專利名稱：含治療細胞的柔性低溫儲存袋的自動灌裝的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及制造、存儲和分裝體細胞治療產(chǎn)品的方法和系統(tǒng)，體細胞治療產(chǎn)品符合監(jiān)管機構(gòu)的要求，例如設備、生物制品和藥品的現(xiàn)行良好的生產(chǎn)規(guī)范(CGMP)。特別是，本發(fā)明涉及用于灌裝容器，尤其是含有活細胞治療產(chǎn)品的柔性低溫儲存袋的部分或全部的自動化、封閉的系統(tǒng)、裝置和方法。進旦冃月^
美國食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定，細胞治療，如預防、治療、治愈或緩解人類疾病或傷痛，是通過施加經(jīng)體外處理或改變的自體、異體或異種細胞。細胞治療、再生醫(yī)學的目標一致，就是要修理、更換或恢復受損的組織或器官。
供體細胞的體外擴增用于，例如，增加用于自體和異體細胞治療的干細胞和祖細胞數(shù)目。例如，多能間充質(zhì)干細胞(MSCs)目前在許多臨床試驗中使用，以探究其在免疫調(diào)節(jié)作用 、造血功能和組織再生中的潛能。MSCs在組織中數(shù)量極低，為了達到移植數(shù)目，需要細胞擴增。
任何細胞治療面臨的挑戰(zhàn)是要確保細胞生產(chǎn)的安全性和高品質(zhì)。特別是，在cGMP 分級條件下，為了進行先進細胞療法，細胞處理是強制性的。對于同種異基因療法，在生產(chǎn)細胞過程中，方法和產(chǎn)品是否符合GMP的測試和認證是一個重要的經(jīng)濟因素，大力鼓勵生產(chǎn)最大批量和最小批量。
因此，為了擴大臨床規(guī)模，最理想的治療細胞生產(chǎn)，從細胞收集到培養(yǎng)后處理，是一個完全自動化的封閉過程。這樣的封閉過程，將促進符合cGMP生產(chǎn)的治療細胞產(chǎn)品適于儲存和在臨床中使用，由于機械或生理應激，從而降低微生物污染和存活率損失的風險。
已經(jīng)確立大規(guī)模的自動化封閉過程用于哺乳動物細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)，如生物療法。 然而，無論是細胞破碎時有意地釋放細胞內(nèi)的產(chǎn)品，或通過苛刻的方法順便分離細胞和分泌產(chǎn)物，例如高速離心，大多數(shù)這樣的生產(chǎn)工序旨在恢復蛋白產(chǎn)物和丟棄死亡細胞。相反， 擴增后的治療細胞的生產(chǎn)工序，在維持細胞存活率最終至臨床功能的條件下，通常需要細胞收集、體積減少、洗滌、制劑、貯存容器灌裝，和低溫貯藏產(chǎn)品細胞。
此外，治療性細胞在已知的細胞生產(chǎn)蛋白過程中可能無法存活，因為，與細胞療法的祖細胞或干細胞相比，后者通常代表高度操做的細胞株，在廣泛復制的培養(yǎng)過程中，可能會選擇對機械剪切力和生理壓力較低敏感的細胞株。因此，為了保留療效，治療細胞通常是有限培養(yǎng)，以便保持脫離人體組織的原始親表型；因此，治療細胞一般不選擇或不經(jīng)基因工程便于下游加工。
從歷史上看，為了獲得功能上有用的增加的細胞數(shù)目，哺乳動物細胞的體外擴增很大程度上手動執(zhí)行，由專門工作人員使用開放的設備、高度復雜的操作。這種特殊的技能高度個性化，利用現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)技術(shù)，很多這樣的手工技術(shù)難以重現(xiàn)，更難以形成規(guī)模和轉(zhuǎn)換為自動化、封閉的過程。
然而，啟動細胞治療產(chǎn)品臨床試驗的早期階段后，整個試驗中保持著相同的基本生產(chǎn)工序。因此，許可審批前，更改工序需向FDA提交研究性新藥申請(INDA)。確立可比性的程度取決于預測任何產(chǎn)品或工藝改變的科學依據(jù)、工序改變的程度、以及產(chǎn)品的發(fā)展階段。一般的方法是通過體外手段，分析和比較生物制品。當差異顯著時，根據(jù)他們的有效性和相關(guān)性，比較在動物模型的藥代動力學、毒理學和有效性中的新舊產(chǎn)品。最后，在動物研究中，如果差異顯著，必須對人類受試者進行臨床等效性研究，目的是建立等效安全、藥代動力學和藥效。對于一個給定的產(chǎn)品和條件，所需的臨床試驗顯示臨床可比性，逐案判斷臨床試驗的性質(zhì)和程度。額外的臨床前或臨床試驗是一個非常昂貴的過程，因此盡可能避免。
FDA已經(jīng)認識到，當一個產(chǎn)品第一次進入臨床試驗時鎖定進程，為免提交一份新的產(chǎn)品許可證申請，在產(chǎn)品的整個商業(yè)生命周期內(nèi)避免改進生產(chǎn)工藝，這些都是不切實際的。 對于某些生物技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品，如單克隆抗體，F(xiàn)DA已經(jīng)發(fā)展相對簡化方法，用以比較由新舊方法生產(chǎn)的產(chǎn)品，通過工藝驗證(例如，清除病毒的研究，去除污染物或溶出物)所有影響工序的因素。然而，與治療蛋白質(zhì)相比，因為治療細胞的更高復雜性和脆弱性，和療效在體外和動物模型中通常較少的可用性，一般很少建立預測任何工序變化對人體療效的科學依據(jù)。因此，對于治療產(chǎn)品，作為臨床試驗前置審批進程中的第一階段和第三階段，通過簡單地擴大或縮小最早的人體試驗中的基本的手工工 藝，以滿足持續(xù)增長的需求。
因此，鑒于臨床試驗早期階段的增長的治療細胞產(chǎn)品，盡量減少人類受試者需要臨床等效性研究的產(chǎn)品的無意變化，需要符合CGMP標準，大批量生產(chǎn)治療性細胞產(chǎn)品的自動化封閉過程，包含幾個數(shù)量級以上的細胞，相比大量的手工傳統(tǒng)工藝相比，傳統(tǒng)工序的基本原則的最小變化。
動物細胞，包括治療細胞，長期超低溫保存，提供了一個關(guān)鍵的下游細胞生產(chǎn)工序的例子，歷來采用勞動密集的手工技術(shù)。因此，美國專利號6136525 (“525專利”)的“肝細胞冷凍保存方法”由Mullon等人于2000年10月24日公開了肝細胞的超低溫保存，通過將肝細胞分裝到冷凍容器，在零下50到零下90攝氏度中凍結(jié)容器，和在流體氮或蒸汽氮中儲存容器。見摘要?！?25專利”還公開了冷凍保存方法，最優(yōu)選的是一種包括10%的胎兒牛血清(FBS)和10%二甲亞砜(DMSO)的冷凍保護劑介質(zhì)。見第3欄，5-8行。將細胞分裝到冷凍室耐熱容器，最優(yōu)選的是來自Baxter國際公司Cryocyte 塑料袋，其容量范圍大約50 至500毫升，最優(yōu)選的是用注射器協(xié)助這種冷凍袋分裝。見第3欄，16-34行。在這個過程中，通過注射器利用重力來匯集細胞或輕壓分裝入袋。一旦細胞被導入袋，注射器用于除去促進解凍過程的過量空氣。然后密封此袋。密封方法可包括機械鋁密封件，熱脈沖熱封機， 魯爾鎖插頭等，最優(yōu)選的是熱封。同上。
事實上普遍認可，成功的超低溫保存和恢復，在冷凍前，手動除去冷灌裝凍保護劑介質(zhì)中的細胞的容器中的空氣。例如，上述內(nèi)容除了在“525專利”披露，美國專利號 5564279 (下稱“279專利”)披露“凍結(jié)袋”，托馬斯等人于1996年10月15日公開了存儲血細胞的冷凍袋，和在細胞和冷凍保護劑通過連接袋的管灌裝袋后，和在盡可能地驅(qū)逐袋內(nèi)的所有空氣，密封管之前，使用該袋冷凍紅血細胞的方法。見，權(quán)利要求11，第5欄，45 行-第6欄，5行。
因此，需要改進治療細胞的生產(chǎn)工藝，從細胞收集到培養(yǎng)后處理，包括用懸浮在冷凍保護劑的細胞灌裝容器，特別是，這樣的過程盡管保持著傳統(tǒng)手工工藝的基本原理，但是便于在自動化、封閉的系統(tǒng)中生產(chǎn)。
美國專利號4021283 (“283專利，，)的“無菌包裝的方法”由Weikert于1977年5月3日公開，其中包括制作無菌袋網(wǎng)，首先，吹擠出一個連續(xù)的、封閉的熱塑管，使用的非感染性的氣體，用橫向熱封部分將管分割成一系列，在一個封閉的系統(tǒng)中，用一個貫穿其開口的連續(xù)的通道彼此互連的袋，在封閉、無菌條件下的網(wǎng)袋中灌裝無菌產(chǎn)品，然后密封該袋， 從而產(chǎn)生密封、無菌的包裝袋。見摘要?！?83專利”顯然并沒有考慮從所公開的袋中除去空氣或其它流體，無論在灌裝之前、期間或之后。
美國專利號4964261 (“261專利”)的“用于制備制藥的無菌溶液的裝袋的方法和裝置”，由Benn于1990年10月23日公布，公開了一種裝袋的方法和裝置，在一個非無菌的環(huán)境中，在多個無菌的柔性袋中制備制藥的無菌溶液，該方法和裝置包括提供一個預先滅菌的筒狀袋，該筒狀袋具有一個單一的入口，通過一消毒過濾器導入溶液，無菌溶液引入到筒狀袋的入口，灌裝一定體積的無菌溶液后，密封多個筒狀袋，以形成多個分離的柔性無菌袋。見摘要?！?61專利”顯然沒有考慮從所公開的袋中除去空氣或其它流體，無論灌裝之前、期間或之后。
“261專利”還稱，美國專利號4610790 (“790專利”)的“生產(chǎn)無菌水和無菌水溶液的工藝與系統(tǒng)”，由Reti等人于1986年9月9日公布，公開了一種方法和裝置，以確保高水平無菌灌裝包裝袋，安全地供人類使用靜脈輸液。見“261專利”，第I欄，20-58行。根據(jù)“261專利”，單個無菌溶液袋的生產(chǎn)是通過使用包括18個柔性乙烯基袋的袋組，柔性袋通過管連接至含有18個閥的歧管，閥依次連接至一消毒過濾器，在廠里，組裝成組袋后都要預先滅菌。同上，“790專利”中公開稀溶液的包 裝包括一個無菌容器和傳統(tǒng)方法滅菌的管，容器和管整體上由包含預先滅菌的過濾器的過濾器殼體形成；管子安裝在過濾器殼體上，以致于本發(fā)明系統(tǒng)所產(chǎn)生的稀溶液通過過濾器進入容器中，過濾器適于保存微生物；使用適當?shù)墓苈罚瑲んw可以連接多個容器，如塑料組合物形成的柔性透明袋，使得水或水溶液中通過過濾器流向所有袋。見第7欄，17-40行。“790專利”顯然并沒有考慮從所公開的袋除去空氣或其它流體，無論灌裝之前，期間或之后。
美國專利5641004號(“004專利”)的“在無菌條件下灌裝一個密封容器的方法”由 Py于1997年6月24日公布，公開了一種密封容器的自動灌裝，密封容器至少有一個部件由能夠被中空針頭刺穿的材料制成，并且足夠柔軟以便除去中空針后再次封閉本身。見摘要。在自動化過程中，密封容器的柔性部分使用中空灌裝針穿孔，與流體接觸引導流體進入容器。在灌裝容器的過程中，中空灌裝針的穿孔端通過氣體層流保持無菌條件。同上“004 專利”還公開了灌裝的密封容器，優(yōu)選灌裝氣體或抽出氣體，由柔性材料構(gòu)成的袋，例如彈性體(見第2欄，40-42行)，還公開了使用與灌裝針同類型的中空疏散針，將已經(jīng)存在于容器中的流體導出。(見第4欄，27-36行)?！?04專利”還指出，“如果需要，由于灌裝流體進入容器的簡單注射，可以獲得疏散。更好的是，使用例如一個排氣裝置協(xié)助疏散，優(yōu)選與灌裝同步，如泵。疏散可以發(fā)生在灌裝之前，期間或之后。編號
美國專利號6712963 (2004年3月30日公布)，7052603 (2006年5月30日公布)，由Schick公布的“生物工藝應用中溶液的自動化無菌轉(zhuǎn)移的一次性使用的歧管”，和美國專利公布號2006/0118472，由?？说热擞?006年6月8日公布的“在生物工藝應用溶液的自動化無菌轉(zhuǎn)移的一次性使用歧管和傳感器”，都披露了用于無菌包裝和一次性使用方法的消毒的歧管。見摘要。通過無菌連接器組裝一次性管和容器柔性壁(如袋)。這些歧管與至少一個遠程控制的只有與歧管配管的外表面接合的夾緊閥交互。這種歧管和夾緊閥系統(tǒng)可以與蠕動類型的泵結(jié)合使用，與遠程控制的夾緊閥一起的蠕動泵由一個控制器控制， 控制器提供在無菌環(huán)境中自動和準確的生物技術(shù)流體傳遞，同時避免或降低清洗和質(zhì)量保證程序。所披露的歧管的各收集/存儲袋具有三個管連接，包括一個主入口管，一個用于緩解灌裝操作過程中的任何袋內(nèi)堆積的氣體和/或壓力的次管，和一個輔助袋內(nèi)物質(zhì)再循環(huán)的入口 /出口。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在非無菌的環(huán)境中，將活的哺乳動物細胞無菌分裝無菌的柔性袋的裝置和方法。本發(fā)明是特別用于將活的哺乳動物細胞作為治療性產(chǎn)品中使用，如低溫保存細胞。
本發(fā)明的一個方面提供一種方法，用于在非無菌的環(huán)境中，將活的哺乳動物細胞無菌分裝到無菌的柔性袋，所述方法包括以下步驟Ca)提供多個無菌的柔性袋；(b)提供所述活的哺乳動物細胞懸浮液，該懸浮液盛在一個無菌的細胞源容器中；(C)將無菌袋連接至細胞源容器、一個真空源和一個無菌凈化氣體源，以形成一個無菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)對外部環(huán)境是封閉的，其中，系統(tǒng)選擇性地允許流體在無菌袋和真空源或細胞源容器或無菌氣體源之間流動；(d)排出至少一個柔性袋中空氣，通過選擇性地允許流體在至少一個袋與真空源之間流動；(e)所需體積的流體分裝到至少一個所述袋，通過選擇性地允許所需體積的流體在該袋和細胞源容器之間流動jP(f)細胞源容器與灌裝袋之間的系統(tǒng)中的所需體積的流體逼進灌裝袋，通過選擇性地允許無菌凈化氣體從所述氣體容器通過該系統(tǒng)流入一個袋內(nèi)。
本發(fā)明的方法的一個實施例中，多個柔性袋、細胞源容器、真空源和無菌凈化氣體源至少部分通過撓性管流動地連接在一起。在本實施例中，至少一個外部接合撓性管的夾緊閥選擇性地允許流體在無菌袋和細胞源容器或真空源或氣源之間流動。在該方法中，使用蠕動泵單元將流體從源容器中通過撓性管泵送到柔性袋，是有利的，使得整個系統(tǒng)保持外部封閉性，也不會移動的泵的泵部件，這使得病毒難以接觸無菌系統(tǒng)內(nèi)的流體。在該方法的一些實施例中，無論是泵單元或至少一個夾緊閥，或泵和一個或多個夾緊閥都是由控制器遠程控制的。
在該方法的一個特定的實施例中，在封閉的無菌系統(tǒng)的撓性管包括一條主線和至少一條分支線。主線是一段撓性管，其一端連接至細胞源容器和氣體源，以便選擇性地允許流體從該容器或氣源進入主線，例如，通過一個雙向閥或通過一個Y型連接器和夾緊閥。在本實施例中，各柔性袋通過一條分支線流動地連接至主線，各分支線是一段撓性管，其一端流動地連接至一個柔性袋，另一端流動地連接至主線，以便允許流體或氣體從主線流入該袋。此外，該真空源流動地連接至主線，以便允許該真空源通過主線和分支線排出各袋中的氣體。該真空源可連接主線上的任何地方，不一定接近細胞源容器和氣體源連接處，該袋可以在同一時間或選擇性地，通過使用額外的夾緊閥選擇性關(guān)閉不同袋子的分支線，抽空所有空氣。
在一些實施例中，本發(fā)明的方法用于將活的哺乳動物細胞無菌分裝到無菌的柔性袋，還包括無菌密封和斷開已灌裝袋的分支線，例如，通過熱焊接的管。
本發(fā)明的方法，在分配流體灌裝袋之前，最后灌裝的袋中的細胞存活率至少為細胞源容器的初始細胞存活率的90 %，95 %，98 %，或99 %。例如，在已灌袋中，至少約70 %， 80 %，90 %，95 %，98 %，或99 %的細胞在灌裝后是活的。該方法，保持較高的存活率，當通過管灌裝的流體流速是從約10毫升/分鐘到I升/分鐘，在懸浮液中的細胞密度是從約100 萬/毫升至約3000萬/毫升，流體包括從O至約10%二甲亞砜(DMS0)，它在本領域中公知用于冷凍保護。因此，本發(fā)明的另一個方面，是存儲活的哺乳動物細胞的方法，包括分裝細胞到無菌的柔性袋，根據(jù)本發(fā)明的方法無菌分裝活的哺乳動物細胞至無菌的柔性袋，并且， 斷開已灌裝的袋后，根據(jù)已知的方法，低溫保存袋子里的細胞，例如液氮。
在另一個實施例中，本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)提供懸浮在流體中的細胞； (b)提供多個無菌柔性袋，無菌柔性袋通過支線連接到無菌撓性管的主線；(C)通過施加真空到主線，排出柔性袋內(nèi)的空氣；(d)除了要灌裝的袋的分支線外，防止流體流過其他所有分支線；(e)分裝所需體積的細胞懸浮液到主線；(f)強迫凈化氣體進入主線，來驅(qū)動任何殘留的細胞懸浮液從主線通過分支線進入要灌裝的袋。
更特別地，在本發(fā)明中使用的細胞是典型的哺乳動物細胞，通常被用作治療性產(chǎn)品的是人體細胞，如人類干細胞。通常情況下，將細胞懸浮在流體培養(yǎng)基中用于存儲細胞， 例如，在液氮(DMSO)中冷凍保存或其他公知的冷凍保存劑。
在另一個方面，本發(fā)明還提供了預消毒的柔性袋組或歧管，根據(jù)本發(fā)明的方法用于灌裝無菌的柔性袋。這些袋組包括流動地通過多個支線連接至主線的多個無菌柔性袋。 這條主線是一段無菌撓性管，具有一個開口端可用于流體流入或流出主線；主線的另一端可被密封，或連接至一條分支線。各分支線是一段無菌撓性管，其一端流動地連接至袋組中的一個袋子，而另一端流動地連接至主線。在本發(fā)明的一些實施例中，多個主線可以獨立地連接至一個細胞源容器，灌裝多個平行袋組，由此進一步提高大批量的細胞灌裝袋率。
適合于在本發(fā)明中使用的袋組已被公開，例如，在美國專利號6712963和 7052603，和美國專利申請公布號2006/0118472號引用，使用市售的柔性袋袋歧管組裝袋組，如ΡΠΠ-ΡΑΚ 4個75mL的傳輸包，創(chuàng)世紀BPS公司，商務路65號，哈肯薩克市，新澤西 (07601)。本發(fā)明的袋組也可以通過連接任何其他柔性袋組裝，主線和分支線適用于低溫儲藏哺乳動物細胞，包括無菌焊接到所需的歧管裝置的一段撓性管。
與常規(guī)方法相反，本發(fā)明中，在用冷凍保存的哺乳動物的細胞懸浮液灌裝柔性袋之前，排出柔性袋中的空氣。特別是，該方法包括排出歧管中的至少一個柔性袋中空氣，通過施加真空到主線的開口端。通常情況下，施加真空時使用實驗室級真空泵。真空應用的水平和持續(xù)時間可以變化，可根據(jù)需要在一個合適的時間期間除去足夠的空氣，根據(jù)本發(fā)明， 在下面的實施例進一步說明。在灌裝袋之前，真空可被應用到該袋，或有利地，在同一時間內(nèi)應用所有袋。
通過主線和分支線排出袋中的空氣后，本發(fā)明的方法涉及，除要灌裝袋的分支線外，防止流體流過的所有分支線。一般來說，主線或分支線的流體流量通過閥控制，可以選擇性地允許或停止撓性管中的流體流動。夾管閥被有利地用于此目的，因為這樣的閥不破壞撓性管的無菌完整性。通常情況下，可以防止一個分支線流體流動，通過施加夾緊閥到主線交界處附近的管，從而有利地提供流入封閉分支線的最小流量。
根據(jù)本發(fā)明的方法，阻止除了要灌裝袋的分支線外的所有分支線的流體流動后， 所需量的細胞懸浮液分裝到主線的開口端。例如，用注射器手動分裝或由任何馬達驅(qū)動的泵。有利的是，所需量的細胞懸浮液用蠕動泵分裝，懸浮液流過封閉的無菌管，沒有直接接觸泵裝置，細菌污染的機會再次減至最小。分裝所需量后，可停止流體流到主線，通過停止泵和/或用閥關(guān)閉主線的開口端，例如，夾緊閥。泵馬達或主線閥可能停止，例如，由遙控器檢測分裝到袋組或細胞源容器中剩余的流體的重量?；蛘撸刂破骺梢员O(jiān)視泵送時間，泵送所需量后停止分注。
為了減少浪費，并提供更好的灌裝量的一致性，本發(fā)明還提供了清除主線和分支線殘余的細胞懸浮液，在所需量通過主線的開口端分裝到袋組后。因此，該方法在這方面， 足以使無菌凈化氣體在壓力下導入主線的開口端，以促使任何在主線或袋的分支線的開口端剩余的分裝流體進入要灌裝的袋中。便利地，無菌的凈化氣體是被過濾的空氣，但其他惰性氣體也可以使用，如活的哺乳動物細胞的低溫保存的領域中，已知氮氣也可以使用。當所有的殘留流體時被強制進入灌裝的袋，凈化氣體的流量可以由閥停止。凈化氣體的流量可以由凈化氣體源和主線之間的閥來控制，但通常是通過要灌裝的袋的主線或分支線的夾緊閥控制。有利的是，由控制器遠程控制停 止凈化氣體流動的閥，控制器檢測去除灌裝袋的主線和分支線的所有殘留流體，例如，按已灌裝袋或通過后彎月面的殘余流體的重量計，殘留流體經(jīng)過位于灌裝袋與分支線連接處的檢測器，從而同時盡量減少管道中的產(chǎn)品損失和不必要的凈化氣體進入灌裝袋。
灌裝后，本發(fā)明的方法提供了無菌地密封和斷開已灌裝袋的分支線，通常是通過無菌焊接封閉和切割的分支線的管。灌裝后后連續(xù)刪除各袋，或一起刪除所有袋。
雖然在本發(fā)明中的方法和裝置中，使用夾緊閥有利于盡量減少滅菌管裂口，但本發(fā)明還考慮在某些情況下，使用管式閥。比如，簡化自動化技術(shù)是可取的，使用單個三通行閥選擇性地連接細胞懸浮液源、真空源或凈化氣體源和袋組的主線，特別是一次性使用的塑料管式閥。
在另一個方面，本發(fā)明存儲活的哺乳動物細胞的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的所述方法分裝這些細胞到無菌的柔性袋，然后低溫保存灌裝袋、密封袋內(nèi)的細胞。
然而，本發(fā)明的另一個方面，提供了一種在一個非無菌的環(huán)境中，將活的哺乳動物細胞無菌分配至無菌的柔性袋的裝置，根據(jù)本發(fā)明的方法。在一些實施例中，該裝置包括 多個無菌的柔性袋，包含懸浮在流體中活的哺乳動物細胞的細胞源容器，一個真空源；和無菌凈化氣體源。在這些實施例中，多個柔性袋，細胞源容器，真空源和氣體源流體連接在一起，以形成無菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)對外部環(huán)境是封閉的，以致于該系統(tǒng)選擇性地允許流體在無菌袋和細胞源容器或真空源或氣源之間流動。在一些實施例中，多個柔性袋囊，細胞源容器， 真空源和無菌凈化氣體源流體連接在一起，至少部分地由撓性管，以及設置有選擇性地允許外部撓性管接合的至少一個夾緊閥無菌袋和細胞源容器或真空源或氣源之間的流體流動。該裝置還可以進一步包括一個蠕動泵單元，其被配置成泵送流體從源容器通過撓性管進入柔性袋，和泵單元或一個或多個夾管閥，或兩者，有利地是由一個控制器遠程控制。
在該裝置中的一個特定的實施例中，撓性管包括一條主線和至少一條分支線，其中的主線是一個長的撓性管，其一端連接至細胞源容器和凈化氣體源，以便有選擇地允許流體流從容器或氣源流入主線。在本實施例中，每個柔性袋流體連接至主線，通過一個分支線，各分支線是一條長的撓性管，其一端流體連接至一個袋，另一端流體連接至主線，以便允許流體或氣體從主線流入該袋。此外，所述真空源流體連接至主線路，從而允許真空源從各袋通過主線和支線撤回氣體。
接觸細胞源容器中的流體的裝置的所有內(nèi)部表面預先滅菌，該裝置被設計為排除周圍大氣中未經(jīng)滅菌的空氣。比如，一消毒過濾器可被用于在該裝置任何朝外部的開口部， 該裝置可能需要以允許進入，退出，或該裝置在非無菌環(huán)境中的氣體交換。因此，本發(fā)明的裝置提供了一種滅菌的，一次性的對外部的微生物污染完全封閉的 系統(tǒng)，用于無菌灌裝活的哺乳動物細胞至柔性袋，例如，用于低溫保存。
有利的是，在本發(fā)明中使用的細胞源容器是一次性的，通常是預先滅菌的柔性袋， 可以無菌灌裝到容器通過無菌焊接撓性管。在該裝置中，該容器連接至主線上，這是一條長的撓性管，其一端流體連接至容器上，直接或通過連接至另一條已經(jīng)連接至容器的管上。甚至在任何主線管被連接至容器上，以便允許容器中的流體流入主線。
本發(fā)明的裝置還包括一組袋或歧管，這是用細胞懸浮液灌裝多個柔性袋，其中每個袋通過一個分支線連接至主線。每個分支線是一條長的撓性管，一端流體連接至一個柔性袋和另一端流體連接至主線，以便允許流體從容器中流入該袋。在本發(fā)明的一組袋中袋的數(shù)目可以是從 2 到超過 1000，如 3，4，5，8，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，400 或 800，優(yōu)選從約10至約100。合適的組袋和組裝袋子的方法由如上文所述市售材料提到。
本發(fā)明的裝置還包括一個選擇性地連接至一組袋的真空源，從而允許真空被施加到該組的每個袋子，或者在同一時間全部施加或單獨施加。真空源在灌裝之前撤離該組袋， 例如，以避免冷凍保存已灌裝袋中的細胞，含有太多的空氣，妨礙細胞懸浮液的一致冷卻速度的問題。
該裝置還提供了一種無菌的凈化氣體源，流體連接至組袋，以便允許這樣的氣體從氣源流到各袋，驅(qū)動在主線或分支線管中剩余的任何流體流入待灌裝的袋，上述的本發(fā)明的灌裝方法。有利的是，氣源被選擇性地連接至一組袋，例如，到主線上，靠近細胞源容器連接處，使凈化氣體進入靠近其中的流體進入該系統(tǒng)，因此清除大部分撓性管的細胞源和待灌裝袋之間的路徑。
在一些實施例中，本發(fā)明的裝置還包括一個閥，其選擇性地允許或停止流體流過一個長的撓性管。優(yōu)選地，該閥是一個夾緊閥，其外部與該組袋的撓性管接合，在不破壞無菌管的條件下選擇性地允許或停止流體流入該管。另外，該裝置有利地包括一個蠕動泵單元，被定位成允許從源容器中的流體通過主線和支線抽入袋。
本發(fā)明的整個裝置和方法允許在一個完全封閉的無菌系統(tǒng)中灌裝無菌袋，并且也容易地適于使用遠程控制的泵、閥門和無菌焊接管的部分或全部自動化，根據(jù)本領域中公知的工藝控制和自動化的方法。由此，與以前相比，本發(fā)明極大地提高了產(chǎn)率和質(zhì)量，這主要是因為無菌分配活的哺乳動物細胞至無菌的柔性袋，例如，在液氮中冷凍保存，是人工操作。圖片說明


圖1是灌裝單個最終產(chǎn)品袋的本發(fā)明方法中使用裝置的示意圖2是一個本發(fā)明的自動封閉的灌裝袋裝置，提交組袋中的5個最終產(chǎn)品袋或歧管單元(PD=產(chǎn)品劑量)的示意圖3表明，根據(jù)本發(fā)明，在灌裝袋的殘留空氣量取決于灌裝之前施加真空水平；
圖4表明，根據(jù)本發(fā)明，最終的灌裝產(chǎn)品袋中的殘留空氣的真空持續(xù)時間(商業(yè)真空泵連接至實驗室內(nèi)部線上)的效果；
圖5表明，凈化殘余流體使用空氣壓力從灌裝線到最終產(chǎn)品中袋的打包的流體量的效果；
圖6表明，根據(jù)本發(fā)明，泵速測試范圍(100-400分鐘轉(zhuǎn)速)和管尺寸(O. 8至3. 2 毫米ID)，產(chǎn)品袋灌裝過程中，蠕動泵的轉(zhuǎn)速和泵管尺寸對細胞的存活率沒有實質(zhì)性影響；
圖7A表明，泵的轉(zhuǎn)速和泵管尺寸(內(nèi)徑)在300萬個細胞/毫升對細胞存活率的影響；
圖7B表明，泵的轉(zhuǎn)速和管尺寸(內(nèi)徑)(B) 1000萬個細胞/毫升對細胞存活率的影響；
圖8表明，在本發(fā)明的灌裝過程中，保持均勻的源細胞懸浮液，可以很容易地通過源懸浮液的機械攪拌；
圖9表明，本發(fā)明的灌裝過程中大規(guī)模的試驗，20個灌裝的產(chǎn)品袋連續(xù)使用工藝的疏散和凈化步驟的結(jié)果。詳細說明
本發(fā)明提供的改進方法，以及與那些方法相關(guān)的自動化的裝置和系統(tǒng)，用于有效地、可靠地和安全地用含有活的哺乳動物細胞的細胞治療產(chǎn)品灌裝最終產(chǎn)品袋。在目前的制造細胞治療產(chǎn)品、灌裝最終產(chǎn)品容器的工藝中，一個柔性的低溫儲存袋，是目前生產(chǎn)的瓶頸-即使是在少于100個最終產(chǎn)品袋的小批量生產(chǎn)中。在下游加工階段的主要時間約束是添加冷凍保護 劑、DMSO后有限的時間，哺乳動物細胞通常將保留可接受的存活率，一般只有約60分鐘到第90分鐘。
傳統(tǒng)的灌裝袋過程是一個復雜的多步驟的手動過程，需要使用注射器灌裝和灌裝后抽出空氣。見，例如，美國專利號6136525的“肝細胞的冷凍保存方法”，上面引用。為了減少潛在的微生物污染，同時連接和斷開連接細胞源注射器和最終產(chǎn)品袋，來源、產(chǎn)品袋和注射器可設置為通過無菌管道焊接的拼接和分離的整體連接的管件。見，例如，無菌管道焊接工藝和設備的專利申請公布號20070142960的“無菌管焊機系統(tǒng)”，由Bollinger等人在美國于2007年6月21日公布，其中引用其他專利文件。無菌焊接創(chuàng)建無菌管道連接，同時保持功能上的封閉系統(tǒng)，從而即使在非無菌環(huán)境中，也能最大限度地減少污染。
在本發(fā)明先前使用的傳統(tǒng)的袋灌裝過程中，例如，一個無菌焊接到源袋的注射器， 該源袋含有I升或更多最終細胞治療產(chǎn)品，該細胞治療產(chǎn)品包括懸浮在含DMSO的冷凍保護介質(zhì)的治療細胞。源袋中的細胞懸浮在一個預先設定的密度的溶液中，注射器灌裝預先設定的量，兩者都是特定產(chǎn)品。每個注射器通過用管封口機切斷源的連接管，與之分離，焊接到連接至最終產(chǎn)品容器的管是無菌的，典型的是50ml CryuuyLefc柔性冷凍袋(Baxter保健公司，歐文，加利福尼亞州)。最終的產(chǎn)品，通常是5-20ml細胞懸浮液，然后將其注入袋子， 袋子被反轉(zhuǎn)和注射器被用于除去上述細胞懸浮液的任何殘留的空氣袋或氣泡，小心避免任何最終產(chǎn)品懸浮液的意外脫落。最后，注射器管用管封口機斷開，袋子準備冷凍。使用6個專業(yè)培訓的技術(shù)人員，手工工藝的生產(chǎn)量，是每小時約60袋，允許處理一批規(guī)模約1. 2升， 20毫升/袋和只有約O. 3升，5毫升/袋，在首選60分鐘的窗口內(nèi)，加入DMSO后冷凍細胞。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)分析了所述的用在冷凍保護劑中的治療細胞灌裝袋的傳統(tǒng)工藝，并發(fā)現(xiàn)了一些改進，以便能有效地完全隔離外部污染的加工自動化，導致最終產(chǎn)品劑量更大的生產(chǎn)量和再現(xiàn)性。在最初嘗試即時加工自動化，但是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用蠕動泵把細胞懸浮液引入到常規(guī)的低溫冷凍袋(例如，一個50毫升Cryocyte· 袋)，在袋中留下來自袋制造和管灌裝的不可接受的空氣量。在上述手工過程，殘留的空氣用灌裝注射器抽空。正如在本文別處中所述，非常不希望在低溫冷凍袋存在的氣泡或氣穴。例如，Cryocyte 袋的灌裝指令(www. cryocyte. com記載)多次重復,在冷凍保存之前,必須小心抽空灌裝袋的所有空氣。氣泡或氣穴可能會導致非均質(zhì)的細胞體積分布，導致凍結(jié)控制缺乏，并且它也可能導致由低溫下在液氮存儲系統(tǒng)中的機械攪拌引起的袋破裂。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在通過蠕動泵泵送最終細胞產(chǎn)品灌裝柔性袋時的另一個問題是，由于連接產(chǎn)品源和灌裝袋的管道內(nèi)的流體，可能會發(fā)生大量的產(chǎn)品損失。相比之前的手工方法，從一個大的產(chǎn)品源泵送產(chǎn)品通常會導致更多的產(chǎn)品被保留在管，實踐中考慮，很可能會決定與之前使用的注射器與小灌裝袋的連接管相比，一個大源與一個小的灌裝袋的連接管長。因此，在蠕動泵灌裝系統(tǒng)，在灌裝管的一些最終產(chǎn)品的損失是不可避免的，但是為了高效生產(chǎn)，有必要把這發(fā)面的損失最小化。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述手動袋灌裝過程中，主要限制存活率是多個無菌焊縫的必要性能，用以灌裝注射器并清空它到一個袋，因為當前的無菌焊接工藝通常需要幾分鐘才能完成每個焊接。
因此，為了解決有效自動灌裝低溫存儲細胞的袋子的問題，包括減少袋子里的殘余空氣，同時最大限度地減少無菌焊縫和產(chǎn)品損失的數(shù)目，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種新方法，用注射器或泵消除至少灌裝后冷凍袋中約95%的空氣，無需打開系統(tǒng)或納入更多無菌焊接。該方法只需要一個到最終產(chǎn)品袋的無菌焊接，灌裝和密封后可以立即進行包裝用于冷凍保存或冷藏。
因此，在一個實施例中，新工藝涉及(例如，Cryocyte 低溫冷凍袋)，通過一個無菌的塑料管網(wǎng)絡，最終產(chǎn)品袋連接至至少(a) —個細胞源容器，優(yōu)選一個柔性袋，含有最終產(chǎn)品密度的細胞懸浮液，其冷凍保護劑介質(zhì)通過分裝泵從源輸?shù)疆a(chǎn)品袋，和(b)—個真空源。 任選地，所述最終產(chǎn)品的袋也通過無菌管網(wǎng)絡連接至(C) 一個凈化氣源，如無菌加壓空氣源。圖1是用于執(zhí)行本發(fā)明的新方法的一個簡單的裝置，用于灌裝單一的最終產(chǎn)品袋。本發(fā)明該裝置的無菌管網(wǎng)絡，包括凈化氣體源，其有至少三個閥，如夾管閥，它可以依次打開和關(guān)閉真空，凈化，和細胞源極線到最終產(chǎn)品袋(1)除去最終產(chǎn)品袋和管道網(wǎng)絡的空氣；(2)所需量的最終產(chǎn)品灌裝最終產(chǎn)品袋；和(3)保留流體產(chǎn)品的凈化管道網(wǎng)絡，強制該流體流入最終產(chǎn)品袋，從而最大限度地減少管道中產(chǎn)品損失。
使用如圖1所示的裝置，本發(fā)明操作過程可以根據(jù)以下指導來進行(1)組裝源袋，分裝泵，真空泵和清洗泵；(2)無菌焊接最終產(chǎn)品袋；(3)關(guān)閉閥1，打開閥2，在預定(優(yōu)化)的時間內(nèi)排出最終產(chǎn)品袋和管的空氣；(4)關(guān)閉 閥2，打開閥1，分配產(chǎn)品的具體容量; (5)關(guān)閉閥1，打開閥3，允許足夠的凈化流體(例如，無菌空氣)強制殘余產(chǎn)物從管道到最終產(chǎn)品袋；(6)凈化流體進入最終產(chǎn)品袋之前，關(guān)閉閥3 ; (7)無菌密封和切割管到灌裝袋，然后可以打包灌裝袋用以冷凍保存或冷藏。
為了增加本發(fā)明裝置和袋灌裝方法的生產(chǎn)量，為更有效地灌裝多個最終產(chǎn)品袋， 本發(fā)明人還設計柔性袋組(在本文的一些實施例中，也稱為“多袋歧管單元”)，其中各袋通過管道連接至一個共同的主要管道部件，使得被導入一個共同的主要管道一端的流體可以流入每個所連接的袋。圖2是操作本發(fā)明方法的一個簡單裝置示意圖，用于灌裝在一個多袋歧管單元中的5個最終產(chǎn)品袋。
在一個如圖2所示的多袋歧管單元，灌裝多袋的過程如下(1)組裝源袋，分裝泵， 真空泵，清洗泵；(2)無菌焊接如圖2所示的最終產(chǎn)品袋；(3)關(guān)閉閥1，打開閥2，在預定(優(yōu)化)的時間內(nèi)排出最終產(chǎn)品袋和管的空氣；(4)關(guān)閉閥2，打開閥1，分配產(chǎn)品的具體容量;(5)關(guān)閉閥1，打開閥3，允許足夠的凈化流體(例如，無菌空氣)強制殘余產(chǎn)物從管道到最終產(chǎn)品袋；(6)凈化流體進入最終產(chǎn)品袋之前，關(guān)閉閥3 ;(7)無菌密封和切割管到每個灌裝袋，然后可以打包灌裝袋用以冷凍保存或冷藏。
上述步驟按各最終產(chǎn)品袋的順序重復。在另一實施例中，灌裝物可以平行進行，因此產(chǎn)品袋如上所述平行灌裝，其后按順序或平行密封和切割。
一次性管和柔性袋組成的歧管，適合用于實施本發(fā)明的使用蠕動泵的方法，連同一個或多個遠程操作的夾緊閥(S)，夾緊閥由控制器操作以提供流體在無菌環(huán)境中自動進入一個生物流體袋，這是已知的。參見，例如，上面提到的美國專利第6712963和7052603 號，和美國專利公布第2006/0118472號，公開披露使用柔性袋歧管單元，通過無菌連接器組裝，自動化分裝生物流體，例如色譜洗脫液。典型的柔性袋被稱為PEM-PAK 四個75毫升傳輸包的，創(chuàng)世紀BPS公司，新澤西洲哈肯薩克市商務路65號，07601。
為了證明在用細胞灌裝前從低溫袋中去除足夠的空氣，不選清洗泵，圖1所述的裝置是最初的測試。如下面的實施例1所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，留在袋中的空氣數(shù)量取決于灌裝步驟之前施加的真空水平。圖3和圖4從實驗中顯示數(shù)據(jù)，在抽成真空的袋的殘余空氣量，灌裝后通過一個注射器中排出殘留空氣進行定量。結(jié)果表明，不同的真空源和應用期間可以充分在袋子灌裝前排出空氣，一個普通的實驗室室內(nèi)真空線幾秒鐘足以除去至少約 95 %的殘余空氣。雖然通常沒有必要，在裝袋之前可以實現(xiàn)去除額外的空氣，通過施加更強的真空源，或通過施加真空的更長時間，(更有效地排出空氣)，或袋灌裝之后，例如，通過進一步應用真空，無論是有或沒有使用袋，手動或通過機械裝置以驅(qū)動截留的空氣氣泡至袋子上方。
關(guān)于保留在灌裝管的產(chǎn)品損失，圖1的裝置在單袋測試中，本發(fā)明人觀察到，超過 I毫升的產(chǎn)品在灌裝過程中丟失，它表示從5% (20mL的劑量)到最多20% (5mL的劑量) 的最終產(chǎn)物的損失，因為這些固有的昂貴的產(chǎn)品，這是不能接受的。請參見下面的實施例2。 通過使用現(xiàn)成的裝置組件盡可能地減少管的長度，這種產(chǎn)品的損耗可以降低，如圖5所示， 通過附加的凈化線，產(chǎn)品的損耗也可以大大減少。用空氣凈化管的附加步驟，發(fā)現(xiàn)不僅是為了減少產(chǎn)品的損失，而且也可以減少在最終產(chǎn)物袋的產(chǎn)品劑量的變化(標準偏差)，盡可能低為+/-0. 5% (見例2)，從而用更嚴格的劑量規(guī)格創(chuàng)造一個更強大的過程。
更重要的是，這個凈化步驟是簡單的自動化和通過一次性管和袋組加上控制邏輯和閥門控制，加上關(guān)閉凈化源閥的傳感器，從而防止過量的清洗流體進入灌裝袋，例如，通過檢測，當袋子包含一個完整的用量(按重量計)或當凈化流體與產(chǎn)物流體之間的接口通過灌裝袋附近的一個點，使用的傳感器是已知的和容易自動化分配流體。因此，本發(fā)明的工藝，可以是完全或部分自動的，使用圖2所示裝置，例如，手動或計算機控制的真空度，分裝泵，清洗泵，閥，以及其他設備和本發(fā)明設計以提供完整的裝袋系統(tǒng)的一次性用品。計算機控制所有的閥門和泵是通過簡單的控制邏輯的軟件來操作的，在灌裝幾個單獨的歧管單元的幾十個袋子時特別有用。這將大大提高治療性細胞制造裝袋的生產(chǎn)量，并進一步緩解關(guān)鍵生廣瓶頸。
本發(fā)明的裝袋過程和裝置，與以前使用的手工工藝相比，在用細胞治療產(chǎn)品灌裝低溫袋，使用較少的勞力提供實質(zhì)上更大的生產(chǎn)量。如上所述，手動過程的生產(chǎn)量，使用六個專業(yè)培訓的技術(shù)人員，是每小時約60灌裝袋，允許批處理大小約為1. 2升，20mL/袋劑量， 只有約O. 3升，5mL/袋劑量，在優(yōu)選60分鐘的窗口，加入DMSO后冷凍細胞。正如在下面的實施例4中，本發(fā)明人估計，用18毫升的劑量，例如，單個技術(shù)員在一小時內(nèi)只能灌裝65個單袋，同樣條件下使用一個3袋歧管可以灌裝139個袋。雖然這估計不包括在實際生產(chǎn)條件下，所需的所有努力，很顯然，本發(fā)明可以顯著地提高技術(shù)員的每小時生產(chǎn)量，從每小時約10個灌裝袋至超過100袋，由此允許由一個單一的技術(shù)人員處理一個1. 2升批次，或由多個技術(shù)人員處理大得多的批次，每個技術(shù)人員使用一個單獨的裝置(尤其是，泵和管道焊機)。
本發(fā)明人還研究了本發(fā)明灌裝袋的其它操作參數(shù)。tWn，實施例4中描述的測試結(jié)果，在圖6中顯示，在產(chǎn)品袋灌裝過程中蠕動泵的轉(zhuǎn)速和泵管尺寸對細胞的存活率沒有實質(zhì)性影響，根據(jù)本發(fā)明，在測試的泵的速度范圍(100-400rpm)和管道的尺寸(O. 8至 3. 2mmID)。實施例5描述了更廣泛的測試，管道尺寸、泵的速度和在一定范圍內(nèi)的典型產(chǎn)物的濃度(100萬至3000萬個細胞/毫升)對細胞率的影響。如圖7A和7B所示，超過測試范圍的測試參數(shù)沒有顯著影響細胞的存活率。
另外，在實施例5中的測試，與圖8中所示的結(jié)果，表明本發(fā)明的在灌裝過程中保持均勻的源細胞懸浮液，可以容易地通過源懸浮液的機械攪拌實現(xiàn)。本發(fā)明人還研究了在本發(fā)明的袋灌裝過程中，低溫保存、DMSO對細胞存活率的影響。根據(jù)本發(fā)明的袋灌裝過程， 實施例6中描述的測試表現(xiàn)出DMSO對人皮膚成纖維細胞(HDF)的存活率沒有顯著影響，HDF 通過管道及時泵送分裝。
相關(guān)技術(shù)領域中的普通技術(shù)人員清楚認識到，在不脫離本發(fā)明的范圍及其任何實施例中的情況下，本文所述的方法和應用的其它合適的修改和調(diào)整是顯而易見的?，F(xiàn)在已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明，通過參考下面的實施例，將被更清楚地理解，其目的僅在于說明，而不是為了限制本發(fā)明。
具體實施方式
實施例1.排出柔性袋的殘余空氣
眾所周知，低溫冷凍袋中殘余空氣對冷凍細胞的存活率和在液氮中冷凍后的袋的物理完整性具有負面影響。進行以下測試，以確定本發(fā)明的排出低溫冷凍袋的殘余空氣的方法的有效性。材料和設備Ped1-PAK 75毫升的樣品柔性袋(p/n 402-04，創(chuàng)世紀BPS公司，美國新澤西州哈肯薩克商務路，07601)60毫升注射器(p/n 06009)18GA 針(p/n 08344)止血水頂裝規(guī)模低壓真空(商業(yè)真空泵)高壓真空(模擬用注射器)Flexicon 螺動泵-DF6
測試用75毫升Ped1-PAK 柔性袋，以模擬最終產(chǎn)品的低溫冷凍袋。直接使用制造商的控制袋。用兩種方法之一測試袋的殘余空氣。第一包括附加一個60毫升的注射器到袋的魯爾鎖口，并手動拉動柱塞直到?jīng)]有多余的空氣需要排出。第二個包括附加魯爾鎖口至實驗室室內(nèi)真空線(商業(yè)真空泵)，在一分鐘之內(nèi)排出袋內(nèi)空氣。真空后，袋密封，然后取樣測量殘留空氣量。在該袋內(nèi)加入15毫升水，15毫升水足以使殘留的空氣上升到取樣口， 將18GA針注射器插入端口抽出空氣，測定剩余的空氣量。袋中的空氣量，可以從注射器只抽空氣不抽水的情況下抽出的空氣量來估計。
如圖3所示，測試結(jié)果(每個條件n=5袋)表明，控制袋(沒有空氣被排出；零真空) 的殘余空氣平均為13. 5毫升±6. 5毫升，而低真空后的殘留空氣(注射器，真空最小化)平均為1. 8毫升±0. 8毫升，高真空后的殘余空氣(室內(nèi)線，真空最大化)平均為O. 425毫升 ±0.1毫升。在真空包裝袋中殘留的空氣被認為是在冷凍保存可接受的范圍內(nèi)，優(yōu)先采用較高的真空度，也就是控制袋中殘余空氣的97%要被抽出。
進一步的測試表明，通過商業(yè)的真空泵在不同時間施加真空，從O到20秒，在約3 秒內(nèi)達到最大除去殘留的空氣(約97% )。參見圖4。
所述試驗表明，用產(chǎn)品灌裝袋之前排出空氣(與現(xiàn)行的做法相反)，在本發(fā)明的灌裝過程中使用封閉的無菌系統(tǒng)，提供充分去除空氣的方法，以制備封閉系統(tǒng)的灌裝袋。備選地,根據(jù)本發(fā)明，由生產(chǎn)商排出袋內(nèi)空氣,供給不需經(jīng)本發(fā)明的集成真空工序的沒有空氣的包裝袋。實施例2.清除用于灌裝袋的管道中流體產(chǎn)品。
在生產(chǎn)過程中很多階段均會發(fā)生產(chǎn)品損失，包括產(chǎn)品灌裝過程中殘留在管道中的流體。當生產(chǎn)規(guī)模提高至商業(yè)水平時，相對少量流體可累積到大量流體。此外，每毫升最終產(chǎn)品是非常有價值的，本質(zhì)上是昂貴的細胞治療，甚至在大批量生產(chǎn)(例如，500-1000產(chǎn)品劑量)中，5%的產(chǎn)品損失就高達數(shù)十萬美元。因此，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種方法，清除管線到密封之前的包裝袋中流體產(chǎn)品。材料和設備 Flexicon 螺動泵-DF6 撓性管，內(nèi)徑(ID) 3. 2毫米頂裝規(guī)模 Ped1-Pak 袋(見例 O 60毫升的注射器，18GA針水
凈化過程測試包括使用標準條件Flexicon泵分裝10毫升水到5個單袋和5袋歧管中各袋子?？刂茥l件包括管道中的流體沒有凈化或操作。試驗條件包括使用一個“Y”連接器，添加一個60毫升的注射器到灌裝線，用一鉗子關(guān)閉到注射器的線。每個袋灌裝后，釋放到鉗的注射器，足夠的空氣被驅(qū)逐以推動保留在灌裝線的流體約在產(chǎn)品袋的3毫米內(nèi)。 然后夾緊到袋的管道，并用相同的方法灌裝下一個袋子。然后，使用帶針的注射器以除去每個袋子中的流體。稱每個袋的流體，記錄重量并分析，以確定每袋的平均交付劑量。
如圖5所示，沒有凈化的單袋平均重量為9. 09克±0. 26g，五袋歧管中沒有凈化一個袋子的平均重量為8. 76克±0. 33克。與此相反，經(jīng)過氣體凈化的一個袋子的平均重量·為9. 85克±0. 17克，而5袋歧管中一個袋子經(jīng)過氣體凈化的平均重量為9. 97克±0. 05 克。
因此，本試驗的結(jié)果表明，每袋的凈化管線可以儲存超過I毫升(或10%)的產(chǎn)品。 它還表明不準確的幅度從±0. 33克(3. 3%)下降至±0.05克(0.5%)。這些產(chǎn)品保留在灌裝生產(chǎn)線，將大大提高效率，降低成本和大規(guī)模生產(chǎn)的時間和金錢。實施例3.分析工藝時間和對生產(chǎn)暈的影響。
即使是專業(yè)培訓的技術(shù)人員手動灌裝個別產(chǎn)品的包裝袋的過程中也會消耗大量的精力。本發(fā)明人分別分析無菌焊接一個袋子到泵組件，灌裝袋，密封袋，從灌裝線取出它所需的精力。基于上述分析，提出了一個高效灌裝袋的策略，使用多袋歧管，以消除許多的手工工藝要求的無菌焊接。材料和設備 Flexicon 栗-DP6 泰爾茂無菌管焊機手管封口機(加熱)計時器 Ped1-Pak 袋水
計算過程中的各個步驟所確定的平均經(jīng)過時間，然后相加，估計總工藝時間。估計灌裝一個單袋和多袋歧管中的一個袋的總時間。灌裝過程被分解成下面列出的幾個步驟焊接對齊的管焊機焊接管焊縫檢查熱管密封袋管分支灌裝-分配流體的實際時間
無論使用單袋還是多袋歧管，每袋的灌裝時間均不會改變。對于多袋歧管每袋的焊接時間，即在細胞源線和歧管的共同主輸入線之間的單個焊縫對準、焊接、和檢查，平均值超過歧管的袋數(shù)。密封和分離時間，每袋是相同的，無論是單一袋或一個歧管。然后加入這些平均的步驟時間來計算灌裝單袋系統(tǒng)或一個歧管中的每個袋子的平均的、預期的時間。
所收集的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的平均時間對齊8. O秒密封19. O秒焊接19. 6秒分離2. O秒袋密封試驗3. O秒
這些數(shù)字表明，一個3袋歧管完整的管道連接和斷開過程，每袋將需要31. 2秒，5 袋歧管需要27. 12秒和7袋歧管需要25. 37秒。結(jié)合灌裝時間(5毫升 2秒和18毫升 4秒)估計，用5毫升的劑量，在一小時內(nèi)，一名技術(shù)人員只能灌裝67個單袋，而使用一個3 袋歧管，可以灌裝112袋。其他灌裝體積和歧管尺寸的估計時間顯示在下面的表I中。
表I估計在一小時內(nèi)，由一名技術(shù)人員灌裝袋
權(quán)利要求
1.一種在非無菌的環(huán)境中，將活的哺乳動物細胞無菌地分裝到無菌的柔性袋的方法， 其特征在于，所述方法包括以下步驟Ca)提供多個所述無菌的柔性袋；(b)提供所述活的哺乳動物細胞懸浮液，該懸浮液盛在一個無菌的細胞源容器中；(C)將所述無菌袋連接至所述細胞源容器、一個真空源和一個無菌凈化氣體源，以形成一個無菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)對外部環(huán)境是封閉的，其中，所述系統(tǒng)選擇性地允許流體在所述無菌袋和所述真空源或所述細胞源容器或所述無菌氣體源之間流動；(d)排出一個所述柔性袋中空氣，通過選擇性地允許流體在所述一個袋與所述真空源之間流動；(e)所需體積的所述流體分裝到一個或多個所述袋，通過選擇性地允許所需體積的流體在一個或多個所述袋和所述細胞源容器之間流動；(f)所述細胞源容器與一個或多個所述袋之間的所述系統(tǒng)中的所需體積的所述流體逼進一個或多個所述袋，通過選擇性地允許所述的無菌凈化氣體從所述氣體容器通過所述系統(tǒng)流入一個或多個所述袋。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個柔性袋、所述細胞源容器、所述真空源和所述無菌凈化氣體源至少部分通過撓性管流動地連接在一起，其中有一個外部接合所述撓性管的夾緊閥，該撓性管選擇性地允許流體在所述無菌袋和所述細胞源容器或所述真空源或所述氣源之間流動。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，一個蠕動泵單元用于泵送所述流體從所述源容器中通過所述撓性管流入所述柔性袋。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，一個或多個所述泵單元和所述閥由一個控制器是遠程控制的。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述撓性管包括一條主線和一條或多條分支線，其中所述主線是一段撓性管，其一端連接至所述容器和所述氣源，以便選擇性地允許流體從所述容器或所述氣源流入所述主線；各所述柔性袋通過一條分支線流動地連接至所述主線，各所述分支線是一段撓性管， 其一端流動地連接至一個所述袋，而另一端流動地連接至所述主線，以便允許所述流體或所述氣體從所述主線流入所述袋；所述真空源流動地連接至所述主線，以便允許所述真空源通過所述主線和所述分支線排出各所述袋中的空氣。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括無菌地密封和斷開已灌裝袋的分支線。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，最后灌裝的袋的細胞存活率為在所述細胞源容器中所述流體分裝所述袋之前初始細胞存活率的至少90%。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，通過所述管的所述流體的流量是從10毫升 /分鐘至1000毫升/分鐘，在懸浮液中的細胞密度是從100萬/毫升至3000萬/毫升，所述流體包括從O至10%二甲亞砜。
9.一種存儲活的哺乳動物細胞的方法，包括所述細胞分裝到如權(quán)利要求6所述方法的無菌柔性袋中，之后斷開已經(jīng)灌裝的袋，低溫保存所述袋中的所述細胞。
10.一種在非無菌的環(huán)境中，將活的哺乳動物細胞無菌分裝到無菌柔性袋中的裝置，所述裝置包括多個所述無菌柔性袋；一個包含懸浮在流體中的所述活的哺乳動物細胞的細胞源容器；一個真空源；一個無菌凈化氣體源其中，所述多個柔性袋、所述細胞源容器、所述真空源與所述氣源流動地連接在一起， 以形成一個對外部環(huán)境封閉的無菌系統(tǒng)，如此，所述系統(tǒng)選擇性地允許流體在所述無菌袋和所述細胞源容器或所述真空源或所述氣源之間流動。
11.如權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，所述多個柔性袋、所述細胞源容器、所述真空源和所述無菌凈化氣體源部分通過撓性管流動地連接在一起，其中有一個或多個外部接合在所述撓性管的夾緊閥，該撓性管選擇性地允許流體在所述無菌袋和所述細胞源容器或所述真空源或所述氣源之間流動。
12.—種如權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，包括一個蠕動泵單元，用于泵送所述流體從所述源容器通過所述撓性管進入所述柔性袋。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，一個或多個所述泵單元和所述夾緊閥是由一個控制器遠程控制。
14.如權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，所述撓性管包括一條主線和一條或多條分支線，其中所述主線是一段撓性管，其一端連接至所述容器和所述氣源，以便選擇性地允許流體從所述容器或所述氣源流入所述主線；各所述柔性袋通過一條分支線流動地連接至所述主線，各所述分支線是一段撓性管， 其一端流動地連接至一個所述袋，而另一端流動地連接至所述主線，以便允許所述流體或所述氣體從所述主線流入所述袋；所述真空源流動地連接至所述主線，以便允許所述真空源通過所述主線和所述分支線抽出各所述袋中的氣體。
全文摘要
一種在一個非無菌的環(huán)境中，將活的哺乳動物細胞無菌分裝到無菌柔性袋的裝置和方法。該方法包括以下步驟提供懸浮在液體中的細胞；提供多個無菌的柔性袋，其通過無菌撓性管的多個分支線流動地連接至一條主線；通過施加真空到該主線的開口端，排出柔性袋中的空氣；除了需要灌裝的袋的分支線外，防止液體流過所有其他分支線；所需體積的細胞懸浮液分裝到該主線的開口端；主線開口端需充分壓入無菌凈化氣體，足以使留在灌裝袋主線或分支線中的分裝的液體進入袋中。細胞可在灌裝袋內(nèi)低溫保存。
文檔編號C12M1/00GK103025857SQ201180022364
公開日2013年4月3日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月4日
發(fā)明者喬納森·羅利, 帕特里克·紐森 申請人:龍沙沃克斯維爾公司