專利名稱：具有改進(jìn)靈敏度的均相化學(xué)發(fā)光測試方法
具有改進(jìn)靈敏度的均相化學(xué)發(fā)光測試方法
背景技術(shù)：
特異性結(jié)合測試是用于檢測物質(zhì)存在和數(shù)量的試驗(yàn)方法，并且是基于特異性識別并與特異性結(jié)合伴侶結(jié)合在一起。免疫測試是指一種特異性結(jié)合測試的例子，其中抗體和特定蛋白或者化合物相結(jié)合。在這個(gè)例子中抗體是特異性結(jié)合配對成員中的成員。核酸結(jié)合測試是另一種類型，其中互補(bǔ)的核酸鏈?zhǔn)翘禺愋耘鋵?。特異性結(jié)合測試建立了一個(gè)廣泛和發(fā)展的技術(shù)空間，能夠進(jìn)行疾病狀態(tài)、感染器官以及藥物濫用的精確檢測。在過去的幾十年里，人們投入大量的工作來設(shè)計(jì)具有必需的靈敏度、動態(tài)范圍、穩(wěn)定性、廣泛適用性和適用于自動化的測試和測試方法學(xué)。發(fā)光化合物，比如熒光化合物和化學(xué)發(fā)光化合物，由于它們可以發(fā)光的能力從而被廣泛地應(yīng)用在測試領(lǐng)域。由于這個(gè)原因，已經(jīng)在測試中諸如上述提到的核酸測試和免疫檢測測試中利用發(fā)光體作為標(biāo)記。例如，特異性結(jié)合配對成員與發(fā)光體共軛，并且可以采用·不同的方案，人們可以將觀察到的發(fā)光水平和樣品中分析物的濃度或僅僅是分析物的存在相關(guān)聯(lián)。這些特異性結(jié)合測試方法可以被寬泛地分為兩類。均相法利用分析物特異性結(jié)合反應(yīng)來調(diào)節(jié)或者創(chuàng)建一個(gè)可檢測信號，而無需分析物特異性的和分析物非特異性的反應(yīng)物之間的分離步驟。非均相模式，依賴于與分析物結(jié)合的可檢測地被標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶與游離的(不與分析物結(jié)合的)可檢測的標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的物理分離。分離通常需要將關(guān)鍵的反應(yīng)物固定到某種類型的固體基質(zhì)上，以便進(jìn)行某種類型的物理過程，例如過濾、沉淀、結(jié)塊或者磁性分離，并且通常也需要洗滌步驟來去除游離的可檢測地被標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶。顆粒，如乳膠顆粒和脂質(zhì)體，在測試中也會被用到。舉例說明，在均相測試中酶可以被捕獲在用抗體或抗原標(biāo)記的脂質(zhì)體的水相中。在樣品和補(bǔ)體存在下，引起脂質(zhì)體釋放該酶?？贵w或抗原標(biāo)記的脂質(zhì)體，在水相中具有被包裹的水溶性的熒光或非熒光染料，或者溶解在脂質(zhì)囊泡的脂雙層中的脂溶性染料，可以利用該脂質(zhì)體用于分析物的測試，該分析物能夠進(jìn)入與表面結(jié)合的抗體或抗原之間的免疫化學(xué)反應(yīng)中。洗滌劑被用于將染料從脂質(zhì)體水相中釋放出來。并入本文以供參考的美國專利6，911，305公開了一種檢測聚核苷酸分析物的方法，該聚核苷酸分析物與第一膜上的用敏化劑或者敏化劑標(biāo)記的探針結(jié)合。該膜與帶有固定的化學(xué)發(fā)光前體的第二膜接觸。在夾心的膜中激發(fā)敏化劑，產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧與化學(xué)發(fā)光前體反應(yīng)在第二膜上產(chǎn)生可觸發(fā)的化學(xué)發(fā)光化合物。可觸發(fā)的化學(xué)發(fā)光化合物和試劑反應(yīng)，在第二膜上產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用于檢測分析物。這些方法并不依賴于使反應(yīng)物相接觸的特異性結(jié)合反應(yīng)，而是將第二膜作為試劑輸送裝置。并入本文以供參考的美國專利6，406，913公開了測試方法，該方法包括在一定條件下處理疑似含有分析物的介質(zhì)，以致于分析物能引起光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物接近。當(dāng)用光源照射光敏劑時(shí)，光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧通過溶液擴(kuò)散至化學(xué)發(fā)光化合物，并且當(dāng)單線態(tài)氧緊密接近化學(xué)發(fā)光化合物時(shí)可以活化化學(xué)發(fā)光化合物。活化的化學(xué)發(fā)光化合物隨后產(chǎn)生光。產(chǎn)生光的量與介質(zhì)中分析物的量相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少一種光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物與懸浮顆粒結(jié)合，另一種特異性結(jié)合配對成員也與其結(jié)合。這些均相測試模式利用單線態(tài)氧擴(kuò)散用于選擇與分析物的化學(xué)發(fā)光化合物的活化關(guān)系，與現(xiàn)有技術(shù)的測試技術(shù)相比，該均相測試模式在自動化上提供了操作的便利性和靈活性。盡管這些優(yōu)勢，在測試設(shè)計(jì)和性能上的其他改進(jìn)仍然是測試研發(fā)人員的目標(biāo)。特別是提高特異性信號的產(chǎn)生，降低背景(比如非特異性信號)是人們想要的。本發(fā)明公開的測試方法通過提供簡單的方法來提供或增加靈敏度，解決了這些需求。

發(fā)明內(nèi)容
本申請公開了用于測定疑似含有分析物的樣品中的分析物的方法、試劑、試劑盒和體系，其中所有試劑都是溶解在水溶液中。一種測試方法包括在一定的條件下處理疑似含有分析物的樣品，如果存在分析物，敏化劑被帶入具有化學(xué)發(fā)光化合物的活性構(gòu)造中以便活化該化學(xué)發(fā)光化合物。包括樣品在內(nèi)的反應(yīng)混合物也用一種試劑處理，以便降低與分析物不相關(guān)的信號。最后，使該樣品經(jīng)受一定條件(或者能量、或者活性化合物)以便引起敏化劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，用于與化學(xué)發(fā)光化合物反應(yīng)從而由化學(xué)發(fā)光化合物產(chǎn)生光，以便發(fā)出·樣品中存在分析物的信號。
具體實(shí)施例方式I.定義烷基——含有1-20個(gè)碳原子的支鏈、直鏈或環(huán)狀烴基，可用一個(gè)或多個(gè)除氫之外的其他取代基取代。本文中使用的術(shù)語“低級烷基”，指的是最多含8個(gè)碳原子的烷基。分析物一測試中待檢測樣品中的物質(zhì)。與分析物具有特異性結(jié)合親合力的一種或多種物質(zhì)會被用于檢測該分析物。分析物可以是蛋白、肽、抗體或可以使其與抗體結(jié)合的半抗原。分析物可以是與互補(bǔ)核酸或寡聚核苷酸結(jié)合的核酸或寡聚核苷酸。分析物可以是可形成特異性結(jié)合配對成員的任何其他物質(zhì)。其他典型的分析物的例子包括藥物，諸如類固醇、激素、蛋白、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、濫用的藥物、維生素、抗細(xì)菌藥、抗真菌藥、抗病毒藥、嘌呤、抗腫瘤試劑、安非他命、雜氮化合物、核酸和前列腺素，以及任何這些藥物的代謝物；殺蟲劑及其代謝物；以及受體。分析物也包括細(xì)胞、病毒、細(xì)菌和真菌?？贵w一包括完整的免疫球蛋白，以及天然的或基因工程化的片段。芳烷基——用芳基取代的烷基，如芐基、二苯甲基、三苯甲基和苯乙基。芳基一含有1-5個(gè)碳環(huán)芳香環(huán)的含芳香環(huán)的基團(tuán)，可以用除了氫之外的一種或多種其他取代基取代。生物材料-包括如全血、抗凝全血、血漿、血清、組織、動物和植物細(xì)胞、細(xì)胞成
分、病毒及真菌。化學(xué)發(fā)光化合物一即一種被稱作為標(biāo)記物的化合物，可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)以便引起發(fā)光，比如通過被轉(zhuǎn)化為在電子激發(fā)態(tài)下形成的另一種化合物。激發(fā)態(tài)可以是單線態(tài)或是三重激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)可弛豫到基態(tài)直接發(fā)光，或者是通過將激發(fā)能量傳遞到發(fā)射能量受體，從而自身恢復(fù)到基態(tài)。在此過程中，能量受體將被躍遷為激發(fā)態(tài)而發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記的固定的特異性結(jié)合伴侶(sbp)——測試混合物中的反應(yīng)物，至少包括下述的連接構(gòu)造a)用于分析物的特異性結(jié)合伴侶(sbp)，b)化學(xué)發(fā)光化合物或標(biāo)記物，c)固相。劑量應(yīng)答——信號，諸如來自于測試反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光輸出，與樣品中待測的分析物的含量相關(guān)。自由基捕集器(FRT)——指易與自由基發(fā)生反應(yīng)的化合物，通常形成一種穩(wěn)定的產(chǎn)物化合物。典型的自由基捕集器有時(shí)也被稱作自旋捕集劑(spin trap)，是脂肪族或芳香族硝酮類化合物，諸如苯基叔丁基硝酮(PBN)。雜烷基——指其中環(huán)或非末端鏈的碳原子中的至少I個(gè)被選自N、0或S的雜原子置換的燒基。雜芳基——指其中環(huán)的碳原子中的1-3個(gè)被選自N、O或S的雜原子置換的芳基。 代表性的基團(tuán)包括吡啶，吡咯，噻吩，呋喃，喹啉和吖啶基團(tuán)。亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)一通常指第一位置產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)并且躍遷至第二位置，在第二位置進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移或是與處于第二位置的分子發(fā)生反應(yīng)。亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)也可以是反應(yīng)中間產(chǎn)物，諸如自由基、自由基離子、氮賓、碳烯、高張力分子(highly strained molecule)諸如反式環(huán)己烯和a-內(nèi)酯、環(huán)丙烷甲烷等等，此處亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)的壽命低于10毫秒，通常低于I微秒。亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)還包括如單線態(tài)諸如單線態(tài)氧、三重態(tài)、還有壽命小于10毫秒且通常小于I微秒的二氧環(huán)丁烷(dioxetane)，其中包括二氧環(huán)丁酮和二氧環(huán)丁烷二酮。通常可通過將合適的敏化劑如芘和能量受體如蒽組合而形成三重態(tài)。例如，二溴蒽可以作為呈三重態(tài)的能量受體。三重態(tài)可以進(jìn)一步將能量傳遞給另一個(gè)分子，并引發(fā)可被檢測到的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)諸如產(chǎn)生光?；罨肿优c單線態(tài)氧或過氧化氫發(fā)生反應(yīng)可以形成二氧環(huán)丁烷，二氧環(huán)丁烷包括二氧環(huán)丁酮和二氧環(huán)丁烷二酮。比如，適量的草酸鹽和過氧化氫反應(yīng)可以生成二氧環(huán)丁烷二酮。酶諸如辣根過氧化物酶可以產(chǎn)生也是亞穩(wěn)態(tài)的并且可與另一個(gè)分子反應(yīng)并發(fā)出可檢測信號的陽離子自由基或單線態(tài)氧。光敏劑——通常用光激發(fā)可形成單線態(tài)氧的一種敏化劑。光敏劑可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化學(xué)活化的(如酶、金屬鹽等)。光激發(fā)時(shí)，光敏劑通常是含有共價(jià)鍵原子的化合物，通常具有多個(gè)共軛的二價(jià)鍵或三價(jià)鍵?；衔锟晌詹ㄩL范圍是200-1 lOOnm、通常是300_1000nm、優(yōu)選是450_950nm的光，在激發(fā)波長處在其吸收峰處的消光系數(shù)大于500M^ cnT1,最好至少是5000Μ4 cnT1,優(yōu)選至少是50000Μ4 cnT1。缺乏氧的情形下，光吸收后產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)的壽命通常至少是100納秒，優(yōu)選至少是I微秒。一般情況下，壽命必須足夠長，以便能量能夠傳遞給氧原子，存在的氧的濃度范圍通常是10_5至10_3M，這取決于介質(zhì)。和基態(tài)相比，光敏劑激發(fā)態(tài)通常擁有不同的自旋量子數(shù)(S )，通常情況下激發(fā)態(tài)是三重態(tài)(S=l)，如通常的那樣，基態(tài)則是單線態(tài)(S=0)。優(yōu)選地，光敏劑具有較高的系間竄越(intersystem crossing)產(chǎn)量。即光敏劑的光激發(fā)能夠產(chǎn)生較長壽命狀態(tài)(通常是三重態(tài))，效率至少是10%，理想地至少是40%，更優(yōu)選是高于80%。測試條件下，光敏劑將處于最弱的熒光狀態(tài)(量子產(chǎn)率通常低于0. 5，優(yōu)選低于0. I)。待被光激發(fā)的光敏劑是相對光穩(wěn)定的,不會有效地與單線態(tài)氧發(fā)生反應(yīng)。在大多數(shù)可用的光敏劑中存在一些結(jié)構(gòu)特征。在保持剛性的通常是芳香族結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)光敏劑至少有一個(gè)，通常有三個(gè)或更多的共軛雙鍵或三鍵。它們通常至少含有一個(gè)能加速系間竄越的基團(tuán)，如羰基、亞胺基或是選自元素周期表第3-6行中的重原子尤其是碘或溴，或者它們可能具有擴(kuò)展型芳香結(jié)構(gòu)。典型的光敏劑包括丙酮、苯甲酮、9-噻噸酮、曙紅、9，10-二溴蒽、亞甲基藍(lán)、金屬卟啉諸如血卟啉、酞菁、葉綠素、孟加拉玫瑰紅、富勒烯等，以及這些化合物的具有1-50個(gè)原子的取代基的衍生物，所 述取代基用于使得這些化合物更具親脂性或更具親水性、和/或作為連接至特異性結(jié)合配對成員的連接基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他光敏劑的例子也可以在本發(fā)明中使用，比如在美國專利No. 6406913中也有描述，將其并入本文以供參考。在此處描述的方法中，光敏劑優(yōu)選是相對非極性的，以確保當(dāng)光敏感劑合并入固相載體包括如小珠、顆粒等等時(shí)，其可溶解到親脂性成員中。顆粒-顆粒大小至少約20nm,不大于20 μ m,通常至少約40 nm且小于ΙΟμπι,優(yōu)
選約O. 10-2.0μπι直徑、通常體積小于I皮升(pL)。顆?？梢允怯袡C(jī)的或是無機(jī)的、可膨脹或不可膨脹的、多孔的或非多孔的，具有任何密度，但優(yōu)選具有和水接近的密度，一般是約
O.7g/mri. 5g/ml之間，優(yōu)選能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料構(gòu)成。顆?？梢杂谢驔]有電荷，當(dāng)帶有電荷時(shí)，優(yōu)選是負(fù)電荷。顆?？梢允枪腆w(如聚合物、金屬、玻璃、有機(jī)和無機(jī)物諸如礦物、鹽和硅藻)、小油滴(如碳?xì)浠衔?、碳氟化合物、硅質(zhì)流體)、囊泡(如合成的諸如磷脂、或天然的諸如細(xì)胞、及細(xì)胞器官)。顆?？梢允侨槟z顆?；蚴呛杏袡C(jī)或無機(jī)聚合物的其他顆粒、脂雙層如脂質(zhì)體、磷脂囊泡、小油滴、硅顆粒、金屬溶膠、細(xì)胞和微晶染料。有機(jī)顆粒通常是聚合物，或者是加成聚合物或者是縮合聚合物，易于分散在測試介質(zhì)中。有機(jī)顆粒也具有吸附性或功能性，以便在它們的表面可間接或直接地結(jié)合特異性結(jié)合配對成員、以及在它們的表面結(jié)合光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物、或者將光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物合并入它們的體積內(nèi)。顆?？梢詠碓从谔烊淮嬖诘牟牧?、經(jīng)合成法修飾的天然 存在的材料或者合成的材料。天然或合成的組裝體諸如脂雙層，如脂質(zhì)體和非磷脂性囊泡是優(yōu)選的。在有機(jī)聚合物中，特別感興趣的是多糖，尤其是交聯(lián)多糖，諸如瓊脂糖有SEPHAROSE (法瑪西亞生物公司)、葡聚糖有SEPHADEX (法瑪西亞生物公司)、纖維素、淀粉等等；加成聚合物，諸如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的衍生物的均聚物、共聚物，尤其是具有游離羥基官能團(tuán)的酯類和氨基化合物包括水凝膠等等。無機(jī)聚合物包括硅酮、玻璃有Bioglas等。溶膠包括金、硒和其他金屬。顆粒也可以是分散于水中的不溶性染料，諸如卟啉、]酞菁染料等，它們也可做光敏劑。顆粒也可以包括硅藻、細(xì)胞、病毒顆粒、磁小體、細(xì)胞核等。當(dāng)顆粒是購買的商品時(shí)，可通過機(jī)械方式諸如研磨、超聲、攪動等將大顆粒破碎成小顆粒，顆粒的大小可以是變化的。顆粒通常具有多功能性，或者能夠通過特異或非特異的共價(jià)或非共價(jià)相互作用而結(jié)合到特異性結(jié)合伴侶(sbp)成員、光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物上。有許多官能團(tuán)是可用的、或者將其合并進(jìn)來。典型的官能團(tuán)包括羧酸、乙醛、氨基、氰基、乙烯基、羥基、巰基等。當(dāng)利用特異性結(jié)合伴侶成員、化學(xué)發(fā)光化合物或光敏劑與顆粒之間的共價(jià)連接時(shí)，連接方式是已知的，并且在文獻(xiàn)中給予了詳細(xì)闡述。該方法在美國專利No. 6406913和其引用的參考文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。可以選擇光敏劑和/或化學(xué)發(fā)光化合物溶解在、或非共價(jià)地結(jié)合到顆粒的表面。在這種情況下，這些化合物優(yōu)選是疏水性的，以降低它們從顆粒解離下來的能力，從而使兩種化合物都能和相同的顆粒結(jié)合。通過如下方法可以進(jìn)一步降低解離下來的可能性通過利用僅是一種組分的顆粒，該組分與光敏劑或者化學(xué)發(fā)光化合物結(jié)合；或者通過利用組分不同的兩種不同類型的顆粒，以促使光敏劑與一種顆粒結(jié)合，化學(xué)發(fā)光化合物同另一種顆
粒結(jié)合。與每個(gè)顆粒結(jié)合的光敏劑或者化學(xué)發(fā)光分子的數(shù)目平均上通常是至少一個(gè)，并且可以是足夠高，以致于顆粒全部由光敏劑或化學(xué)發(fā)光劑分子組成?；诮?jīng)驗(yàn)，所述分子上優(yōu)選的數(shù)目應(yīng)選擇為在測試中可提供最高的信號與背景比(即信噪比)。在一些情況下，可通過結(jié)合多種不同的光敏劑分子至顆粒中來獲得最好的結(jié)果。通常，顆粒中光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物與特異性結(jié)合伴侶(sbp)成員比率至少應(yīng)當(dāng)是1，優(yōu)選至少是100比1，最優(yōu)選是超過1000比I。樣品——測試中待檢測的含有或疑似含有分析物的一種混合物。分析物包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、激素、抗體、藥物和類固醇?？梢员挥迷诒景l(fā)明公開的方法中的典型的樣品包括體液諸如血液(可以是在收集的血液樣品中通?？吹降目鼓?、血漿、血清、尿、精液、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織提取物等。其他類型的樣品包括溶劑、海水、工業(yè)水樣、食品樣品、環(huán)境·樣品諸如土或水、植物材料、真核細(xì)胞、細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒、真菌、及來自于原核的細(xì)胞。敏化劑——一種化合物，當(dāng)被激發(fā)或被誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)可導(dǎo)致另一種化合物或物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。敏化劑包括光敏劑，其能夠被光照射所誘導(dǎo)，從而形成活化的激發(fā)態(tài)。敏化劑也包括能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)諸如單線態(tài)氧的化合物。特異性結(jié)合配對成員——也是已知的特異性結(jié)合伴侶(sbp)，特異性結(jié)合伴侶是一種分子，包括生物分子，對于另一種物質(zhì)(如分析物)具有特異性結(jié)合親合性。用于分析物的兩種特異性結(jié)合伴侶，優(yōu)選在該分析物上具有不同的結(jié)合位點(diǎn)，可被稱作特異性結(jié)合配對。NMA (噪音調(diào)節(jié)劑)一本發(fā)明公開的測試反應(yīng)混合物中提供的一種化合物，與來自于測試反應(yīng)混合物的化學(xué)發(fā)光形成反應(yīng)所產(chǎn)生的分析物特異性信號相比，其可極大地降低非特異性信號或背景信號。在此處描述的方法中，NMA是一種化合物或混合物(諸如單線態(tài)氧淬滅劑(S0Q))，能夠干擾亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)與信號產(chǎn)生化合物之間的反應(yīng)。固體載體——一種大小至少是I微米的材料，具有測試成分可以固定在其上的表面。該材料以顆粒、微粒、納米顆粒、金屬膠體、纖維、薄片、珠子、膜、濾膜或其他載體諸如試管、微孔、芯片、載玻片及微陣列芯片的形式存在?？扇芙獾?、溶解性、溶解一指一種物質(zhì)和另外一種物質(zhì)混合均勻的能力和傾向。在本發(fā)明的公開中，溶解性及其相關(guān)術(shù)語通常指的是固體溶解到液體中的特性，如NMA溶解在水緩沖液中。固體溶解至它們失去晶體形式的程度，變成分子或離子溶解或分散在溶劑(如液體)中，從而形成了真正的溶液。與此相反，雙相系統(tǒng)中，一個(gè)相由小顆粒(包括微顆?；蚰z體大小的顆粒)組成，其分散在整個(gè)主體物質(zhì)中，不管是否能夠被穩(wěn)定化來抑制沉淀或者是未被穩(wěn)定化。取代——指基團(tuán)上至少有一個(gè)氫原子被非氫基團(tuán)所置換。應(yīng)當(dāng)注意的是，關(guān)于取代基，除非有明確的標(biāo)注，指的是可以存在多點(diǎn)取代。反應(yīng)容器——根據(jù)本發(fā)明用于包含樣品和測試中其他成分的容器或裝置。例如包括各種大小、各種形狀的試管和微孔板。II.進(jìn)行本發(fā)明的方式
本發(fā)明的公開提供了均相測試方法，尤其是這樣的均相測試方法在化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶共軛物與分析物相結(jié)合后，利用分析物的化學(xué)發(fā)光檢測。進(jìn)行均相測試和方法不需要將游離的特異性結(jié)合伴侶與復(fù)合物中結(jié)合的特異性結(jié)合伴侶分開。本發(fā)明的公開提供了用于通過特異性結(jié)合配對反應(yīng)來檢測物質(zhì)的存在、定位或含量的快速和簡便的均相測試。該測試需要在液相中使用與第一特異性結(jié)合伴侶相連接的化學(xué)發(fā)光化合物(“化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶”)、與第二特異性結(jié)合伴侶共軛的敏化劑(“敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶”)、噪音調(diào)節(jié)劑(NMA)、增強(qiáng)劑。本發(fā)明的測試方法與其他均相測試方法的區(qū)別就在于不需要特殊的構(gòu)建體，即被設(shè)計(jì)成具有可檢測成分的被標(biāo)記的特異性結(jié)合配對成員，可檢測成分是未被活化的或是在復(fù)合物中與其他成分結(jié)合后只能產(chǎn)生特定的檢測信號。和本發(fā)明公開的測試體系相反，因?yàn)樾枰厥獬煞郑渌木鄿y試方法在制備上復(fù)雜、困難、并且成本高。本發(fā)明的測試為測試的設(shè)計(jì)及研發(fā)提供了更為簡單、更為靈活的方法，并且允許為更多的分析物提供現(xiàn)成
的應(yīng)用。本發(fā)明的測試方法與傳統(tǒng)的非均相測試方法或基于分離的測試方法的區(qū)別就在于，不需要利用分離步驟或方法來將游離的特異性結(jié)合伴侶與復(fù)合物中被結(jié)合的特異性結(jié)合伴侶區(qū)分開來。通過使用本發(fā)明的測試方法，避免了分離，導(dǎo)致測試操作更為簡單，測試耗時(shí)減少，有利于自動化。在本發(fā)明公開的測試方法中，使化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、噪音調(diào)節(jié)劑與樣品放在一起。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)被特異性結(jié)合伴侶成員識別的分析物存在于樣品中時(shí)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶及敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶各自結(jié)合到分析物的不同區(qū)域，形成復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)樣品中的分析物被一種特異性結(jié)合伴侶成員識別后，避免了另一種特異性結(jié)合伴侶成員結(jié)合在復(fù)合物中。這一般是通過下述方式來實(shí)現(xiàn)提供一種特異性結(jié)合伴侶成員作為分析物或分析物類似物以及敏化劑或化學(xué)發(fā)光化合物的共軛物，而另一種特異性結(jié)合伴侶成員是對于該分析物或者其他敏化劑或化學(xué)發(fā)光化合物具有結(jié)合親合性的物質(zhì)的共軛物。后一模式可以進(jìn)行競爭性結(jié)合測試。產(chǎn)生與分析物相關(guān)的特定信號，在將測試混合物置于可生成亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)用于與化學(xué)發(fā)光化合物進(jìn)行反應(yīng)的條件下之后，開始進(jìn)行檢測。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供分析物的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物用于競爭性測試模式。分析物與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物競爭性地結(jié)合敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶。在競爭性結(jié)合測試的一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物和敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶可預(yù)先形成復(fù)合物，并且添加分析物以取代被標(biāo)記的類似物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物、分析物及敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶可以混合在一起而沒有預(yù)先形成結(jié)合復(fù)合物。產(chǎn)生與分析物相關(guān)的特定信號，在將測試混合物置于生成亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)用于與化學(xué)發(fā)光化合物進(jìn)行反應(yīng)的條件下之后，開始進(jìn)行檢測。在這種測試模式中，信號與分析物濃度呈反向相關(guān)性。作為特異性結(jié)合伴侶由于與分析物結(jié)合的結(jié)果，使敏化劑可操作地接近于化學(xué)發(fā)光化合物，從而可有效地在化學(xué)發(fā)光化合物附近生成亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)。亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光化合物反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生光。術(shù)語“可操作地(的)接近”意味著化學(xué)發(fā)光化合物和敏化劑之間應(yīng)該足夠近，包括直至物理接觸，以致于產(chǎn)生的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)是在與化學(xué)發(fā)光化合物之間的距離在其擴(kuò)散壽命內(nèi)產(chǎn)生的。這意味著在亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)壽命內(nèi)，它能夠擴(kuò)散穿過測試介質(zhì)和穿過任何使用的懸浮性顆粒的介質(zhì)而到達(dá)化學(xué)發(fā)光化合物。與需要用于測定分析物濃度的量相比，在體系中提供了過量的敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和/或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶?？梢源嬖诓⒉唤咏谟擅艋瘎?biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和化學(xué)發(fā)光化合物標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶形成的結(jié)合復(fù)合物的“過量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)”或亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)，會導(dǎo)致增加非特異信號。當(dāng)存在過量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)時(shí)，化學(xué)發(fā)光檢測反應(yīng)可能不能提供有用的、或者最多十分有限的信號和分析物之間的相關(guān)性。根據(jù)傳統(tǒng)常識，過量亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)的產(chǎn)生或存在通常會導(dǎo)致測試失敗，這是由于過多的非特異信號、或者限制了測試的靈敏度?？梢酝ㄟ^稀釋分析物將由過量亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)所產(chǎn)生的非特異性信號降至可接受的水平。然而，也會降低測試的靈敏度。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)噪音調(diào)節(jié)劑可以降低與過量亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)有關(guān)的非特異性信號。在本發(fā)明方法中，由過量亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)諸如單線態(tài)氧造成的非特異性背景信號可以通過比如使用單線態(tài)氧淬滅劑(SOQ)來抑制。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，添加特定的NMA化合物可帶來出色的區(qū)分能力。通過使用NMA，在反應(yīng)結(jié)合復(fù)合物中由化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和敏化劑標(biāo)記之間的反 應(yīng)所產(chǎn)生的信號與不是存在于這種復(fù)合物中的標(biāo)記物的信號之間的比例將被極大地提高，而且無需稀釋分析物就可以實(shí)現(xiàn)。NMA在提高測試靈敏度上的功效可根據(jù)下列式I進(jìn)行理解。多種不同的游離型(如沒有結(jié)合到分析物上)、復(fù)合型(如結(jié)合到分析物上)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶(“CLSBP”)和敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶(“SLSBP”)可能有助于產(chǎn)生可被觀測到的化學(xué)發(fā)光信號。下面列舉了四個(gè)可能的反應(yīng)式I.結(jié)合的SLSBP+結(jié)合的CLSBP+接近的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)一特異性信號2.結(jié)合的SLSBP+游離的CLSBP+過量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)一非特異性信號3.游離的SLSBP+結(jié)合的CLSBP+過量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)一非特異性信號
4.游離的SLSBP+游離的CLSBP+過量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)一非特異性信號如上述列表所顯示，反應(yīng)混合物中四種不同類型的化學(xué)發(fā)光劑-敏化劑配對發(fā)生反應(yīng)，與亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)相互作用以便產(chǎn)生可被檢測的信號，但是只有第一種類型產(chǎn)生的信號與測試中分析物含量相關(guān)。與來自于反應(yīng)I的信號相比，NMA可以通過選擇性地阻止、抑制或淬滅反應(yīng)2-4中所產(chǎn)生的信號量來發(fā)揮作用。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，通過特異性的結(jié)合反應(yīng)提供了測定樣品中所關(guān)注的分析物的方法，特異性結(jié)合反應(yīng)涉及分析物與用于該分析物的特異性結(jié)合伴侶(sbp)，其中一種特異性結(jié)合伴侶被敏化劑化合物標(biāo)記，敏化劑化合物可以是光敏劑，尤其是可以產(chǎn)生單線態(tài)氧的光敏劑。分析物的另一種特異性結(jié)合伴侶被化學(xué)發(fā)光化合物標(biāo)記。標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶由于與分析物結(jié)合導(dǎo)致形成被標(biāo)記的復(fù)合物。當(dāng)化學(xué)發(fā)光化合物與形成的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)相互作用時(shí)，化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光與樣品中分析物的含量相關(guān)。將敏化劑標(biāo)記物置于產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)的條件下，通常會產(chǎn)生大量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于與化學(xué)發(fā)光化合物反應(yīng)所需要的量。只有一些亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)可接近結(jié)合復(fù)合物，因此能與復(fù)合物相互作用，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。過量的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)可能產(chǎn)生大量的“背景”信號，以致于不能得出有效的劑量-應(yīng)答關(guān)系。為了能夠進(jìn)行均相非分離式測試，當(dāng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號所必需的全部反應(yīng)成分以結(jié)合復(fù)合物的形式和以游離的形式或非結(jié)合的形式存在時(shí)，必須提供某種手段以便不進(jìn)行物理分離便能區(qū)分被結(jié)合的或未被結(jié)合的被標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶。本方法不需要也不使用特別設(shè)計(jì)的被標(biāo)記的結(jié)合伴侶，如果該結(jié)合伴侶沒有被帶到結(jié)合復(fù)合物中，該結(jié)合伴侶就不能進(jìn)行產(chǎn)生信號的反應(yīng)。在本發(fā)明的測試方法中，通過在反應(yīng)溶液中加入噪音調(diào)節(jié)劑(NMA)，復(fù)合物中與分析物結(jié)合的特異性結(jié)合伴侶成員與游離型的、非結(jié)合的特異性結(jié)合伴侶成員之間可實(shí)現(xiàn)必要的區(qū)分。在反應(yīng)溶液中加入有效量的NMA，導(dǎo)致來自于結(jié)合的標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶成員的信號超過背景信號(包括過量亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)或者沒有接近結(jié)合復(fù)合物的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)所產(chǎn)生的任何信號)的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于沒有NMA時(shí)所發(fā)生的情況。在此處描述的方法中，能夠阻止、抑制或淬滅亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)的NMA物質(zhì)或化合物是單線態(tài)氧淬滅劑(S0Q)。NMA也可以是一種能夠與單線態(tài)氧競爭反應(yīng)而不產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化合物。當(dāng)信號與背景的相關(guān)性取得提高后，
該測試的用處增加，包括具有更高的檢測靈敏度。本發(fā)明的一個(gè)方面是測定分析物的方法。與之前的均相測試方法不同，本發(fā)明不需要為了達(dá)到可以接受的信噪比而將樣品或反應(yīng)混合物稀釋。該方法包括在一定條件下處理疑似含有分析物的樣品，以使得如果存在分析物，就將影響彼此接近的光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物的含量，其中短壽命的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)，即光敏劑所產(chǎn)生的單線態(tài)氧在其自衰之前能夠與化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)生反應(yīng)。該方法進(jìn)一步包括測定由化學(xué)發(fā)光化合物所產(chǎn)生的光強(qiáng)度。產(chǎn)生的光強(qiáng)度與介質(zhì)中分析物的量相關(guān)。單線態(tài)氧可活化化學(xué)發(fā)光化合物，催化單線態(tài)氧生成的光敏劑通常響應(yīng)于光激發(fā)，接著能量轉(zhuǎn)移給分子氧。通常，表面與光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物接近，其中表面優(yōu)選是懸浮顆粒物的表面。通過活化化學(xué)發(fā)光化合物而生成的產(chǎn)物會降解，優(yōu)選會自發(fā)地降解，并伴隨著發(fā)光。本發(fā)明可預(yù)測，分析物導(dǎo)致或抑制了光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物之間的距離相比它們在測試介質(zhì)的本體溶液中的平均距離相互靠的更近。這種隔離取決于待分析樣品中存在的分析物的含量。沒能和化學(xué)發(fā)光化合物相結(jié)合的光敏劑分子產(chǎn)生的單線態(tài)氧在液相介質(zhì)中衰變之前不能到達(dá)化學(xué)發(fā)光化合物。相對于實(shí)際的分析物產(chǎn)生的信號，該“過量的”單線態(tài)氧產(chǎn)生大量的非特異性背景信號，使得對分析物的檢測變得困難，并且極大地削弱了此種測試的靈敏度。因此，優(yōu)選使用NMA。NMA可干擾“過量的”單線態(tài)氧，因此會減少、淬滅或抑制單線態(tài)氧所產(chǎn)生的背景信號，導(dǎo)致信噪比和隨之的測試靈敏度的提高。因此，此處描述的測試方法提供了以一種簡單、有效、可重復(fù)性的方式檢測以及測定眾多分析物的方法，其運(yùn)用簡單的設(shè)備測定反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的光含量，信噪比及靈敏度也得到了極大地提高，并且無需稀釋分析物或反應(yīng)混合物。不管光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物之間是如何結(jié)合的，重要的是兩種物質(zhì)都不能與其特異性結(jié)合伴侶成員解離，而且測試過程中，都不能與結(jié)合了光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物配對中另一個(gè)成員的特異性結(jié)合伴侶成員相結(jié)合。因此，這些化合物與其各自特異性結(jié)合伴侶成員的解離必須比測試所需要的時(shí)間慢?；瘜W(xué)發(fā)光化合物可以結(jié)合到特異性結(jié)合伴侶成員上，該特異性結(jié)合伴侶成員能夠直接或間接地與分析物或測試成分結(jié)合，該測試成分的濃度受存在的分析物的影響。術(shù)語“能夠直接或間接地結(jié)合”指的是，指定的實(shí)體物能夠特異性地結(jié)合到實(shí)體物上(直接地)，或者指定的實(shí)體物能夠特異性地結(jié)合至特異性結(jié)合配對成員、或具有兩個(gè)或更多能夠結(jié)合其他實(shí)體物的特異性結(jié)合伴侶的復(fù)合物上(間接地)。
表面通常有連接其的特異性結(jié)合伴侶成員。優(yōu)選地，化學(xué)發(fā)光化合物通常在懸浮性顆粒內(nèi)與此表面相連。此特異性結(jié)合伴侶成員一般能夠直接或間接地與分析物或分析物的受體結(jié)合。當(dāng)與光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物連接的特異性結(jié)合伴侶成員都能結(jié)合分析物時(shí)，就產(chǎn)生了夾心測試方案。當(dāng)與光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物連接的特異性結(jié)合伴侶成員既能與分析物結(jié)合，也能與其類似物結(jié)合時(shí)，就會導(dǎo)致競爭性測試方案。上述用于光敏劑與顆粒連接或合并入顆粒中的相同的原則決定著化學(xué)發(fā)光化合物與表面連接或者合并入顆粒中。光敏劑一般通過照射含有上述反應(yīng)物的介質(zhì)來活化化學(xué)發(fā)光化合物。介質(zhì)必須用具有一定的波長、且能量足以將光敏劑轉(zhuǎn)化至激發(fā)態(tài)、進(jìn)而使得它能夠?qū)⒎肿友趸罨癁閱尉€態(tài)氧的光照射。能夠激發(fā)分子氧的光敏劑的激發(fā)態(tài)一般位于三重態(tài)，其比處于基態(tài)的光敏劑的能量高大約20Kcal/mol、通常至少23Kcal/mol。雖然可以使用較短的波長，如230-950nm，但是優(yōu)選地，使用波長大約是450_950nm的光來照射介質(zhì)?？梢砸匀魏蝹鹘y(tǒng)方式，諸如照相、肉眼直觀、光度計(jì)等，來測定產(chǎn)生的光，以便確定其與介質(zhì)中分析物含量相關(guān) 的量。盡管通常優(yōu)選使用能夠被光敏劑有效吸收的波長的光照射來激發(fā)光敏劑，但也可以使用一些其他的激發(fā)方法，如從激發(fā)態(tài)的能量供體諸如第二光敏劑轉(zhuǎn)移能量。當(dāng)使用第二光敏劑時(shí)，使用的光的波長不能有效地被光敏劑充分的吸收，而是被第二光敏劑有效地吸收。第二敏化劑可以與測試成分結(jié)合，該測試成分與、或?qū)⑴c第一敏化劑結(jié)合，比如與表面結(jié)合或合并入有第一敏化劑的顆粒中。當(dāng)采用第二光敏劑時(shí)，它通常比第一光敏劑在最低能量三重態(tài)時(shí)所具有的能量更高。發(fā)射線為632. 6nm的氦氖激光是一種廉價(jià)的激發(fā)光源。本發(fā)明中特別有用的是吸收峰位于約620至約700nm區(qū)域的光敏劑。測試中分析物的結(jié)合反應(yīng)通常會在提供了最佳測試靈敏度的適中pH的水介質(zhì)中進(jìn)行。優(yōu)選地，光敏劑的活化也在水介質(zhì)中進(jìn)行。然而采用分離步驟時(shí)，就可以使用非水介質(zhì)諸如乙腈、丙酮、甲苯、氰苯等以及pH值非常高、即高于10. O或者非常低、即低于4. O的水介質(zhì)。如上所述，可以在沒有分離(均相)或分離(非均相)任何測試成分或產(chǎn)品的條件下來進(jìn)行測試。當(dāng)所使用的特異性結(jié)合伴侶成員是蛋白質(zhì)時(shí)，水介質(zhì)可以僅是水，或者可以包括
O.01-80體積百分比的助溶劑、但通常包括小于40%的助溶劑。用于結(jié)合反應(yīng)的介質(zhì)的pH值一般位于約4-11、通常位于約5-10、優(yōu)選位于約6. 5-9. 5的范圍內(nèi)。當(dāng)單線態(tài)氧生成過程中PH值不發(fā)生改變時(shí)，則pH值通常在與結(jié)合成員最佳結(jié)合的pH和用于信號產(chǎn)生和測試中其他試劑保持穩(wěn)定的最佳PH值之間折衷。當(dāng)為了產(chǎn)生信號而需要提高pH值時(shí)，包括添加堿性試劑在內(nèi)的步驟會被插入在結(jié)合反應(yīng)與單線態(tài)氧和/或信號產(chǎn)生之間。通常，提高的PH值大于10，通常是10-14之間。如上所述，也可以使用非水溶劑用于非均相測試，主要考慮的是溶劑不能與單線態(tài)氧有效地反應(yīng)?？梢圆捎枚喾N緩沖液來獲得理想的pH值及維持測試中的pH值。示例性的緩沖液包括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、Tris、巴比妥等。使用特定緩沖液對于本發(fā)明來說不是關(guān)鍵所在，但是在單獨(dú)的測試中一種或另一種緩沖液可能是優(yōu)選的。測試中蛋白質(zhì)配體與受體之間進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)通常需要使用合適的溫度，并且在測定期間通常是恒定的溫度，優(yōu)選25-40° C。用于結(jié)合反應(yīng)的溫育溫度范圍通常在約5-45° C之間，一般在約15-40° C，更通常在約25-40° C之間。如果測試中發(fā)生核酸結(jié)合，通常會使用更高的溫度，通常在約20-90° C，更通常在約35-75° C之間。檢測期間的溫度，即產(chǎn)生單線態(tài)氧和檢測光時(shí)的溫度，通常的范圍在約20-100° C之間，更通常在約25-50° C，更通常在約25-40° C之間。待測定的分析物的濃度一般在1(Γ4Μ至低于1(Γ16Μ之間變化，通常在1(Γ6Μ至1(Γ14Μ之間。一些考慮因素，諸如測試是定性的、半定量的還是定量的，特定檢測技術(shù)，所關(guān)注的分析物濃度以及理想的最大溫育時(shí)間，都通常決定了不同試劑的濃度。在競爭性測試中，當(dāng)測試中眾多試劑的濃度通常被所關(guān)注的分析物的濃度范圍決定時(shí)，每種試劑的最終濃度通常是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)在一定的范圍內(nèi)獲得測試最佳的靈敏度。這就是說，分析物濃度的顯著變化將會提供精確地可測定的信號差。特異性結(jié)合伴侶成員的濃度取決于分析物的濃度、期望的結(jié)合率以及特異性結(jié)合伴侶成員非特異性結(jié)合的程度。通常，特異性結(jié)合伴侶成員至少以最低預(yù)測的分析物的濃 度存在，優(yōu)選至少以最高預(yù)期分析物的濃度存在，對于非競爭性測試，濃度可以是比最高分析物濃度高10至IO6倍，但通常低于10_4m，優(yōu)選低于10_6m，一般位于10—11和IO-7M之間。與特異性結(jié)合伴侶成員結(jié)合的光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物的數(shù)量通常是每個(gè)特異性結(jié)合伴侶成員至少一個(gè)分子，可以高達(dá)105個(gè)，當(dāng)光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物合并入顆粒時(shí)，通常是10至104個(gè)。當(dāng)添加的順序可以有較大的變動時(shí)，取決于測試特性，有特定的優(yōu)選順序。最簡單的添加順序便是同時(shí)加入所有的材料。可選擇的是，按順序完全組合或部分組合試劑。當(dāng)測試是競爭性時(shí)，通常理想的是在樣品與能結(jié)合分析物的特異性結(jié)合伴侶成員組合后再添加分析物的類似物?？蛇x地，在試劑組合后、在引起敏化劑產(chǎn)生單線態(tài)氧及檢測發(fā)射光前，涉及溫育的步驟，溫育的時(shí)間一般是約30秒至6小時(shí)，更通常是約2分鐘至I小時(shí)。在均相測試中，在所有的試劑組合后，可根據(jù)需要溫育。然后，照射組合物，導(dǎo)致產(chǎn)生單線態(tài)氧及可被檢測到的化學(xué)發(fā)光信號。測定該信號，該信號與待測樣品中分析物的含量相關(guān)。本發(fā)明在均相測試中采用的試劑量取決于分析物的特性。通常，本發(fā)明均相測試同其他已知的方法相比，顯示了更高的靈敏度。該優(yōu)勢主要得益于本方法中的信噪比得到了提高，這通過使用作為噪音調(diào)節(jié)劑的自由基捕集器(FRT)或單線態(tài)氧淬滅劑(SOQ)來實(shí)現(xiàn)。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶該方法需要使用連接有第一特異性結(jié)合伴侶的化學(xué)發(fā)光化合物(即“化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶”)。在本申請公開的測試和方法中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物將被固定到固體的表面上，固體比如是顆粒、珠子、多孔板或膜、過濾器、試管、量油計(jì)或其它親合測試和方法中所使用的移液管?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物和特異結(jié)合配對成員。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括一種或多種化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物被直接連接到一個(gè)或多個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物可被直接連接到一個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。術(shù)語“直接連接”，也可指直接標(biāo)記；包括共價(jià)結(jié)合反應(yīng)、離子結(jié)合反應(yīng)、疏水作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記被共價(jià)連接到用于分析物的特異性結(jié)合伴侶上。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物可被間接連接到一個(gè)或多個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。在一些其他的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物可間接連接到一個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。除了化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物和特異性結(jié)合配對成員外，間接連接還需要一種或多種輔助物質(zhì)。輔助物質(zhì)能夠溶于水溶液中。包含一種或多種輔助物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶可溶解于水溶液中。在不同的實(shí)施方式中，輔助物質(zhì)包括可溶性蛋白(比如鏈霉親和素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、生物素、陽離子BSA、fos、jun、鑰孔戚血藍(lán)蛋白“KLH”、免疫球蛋白及它們的片段或部分(無論是天然的或是基因工程化的)、可溶性合成樹聚物(比如PAMAM)、·可溶性合成聚合物(比如聚丙乙烯酸PAA)、可溶性天然聚合物(比如多糖諸如功能化的葡聚糖、氨基葡聚糖、寡聚核苷酸、蛋白以及其任何組合物)、脂質(zhì)體、微團(tuán)、囊泡以及由一種或多種可溶性合成聚合物、可溶性天然聚合物和可溶性蛋白的組合物(如IgG/生物素/鏈霉親和素/PAA)。其他可溶解于水溶液并且可以功能化用于連接一種或多種化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物和/或特異性結(jié)合伴侶的輔助物質(zhì)也可預(yù)期被用于本發(fā)明公開的方法和測試中。在一些實(shí)施方式中，與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物質(zhì)是蛋白或肽。典型的可溶性蛋白包括白蛋白、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、抗生物素蛋白、a-螺旋蛋白、fos、jun、鑰孔戚血藍(lán)蛋白“KLH”、免疫球蛋白及其片段或部分(無論是天然的或是基因工程化的)、以及它們的任何組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，輔助物質(zhì)是一種通用型抗體，比如IgG，其中化學(xué)發(fā)光標(biāo)記以維持與分析物特異捕獲抗體的結(jié)合親合性的方式與此通用型抗體共價(jià)連接。在另一個(gè)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光化合物通過生物素-鏈霉親和素或生物素-中性抗生物素蛋白的連接與一種或多種特異性結(jié)合伴侶相連接。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶合并鏈霉親和素-生物素，或其他等價(jià)的連接，可以比如提供作為生物素共軛物的特異性結(jié)合伴侶，其中化學(xué)發(fā)光化合物是鏈霉親和素結(jié)合的共軛物?？蛇x擇的生物素-鏈霉親和素和相似的連接是眾所周知的?？蛇x擇的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶與鏈霉親和素-生物素的合并，或等價(jià)的連接，可以使用鍵合用于特異性結(jié)合伴侶或化學(xué)發(fā)光化合物與一種或多種附加的輔助物質(zhì)的連接。在另一種實(shí)施方式中，與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物質(zhì)是合成聚合物。使用聚合輔助物用于連接化學(xué)發(fā)光化合物的測試模式，可以通過共價(jià)連接如生物素-親和素連接、或者是通過通用型捕獲成分比如特異性的免疫球蛋白種類的間接連接，與用于分析物的特異性結(jié)合伴侶相連接。在選擇的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括選自于多糖或可溶性自組裝的蛋白質(zhì)的輔助物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括多糖諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖。在一些實(shí)施方式中，多肽諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖的平均分子量在IOKDa至500KDa之間，在其他的實(shí)施方式中，平均分子量在25_150KDa之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括多糖諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量在50-100kDa之間。在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括多糖諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量為70kDao在許多實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的平均直徑在5nM_800nM包含的范圍內(nèi)。在選擇的實(shí)施方式中，通過合并可溶性蛋白、或其他可溶性天然聚合物或可溶性合成聚合物、或其組合物，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的平均直徑在200nM-600nM包含的范圍內(nèi)，在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，直徑在300nM-500nM包含的范圍內(nèi)。敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶該測試方法需要使用連接有第一特異性結(jié)合伴侶的敏化劑化合物(即“敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶”)。在本申請公開的測試和方法中，敏化劑化合物不固定到固體表面上，固體比如是顆粒、多孔板或膜、濾紙、試管、量油計(jì)或其它親合測試和方法中所使用的移 液管。敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括敏化劑標(biāo)記化合物和特異結(jié)合配對成員。在一些實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括一種或多種敏化劑化合物。在一些實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員。在一些實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記化合物被直接連接到一個(gè)或多個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)敏化劑標(biāo)記化合物可直接連接到一個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。術(shù)語“直接連接”，也可指直接標(biāo)記，包括共價(jià)結(jié)合相互作用、離子結(jié)合相互作用、疏水相互作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記共價(jià)連接到用于分析物的特異性結(jié)合伴侶上。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)敏化劑標(biāo)記化合物可間接連接到一個(gè)或多個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。在一些其他的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)敏化劑標(biāo)記化合物可間接連接到一個(gè)拷貝的特異性結(jié)合配對成員上。除了特異性結(jié)合配對成員外，間接連接還需要輔助物質(zhì)。輔助物質(zhì)能夠溶于水溶液中。包含一種或多種輔助物質(zhì)的敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶可溶解于水溶液中。在不同的實(shí)施方式中，輔助物質(zhì)包括可溶性蛋白(比如鏈霉親和素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、生物素、陽離子BSA、fos、jun、鑰孔戚血藍(lán)蛋白“KLH”、免疫球蛋白及它們的片段或部分(無論是天然的或是基因工程化的)、可溶性合成樹聚物(比如PAMAM)、可溶性合成聚合物(比如聚丙乙烯酸PAA)、可溶性天然聚合物(比如多糖諸如葡聚糖、寡聚核苷酸、蛋白以及它們的任何組合物)、脂質(zhì)體、微團(tuán)、囊泡以及由一種或多種可溶性合成聚合物、可溶性天然聚合物和可溶性蛋白的組合物(如IgG/生物素/鏈霉親和素/PAA)。其他可溶解于水溶液并且可以功能化用于連接一種或多種敏化劑標(biāo)記化合物和/或特異性結(jié)合伴侶的輔助物質(zhì)也可預(yù)期被用于本發(fā)明公開的方法和測試中。在一些實(shí)施方式中，與敏化劑標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物質(zhì)是蛋白或肽。典型的可溶性蛋白包括白蛋白、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、抗生物素蛋白、a-螺旋蛋白、fos、jun、鑰孔戚血藍(lán)蛋白“KLH”、免疫球蛋白及它們的片段或部分(無論是天然的或是基因工程化的)、以及它們的任何組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，輔助物質(zhì)是一種通用型抗體，比如IgG，其中敏化劑標(biāo)記以維持與分析物特異捕獲抗體的結(jié)合親合性的方式與此通用型抗體共價(jià)連接。在另一個(gè)敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的實(shí)施方式中，敏化劑化合物通過生物素-鏈霉親和素連接與一種或多種特異性結(jié)合伴侶相連接。敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶合并鏈霉親和素-生物素，或其他等價(jià)的連接，可以比如提供作為生物素共軛物的特異性結(jié)合伴侶，其中敏化劑化合物是鏈霉親和素結(jié)合的共軛物?？蛇x擇的生物素-鏈霉親和素和相似的連接是眾所周知的?？蛇x擇的敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶與鏈霉親和素-生物素的合并，或等價(jià)的連接，可以使用鍵合用于特異性結(jié)合伴侶或敏化劑化合物與一種或多種附加的輔助物質(zhì)的連接。在另一種實(shí)施方式中，與敏化劑標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物質(zhì)是合成聚合物。使用聚合輔助物用于連接化學(xué)發(fā)光化合物的測試模式，可以通過共價(jià)連接如生物素-親和素連接、或者是通過通用型捕獲成分比如特異性的免疫球蛋白種類的間接連接，與用于分析物的特異性結(jié)合伴侶相連接。在選擇的實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括選自于多糖或可溶性自 組裝的蛋白質(zhì)的輔助物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括多糖諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖。在一些實(shí)施方式中，多肽諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖的平均分子量在IOKDa至500KDa之間，在其他的實(shí)施方式中，平均分子量在25-150KDa之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括多糖諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量在50-100kDa之間。在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中,敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括多糖諸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量為70kDa。在大多數(shù)實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的平均分子量在200kDa-3000kDa包含的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，敏化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的平均分子量一般在350kDa-1500kDa之間。敏化劑標(biāo)記除了上述的光敏劑外，本發(fā)明中所使用的敏化劑還欲包括那些能夠產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)諸如單線態(tài)氧、且優(yōu)選較少或不被外部光源活化的物質(zhì)和組合物。因此，比如已經(jīng)表明鑰酸鹽(MOO4.2_)、氯過氧化物酶、髓過氧物酶加溴化物或氯離子(Kanofsky, J. Biol. Chem.(1983) 259，5596)可以催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧和水。這些組合物的任何一個(gè)都可以包括在結(jié)合了特異性結(jié)合伴侶成員的顆粒內(nèi)，并且被使用在測試方法中，該方法中包括作為輔助試劑的過氧化氫，氯過氧化酶被連接到表面，鑰酸鹽被合并到脂質(zhì)體的水相中。那些作為被熱、光或化學(xué)反應(yīng)所激發(fā)后能夠釋放單線態(tài)氧分子的化合物的敏化劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。最為熟知的此類化合物有芳烴內(nèi)過氧化物，如1，4- 二羧基乙基-1，4-萘內(nèi)過氧化物、9，10- 二苯基蒽-9，10內(nèi)過氧化物和5，6，11，12-四苯基萘5，12-內(nèi)過氧化物。力口熱或此類化合物直接吸收光，可釋放出單線態(tài)氧。噪音調(diào)節(jié)劑(NMA)本發(fā)明的噪音調(diào)節(jié)劑是當(dāng)包括在此處描述測試反應(yīng)混合物中時(shí)可干擾特異性結(jié)合配對的化合物，以致于被分析物結(jié)合的被標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶成員所產(chǎn)生的信號超過背景信號的程度顯著大于沒有NMA時(shí)所發(fā)生的情況。在本發(fā)明的方法中，NMA是一種能夠阻止、抑制或淬滅敏化劑所產(chǎn)生的亞穩(wěn)態(tài)類物質(zhì)的化合物，從而減少了 “過量”亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)產(chǎn)生的背景信號，并且提高了測試的靈敏度。在本發(fā)明的方法中，NMA是單線態(tài)氧淬滅劑(SOQ)0測試反應(yīng)中的一種或多種噪音調(diào)節(jié)劑以KT6M-KT1M之間的濃度存在，通常情況下在IO-6M-IO-2M之間，常用的濃度范圍IO-5M-IO-3M,有時(shí)使用的濃度則位于I(T5M-1(T4M之間。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法，在反應(yīng)中噪音調(diào)節(jié)劑以5X10_6M-5X10_4M的范圍存在。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法在反應(yīng)中噪音調(diào)節(jié)劑以5Χ1(Γ5Μ-5Χ1(Γ4Μ 的范圍存在。噪音調(diào)節(jié)劑可以作為單獨(dú)的試劑而存在，或者是以比反應(yīng)溶液中想要的濃度更高的溶液存在。在這種實(shí)施方式中，將經(jīng)測量的工作液定量地加入到反應(yīng)溶液中，以獲得所需的反應(yīng)濃度。在另一種實(shí)施方式中，將噪音調(diào)節(jié)劑并入到含有一種或多種標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶成員的溶液中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，噪音調(diào)節(jié)劑作為包含反應(yīng)化合物的試劑成分 而被提供，其中使用反應(yīng)混合物而不是使用能量來產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)。噪音調(diào)節(jié)劑提高信號-背景比或信噪比的程度的變化取決于其他因素中的化合物的特性及其使用時(shí)的濃度。根據(jù)“提高倍數(shù)”來對提高的程度進(jìn)行劃分，其中在使用噪音調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的測試中在特定的分析物濃度下測試的信號背景比與不加噪音調(diào)節(jié)劑在相同的分析物濃度下的信號背景比進(jìn)行比較。提高倍數(shù)>1、或大約O. 5-1之間、或大約O. 4-1之間、或大約O. 3-1之間、或大約O. 2-1之間，是改進(jìn)測試的標(biāo)準(zhǔn)以及噪音調(diào)節(jié)劑有利效果的證據(jù)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提高倍數(shù)達(dá)到可以至少是2倍，諸如至少為5倍，以及包括至少是10倍，或至少是50倍。根據(jù)下面的實(shí)施例可以看出，測試中，提高倍數(shù)會作為分析物濃度的函數(shù)而變化。比如，當(dāng)分析物濃度增加時(shí)，提高倍數(shù)可以提高。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提高倍數(shù)隨分析物濃度的變化可以產(chǎn)生一個(gè)更線性的校準(zhǔn)曲線，即化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比上分析物濃度的曲線。在此處描述的方法中，NMA是能夠干擾亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)諸如混合反應(yīng)中單線態(tài)氧的物質(zhì)或化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，NMA是一種與化學(xué)發(fā)光化合物競爭用于與單線態(tài)氧反應(yīng)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，NMA是單線態(tài)氧淬滅劑(S0Q)。單線態(tài)氧淬滅劑通過光物理淬滅或者通過化學(xué)反應(yīng)淬滅來淬滅單線態(tài)氧。通過光物理淬滅型進(jìn)行的淬滅劑SOQ包括，但不限于生育酚、抗壞血酸鹽、類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素、番茄紅素等)、一些特定的氨基酸(如脯氨酸)、叔胺(如二氮雜二環(huán)[2. 2. 2]辛烷或DABCO等)、疊氮化物(如疊氮化鈉)、特定的蛋白質(zhì)(如硫氧還蛋白)、鉬族金屬膠體(US2007/0090153中有描述，并入本文以供參考)、氨基-酰胺化合物(如利多卡因)。通過化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的淬滅劑SOQ包括，但不限于甲基哌啶類(如2，2，6，6_四甲基哌啶)、維生素D、雙烯和共軛多烯(如花青染料)、富含電子的烯烴(如烯醇醚、烯胺和二乙烯基硫)、鳥嘌呤等。當(dāng)單線態(tài)氧反應(yīng)化合物被用作單線態(tài)氧淬滅劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解它作為化學(xué)發(fā)光化合物的競爭性反應(yīng)物用于消耗單線態(tài)氧。優(yōu)選地，競爭性化合物，尤其是當(dāng)它是富含電子的烯烴時(shí)，也不能形成化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物。較為不理想的是，反應(yīng)產(chǎn)物是化學(xué)發(fā)光的，但是在不同波長下發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光化合物在本發(fā)明公開的實(shí)踐中，化學(xué)發(fā)光化合物是指那些能夠與單線態(tài)氧進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)從而形成不穩(wěn)定的中間體的化合物，該中間體可分解，伴隨著同時(shí)或隨后的發(fā)光。一般發(fā)光是自然發(fā)生的，沒有加熱或添加其他的能量，并且沒有加入催化劑、能量受體或?qū)е轮虚g體分解和發(fā)光的其他輔助試劑，該中間體是通過化學(xué)發(fā)光化合物與單線態(tài)氧反應(yīng)形成的。優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光化合物通常是能夠與單線態(tài)氧反應(yīng)的富含電子的化合物，通常會形成不穩(wěn)定的中間體，諸如二氧環(huán)丁烷或二氧環(huán)丁酮。這些化合物的典型例子是化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域中眾所周知的烯醇醚、烯胺、9-烷叉黃原膠、9-烷叉-N-烴基吖啶滿、芳乙烯醚、雙環(huán)氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑、光澤精。所關(guān)注的化學(xué)發(fā)光化合物在250-1200nm的波長范圍內(nèi)發(fā)光，一般在大于300或400nm的波長下發(fā)光。單獨(dú)地或者與熒光分子一起在高于血清成分吸收光區(qū)域的波長處發(fā)光的化合物對于本發(fā)明將特別有幫助。血清的熒光迅速下降超過500nm，超過550nm的熒光變得相對不重要。因此，當(dāng)分析物在血清中時(shí)，特別有用的是發(fā)射光超過550nm的化學(xué)發(fā)光化合物，優(yōu)選超過600nm。為了避免化學(xué)發(fā)光化合物的自我敏化，優(yōu)選使用那些不能吸收用于激發(fā)光敏劑的光的化學(xué)發(fā)光化合物。由于一般優(yōu)選用大于500nm的光波長激發(fā)敏化劑， 因此化學(xué)發(fā)光化合物的光吸收優(yōu)選是遠(yuǎn)低于500nm。本發(fā)明中所使用的乙烯醚通常具有下述結(jié)構(gòu)
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D1OD2⑴此處，D1可獨(dú)自選自下述基團(tuán)H和I至50個(gè)原子的取代基，優(yōu)選是芳基、羥芳基、氨芳基、叔烷基、氫、烷氧基、雜芳基等，也可以與一個(gè)或兩個(gè)碳原子形成環(huán)，如環(huán)烯烴、金剛燒烯(adamantylidene)、7_降冰片烯等。D2優(yōu)選是燒基或芳基。典型的烯醇醚作為示例是，但不限于，2，3- 二芳基-4，5- 二羥雙環(huán)氧乙烯。
KAi .‘(2)此處的X是O、S或ND2, Ar及Ar’是芳基，包括取代型的芳基，其中至少有一個(gè)取
代基是氣基、乙稀基或輕基。本發(fā)明中所使用的乙烯基硫化物一般包括了上述的烯醇醚，其中氧原子被硫原子取代。本發(fā)明中使用的烯胺一般具有下述的結(jié)構(gòu)
C .................................................C...其中D3可以獨(dú)立地是烷基或芳基，烯烴上剩余的取代基選自下組氫和1-50個(gè)原子的取代基，優(yōu)選芳基、羥芳基、氨芳基、叔烷基、H、烷氧基、雜芳基等。9-烷叉-N-烴基吖啶滿通常具有下述結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種用于檢測樣品中分析物的改進(jìn)的均相測試試劑盒，其特征在于，該均相測試試劑盒用于產(chǎn)生反應(yīng)混合物，該過程包括與化學(xué)發(fā)光化合物之間的分析物介導(dǎo)的單線態(tài)氧活化反應(yīng)，并隨后得到與樣品中分析物的存在或濃度成比例的可檢測信號，該改進(jìn)的均相測試試劑盒另外還含有噪音調(diào)節(jié)劑，其中該噪音調(diào)節(jié)劑存在于具有與化學(xué)發(fā)光化合物之間的分析物介導(dǎo)的單線態(tài)氧活化反應(yīng)的反應(yīng)混合物中。
2.如權(quán)利要求I所述的改進(jìn)的測試試劑盒，其特征在于，噪音調(diào)節(jié)劑淬滅不與分析物介導(dǎo)的單線態(tài)氧活化反應(yīng)相關(guān)的單線態(tài)氧，從而降低非特異性信號。
3.如權(quán)利要求I和2所述的改進(jìn)的測試試劑盒，其特征在于，噪音調(diào)節(jié)劑是單線態(tài)氧的淬滅劑，其濃度是反應(yīng)混合物的O. Γ0. 001%。
4.如權(quán)利要求1-3所述的改進(jìn)的測試試劑盒，其特征在于，噪音調(diào)節(jié)劑選自下組疊氮化合物、氯化錳(II)、氯化銅(II)、鉬(II)膠體、叔胺、雙烯、共軛多烯、富含電子的烯烴、鳥嘌呤、TEMP、脯氨酸或它們的混合物。
5.如權(quán)利要求1-4所述的改進(jìn)的測試試劑盒，其特征在于，噪音調(diào)節(jié)劑是鹵化疊氮化合物。
6.如權(quán)利要求1-5所述的改進(jìn)的測試試劑盒，其特征在于，該均相測試試劑盒包括 包含光敏劑化合物和第一特異性結(jié)合配對成員的第一物質(zhì)；和 包含化學(xué)發(fā)光化合物和第二特異性結(jié)合配對成員的第二物質(zhì)； 其中第一物質(zhì)和第二物質(zhì)參與分析物介導(dǎo)的單線態(tài)氧活化反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求1-6所述的改進(jìn)的測試試劑盒，其特征在于，第一物質(zhì)與第一懸浮顆粒相連，第二物質(zhì)與第二懸浮顆粒相連。
8.一種使用如權(quán)利要求1-7所述的改進(jìn)的均相測試試劑盒來測定疑似含有分析物的樣品中所述分析物存在的方法，該方法包括 a)通過至少將樣品、噪音調(diào)節(jié)劑、以及第一物質(zhì)和第二物質(zhì)組合在一起形成反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物包括樣品、可以產(chǎn)生單線態(tài)氧的第一物質(zhì)、噪音調(diào)節(jié)劑、以及可與單線態(tài)氧反應(yīng)生成可檢測的信號的第二物質(zhì)； b)用能量或者活性化合物處理反應(yīng)混合物，導(dǎo)致第一物質(zhì)形成單線態(tài)氧， 其中，如果存在分析物，或者i)使第二物質(zhì)與單線態(tài)氧的形成位點(diǎn)接近；或者ii)阻止第二物質(zhì)與單線態(tài)氧的形成位點(diǎn)接近； c)通過檢測作為第二物質(zhì)被單線態(tài)氧活化的結(jié)果的由第二物質(zhì)產(chǎn)生的信號，測定單線態(tài)氧是否已與第二物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，信號的存在或信號的量顯示了樣品中分析物的存在；以及 其中，噪音調(diào)節(jié)劑干擾沒有接近第二物質(zhì)的單線態(tài)氧的反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，單線態(tài)氧和第二物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)會導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光。
10.如權(quán)利要求8-9所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括檢測樣品中分析物的含量和濃度。
11.如權(quán)利要求8-10所述的方法，其特征在于，與沒有噪音調(diào)節(jié)劑存在時(shí)以相同方式產(chǎn)生的信號相比，反應(yīng)混合物中存在噪音調(diào)節(jié)劑提高了產(chǎn)生信號的信噪比。
全文摘要
本申請公開了在疑似含有分析物的介質(zhì)中測定分析物的方法。一種方法包括在一定的條件下處理疑似含有分析物的介質(zhì)，以致于如果存在分析物，分析物能致使光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物接近。當(dāng)光敏劑接近時(shí)，光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，活化化學(xué)發(fā)光化合物。利用單線態(tài)氧淬滅劑(SOQ)可降低或抑制單線態(tài)氧沒有接近時(shí)產(chǎn)生的非特異性信號。隨后，活化的化學(xué)發(fā)光化合物產(chǎn)生光，而產(chǎn)生的光的量與介質(zhì)中分析物的含量相關(guān)。利用噪音調(diào)節(jié)劑顯著提高了信噪比和測試的靈敏度。本申請也公開了組合物和試劑盒。
文檔編號C12Q1/66GK102892896SQ201180024015
公開日2013年1月23日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者N·沙皮爾, M·薩爾瓦蒂, J·托特勒本, H·阿哈萬-塔夫蒂, R·S·漢德利 申請人:貝克曼考爾特公司