專利名稱：用于口服誘導(dǎo)對膳食蛋白的耐受性的非消化性寡糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含非消化性寡糖和蛋白部分水解物的腸道組合物，其能夠誘導(dǎo)對膳食中的天然蛋白，特別是乳類蛋白(milk protein)的口服免疫耐受性。
背景技術(shù)：
在通常的營養(yǎng)獲取過程中，膳食蛋白經(jīng)由胃腸道呈遞給免疫系統(tǒng)，而不會產(chǎn)生針對所攝營養(yǎng)物質(zhì)的免疫反應(yīng)。這種無應(yīng)答性被稱作口服免疫耐受性或口服耐受性?？诜庖吣褪苄缘恼T導(dǎo)對于嬰兒尤其重要，嬰兒在出生后首次接觸膳食蛋白質(zhì)，并且需要對其進(jìn)行適應(yīng)。如果在嬰兒體內(nèi)沒有建立起口服免疫耐受性，則會發(fā)生食物過敏。食物過敏癥患者所需食譜中應(yīng)避免特定的食物蛋白。針對患有牛奶蛋白過敏癥的嬰兒，市場上售有包含被廣泛水解的蛋白(蛋白廣泛水解物)或甚至僅含有游離氨基酸做為氮源的嬰兒配方奶粉，在這些配方奶粉中不存在變應(yīng)原性蛋白或肽 。當(dāng)嬰兒的父母一方或雙方患有特應(yīng)性疾病，或嬰兒的一個或多個兄弟姐妹患有特應(yīng)性疾病時，其對膳食蛋白產(chǎn)生過敏的風(fēng)險較高。對于此類群體，除了優(yōu)選母乳喂養(yǎng)以外，市場上還售有包含蛋白部分水解物(被部分水解的蛋白)的低變應(yīng)原性配方奶粉。這些部分水解蛋白的變應(yīng)原性降低?，F(xiàn)已證明此方法可有效地防止改良配方奶粉中存在的天然蛋白質(zhì)的致敏作用。通常，蛋白的水解程度低于用于已患有過敏癥的嬰兒的廣泛水解蛋白。這些配方的優(yōu)勢在于其不僅通過防止對所述蛋白的致敏而降低了產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險，而且還口服誘導(dǎo)了對完整蛋白質(zhì)的免疫耐受性。這樣做的優(yōu)點在于過后可在食譜中引入所述天然蛋白，而產(chǎn)生過敏反應(yīng)的風(fēng)險則降低了。EP 1557096中披露了包含低變應(yīng)原性酪蛋白水解物和乳酸細(xì)菌益生菌株的嬰兒食品。為了誘導(dǎo)耐受性，首選乳清蛋白部分水解物。EP 2044851中披露了包含水解程度介于15%和25%之間的部分水解乳類蛋白的營養(yǎng)組合物并且其每IOOml中含有50至IOOOng TGF-^，初級預(yù)防用于針對膳食蛋白的變態(tài)反應(yīng)以及預(yù)防特應(yīng)性疾病在年輕哺乳動物中的發(fā)展。EP 0629350中披露了非變應(yīng)原性乳清蛋白水解物的應(yīng)用，據(jù)說其可以誘導(dǎo)牛奶蛋白耐受性。EP 0827697中披露了乳清的應(yīng)用，其經(jīng)過酶水解制備用于在易感哺乳動物中誘導(dǎo)對牛奶的口服耐受性的組合物。該乳清的變應(yīng)原性蛋白的免疫檢測水平比未水解乳清低彡100倍。WO 00/42863中披露了用于在具有蛋白過敏癥風(fēng)險的嬰兒中誘導(dǎo)蛋白耐受性的低變應(yīng)原性組合物，其包含廣泛水解的非變應(yīng)原性蛋白作為基本成分和/或游離氨基酸作為基本成分，所述組合物包含至少一種變應(yīng)原性蛋白的耐受原性肽做為活性成分。然而，現(xiàn)有技術(shù)中的低變應(yīng)原性組合物通常僅僅通過避免潛在變應(yīng)原的出現(xiàn)來發(fā)揮其作用，因此其僅起到了二級預(yù)防作用和/或其需要特殊成分比如益生菌或生長因子的存在。然而具有產(chǎn)生食物過敏癥的風(fēng)險或患有食物過敏癥的個體仍需要改善免疫耐受性誘導(dǎo)作用的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，本發(fā)明的根本技術(shù)問題是提供能夠克服上述缺點的組合物、方法及方式，特別是使針對人體膳食蛋白的口服耐受性得到改善，特別是使針對人體膳食蛋白的初級過敏預(yù)防作用得到改善，特別是在具有產(chǎn)生食物過敏癥風(fēng)險的人體內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過飲食伴隨服用非消化性寡糖時，乳類蛋白部分水解物誘導(dǎo)口服免疫耐受性的能力得到了顯著的協(xié)同性提高。人們發(fā)現(xiàn)在使用完整乳清蛋白進(jìn)行皮內(nèi)刺激后，用完整乳清蛋白敏化的小鼠出現(xiàn)了皮膚急性變態(tài)反應(yīng)。當(dāng)使用廣泛或部分水解乳清蛋白進(jìn)行皮內(nèi)刺激后，該反應(yīng)得到減輕。如果在敏化之前通過口服乳清蛋白部分水解物或完整乳清蛋白對這些敏化小鼠進(jìn)行預(yù)處理，則可觀察到對完整皮內(nèi)乳清蛋白的急性皮膚反應(yīng)有了顯著降低。當(dāng)以口服乳清蛋白廣泛水解物作為預(yù)處理時，則沒有觀察到反應(yīng)的降低。 令人驚訝的是觀察到，如果在使用乳清蛋白部分水解物進(jìn)行預(yù)處理的過程中也用非消化性寡糖對小鼠進(jìn)行預(yù)處理的話，則可以進(jìn)一步協(xié)同性地降低急性皮膚反應(yīng)。本發(fā)明，特別是非消化性寡糖用以加強蛋白部分水解物的作用的用途，甚至可完全消除急性皮膚反應(yīng)。在使用單獨含有非消化性寡糖(以下也稱作ND0)的膳食進(jìn)行預(yù)處理或使用乳清蛋白廣泛水解物和含有NDO的膳食進(jìn)行預(yù)處理后，則沒有觀察到這種由于非消化性寡糖的存在而產(chǎn)生的對口服免疫耐受性誘導(dǎo)作用的加強和改善。因此，本發(fā)明提供了包含蛋白部分水解物(特別是乳清蛋白部分水解物)和非消化性寡糖(特別是低聚半乳糖、低聚果糖和/或糖醛酸寡糖)的組合物，其優(yōu)選用于增強對膳食蛋白耐受性的誘導(dǎo)，尤其是增強對乳類蛋白、更特別的是對乳清蛋白耐受性的誘導(dǎo)，且其優(yōu)選用于人體。將本發(fā)明的組合物用于嬰兒尤其有益，優(yōu)選用于具有發(fā)生食物過敏癥風(fēng)險的嬰兒。此外，根據(jù)本發(fā)明還確定了乳清蛋白￠-乳球蛋白中特定肽的特定序列，如果作為預(yù)處理讓用完整乳清蛋白敏化的老鼠服用這些肽，這些肽可誘導(dǎo)對完整乳清蛋白的口服免疫耐受性。在預(yù)處理時伴隨使用非消化性寡糖可以協(xié)同增強這種作用。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明解決其技術(shù)問題尤其通過提供了以下教導(dǎo)將非消化性寡糖用于增強本發(fā)明的蛋白部分水解物對膳食蛋白口服耐受性的誘導(dǎo)作用，優(yōu)選地，所述蛋白部分水解物的特征在于其所包含的肽中至少3wt%的肽的尺寸為5kDa或更高,且至少50wt. %的肽的尺寸小于5kDa。本發(fā)明解決所述技術(shù)問題還通過提供了以下教導(dǎo)將非消化性寡糖用于增強本發(fā)明的蛋白部分水解物對膳食蛋白的初級過敏預(yù)防作用的用途，優(yōu)選所述蛋白部分水解物的特征在于其所包含的肽中至少3wt. %的肽的分子量為5kDa或更高,且至少50wt. %的肽的分子量小于5kDa。優(yōu)選地，用于增強蛋白部分水解物的口服耐受性誘導(dǎo)作用或用于增強蛋白部分水解物的初級過敏預(yù)防作用的非消化性寡糖與蛋白部分水解物一同包含于本發(fā)明的腸道組合物中。因此，本發(fā)明解決其技術(shù)問題還通過提供本發(fā)明的包含至少一種非消化性寡糖和至少一種蛋白部分水解物的腸道組合物，該組合物用于對膳食蛋白的口服耐受性的誘導(dǎo)，優(yōu)選用于增強對膳食蛋白的口服耐受性的誘導(dǎo)，優(yōu)選地，所述蛋白部分水解物的特征在于其所包含的肽中至少3wt. %的肽的分子量為5kDa或更高，且其中至少50wt. %的肽的分子量小于5kDa。本發(fā)明解決其技術(shù)問題還通過提供包含至少一種非消化性寡糖和至少一種蛋白部分水解物的腸道組合物，該組合物優(yōu)選用于預(yù)防食物過敏癥或炎癥性腸道疾病，所述蛋白部分水解物的特征在于其所包含的肽中至少3wt. %的肽的分子量為5kDa或更高，且其中至少50wt. %的肽的分子量小于5kDa。本發(fā)明解決所述技術(shù)問題還通過提供了包含非消化性寡糖和至少一種蛋白部分水解物的腸道組合物，其中蛋白部分水解物為乳清蛋白部分水解物且其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物，用于誘導(dǎo)對膳食蛋白的口服耐受性或用于預(yù)防食物過敏癥或炎癥性腸道疾病。本發(fā)明還特別通過提供腸道組合物解決其技術(shù)問題，其中所述蛋白部分水解物為乳清蛋白部分水解物，并且其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物。本發(fā)明解決其根本問題還通過提供制備優(yōu)選口服耐受性誘導(dǎo)作用增強的腸道組合物的方法，其中將至少一種本發(fā)明的蛋白部分水解物，優(yōu)選將所含肽中至少3wt. %的肽的分子量為5kDa或更高且至少50wt. %的肽的分子量小于5kDa的蛋白部分水解物，和至少一種非消化性寡糖混合在一起，并獲得優(yōu)選口服耐受性誘導(dǎo)作用增強的腸道組合物。本發(fā)明還涉及制備優(yōu)選口服耐受性誘導(dǎo)作用增強的腸道組合物的方法，其中將至少一種P -乳球蛋白肽和至少一種非消化性寡糖混合在一起，并獲得優(yōu)選口服耐受性誘導(dǎo)作用增強的腸道組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，還提出了喂養(yǎng)受試對象特別是嬰兒的方法，優(yōu)選為治療特別是預(yù)防過敏癥(優(yōu)選食物過敏癥)和/或特應(yīng)性疾病(包括特應(yīng)性濕疹和/或哮喘和/或鼻炎和/或皮炎)的方法，所述方法包括給有此需要的受試對象，特別是嬰兒，尤其是具有發(fā)生此類疾病的風(fēng)險的嬰兒施用本發(fā)明的腸道組合物。因此，本發(fā)明的基礎(chǔ)包括非消化性寡糖可以用于改善(即增強)蛋白部分水解物的口服耐受性誘導(dǎo)作用這一驚人且有利的發(fā)現(xiàn)。特別地，本發(fā)明教導(dǎo)了使用非消化性寡糖來改善(即增強)蛋白部分水解物的口服耐受性誘導(dǎo)作用，并從而改善(即加強)蛋白部分水解物的初級過敏預(yù)防作用(即預(yù)防初級過敏的作用)。本發(fā)明具有的特別優(yōu)勢在于其產(chǎn)生了口服耐受性和初級過敏預(yù)防作用，該作用至少與使用完整乳清蛋白誘導(dǎo)耐受性和預(yù)防過敏的作用同樣好且有效，然而，使用本發(fā)明的NDO和蛋白部分水解物的組合時，引發(fā)變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險要低得多。在本發(fā)明的背景下，增強即表示增加或提高，特別是從一個給定的可測基礎(chǔ)值到一個遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基礎(chǔ)值的可測值的顯著提高。在本發(fā)明的背景下，依照本發(fā)明的實施例I在測定蛋白口服耐受性的給定小鼠模型中測定蛋白部分水解物所誘導(dǎo)的口服耐受性的增強。因此，當(dāng)非誘導(dǎo)口服耐受性的即發(fā)型高反應(yīng)性(ITH)數(shù)值為100%時，可用作基礎(chǔ)值的蛋白部分水解物誘導(dǎo)的口服耐受性的狀態(tài)可用35到90%的ITH數(shù)值來表示。
所述誘導(dǎo)口服耐受性顯著增強的特征在于，當(dāng)以非誘導(dǎo)口服耐受性的ITH值為100%時，其ITH數(shù)值為0到30%，優(yōu)選0到25%，優(yōu)選0到20%，優(yōu)選0到10%，更優(yōu)選為0%。因此，誘導(dǎo)口服耐受性的增強優(yōu)選表示降低了誘導(dǎo)口服耐受性基礎(chǔ)值的至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，優(yōu)選100%，該基礎(chǔ)值表示為在上述小鼠模型中所測量的即發(fā)型高反應(yīng)性。ITH的相對數(shù)值可通過以下計算公式轉(zhuǎn)換為口服耐受性數(shù)值100減去ITH等于耐受性數(shù)值。因此，最優(yōu)選地，蛋白部分水解物所誘導(dǎo)的口服耐受性的增強導(dǎo)致完全耐受，這表示對膳食蛋白60到100%耐受，優(yōu)選90到100%耐受，優(yōu)選95到100%耐受，最優(yōu)選100%耐受。在本發(fā)明的背景下，依照本申請實施例I在給定小鼠模型中測定蛋白部分水解物的初級過敏預(yù)防作用的增強，以確定對蛋白的口服耐受性。因此，當(dāng)以完全形成過敏狀態(tài)(fully developed allergy state)的即發(fā)型高反應(yīng)性(ITH)數(shù)值為100%時,可用作基礎(chǔ)值的蛋白部分水解產(chǎn)物的初級過敏預(yù)防作用的狀態(tài)可用35到90%的ITH數(shù)值來表示。所 述初級過敏預(yù)防作用(primaryallergy-prventing effect)顯著增強的特征在于，當(dāng)以完全形成過敏狀態(tài)的ITH值為100%時，其ITH數(shù)值為0到30%，優(yōu)選0到25%，優(yōu)選0到20%，優(yōu)選0到10%，最優(yōu)選0%。因此，初級過敏預(yù)防作用的增強優(yōu)選表示降低了由蛋白部分水解物所產(chǎn)生的初級過敏預(yù)防作用的基礎(chǔ)值的至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%且優(yōu)選100%，所述基礎(chǔ)值表示為在上述小鼠模型中所測得的即發(fā)型高反應(yīng)性。因此，最優(yōu)選地，蛋白部分水解物的初級過敏預(yù)防作用的增強導(dǎo)致初級過敏的完全防止，這表示對膳食蛋白90到100%耐受，優(yōu)選95到100%耐受，最優(yōu)選100%耐受。在本發(fā)明的背景下，基于初級過敏預(yù)防作用的初級過敏預(yù)防措施是指目的為部分地，優(yōu)選完全地防止過敏癥狀在危險甚至高危個體中的發(fā)生(development)和爆發(fā)的預(yù)防治療。在本發(fā)明的背景下，初級過敏預(yù)防作用是一種免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。初級過敏預(yù)防作用不包括由在膳食中避免致敏食物成分所產(chǎn)生的二級過敏預(yù)防作用(secondaryallergy-preventing effect)。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“5kDa或更高”意為“至少5kDa”。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“低于5kDa”意為上限達(dá)到但不包括5kDa。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“口服耐受性(oral tolerance) ”優(yōu)選表示口服免疫耐受性。本發(fā)明在一個優(yōu)選實施方式中還涉及包含非消化性寡糖和至少一種蛋白部分水解物的腸道組合物，其中所述蛋白部分水解物為乳清蛋白部分水解物，優(yōu)選3 -乳球蛋白部分水解物，并且其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物。所述腸道組合物優(yōu)選用于誘導(dǎo)對膳食蛋白的口服耐受性或預(yù)防食物過敏癥或炎癥性腸道疾病，或兼用于兩種目的。在優(yōu)選的實施方式中，所述腸道組合物所包含的乳清蛋白部分水解物包含至少一種特定的哺乳動物乳類蛋白肽，優(yōu)選為特定的乳清蛋白肽，更優(yōu)選為特定的￠-乳球蛋白肽。乳清蛋白部分水解物可為天然或合成的，即可包含天然或合成肽。優(yōu)選地，所述乳清蛋白部分水解物包含至少一種特定的￠-乳球蛋白肽，其由￠-乳球蛋白氨基酸序列的12到38個氨基酸組成，更優(yōu)選由15到36個氨基酸組成，甚至更優(yōu)選由18到34個氨基酸組成，最優(yōu)選由18個氨基酸組成。所述特定的￠-乳球蛋白肽的尺寸優(yōu)選低于5kDa，特別是0. I到4. 9kDa，優(yōu)選為0. 5到4. 9kDa，更優(yōu)選為2到4. 9kDa，最優(yōu)選為大約2. 4kDa。不期望受理論限制，尺寸較小的肽被認(rèn)為會產(chǎn)生較低的口服耐受誘導(dǎo)作用，原因是耐受性誘導(dǎo)表位被以欠佳的方式提呈給T細(xì)胞。另一方面，由于與肥大細(xì)胞上的兩個IgE分子交聯(lián)的幾率隨尺寸的增大而升高，較大尺寸會增加發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險。所述至少一種￠-乳球蛋白肽優(yōu)選包含選自由SEQ ID NO USEQ ID N02、SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4組成的組的序列，尤其是氨基酸序列。最優(yōu)選地，所述腸道組合物包含含有2種、3種或優(yōu)選4種肽的混合物，所述肽包含SEQ ID NOs I至4。所述肽中的每一種均可優(yōu)選在其C-末端、其N-末端或兩端獨立地被可以為任意氨基酸的I到10個氨基酸，優(yōu)選I到8個氨基酸，更優(yōu)選I到5個氨基酸取代。所述特定的￠-乳球蛋白肽的分子低于5kDa，尤其為0. I到4. 9kDa，優(yōu)選為0. 5到4. 9kDa，更優(yōu)選為2到4. 9kDa，最優(yōu)選為約2. 4kDa0 在另一優(yōu)選實施方式中，用于本發(fā)明的乳清蛋白部分水解物由上述特定的￠-乳球蛋白肽組成。因此，本發(fā)明在一個優(yōu)選實施方式中還涉及了包含非消化性寡糖和至少一種^ -乳球蛋白肽的腸道組合物，其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物，而所述￠-乳球蛋白肽包含選自由SEQ IDNO USEQ ID NO 2,SEQ ID NO3和SEQ ID NO 4組成的組的序列，其中所述肽的分子量優(yōu)選小于5kDa，用于預(yù)防食物過敏癥或炎癥性腸道疾病的。此外，本發(fā)明在一個優(yōu)選實施方式中還涉及了包含非消化性寡糖和至少一種￠-乳球蛋白肽的腸道組合物，其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物，而所述￠-乳球蛋白肽包含選自由SEQ ID NOUSEQ ID NO
2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4組成的組的序列，其中所述肽的分子量優(yōu)選小于5kDa，用于誘導(dǎo)對膳食蛋白口服耐受性。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將SEQ ID NOs I到4的肽的混合物作為預(yù)處理進(jìn)行給藥時，對完整乳清蛋白敏化的小鼠顯示對完整皮內(nèi)乳清蛋白的急性皮膚反應(yīng)得到了顯著的降低。進(jìn)一步觀察到當(dāng)在用肽混合物進(jìn)行預(yù)處理的過程中還用非消化性寡糖對小鼠進(jìn)行預(yù)處理時，則急性皮膚反應(yīng)得到了進(jìn)一步的協(xié)同性降低。優(yōu)選地，所述腸道組合物中至少一種特定的肽以每IOOml至少IOOmg的濃度存在，更優(yōu)選每IOOml至少120mg,尤其是每IOOml至少150mg。本發(fā)明的蛋白部分水解物本發(fā)明的組合物包含蛋白部分水解物，在下文中也稱為“部分水解蛋白”。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物不含完整的未水解蛋白。完整的未水解蛋白的過敏原性太高且可能引發(fā)不利的變態(tài)反應(yīng)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明組合物可在蛋白部分水解物之外進(jìn)一步包含廣泛水解的蛋白(也稱為蛋白廣泛水解物)和/或游離氨基酸。廣泛水解蛋白和/或游離氨基酸不會弓I發(fā)變態(tài)反應(yīng)，但也不具備誘導(dǎo)口服耐受性的特性。優(yōu)選地，蛋白部分水解物源自哺乳動物乳汁，更優(yōu)選牛奶。在本發(fā)明中優(yōu)選排除使用人乳蛋白。優(yōu)選地，所述蛋白部分水解物包含或為哺乳動物乳類蛋白部分水解物。蛋白部分水解物包含或為乳清蛋白部分水解物。更優(yōu)選地，所述蛋白部分水解物包含或為￠-乳球蛋白部分水解物和/或a-乳白蛋白部分水解物。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述蛋白部分水解物包含或為豌豆、大豆和/或稻蛋白部分水解物。更優(yōu)選地，所述蛋白部分水解物包含或為酪蛋白部分水解物。用于部分水解以獲得本發(fā)明的蛋白部分水解物的蛋白可以是含有蛋白質(zhì)，優(yōu)選乳類蛋白的任何組合物，且尤其優(yōu)選乳類蛋白的溶液或分散液。優(yōu)選地，用于部分水解的蛋白為乳清蛋白、酸性乳清蛋白、甜乳清蛋白、乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、脫礦質(zhì)化乳清粉或酪蛋白酸鹽。用于部分水解的水解酶可以來源于例如動物或植物(胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、腸粘膜提取物、胰腺提取物、凝乳酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶)，細(xì)菌或真菌(來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、米曲霉(Aspergillus orysae)、溫特曲霉(/lsy e/v:tj7//w.V的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶和來源于Aspergillus orizae、溫特曲霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、微小毛霉(Mucor pusillus)、栗疫菌(Endothia parasitica)的酸性蛋白酶)或是它們的 組合物。在水解過程中，溶液或懸液中蛋白的濃度優(yōu)選為重量的約5-20%(wt%)，并可在引入蛋白酶之前用巴斯德法將其消毒。酶/蛋白的比例可以為0.1-10%重量/重量，并且優(yōu)選為約0. 25到4%。水解可在約35oC到65oC之間的溫度進(jìn)行30分鐘到10小時，優(yōu)選進(jìn)行30分鐘到4小時，pH值在2. 5到11的范圍內(nèi)，優(yōu)選在4. 5到7. 0、8.0和8. 5的范圍。如有需要，可用例如檸檬酸、食品級HCl或NaOH、NH4OH, KOH、Ca(OH)2以2N的濃度單獨或以混合物調(diào)整并調(diào)控溶液的pH值?？捎每焖倮鋮s中止酶水解過程。然后，可在約70到110° C的溫度對蛋白水解物進(jìn)行約0. I到10分鐘的熱處理，以將殘留的酶即蛋白酶滅活。通過離心和過濾凈化所得的蛋白水解物溶液，以分別除去不溶的和完整的蛋白，并回收清液?？梢怨I(yè)規(guī)模使用由不同材料(礦物、聚砜)制成的不同類型的膜(螺旋狀、管狀、扁平狀、箭纖維狀(allow fibbers))0根據(jù)酶的類型、水解條件和過濾法即所用膜類型的不同，在此步驟可獲得所需的蛋白部分水解物的肽尺寸分布。如有需要，可將回收的水解物清夜通過蒸發(fā)濃縮直到干固體含量為例如10-50%，用于隨后的處理，或噴霧干燥。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含蛋白水解程度為5到25%，更優(yōu)選為7. 5到21%，最優(yōu)選為10到20%的蛋白部分水解物。以現(xiàn)有潛在肽鍵的總數(shù)為100%，將水解程度定義為已經(jīng)由酶促水解斷裂的肽鍵的百分?jǐn)?shù)。具有上述水解程度的蛋白提供足夠的鏈長為2到30的肽。以下如果不做另外說明，肽的被％值(相對量)是基于與總的蛋白部分水解物的干重有關(guān)的肽干重。肽的大小和分子量分布可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法測定，例如HPLC或尺寸排阻色譜(SEC)，特別是高效尺寸排阻色譜。Gonzdlez-Telloetal，1994, Enzymatic hydrolysis of whey proteins II. Molecular weight range.Biotech. Bioeng，44，529-532 中公開了適合的方法。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述蛋白部分水解物的特征在于其所含肽中至少3wt%的肽的尺寸為5kDa或更高,優(yōu)選至少3. 5wt%的肽的尺寸為5kDa或更高,優(yōu)選至少4wt%,更優(yōu)選至少4. 5wt%的肽的尺寸為5kDa或更高。本發(fā)明的蛋白部分水解物的進(jìn)一步特征在于其中至少50wt%,優(yōu)選至少55wt%,優(yōu)選至少60wt%,優(yōu)選至少70wt%的肽的尺寸小于 5kDa。更優(yōu)選地,所述蛋白部分水解物所含肽中至少0. 5wt%,優(yōu)選至少Iwt. %，優(yōu)選至少1.5wt%且最優(yōu)選至少2wt%的肽的尺寸大于20kDa。更優(yōu)選地,所述蛋白部分水解物所含肽中至少0. 5wt%,優(yōu)選至少Iwt. %,優(yōu)選至少1. 5wt%,優(yōu)選至少2wt%至最高3. 5wt%,優(yōu)選最高
3.0wt%的肽的尺寸大于20kDa。在更加優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白部分水解物所含肽中至少5wt%，優(yōu)選5到10wt%,優(yōu)選6到10wt%的肽的尺寸為至少3kDa。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白部分水解物的特征在于其中尺寸為2到<5kDa的肽的相對量與尺寸為至少5kDa的肽的相對量之間的比例為(5至1):1，優(yōu)選為(4至1):1，優(yōu)選(3至I) :1，優(yōu)選(2至I) :1,優(yōu)選1:1。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白部分水解物所含肽中至少0. 5wt%，優(yōu)選至少0. 6wt%，特別是0. 5到3. 0wt%,優(yōu)選0. 5到2. 0wt%,優(yōu)選0. 5至Ij1. 0wt%的肽的尺寸為 10 到 20kDa。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白部分水解物的特征在于其中尺寸為5到IOkDa的肽的相對量與尺寸大于20kDa的肽的相對量之間的比例為(5至I) : (I至5)，優(yōu)選為(3至I) : (I至3)，更優(yōu)選為(2至I) : (I至2)，特別是1:1。在更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的蛋白部分水解物的特征尤其在于其肽的分子尺寸分布，其中尺寸大于20kDa的肽的重量相對量高于尺寸為10到20kDa的肽的相對量,尤其是高至少2倍。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述蛋白部分水解物的特征在于其中尺寸為10到20kDa的肽的相對量與尺寸大于20kDa的肽的相對量的比例為1: (1.1到3)，優(yōu)選為1:(1.1到2. 5)，優(yōu)選為1:(1.5到2)。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的蛋白部分水解物的特征在于其中尺寸為10到20kDa的肽的相對量低于尺寸大于20kDa的肽的相對量，且低于尺寸為5到IOkDa的肽的相對量。因此，在特別優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白部分水解物的特征在于其特殊的肽分布，特別是尺寸至少為5kDa的肽的分布，特別是在所述分布中尺寸大于20kDa的肽和尺寸為5到IOkDa的肽的量均高于尺寸為10到20kDa的肽的相對量，并且優(yōu)選其中至少50wt%、最優(yōu)選至少60wt%的肽的尺寸小于5kDa。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白部分水解物的特征在于水解物中所含肽具備以下尺寸分布其中60至90wt%的肽的尺寸〈lkDa，5至20wt%的肽的尺寸為I到<2kDa，2至15wt%的肽的尺寸為2到<5kDa，0. 6至3wt%的肽的尺寸為5到〈lOkDa，0. 5至2wt%的肽的尺寸為10到20kDa且I至3wt%的肽的尺寸>20kDa。在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白部分水解物的特征在于水解物中所含肽具有以下尺寸分布85至90wt%的肽的尺寸〈lkDa, 6至10wt%的肽的尺寸為I到<2kDa, 2至6wt%的肽的尺寸為2到<5kDa，0. 6至3wt%的肽的尺寸為5到〈lOkDa, 0. 5至2wt%的肽的尺寸為10到20kDa且I至3wt%的肽的尺寸>20kDa。
在優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白部分水解物的特征在于水解物中所含肽具有以下尺寸分布85wt. % 為〈lkDa, 8wt. % 為 I 到 <2kDa, 4wt. % 為 2 到 <5kDa, lwt. % 為 5 到<IOkDa, 0. 6wt. % 為 10 到 20kDa 和 I. 4wt. % 為 >20kDa。在更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的蛋白部分水解物為乳清蛋白部分水解物，更優(yōu)選為3-乳球蛋白部分水解物。所述乳清蛋白部分水解物可包含或由上述天然肽組成。此夕卜，所述蛋白部分水解物可包含或由特定的和/或合成肽組成。優(yōu)選地，所述肽為來自哺乳動物乳類蛋白，優(yōu)選來自乳清蛋白，最優(yōu)選來自P -乳球蛋白的特定肽。所述特定的P -乳球蛋白肽的分子量優(yōu)選低于5kDa，尤其為0. I至4. 9kDa，優(yōu)選為0. 5至4. 9kDa，更優(yōu)選為2至4. 9kDa，最優(yōu)選為大約2. 4kDa。優(yōu)選地，所述特定P -乳球蛋白肽由12至38個￠-乳球蛋白肽氨基酸序列的氨基酸組成，更優(yōu)選由15至36個氨基酸組成，甚至更優(yōu)選由18至34個氨基酸組成，最優(yōu)選由18個氨基酸組成。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述特定的￠-乳球蛋白肽包含選自由SEQ ID NO USEQ ID NO 2,SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4組成的組的序列。這些肽中的每一種肽在其C-末端、N-末端或兩端 都可以獨立地被可為任意氨基酸的I到10個氨基酸，優(yōu)選I到8個氨基酸，更優(yōu)選I到5個氨基酸取代。所述特定P -乳球蛋白肽的分子量優(yōu)選低于5kDa，尤其為0. I至4. 9kDa，優(yōu)選為0. 5至4. 9kDa，更優(yōu)選為2至4. 9kDa，最優(yōu)選為大約2. 4kDa。然而，在本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方式中也預(yù)見到，所述特定的￠-乳球蛋白肽并非乳清蛋白部分水解物的一部分，而特別來說是所使用的唯一蛋白質(zhì)來源或者它們與除乳清蛋白部分水解物以外的成分(如游離氨基酸或廣泛水解蛋白)一起使用。通常，蛋白廣泛水解物中每IOOg蛋白質(zhì)中的游離氨基酸含量大于10g。優(yōu)選地，本文所用的術(shù)語“蛋白”包括肽與游離氨基酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述腸道組合物優(yōu)選包含基于總組合物的干重的至少7wt%,更優(yōu)選至少8wt%,優(yōu)選至少9wt%,優(yōu)選7到40wt%,更優(yōu)選7到20wt%,特別是優(yōu)選7到15wt%的蛋白部分水解物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述腸道組合物優(yōu)選包含基于總組合物的干重的最多40wt%，優(yōu)選最多20wt%且最優(yōu)選最多15wt%，優(yōu)選8至15wt%，優(yōu)選8至20wt%，優(yōu)選8至40wt%或優(yōu)選9至15wt%,優(yōu)選9至20wt%或9至40wt%的蛋白部分水解物。本發(fā)明的蛋白部分水解物的特征在于具有至少一個上述特征或同時具有上述特征中大多數(shù)或全部。本發(fā)明的廣泛水解蛋白涉及已水解且其中少于3wt%的肽的尺寸大于5kDa的蛋白。通常，廣泛水解蛋白已經(jīng)通過蛋白酶水解和隨后在截斷值為5或3kDa的膜上過濾而進(jìn)行的超濾步驟而獲得。實施例I和W00141581中第13頁第13行至第16頁第I行披露了獲得蛋白部分水解物的合適來源與方法。在本發(fā)明的背景下，所有以所示組合物整體的百分比(%)的形式給出的相對量加起來為所示組合物整體的100%。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“含有”、“包含”和“包括”以及它們的詞形變化在一個優(yōu)選實施方式中以其非限制性含義使用，意指包括該術(shù)語后面的項目，但不排除未特別提及的項目。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“含有”、“包含”和“包括”以及它們的詞形變化在另一個優(yōu)選實施方式中以其限制性含義使用，意指包括該術(shù)語后面的項目，且排除了未特別提及的項目，因而與術(shù)語“由……組成”及其詞形變化的含義相同。在提及本發(fā)明中特別是組合物或方法的要素時，不定冠詞“a”或“an”并不排除存在多于一個該要素的可能性，除非上下文清楚地要求有一個且只有一個該要素。因此不定冠詞“a”或“an” 一般意指“至少一個”。本發(fā)明的非消化性寡糖本發(fā)明的組合物包含非消化性寡糖。有利且最優(yōu)選的是，所述非消化性寡糖溶于水(依據(jù) L. Prosky et al, J. Assoc. Anal. Chem 71:1017-1023，1988 中所披露的方法)，且優(yōu)選聚合度(DP)為2到200的寡糖。非消化性寡糖的平均DP優(yōu)選低于200，更優(yōu)選低于100，甚至更優(yōu)選低于60，最優(yōu)選低于40。非消化性寡糖在腸中并沒有被人上消化道(小腸和胃)中存在的消化酶作用而消化。非消化性寡糖通過人腸道微生物群來進(jìn)行發(fā)酵的。例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和麥芽糊精均被認(rèn)為是可消化的。寡糖原料可包括單糖比如葡萄糖、果糖、巖藻糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸和GalNac等，但在 本發(fā)明中這些并非寡糖的一部分。 本發(fā)明的組合物和方法中包含的非消化性寡糖優(yōu)選包括非消化性寡糖的混合物。所述非消化性寡糖優(yōu)選選自由低聚果糖如菊糖、非消化性糊精、低聚半乳糖如低聚反式半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡萄糖如低聚龍膽糖和環(huán)糊精、低聚葡萄甘露糖、低聚半乳甘露糖、低聚甘露糖、殼寡糖、糖醛酸寡糖、唾液酸寡糖如3-SL、6-SL、LSTa, LSTb, LSTc, DSLNT, S-LNH、DS-LNH和低聚巖藻糖如(未)硫酸化的巖藻多糖
0S、2-FL、3-FL、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、LNnFPI、LNDH 及其混合物所組成的組，更優(yōu)選地為低聚果糖如菊糖、低聚半乳糖如3 -連接的低聚反式半乳糖、糖醛酸寡糖和低聚巖藻糖及其混合物，甚至更優(yōu)選地為低聚反式半乳糖、菊糖和/或糖醛酸寡糖，最優(yōu)選地為低聚反式半乳糖。當(dāng)非消化性寡糖為混合物時，則用各參數(shù)的平均值來定義本發(fā)明。本發(fā)明優(yōu)選提供了具有兩種不同的非消化性寡糖，S卩非消化性寡糖A和非消化性寡糖B的組合物。非消化性寡糖A和非消化性寡糖B優(yōu)選含有不同類型的糖苷鍵、不同的聚合度和/或不同的單糖組成。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，非消化性寡糖A中特定單糖的百分比比非消化性寡糖B中同一單糖的百分比至少高40%，優(yōu)選至少高50%，更優(yōu)選至少高75%，甚至更優(yōu)選至少高90%。非消化性寡糖中單糖百分比的簡單計算方式可以為用非消化性寡糖中各單糖單位例如葡萄糖的數(shù)目除以該非消化性寡糖中單糖單位總數(shù)，并乘以100。如果非消化性寡糖為非消化性寡糖混合物，就必須考慮非消化性寡糖混合物中各單獨單糖單位的貢獻(xiàn)。非消化性寡糖混合物中單糖百分比的簡單測定方式可以為使混合物完全水解并測定各單糖的百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選地，非消化性寡糖A包含至少40%(數(shù)量)的半乳糖，優(yōu)選至少67%，更優(yōu)選至少75%的半乳糖。優(yōu)選地，非消化性寡糖B包含至少30%(數(shù)量)的果糖，更優(yōu)選至少67%，甚至更優(yōu)選至少80%的果糖。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，非消化性寡糖A的平均DP比非消化性寡糖B的平均DP低至少5個單糖單位，優(yōu)選至少10個單糖單位，甚至更優(yōu)選至少15個單糖單位。優(yōu)選地，非消化性寡糖A的平均DP為2-10，更優(yōu)選為3-5。優(yōu)選地，非消化性寡糖B的平均DP低于200，更優(yōu)選11-60，甚至更優(yōu)選20-30?？梢詢?yōu)選包含有聚合度增高的非消化性寡糖。DP不同的非消化性寡糖A和B可以具有相同或不同的單糖組成。優(yōu)選地，非消化性寡糖A和B具有不同的單糖組成和不同的DP。優(yōu)選地,非消化性寡糖A和B累計重量中至少80wt%,更優(yōu)選至少95%,最優(yōu)選至少98%的DP低于60，更優(yōu)選低于40，最優(yōu)選低于20。DP較低可以有利地降低非消化性寡糖的粘稠度且增加其可發(fā)酵性。非消化性寡糖A和B累計重量中優(yōu)選至少50wt. %，優(yōu)選至少75wt. %的DP為2-8。在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式中，非消化性寡糖A中至少一種糖苷鍵占非消化性寡糖A中總糖苷鍵的百分比比寡糖B中同一糖苷鍵的百分比高出或低出至少40%，優(yōu)選至少50%，甚至更優(yōu)選至少75%。本發(fā)明中使用的術(shù)語“糖苷鍵”是指通過脫水反應(yīng)而形成于兩個環(huán)狀單糖環(huán)之間的C-O-C鍵。糖苷鍵優(yōu)選具有較高的多樣性。糖苷鍵的區(qū)別在于它們共價結(jié)合于單糖單位中不同編號位置的碳原子，和/或在于它們形成a或0鍵。非消化性寡糖中出現(xiàn)的不同糖苷鍵的例子有^ (I, 3)、a (1，4)、P (2，I)·、a (I, 2)和^ (I, 4)鍵。優(yōu)選地，非消化性寡糖A中的糖苷鍵包含至少40%的P (I, 4)和/或P (I, 6)糖苷鍵，更優(yōu)選至少75%。非消化性寡糖B中的糖苷鍵優(yōu)選包含至少40%的P (2，I)糖苷鍵，更優(yōu)選至少75%。優(yōu)選地，非消化性寡糖A和B的單糖單位組成和糖苷鍵類型不同。優(yōu)選地，非消化性寡糖A和B的糖苷鍵類型和DP不同。最優(yōu)選地，非消化性寡糖A和B的糖苷鍵類型、單糖組成和DP都不相同。非消化性寡糖，特別是非消化性寡糖A和B的總單糖單位中優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少75%,甚至更優(yōu)選90%,最優(yōu)選98%為選自由半乳糖(gal),果糖(fu)和葡萄糖(glu)組成的組中的單糖。非消化性寡糖A優(yōu)選為選自由P -低聚半乳糖、a -低聚半乳糖和半乳聚糖組成的組中的單糖。依據(jù)更優(yōu)選的實施方式，非消化性寡糖A為￠-低聚半乳糖。￠-低聚半乳糖有時也被稱為低聚反式半乳糖。優(yōu)選地，非消化性寡糖A包含帶有P (1,4), ^ (1,3)和/或P (1,6)糖苷鍵和末端葡萄糖的低聚半乳糖?，F(xiàn)有可用的低聚反式半乳糖為例如商品名為Vivinal GOS (Borculo Domolngredients, Zwolle, Netherlands), Bi2muno (Clasado),Cup-oligo (Nissin Sugar)和 01 igomate55 (Yakult)的產(chǎn)品。非消化性寡糖B優(yōu)選為低聚果糖。在其他背景下，低聚果糖fructo-oIigosaccharide 也可以被稱為如果糖多聚體(fructopolysaccharides)、寡果糖(oligofructose)、聚果糖(polyfructose)、多果聚糖(polyfructan)、菊糖(inulin)、果糖膠(Ievan)和果聚糖(fructan),并且可以用來指含3 -連接的果糖單位的寡糖,該果糖單位優(yōu)選由P (2，I)和/或P (2，6)糖苷鍵連接，且DP優(yōu)選介于2和200之間。優(yōu)選地，低聚果糖包含末端P (2，I)糖苷鍵連接的葡萄糖。優(yōu)選地，低聚果糖含有至少7個￠-連接的果糖單位。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，菊糖被用作非消化性寡糖B。菊糖是低聚果糖的一種，其糖苷鍵中至少75%為P (2，I)連接。典型地，菊糖的平均鏈長介于8和60個單糖單位之間。適用于本發(fā)明組合物的低聚果糖可商購，例如商品名為Raftiline HP(Orafti)的產(chǎn)品。其他合適的來源有 raftilose (Orafti)、fibrulose 和 fibruline (Cosucra)以及Frutafit 和 frutalose(Sensus)。作為非消化性寡糖A，最優(yōu)選平均DP小于10、優(yōu)選小于6的低聚反式半乳糖；作為非消化性寡糖B，最優(yōu)選平均DP大于7，優(yōu)選大于11，甚至更優(yōu)選大于20的低聚果糖。如果本發(fā)明的腸道組合物包含非消化性寡糖A和B，非消化性寡糖A和非消化性寡糖B之間的重量比優(yōu)選為1/99至99/1，更優(yōu)選為1/19至19/1，甚至更優(yōu)選為I至19/1。當(dāng)非消化性寡糖A的DP低而非消化性寡糖B的DP相對較高時，這樣的重量比尤其具有優(yōu)勢。優(yōu)選地，寡糖A為低聚反式半乳糖，且寡糖B為低聚果糖。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，組合物包含非消化性寡糖A和B，其中非消化性寡糖A和B的區(qū)別在于i)對于基于寡糖A的總單糖單位的寡糖A的至少一種單糖的百分比，所述單糖比寡糖B中同一單糖的百分比高出至少40數(shù)量％ ;和/或ii)對于基于寡糖A的總糖苷鍵的寡糖A的至少一種糖苷鍵的百分比，所述糖苷鍵比寡糖B中同一糖苷鍵的百分比高出至少40% ;和/或iii)對于寡糖A的聚合度，寡糖A的聚合度比寡糖B的聚合度低至少5個單糖單位。在更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含非消化性寡糖C。所述非消化性寡糖C包含糖醛酸寡糖。本發(fā)明中所用的術(shù)語糖醛酸寡糖是指這樣的寡糖在所述寡糖中存在的單糖單位中至少50數(shù)量％是選自由古羅糖醛酸、甘露糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醒酸、核糖醒酸(riburonic acid)和葡萄糖醒酸組成的組中的一種。在優(yōu)選實施方式中，所述糖醛酸寡糖包含基于糖醛酸寡糖中總糖醛酸單位至少50數(shù)量％的半乳糖醛酸。本發(fā)明中使用的糖醛酸寡糖優(yōu)選通過果膠、果膠酸鹽、藻酸鹽、軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、乙酰肝素、細(xì)菌碳水化合物、和/或唾液酸聚糖的降解而制備，更優(yōu)選通過果膠和/或藻酸鹽的降解而制備，甚至更優(yōu)選通過果膠的降解而制備，最優(yōu)選通過多聚半乳糖醛酸。優(yōu)選地，降解的果膠通過水解和/或3 -去除水果和/或植物果膠而制備的，更優(yōu)選通過蘋果、柑橘和/或甜菜果膠而制備，甚至更優(yōu)選通過經(jīng)至少一種裂解酶降解蘋果、柑橘和/或甜菜果膠而制備。優(yōu)選地，非消化性寡糖為半乳糖醛酸寡糖。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物包含基于所述組合物中糖醛酸寡糖總重的25wt. %和IOOwt. %之間，更優(yōu)選介于50wt. %和IOOwt. %之間的DP為2到250的糖醛酸寡糖，更優(yōu)選基于所述組合物中糖醛酸寡糖總重，DP為2到100，DP甚至更優(yōu)選DP為2到50，最優(yōu)選DP為2到20。在優(yōu)選實施方式中，所述糖醛酸寡糖中至少一個末端己糖醛酸單位具有雙鍵。該雙鍵有效地保護(hù)了腸上皮細(xì)胞，使其不被病原菌附著。這對嬰兒來說是有利的。優(yōu)選地，末端己糖醛酸單位之一包含C4-C5雙鍵。位于末端己糖醛酸單位的雙鍵可以通過例如裂解酶對果膠的酶促水解而獲得。糖醛酸寡糖可以由此衍生。糖醛酸寡糖可以被甲氧基化和/或酰胺化。在一個實施方式中，糖醛酸寡糖的特征在于其甲氧基化的程度高于20%，優(yōu)選高于50%，甚至更優(yōu)選高于70%。本文所用的“甲氧基化程度”(也被稱為DE或“酯化度”)的意思是指糖醛酸寡糖中包含的游離羧酸基團(tuán)已經(jīng)被酯化比如甲基化的程度。優(yōu)選地，本發(fā)明腸道組合物包含非消化性寡糖低聚反式半乳糖、低聚果糖和果膠降解產(chǎn)物。低聚反式半乳糖低聚果糖果膠降解產(chǎn)物的重量比優(yōu)選為(20至2) :1: (I至3)，更優(yōu)選為(12至7) :1:(1至2)。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及下述腸道組合物，其中非消化性寡糖選自由低聚果糖、低聚半乳糖和糖醛酸寡糖組成的組，其中糖醛酸寡糖優(yōu)選為半乳糖醛酸寡糖。本發(fā)明腸道組合物優(yōu)選包含基于所述組合物干重0. 05至20wt. %的總非消化性寡糖，更優(yōu)選0. 5至15wt. %,甚至更優(yōu)選I至IOwt. %,最優(yōu)選2. 0至IOwt. %的總非消化性寡糖?；?00ml，本發(fā)明的腸道組合物基于IOOml所述組合物優(yōu)選包含0. 01至2. 5wt. %的總非消化性寡糖，更優(yōu)選包含0. 05至I. 5wt. %，甚至更優(yōu)選包含0. 25至I. 5wt. %的總非消化性寡糖。腸道組合物本發(fā)明涉及非消化性寡糖用于增強蛋白部分水解物誘導(dǎo)的對膳食蛋白的口服耐受性，優(yōu)選在本發(fā)明的腸道組合物中，所述蛋白部分水解物的特征在于其所含肽中至少 3wt%的肽的尺寸為5kDa或更高,且至少50wt. %的肽的尺寸小于5kDa。本發(fā)明涉及非消化性寡糖用于增強蛋白部分水解物對膳食蛋白的初級過敏預(yù)防作用，在本發(fā)明的腸道組合物中，所述蛋白部分水解物的特征在于其所含肽中至少3wt%的肽的尺寸為5kDa或更高,且至少50wt. %的肽的尺寸小于5kDa。本發(fā)明涉及包含優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的非消化性寡糖和至少一種蛋白部分水解物的腸道組合物，其中所述蛋白部分水解物為乳清蛋白部分水解物，且其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物。優(yōu)選地，所述腸道組合物的蛋白部分水解物的特點在于其所含肽中至少3wt%的肽的尺寸為5kDa或更高，且至少50wt. %的肽的尺寸小于5kDa。本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選為營養(yǎng)組合物。優(yōu)選地，所述腸道組合物用于口服。如以上所說明的，本發(fā)明的腸道組合物包含蛋白部分水解物和非消化性寡糖。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的腸道組合物包含a)基于組合物干重的至少5wt.%的乳清蛋白部分水解物或至少5wt.%的所述至少一種￠-乳球蛋白肽；和《基于組合物干重至少1被％的低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖之和，其中優(yōu)選低聚半乳糖低聚果糖半乳糖醛酸寡糖的重量比為(20-4) : (0. 5-2) : I。此外，本發(fā)明所述的腸道組合物還可進(jìn)一步包含脂類(也稱為脂類組分)，特別是脂肪。本腸的腸道組合物優(yōu)選包含作為脂類的植物脂類和/或海洋生物油類，如藻類油類、細(xì)菌油類、動物油類、植物油類或魚油類。在更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的腸道組合物除非消化性寡糖之外還包含其他碳水化合物組分，如消化性碳水化合物，優(yōu)選乳糖。在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方式中，所述腸道組合物除蛋白部分水解物以外還包含其他蛋白組分，如未水解的蛋白，或優(yōu)選蛋白廣泛水解物。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的腸道組合物包含包括蛋白部分水解物在內(nèi)的蛋白組分，包括非消化性寡糖在內(nèi)的碳水化合物組分，脂質(zhì)組分，和任選的液態(tài)溶劑，如水。本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含基于總蛋白干重的至少50wt.%的動物性乳類來源的蛋白組分，更優(yōu)選至少90wt.%。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含均基于總蛋白干重的至少50wt. %牛奶來源性蛋白，更優(yōu)選至少90wt. %。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含源于糖巨肽(glycomacropeptide) dl濃度降低的酸乳清和/或甜乳清的蛋白。通常，分子量為8000Da的糖巨肽(GMP)是源自酪蛋白的乳清蛋白，其含有K-酪蛋白中第106-169個氨基酸殘基，并且通過腎素(凝乳酶)的水解作用從K-酪蛋白中釋放出來。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物包含源自￠-酪蛋白、￠-乳球蛋白和/或a-乳白蛋白的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述蛋白為跳ii、大ii和/或稻蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物包含乳清蛋白部分水解物和酪蛋白部分水解物。酪蛋白部分水解物和乳清蛋白部分水解物優(yōu)選以酪蛋白乳清的重量比為10:90到90:10存在，更優(yōu)選為20:80到80:20。本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選包含酪蛋白水解物和乳清蛋白水解物兩者，這是因為牛酪蛋白的氨基酸組成與人乳蛋白的氨基酸組成更為近似，并且乳清蛋白更加易于消化并以更高的比例存在于人乳中.本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選包含基于總熱量的5到25%的蛋白，優(yōu)選7至25%，優(yōu)選 5至20%，優(yōu)選5至16%，優(yōu)選5至12%的蛋白。總熱量數(shù)值可以根據(jù)可消化的碳水化合物、脂肪和蛋白的量來計算。基于100ml，本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選包含基于IOOml本發(fā)明的組合物0.5至
2.5wt. %白勺蛋白質(zhì)，更優(yōu)選0. 05至I. 5wt. %,甚至更優(yōu)選I至3wt. %。本發(fā)明中所用的術(shù)語“蛋白”指的是蛋白、肽和游離氨基酸的總和。本發(fā)明的腸道組合物中，每IOOml即食組合物優(yōu)選包含0. 5到6. Og蛋白，更優(yōu)選
I.0到3. 0g，甚至更優(yōu)選I. 0到2. 5g蛋白。本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選包含基于總組合物干重至少7. Owt. %的蛋白，更優(yōu)選至少8. Owt. %,最優(yōu)選至少9. Owt. %或至少10. Owt. %的蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物包含基于總組合物干重最多40wt. %的蛋白，更優(yōu)選最多15wt%，優(yōu)選最多20wt%的蛋白?；诒景l(fā)明腸道組合物干重的蛋白wt. %可以依據(jù)Kjeldahl法通過測量總氮量來計算，優(yōu)選對于酪蛋白，所用換算因數(shù)為6. 38，對于酪蛋白以外的其他蛋白，則使用6. 25作為換算因數(shù)。本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選包含基于本發(fā)明腸道組合物總蛋白干重至少50wt. %，優(yōu)選至少80wt. %，尤其是90wt. %，更優(yōu)選100%的本發(fā)明蛋白部分水解物。本發(fā)明腸道組合物中每IOOg蛋白優(yōu)選包少于IOg,更優(yōu)選少于7g的游離氨基酸。相對較低的氨基酸含量可以產(chǎn)生低滲透壓，并可因此防止胃腸道/消化系統(tǒng)的紊亂，如腹瀉。低游離氨基酸含量還進(jìn)一步具有減少苦味的作用；游離氨基酸賦予配方奶粉苦味。此外，與肽相比，腸道對游離氨基酸的吸收較差。因此，優(yōu)選限制本發(fā)明腸道組合物中游離氨基酸的量。本發(fā)明腸道組合物優(yōu)選還包含脂質(zhì)組分和蛋白組分且優(yōu)選包含消化性碳水化合物組分，所述脂質(zhì)優(yōu)選為脂肪，其優(yōu)選提供了 30到60%的總熱量，所述蛋白組分優(yōu)選提供5到20%，更優(yōu)選5到15%的總熱量，而消化性碳水化合物成分優(yōu)選提供25到75%的總熱量。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物所包含的脂質(zhì)組分提供35到50%的總熱量，蛋白組分提供6到12%的總熱量，而消化性碳水化合物組分則提供40到60%的總熱量。熱量總量由來源于蛋白、脂質(zhì)和消化性碳水化合物的熱量總和決定。
本發(fā)明的組合物不是人母乳。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物不包含活的或死的益生菌，特別是雙歧桿菌或乳酸菌。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物不包含生長因子和/或細(xì)胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物不含TGF，特別是TGF-3。本發(fā)明中的組合物優(yōu)選包含其他組分，如維他命和/或礦物質(zhì)，其優(yōu)選符合有關(guān)嬰兒配方奶粉的國際規(guī)定。在一個實施方式中，本發(fā)明的腸道組合物為干形式，例如粉末，其經(jīng)水溶液優(yōu)選用水重溶后適合用來制備液態(tài)組合物。優(yōu)選地，所述腸道組合物為粉末，優(yōu)選用水重溶。為了滿足嬰兒對熱量的需求，在本發(fā)明的腸道組合物中，每IOOml液體優(yōu)選包含50到200卡路里，更優(yōu)選每IOOml液體包含60到90卡路里，甚至更優(yōu)選每IOOml液體包含60到75卡路里。這種熱量密度確保了水與熱量消耗之間的比例為最佳。本發(fā)明的組合物的滲透壓優(yōu)選介于150和420m0smol/l之間，更優(yōu)選介于260和320m0smol/l之間。低滲透壓的目的在于降低胃腸壓力。壓力可誘發(fā)脂肪細(xì)胞的形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物為液體形式，優(yōu)選用Brookfield粘度計在20° C且剪切率為lOOs—1的條件下所測得的粘稠度低于35mPa. s，更優(yōu)選低于6mPa. S。適合地，本發(fā)明的腸道組合物的形式為粉末狀，優(yōu)選可用水將其重溶從而形成液體或濃縮液形式，濃縮液應(yīng)在水中稀釋。當(dāng)本發(fā)明的腸道組合物為液體形式時，優(yōu)選的日服用體積為每天約80到2500ml，更優(yōu)選每天約450到1000ml。應(yīng)用本發(fā)明所述的腸道組合物優(yōu)選用于嬰兒，即為嬰兒營養(yǎng)組合物。因此，優(yōu)選在生命的頭三年給受試對象服用本發(fā)明的腸道組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物為嬰兒配方奶粉或后續(xù)配方奶粉(follow-on-formula)，或為幼兒奶粉，以用于年長于嬰兒的人群。在本發(fā)明所述用途的一個實施方式中，所述腸道優(yōu)選營養(yǎng)組合物用于喂養(yǎng)或?qū)⒃摻M合物用于喂養(yǎng)年齡在0到36個月的受試對象。本發(fā)明的腸道組合物被有利地施用于0到24個月的人，更優(yōu)選0到18個月的人，最優(yōu)選0到12個月的人。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道組合物用于預(yù)防食物過敏癥。優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道優(yōu)選營養(yǎng)組合物提供人體日常所需的營養(yǎng)，組合物特別用于施用于人尤其是哺喂給人，尤其是包括較大幼兒(toddler)在內(nèi)的嬰幼兒，優(yōu)選具有發(fā)生過敏特別是具有產(chǎn)生過敏癥狀的風(fēng)險的人群。在本發(fā)明中，術(shù)語“耐受性”應(yīng)理解為特定的免疫無應(yīng)答狀態(tài)。體液(抗體)和細(xì)胞介導(dǎo)(淋巴細(xì)胞)的免疫應(yīng)答途徑都可被耐受性誘導(dǎo)抑制。口服耐受性的破壞被認(rèn)為是食物過敏的根本原因。口服免疫耐受性是指預(yù)先通過口服途徑施用抗原而產(chǎn)生的對針對該抗原的細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)的特異抑制，其很可能已演變?yōu)閷κ澄锏鞍椎某舴磻?yīng)的預(yù)防。由于口服免疫耐受性是受外源性抗原驅(qū)使的持續(xù)的天然免疫事件，其具有極大的免疫學(xué)意義。由于持續(xù)接觸粘膜的抗原具有進(jìn)入內(nèi)部環(huán)境的特權(quán)，它們代表了在異體組分和自體組分之間的界限?？诜庖吣褪苄砸蜒葑?yōu)閷⑼ㄟ^自然途徑獲得進(jìn)入身體的途徑的外部物質(zhì)當(dāng)作內(nèi)部組分，而不會產(chǎn)生危險信號，且所述外部物質(zhì)隨后成為自體的一部分?？诜庖吣褪苄缘氖Э蓺w咎于幾種基于免疫學(xué)疾病的發(fā)病和發(fā)展，所述疾病包括食物過敏癥和炎癥性腸道疾病，特別是克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。在本發(fā)明中誘導(dǎo)或獲得了耐受性，在此過程中可以通過操控免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對外部抗原的耐受性。獲得或誘導(dǎo)的耐受性指的是免疫系統(tǒng)對外界抗原的適應(yīng)，其特征在于淋巴組織對給定抗原的特異無反應(yīng)性，而在其他條件下，該抗原則極有可能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或體液免疫。本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選用于誘導(dǎo)優(yōu)選人特別是嬰兒的口服耐受性，優(yōu)選用于誘導(dǎo)免疫耐受性，最優(yōu)選用于誘導(dǎo)口服免疫耐受性。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，用于誘導(dǎo)口服耐受性的本發(fā)明的腸道組合物尤其可用于預(yù)防，優(yōu)選初級預(yù)防食物過敏，優(yōu)選牛奶過敏和/或特應(yīng)性疾病的發(fā)展，如特應(yīng)性濕疹、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎或哮喘。本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選用于誘導(dǎo)耐受性，優(yōu)選用于誘導(dǎo)人體口服耐受性，特別是針對具有產(chǎn)生過敏癥的風(fēng)險，尤其是具有產(chǎn)生食物過敏癥的風(fēng)險，尤其是食物過敏癥的癥狀的嬰兒。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的腸道組合物為低致敏性腸道組合物。在本發(fā)明具有優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的腸道組合物優(yōu)選用于預(yù)防或治療炎癥性腸道疾病。經(jīng)本文鑒定適合并經(jīng)設(shè)計用于本發(fā)明的用途的所有組合物和物質(zhì)均應(yīng)被認(rèn)為也適合并經(jīng)設(shè)計用于治療方法或喂養(yǎng)受試對象的方法，特別是有需要的人類受試對象。進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式為從屬權(quán)利要求的主體。下面還將通過非限制性實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1:在蛋白過敏癥小鼠模型中，非消化性寡糖協(xié)同增強了部分水解蛋白誘導(dǎo)針對蛋白的口服耐受性的能力。乳清獲自國際DMV(費赫爾，荷蘭)。乳清蛋白部分水解物(PWH)由達(dá)能專業(yè)營養(yǎng)研究中心(Danone Research Centre for Specialised Nutrition)按照以下具體條件通過酶促水解產(chǎn)生。將19. 5kg溫度為12 ° C的脫礦質(zhì)水(以下稱為“demi水”)放入容器中，并將其與 4.1kg 脫礦質(zhì)乳清(Deminal, Friesland Foods Domo)和1. 41kg 的lactalisNutr1-whey800 (DMV Campina)混合 30 分鐘。將溶液于78° C熱處理2分鐘。熱處理后，將產(chǎn)物冷卻至60° C。將15. 6g Ca (OH)2U. 84g Mg (OH)2,16.1g KOH 和 15. 25g NaOH 溶解于 235ml 脫礦質(zhì)水中以得到堿性溶液。在水解池中裝入12kg經(jīng)過熱處理的乳清溶液并攪拌。將溫度保持在58° C。用所述堿性溶液將水解池中的pH值調(diào)節(jié)至7. 75。將16. 8g堿性蛋白酶(Alcalase)和3. 8g風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)混合并快速加入到發(fā)酵罐中。用所述堿性溶液將PH值調(diào)節(jié)至7. 75。進(jìn)行水解180分鐘。用快速降溫結(jié)束酶解過程并將溶液冷凍。用尺寸排阻高壓液相色譜法分析所得肽以進(jìn)一步鑒定pWH。尺寸分布如下85wt.% 為〈lkD，8wt. % 為 I 到 <2kDa, 4wt. % 為 2 到 <5kDa, lwt. % 為5 到〈lOkDa, 0. 6wt. % 為 10 到 20kDa,1. 4wt. % 為 >20kDa。3到4周大的無病原體雌性C3H/He0uJ小鼠購自Charles River實驗室(馬斯特里赫特，荷蘭)，并飼以不含牛奶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)小鼠食物(AIN-93G soy, Special DietsServices, ffitham, Essex, UK)。
對小鼠飼以對照組飼料(下表I)并在第0、7、14、21和28天用含有勻漿于PBS (0. 5ml, Cambrex Bio Science,韋爾維耶，比利時)中且混合有作為佐劑的10 ii g霍亂毒素(Quadratech Diagnostics,埃普瑟姆,英國)的乳清蛋白(每只動物20mg)的鈍頭針口服敏化。未敏化小鼠則只接受霍亂毒素。在使用乳清蛋白敏化之前，用作為對照的PBS或50mg pWH對小鼠進(jìn)行口服預(yù)處理(從第-7天到第-2天，每天進(jìn)行)。為了研究包含非消化性寡糖的飼料對PWH誘導(dǎo)口服耐受性的影響，小鼠被飼以飼料(包含總和為2wt. %的反式半乳糖寡糖(來源為Vivinal-GOS)、低聚長鏈果糖(F0S，來源為RaftilinHP)和半乳糖醛酸寡糖(A0S，果膠溶解產(chǎn)物)的AING-93G soy)(下表I)。表I:小鼠飼料
g/ IOkg食物飼料#飼料# __Pl (對照)__P2 (GFA)_
碳水化合物___
_玉米淀粉__4769,820__4719,708_
糊精化玉米淀粉__1549,488__1549,488_
___1163,892__1163,892_
纖維來源(纖維素)__600,000__480,000_
___36,108__
_葡萄糖__34,512__
GOS/FOS___216,000_
_AOS___24,000_
_蛋白質(zhì)___
_大豆蛋白__2400,000__2400,000_
L-半胱氨酸__36,000__36,000_
權(quán)利要求
1.腸道組合物，其包含非消化性寡糖和至少一種蛋白部分水解物，其中所述蛋白部分水解物為乳清蛋白部分水解物，并且其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物。
2.如權(quán)利要求I所述的腸道組合物，其用于誘導(dǎo)對膳食蛋白的口服耐受性或用于預(yù)防食物過敏癥或炎癥性腸道疾病。
3.如權(quán)利要求I或2所述的腸道組合物，其中所述乳清蛋白部分水解物為￠-乳球蛋白部分水解物。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的腸道組合物，其中所述乳清蛋白部分水解物為天然的或合成的。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項所述的腸道組合物，其中所述乳清蛋白部分水解物包含至少一種￠-乳球蛋白肽，所述￠-乳球蛋白肽包含選自如下的序列SEQ ID NO USEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4，其中，所述肽的分子量優(yōu)選小于5kDa。
6.腸道組合物，其包含非消化性寡糖和至少一種￠-乳球蛋白肽，其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物，所述3 -乳球蛋白肽包含選自如下的序列SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4，其中，所述肽的分子量優(yōu)選小于5kDa，用于預(yù)防食物過敏癥或炎癥性腸道疾病。
7.腸道組合物，其包含非消化性寡糖和至少一種￠-乳球蛋白肽，其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物，所述3 -乳球蛋白肽包含選自如下的序列SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4，其中，所述肽的分子量優(yōu)選小于5kDa，用于誘導(dǎo)對膳食蛋白的口服耐受性。
8.如權(quán)利要求5至7中任一項所述的腸道組合物，其中所述至少一種￠-乳球蛋白肽可在其C-末端和/或N-末端獨立地被I至10個任意氨基酸取代。
9.如權(quán)利要求I至4中任一項所述的腸道組合物，其中所述乳清蛋白部分水解物的特性在于,其所含肽中至少3wt%的肽的尺寸為5kDa或更高，且至少50wt%的肽的尺寸小于5kDa0
10.如權(quán)利要求I至4或9中任一項所述的腸道組合物，其中所述乳清蛋白部分水解物中肽的尺寸分布為60至90%〈lkDa，5至20%為I至<2kDa，2至16%為2至<5kDa，0. 6至3%為5至<10kDa，0. 5至2%為10至20kDa且I至3%>20kDa(基于蛋白部分水解物中存在的肽的干重)。
11.如權(quán)利要求I至4、9或10中任一項所述的腸道組合物，其中所述乳清蛋白部分水解物的特性在于，尺寸為2至<5kDa的肽的相對量(wt%)與尺寸為至少5kDa的肽的相對量之間的比例為(5至I): 1，優(yōu)選為(4至I): I。
12.如權(quán)利要求I至11中任一項所述的腸道組合物，其中所述組合物包含蛋白組分、月旨類組分和消化性碳水化合物，并且其中存在的所述蛋白組分的含量為基于所述組合物總熱量的5%至25%。
13.如權(quán)利要求I至12中任一項所述的腸道組合物，其中所述組合物包含基于組合物總干重的0. 05至20wt%的非消化性寡糖。
14.如權(quán)利要求I至13中任一項所述的腸道組合物，其包含 a)基于所述組合物干重，至少5wt%的乳清蛋白部分水解物或基于所述組合物干重的至少5wt. %的至少一種P -乳球蛋白肽；和 b)基于所述組合物干重，至少1被％的低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖之和，其中低聚半乳糖低聚果糖半乳糖醛酸寡糖的重量比為(20-4) : (0. 5-2) : I。
15.如權(quán)利要求I至14中任一項所述的腸道組合物，其為嬰兒配方奶粉或后續(xù)配方奶 粉。
16.用于制備如權(quán)利要求I至15中任一項所述的口服耐受性誘導(dǎo)作用增強的腸道組合物的方法，其中將至少一種乳清蛋白部分水解物或至少一種P-乳球蛋白肽和至少一種非消化性寡糖混合在一起，并獲得口服耐受性誘導(dǎo)作用增強的組合物，其中所述非消化性寡糖為低聚半乳糖、低聚果糖和半乳糖醛酸寡糖的混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有部分水解的蛋白和非消化性寡糖的嬰兒營養(yǎng)品，用于誘導(dǎo)對天然膳食蛋白的口服耐受性。
文檔編號A23L1/308GK102984958SQ201180027538
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者利昂·馬蒂厄·約翰內(nèi)斯·克尼佩爾斯, 伊麗莎白·卡塔里娜·阿德里安娜·馬里亞·范埃施, 約翰·加森 申請人:N.V.努特里奇亞