31中任一項的重組多核苷酸，其中所述阻抑型啟動子包含如SEQIDNO :855、856、857、858、859、860 或 862 中所示的多核苷酸序列、或與 SEQ ID NO :855、856、.857、858、859、860或862具有至少95%的序列同一性的多核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了涉及使用磺酰脲類介導(dǎo)的基因表達(dá)控制的組合物和方法。組合物包括磺酰脲類響應(yīng)化學(xué)開關(guān)，其中所述基因表達(dá)受磺酰脲類化合物的調(diào)控。組合物也包括編碼多肽的多核苷酸、以及構(gòu)建體、載體、原核和真核細(xì)胞、和真核生物，所述真核生物包括包含所述多核苷酸、和/或通過所述方法產(chǎn)生的植物和種子。也提供了調(diào)控細(xì)胞或生物中受關(guān)注的多核苷酸表達(dá)的方法、以及改變基因組的方法，包括植物或植物細(xì)胞中的基因組。
文檔編號C12N15/82GK102905517SQ201180020245
公開日2013年1月30日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者J.方, W.J.戈登-凱姆, K.S.羅, K.E.麥克布里德, B.麥戈尼格爾, C.西蒙斯 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司