專利名稱：硫酯酶以及使用其的脂肪酸或脂質(zhì)的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型硫酯酶以及編碼該硫酯酶的基因。另外，本發(fā)明涉及含有該硫酯酶基因的轉(zhuǎn)化子以及使用該硫酯酶的脂肪酸或脂質(zhì)的制造方法。
背景技術(shù)：
脂肪酸是脂質(zhì)的I個主要構(gòu)成成分，在生物體內(nèi)與甘油進行酯結(jié)合構(gòu)成三酰基甘油等脂質(zhì)，在較多動植物中作為能量源被儲藏利用的物質(zhì)。在動植物內(nèi)積蓄的脂肪酸或脂質(zhì)作為食用或工業(yè)用受到廣泛地利用，例如，單?；视?、二酰基甘油等被利用作食品的中間原料，其它各種工業(yè)產(chǎn)品的添加劑、中間原料。另外，還原碳原子數(shù)為12 18左右的高級脂肪酸所得到的高級醇的衍生物可以用作表面活性劑。例如，烷基硫酸酯鹽或烷基苯磺酸鹽等作為陰離子表面活性劑，另外，聚氧化烯烷基醚或烷基聚糖苷等作為非離子表面活性劑都可以用作清潔劑或殺菌劑。同樣地，作為高級醇的衍生物的烷基胺鹽或者單或二烷基季銨鹽等陽離子表面活性劑日常用作殺菌劑，苯扎型季銨鹽日常用作殺菌劑或防腐劑。特 別是，包含碳原子數(shù)為12左右的烷基部位的陰離子表面活性劑以及非離子表面活性劑作為表現(xiàn)出高清潔能力的清潔基材等，另外，包含碳原子數(shù)為14左右的烷基部位的陽離子表面活性劑作為優(yōu)異的毛發(fā)護理劑等是有用的。進一步，碳原子數(shù)為18左右的高級醇作為植物的生長促進劑也是有用的。由于這樣的脂肪酸類能夠利用于各方面，因而其是有用的物質(zhì)，所以進行使動植物等生物體內(nèi)的脂肪酸或脂質(zhì)的生產(chǎn)能力提高的嘗試。例如，提出有通過導(dǎo)入乙?；鵆oA羧化酶(ACCase)而使種子中的脂質(zhì)量提高的方法(專利文獻I、非專利文獻I、專利文獻5)，通過導(dǎo)入酶sn-2?；D(zhuǎn)移酶(SLCl-I)使種子中的脂質(zhì)量提高的方法(專利文獻2、專利文獻3和非專利文獻2)，通過導(dǎo)入二?；视王；D(zhuǎn)移酶基因(DGAT)使種子中的脂質(zhì)量提高的方法(專利文獻4以及非專利文獻3)等。另外，由于脂肪酸類的用途和有用性較大地依賴于其碳原子數(shù)，因此也進行控制脂肪酸的碳原子數(shù)、即鏈長的嘗試。例如，提出有通過導(dǎo)入來自于加州月桂(Umbellularia californica (California bay))的酸基-ACP 硫酯酶使碳原子數(shù)為12的脂肪酸積蓄的方法(專利文獻6、非專利文獻4)，通過導(dǎo)入來自于萼距花(Cuphea hookeriana)的?；?ACP硫酯酶使碳原子數(shù)為8或10的脂肪酸積蓄的方法(專利文獻7)、通過導(dǎo)入來自于樟樹(Cinnamomum camphorum)的?；?ACP硫酯酶使碳原子數(shù)為14的脂肪酸積蓄的方法(非專利文獻5)等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I :日本特開2002-335786號公報專利文獻2 :日本特表平11-506323號公報專利文獻3 :國際公開第2008/076377號小冊子專利文獻4 :國際公開第2000/036114號小冊子專利文獻5 :美國專利第5，925，805號說明書
專利文獻6 :日本特表平7-501924號公報專利文獻7 :日本特表平8-502892號公報非專利文獻非專利文獻I :Madoka Y, Tomizawa K, Mizoi J, Nishida I, Nagano Y, SasakiY. , uChloroplast transformation with modified accD operon increases acetyl-CoAcarboxylase and causes extension of leaf longevity and increase in seed yieldin tobacco”，Plant Cell Physiol. , 2002 Dec, 43 (12)，p.1518-1525非專利文獻2 :Zou J, Katavic V, Giblin EM, Barton DL, MacKenzie SL, KellerWA, Hu X, Taylor DC. , “Modification of seed oil content and acyl composition inthe brassicaceae by expression of a yeast sn-2 acyltransferase gene，，，PlantCell, 1997 Jun，9 (6) ,p. 909-923 非專利文獻3 :Jako C, Kumar A, Wei Y, Zou J, Barton DL, Giblin EM, CovelloPS, Taylor DC.，“Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding adiacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight”, PlantPhysiol. , 2001, 126 (2) ,p. 861-874非專利文獻4:Voelker TA, Worrell AC, Anderson L, Bleibaum J, Fan C, HawkinsDJ, Radke SE, Davies HM. ,“Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains intransgenic oilseed plants，，，Science. 1992 Jul 3; 257 (5066), p. 72-74.非專利文獻5 :Yuan L, Voelker TA, Hawkins DJ. “Modification of thesubstrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by proteinengineering” Proc Natl Acad Sci USA. 1995Nov 7;92 (23),p.10639-10643.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供一種新型硫酯酶以及編碼該酶的硫酯酶基因。另外，本發(fā)明的課題在于提供含有該硫酯酶基因、并且提高了脂肪酸或包含這些脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化子。進一步，本發(fā)明的課題在于提供使用該轉(zhuǎn)化子的脂肪酸或包含這些脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法。解決課題的手段本發(fā)明者們?yōu)榱颂岣邉又参锏戎械闹舅峄蛑|(zhì)的生產(chǎn)能力進行了專心研究。因此，著眼于對生物體內(nèi)的脂肪酸和脂質(zhì)的生物合成起重要作用的酶硫酯酶，嘗試對較之現(xiàn)有硫酯酶的生產(chǎn)能力更高的新型硫酯酶進行了探索。其結(jié)果發(fā)現(xiàn):從椰子(Cocos nuciferaL.)中分離新型編碼硫酯酶的基因，并導(dǎo)入有該硫酯酶基因的轉(zhuǎn)化子，與導(dǎo)入有其它硫酯酶基因的轉(zhuǎn)化子相比較，其脂肪酸和脂質(zhì)的生產(chǎn)能力都明顯提高，以及脂質(zhì)中所含的脂肪酸的組成與椰子胚乳的組成不同?；谶@些發(fā)現(xiàn)至此完成本發(fā)明。本發(fā)明涉及下述(a) (C)的任意一種蛋白質(zhì)(以下，也稱為本發(fā)明的蛋白質(zhì))。(a)由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)，(b)由在序列號I所示的氨基酸序列中缺失、置換、插入和/或添加I個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)，
(c)由與序列號I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性(同源性)的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及編碼所述本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因(以下，也稱為本發(fā)明的基因)，優(yōu)選為由下述(d) Cf)的任意一種的DNA構(gòu)成的基因。(d)由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成的，并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA,(e)在嚴格條件下與由序列號2所示的堿基序列互補的堿基序列構(gòu)成的DNA進行雜交的，并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，(f)由與序列號2所示的堿基序列具有90%以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的，并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。 另外，本發(fā)明涉及含有所述基因的重組載體，以及包含所述基因或所述重組載體的轉(zhuǎn)化子。另外，本發(fā)明涉及一種脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子，從培養(yǎng)物中提取脂肪酸或者包含這些脂肪酸的脂質(zhì)，其中，脂肪酸優(yōu)選為月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸以及棕櫚油酸。進一步，本發(fā)明涉及使脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力提高的方法，其特征在于，在宿主中導(dǎo)入編碼下述(a) (C)的任意一種的蛋白質(zhì)的基因。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種新型硫酯酶以及編碼該酶的硫酯酶基因。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供含有該硫酯酶基因，并且提高了脂肪酸或脂質(zhì)的生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化子。進一步，根據(jù)本發(fā)明，可以提供使用該轉(zhuǎn)化子的脂肪酸(優(yōu)選為月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸以及棕櫚油酸)或脂質(zhì)的制造方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子以及脂肪酸或脂質(zhì)的制造方法具有優(yōu)異的生產(chǎn)能力，還可以得到特有的脂肪酸組成，可以優(yōu)選用于脂肪酸或脂質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的上述以及其它特征和優(yōu)點可以適當參照附圖，從下述的記載中進一步明確。


圖I是表示導(dǎo)入有來自于加州月桂的硫酯酶(BTE)基因、或者來自于椰子的硫酯酶(CTE)基因并經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的各脂肪酸的生產(chǎn)量的圖。圖2是表示導(dǎo)入有來自于加州月桂的硫酯酶(BTE)基因、或者來自于椰子的硫酯酶(CTE)基因并經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的總脂肪酸生產(chǎn)量的圖。圖3是分別表示(a)椰子胚乳中的脂肪酸構(gòu)成比率、(b)導(dǎo)入有來自于椰子的硫酯酶(CTE)基因的轉(zhuǎn)化子的脂肪酸構(gòu)成比率的圖。圖4是表示擬南芥野生株、以及導(dǎo)入有來自于椰子的硫酯酶基因的擬南芥轉(zhuǎn)化子Pnapin-CTE的種子中所含的總脂肪酸量的圖。圖5是表示擬南芥野生株、以及導(dǎo)入有來自于椰子的硫酯酶基因的擬南芥轉(zhuǎn)化子Pnapin-CTE的種子中的脂肪酸構(gòu)成比率的圖。
具體實施方式
I.硫酯酶本發(fā)明的蛋白質(zhì)為以下的(a) (C)的任意一種蛋白質(zhì)(以下，也稱為“本發(fā)明的硫酯酶”)。(a)由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)，(b)由在序列號I所示的氨基酸序列中缺失、置換、插入和/或添加I個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)，(c)由與序列號I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性(同源性)的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的基因為編碼上述蛋白質(zhì)的基因。由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)為來自于椰子(Cocos nucifera L.)·的新型硫酯酶(以下，簡稱為CTE)。硫酯酶是作為與甘油三酯的生物合成體系相關(guān)的酶的?；??；d體蛋白質(zhì)(Acyl-ACP)硫酯酶，并且水解作為葉綠體內(nèi)或質(zhì)體內(nèi)的脂肪酸生物合成過程的中間體的?；?酰基載體蛋白質(zhì)(由作為脂肪酸殘基的?；王；d體蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體)的硫酯鍵，生成游離的脂肪酸的酶。通過硫酯酶的作用，使?；d體蛋白質(zhì)上的脂肪酸合成終止，游離的脂肪酸從質(zhì)體輸送并供給于甘油三酯合成?？芍蝓ッ父鶕?jù)作為基質(zhì)的構(gòu)成?；?酰基載體蛋白質(zhì)的脂肪酸殘基的種類不同而表現(xiàn)出不同的反應(yīng)特異性，是確定生物體內(nèi)的脂肪酸組成的重要的因素。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，除了(a)由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)，還包含與該蛋白質(zhì)功能上均等的蛋白質(zhì)。通常，編碼酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列并不是全部區(qū)域的序列沒被保留就一定不顯示酶活性，已知即使氨基酸序列發(fā)生變化也存在不影響酶活性的區(qū)域。在這樣的區(qū)域中即使導(dǎo)入氨基酸的缺失、置換、插入或添加等突變也可以維持酶本來的活性。在本發(fā)明中，也可以使用這樣保持硫酯酶活性地由序列號I所示的氨基酸序列進行部分變化的變異體。作為與由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的硫酯酶功能上均等的蛋白質(zhì)，可以列舉(b)由在序列號I所示的氨基酸序列中缺失、置換、插入和/或添加I個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)、以及(C)由與序列號I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性(同源性)的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)，這些都包含于本發(fā)明的蛋白質(zhì)。上述(b)的蛋白質(zhì)中的“缺失、置換、插入和/或添加I個或多個氨基酸的氨基酸序列”優(yōu)選為缺失、置換、插入和/或添加廣20個氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加f 10個氨基酸的氨基酸序列，進一步優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加f 5個氨基酸的氨基酸序列，特別優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加廣2個左右氨基酸的氨基酸序列。另外，上述添加中包括在兩末端添加f多個氨基酸。另外，作為上述(C)的蛋白質(zhì)中的“具有90%以上同一性的氨基酸序列”，氨基酸序列的同一性優(yōu)選為95%以上，更優(yōu)選為96%以上，進一步優(yōu)選為97%以上，特別優(yōu)選為98%以上。在后述的實施例中本發(fā)明者們進行了研究，在將由序列號I的氨基酸序列構(gòu)成的硫酯酶與其它公知的硫酯酶的氨基酸序列比較的情況下，其同一性為5(Γ60%左右。例如，與來自于加州月桂(Umbellularia californica,也稱為加利福尼亞月桂)的硫酯酶的氨基酸序列的同源性為50%左右，與來自于擬南芥的硫酯酶的氨基酸序列的同源性為60%左右。本發(fā)明中的氨基酸序列和堿基序列的同一丨生(同源性)通過Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))進行計算。具體來說，使用基因信息處理軟件Genetyx-Win(軟件開發(fā))的同源性分析(Search homology)程序,將Unit size to compare (ktup)作為2進行分析，由此算出。在上述(b)和(C)的蛋白質(zhì)中，作為更優(yōu)選的具有硫酯酶活性的變異體，優(yōu)選具有硫酯酶活性的、并且具有序列號I所示的氨基酸序列中以下位置的氨基酸被保留，而在這些位置以外的區(qū)域中氨基酸序列一部分發(fā)生變化的蛋白質(zhì)相當于第34個的氨基酸保留為精氨酸，相當于第35個的氨基酸保留為絲氨酸，相當于第37個的氨基酸保留為谷氨酸，相當于第39個的氨基酸保留為甘氨酸，相當于第41個的氨基酸保留為天冬氨酸，相當于第 51個的氨基酸保留為天冬酰胺，相當于第54個的氨基酸保留為谷酰胺，相當于第59個的氨基酸保留為天冬酰胺，相當于第65個的氨基酸保留為甘氨酸，相當于第70個的氨基酸保留為甘氨酸，相當于第72個的氨基酸保留為甘氨酸，相當于第74個的氨基酸保留為蘇氨酸，相當于第77個的氨基酸保留為蛋氨酸，相當于第82個的氨基酸保留為亮氨酸，相當于第84個的氨基酸保留為色氨酸，相當于第85個的氨基酸保留為纈氨酸，相當于第96個的氨基酸保留為酪氨酸，相當于第98個的氨基酸保留為色氨酸，相當于第99個的氨基酸保留為色氨酸，相當于第108個的氨基酸保留為色氨酸，相當于第113個氨基酸保留為甘氨酸，相當于第137個的氨基酸保留為絲氨酸，相當于第142個的氨基酸保留為蛋氨酸，相當于第147個的氨基酸保留為精氨酸，相當于第177個的氨基酸保留為賴氨酸，相當于第192個的氨基酸保留為甘氨酸，相當于第193個的氨基酸保留為亮氨酸，相當于第195個的氨基酸保留為脯氨酸，相當于第197個的氨基酸保留為色氨酸，相當于第199個的氨基酸保留為天冬氨酸，相當于第201個的氨基酸保留為天冬氨酸，相當于第203個的氨基酸保留為天冬酰胺，相當于第205個的氨基酸保留為組氨酸，相當于第206個的氨基酸保留為纈氨酸，相當于第210個的氨基酸保留為賴氨酸，相當于第211個的氨基酸保留為酪氨酸，相當于第214個的氨基酸保留為色氨酸，相當于第220個的氨基酸保留為脯氨酸，相當于第236個的氨基酸保留為酪氨酸，相當于第239個的氨基酸保留為谷氨酸，相當于第248個的氨基酸保留為絲氨酸，相當于第266個的氨基酸保留為組氨酸，以及相當于第283個的氨基酸保留為色氨酸。本發(fā)明的硫酯酶具有下述特征。(I)本發(fā)明的導(dǎo)入了硫酯酶的轉(zhuǎn)化子與導(dǎo)入了其它植物硫酯酶(例如，來自于加州月桂的硫酯酶)的轉(zhuǎn)化子相比，脂肪酸或脂質(zhì)的生產(chǎn)能力更高。(2)在本發(fā)明的導(dǎo)入了硫酯酶的轉(zhuǎn)化子中，可以生產(chǎn)與椰子胚乳不同組成的脂肪酸。具體來說，增加肉豆蘧酸(C14:0)的生產(chǎn)量。另外，可以生產(chǎn)椰子胚乳中幾乎看不到的不飽和脂肪酸(特別是，C16:l的棕櫚油酸)。(3)本發(fā)明的導(dǎo)入了硫酯酶的轉(zhuǎn)化子中，主要生產(chǎn)月桂酸(C12:0)、肉豆蘧酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)以及棕櫚油酸(C16:l)。在本發(fā)明中，“具有硫酯酶活性”是指，具有水解酰基-?；d體蛋白質(zhì)的硫酯鍵的活性。蛋白質(zhì)是否具有硫酯酶活性，例如，可以通過將在大腸桿菌等宿主細胞內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子的下游處連接有硫酯酶基因的融合基因?qū)肴睋p脂肪酸分解體系的宿主細胞，在導(dǎo)入的硫酯酶基因表達的條件下進行培養(yǎng)，使用氣相色譜分析等方法分析宿主細胞的脂肪酸組成的變化，從而可以測定硫酯酶活性?；蛘撸ㄟ^將在大腸桿菌等宿主細胞內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子的下游處連接有硫酯酶基因的融合基因?qū)胨拗骷毎?，對于在?dǎo)入的硫酯酶基因表達的條件下進行了培養(yǎng)的細胞的破碎液，進行將根據(jù)Yuan etal.，PNAS, 1995，(92)，p. 10639-10643等方法(所述非專利文獻5)制得的各種?；?ACP作為基質(zhì)的反應(yīng)，由此可以測定硫酯酶活性。對于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的取得方法沒有特別地限制，可以通過通常進行的化學(xué)或基因工程的方法等來得到。例如，可以通過從椰子的胚乳中分離、精制等，從而取得來自于天然物的蛋白質(zhì)。另外，既可以基于序列號I所示的氨基酸序列信息進行人工合成等，也可以通過化學(xué)合成進行蛋白質(zhì)合成，也可以通過基因重組技術(shù)制作重組蛋白質(zhì)。在制作重組蛋白質(zhì)的情況下，可以使用后述的本發(fā)明的硫酯酶基因。2.硫酯酶基因本發(fā)明的基因是編碼上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因(以下，也稱為“本發(fā)明的硫酯酶基因”)。優(yōu)選，可以列舉(d)由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成并且編碼具有硫酯酶活性的蛋 白質(zhì)的DNA所構(gòu)成的基因，或者與該基因功能上均等的基因。作為功能上均等的基因，可以列舉以下(e) (g)的基因，(e)在嚴格條件下與由序列號2所不的喊基序列互補的喊基序列構(gòu)成的DNA進行雜交并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA所構(gòu)成的基因，(f)由與序列號2所示的堿基序列具有90%以上的同一性(同源性)的堿基序列構(gòu)成并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA所構(gòu)成的基因，以及(g)由序列號2所示的堿基序列中I個或多個堿基缺失、置換、插入和/或添加的堿基序列構(gòu)成并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA所構(gòu)成的基因，這些都包含于本發(fā)明的基因。在本發(fā)明中，作為“嚴格的條件”，例如可以列舉Molecular Cloning - ALABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W Russell. ， Cold SpringHarbor Laboratory Press]記載的方法,例如可以列舉使含有6XSSC (1XSSC的組成:O. 15M氯化鈉、O. 015M檸檬酸鈉，pH7. 0),0. 5%SDS、5xDenhardt 以及 100mg/ml 鯡魚精 DNA 的溶液與探針在65°C下恒溫8 16小時進行雜交的條件。作為上述(f)的基因中的“具有90%以上同一性的堿基序列”，堿基序列的同一性優(yōu)選為95%以上，更優(yōu)選為96%以上，進一步優(yōu)選為97%以上，特別優(yōu)選為98%以上。本發(fā)明中的堿基序列的同一性通過所述的Lipman-Pearson法(Science, 227, 1435, (1985))來進行計算。具體來說，通過使用基因信息處理軟件Genetyx-Win (軟件開發(fā))的同源性分析(Search homology)程序,將 Unit size to compare (ktup)作為 2 進行分析,從而算出。上述(g)的基因中的“缺失、置換、插入和/或添加I或多個堿基的堿基序列”優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加f 60個堿基的堿基序列，更優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加I 30個喊基的喊基序列，進一步優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加I 15個喊基的喊基序列，特別優(yōu)選缺失、置換、插入和/或添加1飛個堿基的堿基序列。另外，上述添加包括在兩末端添加多個堿基。作為上述(e廣(g)的基因，優(yōu)選為由編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的基因，并且，具有對應(yīng)于該基因編碼的氨基酸序列成為在所述序列號I所示的氨基酸序列中以下位置的氨基酸被保留的堿基序列，而這些氨基酸保留位置以外的區(qū)域中堿基序列一部分發(fā)生變化相當于第34個的氨基酸保留為精氨酸、相當于第35個的氨基酸保留為絲氨酸、相當于第37個的氨基酸保留為谷氨酸、相當于第39個的氨基酸保留為甘氨酸、相當于第41個的氨基酸保留為天冬氨酸、相當于第51個的氨基酸保留為天冬酰胺、相當于第54個的氨基酸保留為谷酰胺、相當于第59個的氨基酸保留為天冬酰胺、相當于第65個的氨基酸保留為甘氨酸、相當于第70個的氨基酸保留為甘氨酸、相當于第72個的氨基酸保留為甘氨酸、相當于第74個的氨基酸保留為蘇氨酸、相當于第77個的氨基酸保留為蛋氨酸、相當于第82個的氨基酸保留為亮氨酸、相當于第84個的氨基酸保留為色氨酸、相當于第85個的氨基酸保留為纈氨酸、相當于第96個的氨基酸保留為酪氨酸、相當于第98個的氨基酸保留為色氨酸、相當于第99個的氨基酸保留為色氨酸、相當于第108個的氨基酸保留為色氨酸、相當于第113個氨基酸保留為甘氨酸、相當于第137個的氨基酸保留為絲氨酸、相當于第142個的氨基酸保留為蛋氨酸、相當于第147個的氨基酸保留為精氨酸、相當于第177個的氨基酸保留為賴氨酸、相當于第192個的氨基酸保留為甘氨酸、相當于第193個的氨基酸保留為亮氨酸、相當于第195個的氨基酸保留為脯氨酸、相當于第197個的氨基酸保留為色氨酸、相當于第199個的氨基酸保留為天冬氨酸、相當于第201個的氨基酸保留為天冬氨酸、相當于第203個的氨基酸保留為天冬酰胺、相當于第205個的氨基酸保留為組氨酸、相當于第206個的氨基酸保留為纈氨酸、相當于第210個的氨基酸保留為賴氨酸、相當于第211個的氨基酸保留為酪氨酸、相當于第214個的氨基酸保留為色氨酸、相當于第220個的 氨基酸保留為脯氨酸、相當于第236個的氨基酸保留為酪氨酸、相當于第239個的氨基酸保留為谷氨酸、相當于第248個的氨基酸保留為絲氨酸、相當于第266個的氨基酸保留為組氨酸、以及相當于第283個的氨基酸保留為色氨酸。作為本發(fā)明的硫酯酶基因的取得方法，沒有特別地限制，可以通過通常的基因工程技術(shù)來得到。例如，基于序列號I所示的氨基酸序列或序列號2所示的堿基序列，可以通過人工合成取得本發(fā)明的硫酯酶基因?；虻娜斯ず铣煽梢岳美鏘nvitrogen Inc.等業(yè)務(wù)。另外，可以通過克隆從椰子中取得，例如，可以根據(jù)Molecular Cloning-ALABORATORYMANUAL THIRD EDITI0N[Joseph Sambrook, David ff. RusselI, Cold Spring HarborLaboratory Press (2001)]記載的方法等來進行。在將突變導(dǎo)入序列號I所示的氨基酸序列或序列號2所示的堿基序列的情況下，例如可以列舉位點特異突變導(dǎo)入法。作為具體的位點特異突變的導(dǎo)入方法，可以列舉利用剪接重疊延伸(Splicing overlap extension, S0E) PCR 反應(yīng)(Horton et al. , Gene77, 61-68, 1989)的方法、ODA 法(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene, 152，271-276，1995)、Kunkel 法(Kunkel, T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985，82，488)等。另外，也可以利用 Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmi^ 劑盒(TakaraBio, Inc. )、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis 試劑盒(Clonetech 公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit (東洋紡公司)等市售的試劑盒。另外，在賦予任意的基因突變之后，可以通過用適當?shù)姆椒ㄟM行酶活性評價和基因分析來取得目標基因。具體來說，通過使用任意克隆的DNA片段使同源重組發(fā)生的方法，或者通過照射Y射線等，從而可以導(dǎo)入任意的基因突變。3.轉(zhuǎn)化子本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子是包含所述本發(fā)明的硫酯酶基因或含有該基因的重組載體而成的。如后述的實施例所示，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子大幅提高脂肪酸或者含有這些脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力，所述脂肪酸優(yōu)選為碳原子數(shù)為12以上的長鏈脂肪酸，更優(yōu)選月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸以及棕櫚油酸。另外，對于轉(zhuǎn)化子的脂肪酸生產(chǎn)能力，可以通過后述的實施例中記載的方法進行測定。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子通過用通?；蚬こ痰姆椒▽⑺隽蝓ッ富?qū)胨拗鞫玫健?yōu)選為，可以通過將該基因?qū)肽軌蚴顾隽蝓ッ富蛟谒拗骷毎斜磉_的載體中來調(diào)制重組載體，并將該重組載體導(dǎo)入宿主細胞使宿主細胞轉(zhuǎn)化來制作。得到的轉(zhuǎn)化子提高脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力。首先，對本發(fā)明的含有硫酯酶基因的重組載體進行說明。作為使用的載體，只要是能夠?qū)⒈景l(fā)明的硫酯酶基因?qū)胨拗?、并且能夠使該基因在宿主細胞?nèi)表達的載體即可。例如，可以使用根據(jù)所要導(dǎo)入的宿主的種類而具有啟動
子或終止子等表達調(diào)節(jié)區(qū)域的表達載體，該載體并且具有復(fù)制起始點或選擇標記等。另外，也可以是在質(zhì)粒等染色體外進行自增殖·復(fù)制的載體，也可以是合并于染色體內(nèi)的載體。作為具體的載體，在將微生物作為宿主的情況下，例如可以列舉pBlue script IISK(-) (Stratagene 公司制造)、pUCl 19 (寶酒造公司制造)、pET 系載體(Takara Bio, Inc.制造)、pGEX 系載體(GE Healthcare, Inc.制造)、pCold 系載體(Takara Bio, Inc.制造)、pHY300PLK (Takara Bio, Inc.制造)、pUBllO (Mckenzie, T. et al. , (1986), Plasmid15 (2) ; p. 93-103)、pBR322 (Takara Bio, Inc.制造)、pRS403 (Stratagene Corp.制造)、PMW218/219 (Nippon Gene Co. , Ltd.制造)等。在將植物細胞作為宿主的情況下，例如可以列舉 pRI 系載體(Takara Bio, Inc.制造)、pBI 系載體(Clontech Laboratories, Inc.制造)、IN3系載體(Inplanta Innovations, Inc.制造)等。特別是,在將大腸桿菌作為載體的情況下，優(yōu)選使用 pBlue script II SK(-) (Stratagene 公司制造)、pMW218/219 (NipponGene Co.，Ltd.制造)；在將擬南芥作為宿主的情況下，優(yōu)選使用pRI系載體(TakaraBio, Inc.制造)、pBI 系載體(Clontech Laboratories, Inc.制造)。啟動器或終止子等表達調(diào)節(jié)區(qū)域或選擇標記的種類也沒有特別地限定，可以根據(jù)所要導(dǎo)入的宿主的種類，適當選擇通常使用的啟動子或標記等來使用。具體來說，作為啟動子，可以列舉Iac啟動子、trp啟動子、tac啟動子、trc啟動子、T7啟動子、SpoVG啟動子、花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子、肌動蛋白和泛素等看家基因(house-keeping gene)的啟動子、來自于菜籽的Napin基因啟動子、來自于植物的Rubisco啟動子等。另外，作為選擇標記，可以列舉抗生素抗藥性基因(氨芐西林抗性基因、氯霉素抗性基因、紅霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、大觀霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、滅瘟素S抗性基因、雙丙氨膦抗性基因、以及潮霉素抗性基因)等抗藥性基因。進一步，也可以將與營養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基因的缺失等用作選擇標記基因?？梢圆捎孟拗泼柑幚砘蚪Y(jié)扎等通常的方法，通過將本發(fā)明的硫酯酶基因?qū)脒@樣的載體來構(gòu)建轉(zhuǎn)化子用的載體。另外，本發(fā)明的硫酯酶基因可以通過上述的方法取得。通過由此制得的重組載體，將所述硫酯酶基因?qū)胨拗鲝亩谱鬓D(zhuǎn)化子。作為轉(zhuǎn)化子的宿主沒有特別地限定，可以使用微生物、植物體、動物體。本發(fā)明的硫酯酶如后所述優(yōu)選用于特別是碳原子數(shù)為12以上的長鏈脂肪酸的制造，例如，本來不具有將碳原子數(shù)為12的脂肪酸殘基識別為基質(zhì)的硫酯酶的生物體也可以用作宿主。在本發(fā)明中，從脂肪酸或脂質(zhì)的制造效率以及得到的脂肪酸的利用性的觀點出發(fā)，作為宿主優(yōu)選使用微生物和植物體。作為微生物，可以使用屬于埃希氏菌(Escherichia)屬的微生物或?qū)儆谘挎邨U菌(Bacillus)屬的微生物等原核生物，或者酵母或絲狀菌等真核微生物，其中，優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、圓紅冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、被抱霉菌(Mortierella sp.)，特另Il優(yōu)選大腸桿菌。作為植物體，優(yōu)選擬南芥(Arabidopsis thaliana)、菜籽、椰子、棕櫚、萼距花、麻風(fēng)樹(Jatropha),特別優(yōu)選擬南芥。作為轉(zhuǎn)化方法，只要是能夠?qū)⒛繕嘶驅(qū)胨拗鞯姆椒ň蜎]有特別地限定。例如，可以采用使用鈣離子的方法、通常的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化方法(J. Bacterial. 93, 1925(1967))、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(Mol. Gen. Genet. 168, 111(1979))、電穿孑L 法(FEMS Microbiol.Lett. 55, 135 (1990))或者 LP 轉(zhuǎn)化方法(T. Akamatsu 和 J. Sekiguchi, Archives of Microbiology, 1987, 146, p. 353-357;T. Akamatsu 和 H. Taguchi, Bioscience, Biotechnology, andBiochemistry, 2001, 65, 4, p. 823-829)等。另外，導(dǎo)入有目標基因片段的轉(zhuǎn)化子的選擇可以通過利用選擇標記等來進行。例 如，將轉(zhuǎn)化子獲得抗藥性為指標可以來進行選擇，其結(jié)果來自于載體的抗藥性基因在轉(zhuǎn)化時導(dǎo)入目標DNA片段并且導(dǎo)入宿主細胞中。另外，將染色體組作為模板，通過PCR法等也可以確認目標DNA片段的導(dǎo)入。4.脂肪酸或脂質(zhì)的制造方法本發(fā)明的脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法使用上述本發(fā)明的硫酯酶。作為具體的制造方法，可以列舉使用含有編碼本發(fā)明的硫酯酶的基因的轉(zhuǎn)化子(重組體)的方法、使用精制的Acyl-ACP和本發(fā)明的硫酯酶體外進行從Acyl-ACP中切出脂肪酸的方法(Yuan et al. , PNAS, 1995, (92)，ρ· 10639-10643)等。特別是優(yōu)選為，在通過上述的方法等得到導(dǎo)入了編碼本發(fā)明的硫酯酶的基因的轉(zhuǎn)化子之后，使用適當?shù)呐囵B(yǎng)基在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，使脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)產(chǎn)生，從培養(yǎng)物中提取脂肪酸或脂質(zhì)。另外，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子當然包含微生物或動植物或者其細胞·組織的培養(yǎng)，也包含在土壤等中栽培植物體。另外，在培養(yǎng)物中也包含經(jīng)培養(yǎng)·栽培等后的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)條件可以根據(jù)導(dǎo)入了硫酯酶基因的宿主的種類來選擇，可以采用適宜優(yōu)選的培養(yǎng)條件。作為一個例子，在將大腸桿菌用作宿主的轉(zhuǎn)化子的情況下，可以列舉在LB培養(yǎng)基中3(T37°C下進行培養(yǎng)O. 5^1天。另外，在將擬南芥用作宿主的轉(zhuǎn)化子的情況下，在土壤中在溫度條件為2(T25°C下連續(xù)照射白色光或光期為16小時 暗期為8小時等的光照條件下進行栽培Γ2個月。另外，從脂肪酸和脂質(zhì)的生產(chǎn)效率的觀點出發(fā)，在培養(yǎng)基中可以添加例如作為與硫酯酶的基質(zhì)或脂肪酸生物合成體系相關(guān)的前驅(qū)物質(zhì)的甘油、醋酸、丙二酸等。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子使脂肪酸或脂質(zhì)產(chǎn)生之后，從培養(yǎng)物(培養(yǎng)體或培養(yǎng)液等)中分離、精制等脂肪酸或含有其的脂質(zhì)提取。作為分離、回收轉(zhuǎn)化子內(nèi)產(chǎn)生的脂肪酸或含有其的脂質(zhì)的方法沒有特別地限定，可以通過分離通常生物體內(nèi)的脂質(zhì)成分等時使用的方法來進行。例如，可以通過過濾、離心分離、細胞破碎、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、氯仿/甲醇提取法、己烷提取法、乙醇提取法等從轉(zhuǎn)化子或培養(yǎng)物中分離、回收脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)成分。另外，在更大規(guī)模的情況下，在通過壓榨或提取從轉(zhuǎn)化子或培養(yǎng)物中回收油分之后，可以進行脫氣、脫酸、脫色、脫蠟、脫臭等通常的精制，得到脂質(zhì)。在分離該含有脂肪酸的脂質(zhì)成分之后，可以通過水解分離的脂質(zhì)得到脂肪酸。作為從脂質(zhì)成分中分離脂肪酸的方法，具體來說，可以列舉在堿溶液中在70°C左右的高溫下進行處理的方法、進行脂肪酶處理的方法、使用高壓熱水進行分解的方法等。由此，可以使用本發(fā)明的硫酯酶基因制造脂肪酸或脂質(zhì)。本發(fā)明的脂肪酸或脂質(zhì)的制造方法可以優(yōu)選用于特別是碳原子數(shù)為12以上的長鏈脂肪酸的制造。其中，本發(fā)明的制造方法優(yōu)選用于制造碳原子數(shù)為12 18的脂肪酸，更優(yōu)選用于制造碳原子數(shù)為12 16的脂肪酸，特別優(yōu)選用于制造月桂酸(C12:0)、肉豆蘧酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:l)。本發(fā)明的制造方法或通過轉(zhuǎn)化子制得的脂肪酸或其衍生物，除了用作食用以外，可以作為乳化劑配合于化妝品等中，或者可以作為皂或洗劑等的清潔劑、纖維處理劑、毛發(fā) 護理劑、或殺菌劑或防腐劑利用。特別是，棕櫚油酸可以利用為皮膚功能改善劑(皮膚乳化作用、保護效果、抗炎癥作用、減輕發(fā)癢刺激、輕度燙傷的鎮(zhèn)靜等)。實施例以下，基于實施例進一步詳細地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并沒有限定于此。實施例I來自于椰子(Cocos nucifera L.)的Acyl-ACP硫酯酶基因的取得I.由椰子胚乳調(diào)制cDNA從椰子胚乳中提取RNA。在RNA的提取操作中使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Valencia, California)。用液氮凍結(jié)椰子胚乳之后，使用研缽和碾槌進行粉碎。將已粉碎的物質(zhì)移至適量I. 5mL管中，在其中加入450 μ L添加有1Μ1/100容量的二硫蘇糖醇的RLT Buffer,將攪拌后的總量適用于QIA shredder spin column。之后按照試劑盒附上的手冊進行操作，得到來自于椰子的total RNA。使用得到的total RNA (3.2yg)和SuperScript III First-Strand Synthesis SystemCInvitrogen Carlsbad, California),按照試劑盒附上的手冊，通過進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到來自于椰子胚乳的cDNA。2.來自于椰子的硫酯酶基因(CTE基因)的克隆與椰子相關(guān)的染色體組信息以及與來自于椰子的Acyl-ACP硫酯酶相關(guān)的基因信息并不是公知的，挑選已知的植物硫酯酶的氨基酸序列，并且挑選各硫酯酶間氨基酸保留性高的區(qū)域，相對于該區(qū)域設(shè)計表I所示的簡并引物(引物No. ΓΝο. 5(序列號5、))。具體來說，相當于擬南芥硫酯酶(Genbank ID (GI):804947)中的105 110位(AAEKQW)、250 255位(WVMMN)、31(T318位(DLDVNQHV)、325 324位(NQHVNNVKY)的氨基酸相對于植物硫酯酶序列設(shè)計簡并引物。將來自于椰子胚乳的cDNA作為模板，進行使簡并引物組合的PCR反應(yīng)，通過序列分析確定取得的各CTE基因片段的序列。特別是，通過比對由引物No. 2和No. 4的組合而得到的序列，取得CTE基因的部分序列信息。使用參考取得的部分的序列信息設(shè)計的DNA引物(表1，引物No. 6 (序列號10))以及低聚dT引物(表1，引物No. 7 (序列號11))通過PCR反應(yīng)擴增DNA片段，進行該DNA片段的序列分析，取得、確認編碼來自于椰子的硫酯酶的功能性部分的基因的堿基序列(序列號2)。表I :表I引物序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其中， 所述蛋白質(zhì)為下述(a) (C)的任意一種蛋白質(zhì)， Ca)由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)， (b)由在序列號I所示的氨基酸序列中缺失、置換、插入和/或添加I個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)， (c)由與序列號I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)。
2.—種基因，其中， 所述基因編碼權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)。
3.—種基因，其中， 所述基因由下述(d) (f)的任意一種的DNA構(gòu)成， Cd)由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成的，并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA， Ce)在嚴格條件下與由序列號2所示的堿基序列互補的堿基序列構(gòu)成的DNA進行雜交的，并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA， (f)由與序列號2所示的堿基序列具有90%以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的，并且編碼具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
4.一種重組載體,其中， 所述重組載體含有權(quán)利要求2或3所述的基因。
5.一種轉(zhuǎn)化子，其中， 所述轉(zhuǎn)化子包含權(quán)利要求2或3所述的基因或者權(quán)利要求4所述的重組載體。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，其中， 宿主為微生物或植物。
7.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，其中， 宿主為大腸桿菌。
8.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，其中， 宿主為擬南芥。
9.一種脂肪酸的制造方法，其特征在于， 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求51中任一項所述的轉(zhuǎn)化子，并從培養(yǎng)物中提取脂肪酸。
10.一種含有脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其特征在于， 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求51中任一項所述的轉(zhuǎn)化子，并從培養(yǎng)物中提取含有脂肪酸的脂質(zhì)。
11.如權(quán)利要求9或10所述的制造方法，其特征在于， 所述脂肪酸為碳原子數(shù)為12以上的長鏈脂肪酸。
12.如權(quán)利要求擴11中任一項所述的制造方法，其特征在于， 所述脂肪酸為選自月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸以及棕櫚油酸中的任意一種以上。
13.一種提高脂肪酸或含有脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力的方法，其特征在于， 在宿主中導(dǎo)入編碼下述(a) (c)的任意一種蛋白質(zhì)的基因， Ca)由序列號I所示的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)， (b)由在序列號I所示的氨基酸序列中缺失、置換、插入和/或添加I個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)， (C)由與序列號I所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硫酯酶活性的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及由序列號1所示的氨基酸序列構(gòu)成的硫酯酶以及編碼該蛋白質(zhì)的硫酯酶基因、包含該基因的轉(zhuǎn)化子、以及使用該轉(zhuǎn)化子的脂肪酸或脂質(zhì)的制造方法。
文檔編號C12N5/10GK102884189SQ20118002275
公開日2013年1月16日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者東條卓人, 遠藤圭二 申請人:花王株式會社