專利名稱：核酸計數(shù)的制作方法
核酸計數(shù)相關(guān)申請本申請要求2010年6月7日提交的美國臨時申請No. 61/352,062的優(yōu)先權(quán)。美國臨時申請No. 61/352，062的公開內(nèi)容通過引用以其整體合并。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及用于可用于檢測罕見事件的核酸計數(shù)的方法和系統(tǒng)，所述罕見事件諸如胚胎非整倍性，癌檢測和感染性疾病。
背景技術(shù)：
存在于患病的細胞中的核酸的突變的早期檢測和不平衡的確定可具有重要臨床含義。例如，癌細胞可攜帶不存在于正常細胞的突變，而該突變的檢測可輔助癌的早期診斷。具有小于2個常染色體基因的正?？截惖膫€體可處于發(fā)展疾病和/或成為疾病攜帶者的增加的風(fēng)險。作為另一例，非整倍性定義為導(dǎo)致在發(fā)育的早期階段可為致死，在懷孕后期導(dǎo)致流產(chǎn)或?qū)е禄畹牡惓言械倪z傳不平衡的全染色體或染色體的部分的異常數(shù)。最頻繁和臨床顯著的非整倍性涉及單數(shù)染色體(嚴格“非整倍體性”)，其中有3個(“三體性”)或僅I個(“單體性”)，代替正常對的染色體。由此，精確的核酸計數(shù)諸如染色體可具有壽命-變化結(jié)果。因此，有對用于檢測突變和/或基因組不平衡的更精確和敏感方法的大需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于分析(例如，檢測和/或計數(shù))生物學(xué)樣品中的靶核酸的更精確的，有效和敏感方法和系統(tǒng)。尤其是，本發(fā)明提供用于基于單分子擴增和基于雜交的探查的精確的核酸分子計數(shù)的方法和系統(tǒng)。此外，本發(fā)明對于檢測罕見事件包括與疾病和病情關(guān)聯(lián)的突變是有用的。一方面，本發(fā)明提供測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量的方法。在一些實施方式中，本發(fā)明的發(fā)明的方法包括以下步驟排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個反應(yīng)位點，其中各反應(yīng)位點含有平均一個多核苷酸；擴增多個反應(yīng)位點中的多核苷酸；由核酸雜交測定(i)含有靶核酸序列、或其部分的第I反應(yīng)位點的第I數(shù)，及(ii)含有參照核酸序列、或其部分的第2反應(yīng)位點的第2數(shù)；及比較第I反應(yīng)位點的第I數(shù)與第2反應(yīng)位點的第2數(shù)以測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量。與已之前描述的其他方法，諸如大規(guī)模并行測序相反，本發(fā)明提供用于測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量的更快的，更有效和欠昂貴的方法。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包括提供在PCR基質(zhì)上在PCR克隆(PCR集落)中排列的5百萬拷貝的基因組信息；各用不同可檢測的標記物標記的用于期望的序列的百萬的PCR探針可然后與基質(zhì)雜交；移出過量標記物，及各可檢測的標記物的數(shù)和同一性可通過知道的方法測定；靶核酸的相對量可通過針對知道的參照序列標準化靶序列的比來測定，如已之前描述。在另一方面，本發(fā)明的實施方式可用作用于由血清篩選具有陽性結(jié)果的患者或用于被認為“高風(fēng)險”的患者的另外的出生前篩選工具。本發(fā)明的實施方式，如在本文詳細描述，可在早至4 6周妊娠的頭三個月期間利用。在其他實施方式中，本發(fā)明的方法可在大致12周妊娠陽性血清篩選之后利用。本發(fā)明的實施方式可呈現(xiàn)100%靈敏度，有小于1%假陽性。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包括以下步驟排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個擴增位點，其中各擴增位點含有平均一個多核苷酸；擴增多個擴增位點中的多核苷酸以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；使擴增產(chǎn)物與特異于多個檢測位點中的(i)靶核酸、或其部分，及(ii )參照核酸、或其部分的核酸探針雜交，其中各檢測位點含有平均一個來自擴增產(chǎn)物的多核苷酸；測定(i)含有與靶核酸、或其部分雜交的探針的第I檢測位點的第I數(shù)，及
(11)含有與參照核酸、或其部分雜交的探針的第2檢測位點的第2數(shù)；及比較第I檢測位點的第I數(shù)與第2檢測位點的第2數(shù)以測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法還在雜交步驟之前包括收獲擴增產(chǎn)物的步驟。在一些實施方式中，雜交步驟用微陣列實施。在一些實施方式中，排列步驟通過使用固體，半-固體和/或液體支持物實施。在一些實施方式中，排列步驟在固體支持物上實施。在一些實施方式中，適合的固體支持物選自玻璃，光學(xué)纖維，氧化硅，微芯片，塑料，珠；生物膜，纖維素。在一些實施方式中，排列步驟包括使用流動細胞技術(shù)的步驟。在一些實施方式中，排列步驟包括在凝膠基質(zhì)之內(nèi)分布核酸分子收集物的步驟。在一些實施方式中，排列步驟包括使核酸分子收集物與乳劑珠混合的步驟。在一些實施方式中，支持物包含多個其上固定的捕獲部分以捕獲個體多核苷酸。在一些實施方式中，捕獲部分包 含捕獲寡核苷酸。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法還包括首先處理多核苷酸使得個體多核苷酸在5’和3’端含有適配體序列的步驟，其中適配體序列在支持物上與固定的捕獲寡核苷酸雜交。在一些實施方式中，擴增步驟包括實施PCR反應(yīng)。在一些實施方式中，擴增步驟包括實施滾環(huán)擴增。在一些實施方式中，待計數(shù)的靶核酸是靶染色體。在一些實施方式中，靶染色體選自第X，Y，13，18或21染色體。在其他實施方式中，靶染色體可包含第4，5，8，9，11，15，16，17或22染色體。在一些實施方式中，參照核酸是參照染色體。在一些實施方式中，參照染色體是第1，2,6，11, X, Y, 13,18或21染色體。在其他實施方式中，參照染色體可包含第4，5，8，9，11，15，16，17 或 22 染色體。在一些實施方式中，祀核酸含有突變。在一些實施方式中，突變選自單核苷酸多態(tài)性(SNP)，缺失，插入，復(fù)制和其組合。在一些實施方式中，待分析的生物學(xué)樣品含有過豐或亞豐的靶核酸。在一些實施方式中，生物學(xué)樣品含有非整倍體染色體。在一些實施方式中，適合的特異于靶核酸、或其部分的核酸探針特異于單個座位。在一些實施方式中，適合的特異于靶核酸、或其部分的核酸探針特異于多個座位。在一些實施方式中，將適合的特異于靶核酸、或其部分的核酸探針多重化。在替代實施方式中，適合的多重化的探針包含2 10，000個探針。在一些實施方式中，適合的多重化的探針包含約200，或 300，或 400，或 500，或 600，或 700，或 800，或 900，或 I, 000，或 I, 500，或 2，000，或2，500，或 3，000，或 3，500，或 4，000，或 5，000，或 6，000，或 7，000，或 8，000，或 9，000 個探
針。在一些實施方式中，適合的多重化的探針包含約500個探針。在一些實施方式中，適合的特異于參照核酸、或其部分的核酸探針特異于單個座位。在一些實施方式中，適合的特異于靶核酸、或其部分的核酸探針特異于多個座位。在一些實施方式中，將適合的特異于參照核酸、或其部分的核酸探針多重化。在替代實施方式中，適合的多重化的探針包含2 10，000個探針。在一些實施方式中，適合的多重化的探針包含約 200，或 300，或 400，或 500，或 600，或 700，或 800，或 900，或 I, 000，或 I, 500，或2，000，或 2，500，或 3，000，或 3，500，或 4，000，或 5，000，或 6，000，或 7，000，或 8，000，或9，000個探針。在一些實施方式中，適合的多重化的探針包含約500個探針。在一些實施方式中，特異于靶核酸、或其部分的探針，及特異于參照核酸、或其部分的探針，用特殊地可檢測的信號標記。在一些實施方式中，特殊地可檢測的信號是不同光信號。在一些實施方式中，不同光信號是不同突光或發(fā)光信號。在一些實施方式中，測定步驟包括測定靶核酸的相對拷貝數(shù)。在一些實施方式中，測定靶核酸的相對拷貝數(shù)的步驟包括以下步驟(a)測定指示含有靶核酸、或其部分的檢測位點的第I數(shù)的第I熒光信號水平，將其相對背景信號標準化；(b)測定指示含有參照核酸、或其部分的檢測位點的第2數(shù)的第2熒光信號水平，將其相對背景信號標準化；(C)測定第I熒光信號水平與第2熒光信號水平的比；及((1)通過相對特異于靶核酸的探針數(shù)和特異于參照核酸的探針數(shù)之間的比標準化在步驟(c)中測定的比來測定靶核酸的相對拷貝數(shù)。在一些實施方式中，自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以小于一個基因組當(dāng)量的量含有基因組DNA。在一些實施方式中，擴增產(chǎn)物以預(yù)定的水平的基因組當(dāng)量含有擴增的基因組DNA。 在一些實施方式中，祀核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于1%。在一些實施方式中，祀核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于O.10Zoο在一些實施方式中,祀核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于I百萬分之I。在一些實施方式中，靶核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于I千萬分之I?；蛘?，自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸可落入這些范圍之內(nèi)。在一些實施方式中，靶核酸源于胚胎細胞。在一些實施方式中，靶核酸包含胚胎染色體。在一些實施方式中，靶核酸源于可為相同的來源或可為不同來源的患病的細胞(例如，癌細胞)或多個癌細胞(例如，原發(fā)性癌和轉(zhuǎn)移)。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法還在排列步驟之前包括全基因組擴增的步驟。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法還包括測定是否靶核酸的相對量相比對照異常的步驟。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于檢測與異常量的靶核酸關(guān)聯(lián)的疾病，病癥或病情，或其攜帶者。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于胚胎非整倍性的出生前診斷。在一些實施方式中，適合的生物學(xué)樣品選自細胞，組織，全血，血漿，血清，尿，糞便，唾液，臍帶血，絨毛膜絨毛樣品，絨毛膜絨毛樣品培養(yǎng)物，羊水，羊水培養(yǎng)物，經(jīng)子宮頸灌洗液，及其組合?；蛘呖墒褂闷渌飳W(xué)樣品(例如，組織活組織檢查)。在另一方面，本發(fā)明也提供用于實施本文所述的各種方法的系統(tǒng)。在一些實施方式中，本發(fā)明提供測定靶核酸的相對量的系統(tǒng)，包含為擴增在多個擴增位點上的多核苷酸以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的組分；為實施擴增產(chǎn)物與用特異于靶核酸、或其部分的第I可檢測的信號標記的探針，及用特異于參照核酸、或其部分的第2可檢測的信號標記的探針的雜交的組分；適應(yīng)于測定第I可檢測的信號的水平，及測定第2可檢測的信號的水平的組分(例如，測定模塊)；配置為存儲來自測定模塊的信號信息和由用戶提供的指示特異于靶核酸、或其部分的探針數(shù)，及特異于參照核酸、或其部分的探針數(shù)的信息的組分(例如，存儲裝置);及適應(yīng)于計算第I可檢測的信號的水平與第2可檢測的信號的水平的比及通過相對特異于靶核酸、或其部分的探針數(shù)和特異于參照核酸、或其部分的探針數(shù)之間的比標準化信號水平比來測定靶核酸的相對量的組分(例如，計算模塊)。在仍另一方面，本發(fā)明提供用于檢測在生物學(xué)樣品中的罕見事件的方法和系統(tǒng)。在一些實施方式中，本發(fā)明提供檢測生物學(xué)樣品中的靶核酸的方法，包括排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個反應(yīng)位點，其中各反應(yīng)位點含有平均一個多核苷酸；擴增多個反應(yīng)位點中的多核苷酸以產(chǎn)生多個簇使得各簇含有擴增的核酸產(chǎn)物；及通過使用一種或更多特異于靶核酸的探針雜交檢測含有靶核酸、或其部分的簇或反應(yīng)位點，由此檢測生物學(xué)樣品中的靶核酸。本文所述的各替代實施方式指稱任何本發(fā)明的方法或系統(tǒng)，除非另外陳述。在本申請中，使用“或”是指“和/或”除非另外陳述。如在本申請中使用，術(shù)語“包含(comprise)”和該術(shù)語的變異，諸如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”,未旨在排除其他添加劑，組分，整體或步驟。如在本申請中使用，術(shù)語“約”和“大致”用作相當(dāng)體。本申請中使用的有或無/大致的任何數(shù)字意指含蓋由關(guān)聯(lián)領(lǐng)域普通技術(shù)人員同意的任何正常波動。在特定實施方式中，術(shù)語“大致”或“約”指稱以任意方向(大于或小于)落入陳述的參照值的 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%,4%，3%，2%，1%或更小范圍的一系列值，除非另外陳述或自情景另外明白(除非該數(shù)會超過可能的值的100%)。其他特征，本發(fā)明 的目的和優(yōu)勢在以下詳述和權(quán)利要求中顯而易見。但是，應(yīng)明白，詳述，及權(quán)利要求，在指示本發(fā)明的實施方式的同時，由僅例證，而非限制的方式給予。本發(fā)明的范圍之內(nèi)的各種變化和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員會變得顯而易見。定義為了本發(fā)明更容易明白，以下首先定義特定術(shù)語。以下術(shù)語和其他術(shù)語的另外的定義貫穿說明書給出。等位基因如本文所用，短語“等位基因”與“等位基因變體”互換使用及指稱座位或基因的變體。在一些實施方式中，座位或基因的特定等位基因相關(guān)于特定表型，例如，改變的發(fā)展疾病或病情的風(fēng)險，進展為特定疾病或病情階段的似然性，依從于特定治療劑，對感染的感受性，免疫功能，等。擴增如本文所用，術(shù)語“擴增”指稱本領(lǐng)域知道的任何拷貝靶核酸的方法，由此增加選擇的核酸序列的拷貝數(shù)。擴增可為指數(shù)或線性擴增。靶核酸可為DNA或RNA。一般而言，以此方式擴增的序列形成“擴增子”。擴增可用各種方法實現(xiàn)，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)，基于轉(zhuǎn)錄的擴增，等溫擴增，滾環(huán)擴增，等。擴增可用相對類似量的引物對的各引物實施，以產(chǎn)生雙鏈擴增子。但是，不對稱PCR可用于擴增主要或完全單鏈產(chǎn)物，如為本領(lǐng)域所熟知(例如，Poddar et al. Molec. And Cell. Probes 14: 25-32 (2000))。此可通過使用各引物對通過相對于對的另一引物顯著減少一個引物的濃度(例如，100倍差異)來達到。由不對稱PCR的擴增通常是線性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，不同擴增方法可一起使用。非整倍性如本文所用，術(shù)語“非整倍性”指稱異常數(shù)的全染色體或部分染色體。一般而言，非整倍性導(dǎo)致遺傳不平衡，其在發(fā)育的早期階段可為致死，在隨后懷孕中導(dǎo)致流產(chǎn)或?qū)е禄畹牡惓言?。最頻繁的和臨床顯著非整倍性涉及單染色體(嚴格意義上“非整倍體性”)，其中有3個(“三體性”)或僅一個(“單體性”)代替正常對的染色體。動物如本文所用，術(shù)語“動物”指稱動物界的任何成員。在一些實施方式中，“動物”指稱人，在發(fā)育的任何階段，包括尚未出生的人(例如，胎兒)。在一些實施方式中，“動物”指稱非-人動物，在發(fā)育的任何階段。在特定實施方式中，非-人動物是哺乳動物(例如，嚙齒動物，小鼠，大鼠，兔，猴，狗，貓，綿羊，牛，靈長類動物，和/或豬)。在一些實施方式中，動物包括，但不限于，哺乳動物，鳥，爬行動物，兩棲動物，魚，昆蟲和/或蠕蟲。在一些實施方式中，動物可為轉(zhuǎn)基因動物，遺傳-加工的動物和/或克隆。大致如本文所用，如對一個或更多目標值應(yīng)用的術(shù)語“大致”或“約”指稱近似于陳述的參照值的值。在特定實施方式中，術(shù)語“大致”或“約”指稱以任意方向(大于或小于)落入陳述的參照值的 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%，10%, 9%, 8%, 7%,6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小范圍的一系列值，除非另外陳述或自情景另外明白(除非該數(shù)會超過可能的值的100%)。生物學(xué)樣品如本文所用，術(shù)語“生物學(xué)樣品”包括自生物學(xué)來源獲得的任何樣品。生物學(xué)樣品可，由非限制性例的方式，包括血，羊水，血清，尿，糞便，表皮樣品，皮膚樣品，頰拭子，精子，羊水，培養(yǎng)的細胞，骨髓樣品，組織活組織檢查和/或絨毛膜絨毛。方便的生物學(xué)樣品可由，例如，自口腔前庭的表面刮細胞來獲得。任何生物學(xué)樣品的細胞培養(yǎng)也可用作生物學(xué)樣品，例如，絨毛膜絨毛 樣品和/或羊水培養(yǎng)諸如羊水細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)。生物學(xué)樣品也可為，例如，自，可包含細胞(無論原代細胞或培養(yǎng)的細胞)的任何器官或組織(包括活組織檢查或尸檢樣本)獲得的樣品，根據(jù)任何細胞，組織或器官，組織培養(yǎng)物調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。在一些實施方式中，適合于本發(fā)明的生物學(xué)樣品是已處理而釋放或另外使得用于本文所述的檢測核酸可利用的樣品。適合的生物學(xué)樣品可從生命的階段諸如胎兒，年輕成年，成年(例如，懷孕的女性)等得到。也可使用固定的或冷凍的組織。術(shù)語“生物學(xué)樣品”和“生物學(xué)樣本”互換使用。攜帶者如本文所用，短語“攜帶者”指稱包含遺傳突變或等位基因變體，但不顯示與遺傳突變或等位基因變體關(guān)聯(lián)的疾病的癥狀的個體。但是，攜帶者，一般能將遺傳突變或等位基因變體傳遞給它們的后代，這些后代可然后表達突變的基因或等位基因變體。一般而言，此現(xiàn)象是許多基因的隱性性質(zhì)的結(jié)果。在特定實施方式中，攜帶者帶有的突變或等位基因變體易感或相關(guān)于特定表型，例如，改變的發(fā)展疾病或病情的風(fēng)險，進展為特定疾病或病情階段的似然性，對特定治療劑的依從性，對感染的感受性，免疫功能，等。無限制，攜帶者可具有減少的或增加的基因或部分基因的拷貝數(shù)。攜帶者也可在基因之內(nèi)包含突變(例如，點突變，多態(tài)性，缺失，插入或轉(zhuǎn)位，等)?！皵y帶者”也在本文稱為“遺傳攜帶者”?？截悢?shù)如本文所用，短語“拷貝數(shù)”當(dāng)參照座位使用時，指稱每基因組或基因組相當(dāng)體上存在的該座位的拷貝數(shù)?！罢？截悢?shù)”當(dāng)參照座位使用時，指稱存在于正常個體的正?；蛞吧偷任换虻目截悢?shù)。在特定實施方式中，拷貝數(shù)是O 2，包括端點。在特定實施方式中，拷貝數(shù)是O 3，O 4，O 6，O 7，或O 多于7拷貝，包括端點。在座位的拷貝數(shù)在群中個體間變化大的實施方式中，為計算和/或比較目的，可取估計的中位拷貝數(shù)作為“正常拷貝數(shù)”。編碼序列對比非-編碼序列如本文所用，術(shù)語“編碼序列”指稱可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而產(chǎn)生mRNA和/或其多肽或片段的核酸或其補體，或其一部分的序列。編碼序列包括基因組DNA或未成熟的初級RNA轉(zhuǎn)錄物中的外顯子，其由細胞的生物化學(xué)機械接合在一起而提供成熟mRNA。反義鏈是該核酸的補體，而編碼序列可由其推導(dǎo)。如本文所用，術(shù)語“非-編碼序列”指稱不體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成氨基酸，或其中tRNA不相互作用而放置或嘗試放置氨基酸的核酸或其補體，或其一部分的序列。非-編碼序列包括基因組DNA或未成熟的初級RNA轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子序列，及基因-關(guān)聯(lián)的序列諸如啟動子，增強子，沉默子，等。補體如本文所用，術(shù)語“補體”，“互補”和“互補”指稱根據(jù)Watson/Crick配對規(guī)則的核苷酸序列的配對。例如，序列5’ -GCGGTCCCA-3’具有5’ -TGGGACCGC-3’的互補序列。補體序列也可為與DNA序列互補的RNA的序列。不通常見于天然的核酸的特定堿基可包括在互補核酸中，包括但不限于肌苷，7-脫氮鳥嘌呤，鎖核酸(LNA)，及肽核酸(PNA)?；パa性不必需是完美的；穩(wěn)定的雙聯(lián)體可含有錯配的堿基對，簡并體或不匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可考慮許多變量包括，例如，寡核苷酸長度，寡核苷酸的堿基組成和序列，離子強度和錯配的堿基對的發(fā)生率，依經(jīng)驗測定雙聯(lián)穩(wěn)定性。對照如本文所用，術(shù)語“對照”具有其領(lǐng)域-明白的含義，即為針對其比較結(jié)果的標準物。一般而言，對照用于通過分離變量增加實驗中的完整性，以便得到關(guān)于該變量的結(jié)論。在一些實施方式中，對照是與測試反應(yīng)或測定同時實施以提供比較的反應(yīng)或測定。在一實驗中，應(yīng)用“測試”(即，測試的變量)。在第2實驗中，“對照”，未應(yīng)用測試的變量。在一些實施方式中，對照是歷史對照(即，之前實施的測試或測定，或之前知道的量或結(jié)果)。在一些實施方式中，對照是或包含打印的或另外保存的記錄。對照可為陽性對照或陰性對照。粗產(chǎn)物如 本文所用，術(shù)語“粗產(chǎn)物”，當(dāng)使用關(guān)聯(lián)生物學(xué)樣品時，指稱處于基本上未精制的狀態(tài)的樣品。例如，粗產(chǎn)物樣品可為細胞裂解物或活組織檢查組織樣品。粗產(chǎn)物樣品可存在于溶液或作為干制備物。缺失如本文所用，術(shù)語“缺失”包括自天然存在的核酸移出一個或更多核苷酸的突變。偵賭如本文所用，術(shù)語“側(cè)接”意指與鄰接尋求在靶上擴增的目標區(qū)的靶核酸雜交的引物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，優(yōu)選的引物是自目標區(qū)3’雜交的引物對，每一個在靶雙鏈DNA分子的各鏈，使得核苷酸可由適合的DNA聚合酶添加到引物的3’端?；蛉绫疚乃茫g(shù)語“基因”指稱負責(zé)離散的細胞(例如，細胞內(nèi)或細胞外)產(chǎn)物和/或功能的離散的核酸序列。更特別，術(shù)語“基因”指稱包括編碼蛋白的部分和任選地包括調(diào)控序列，諸如啟動子，增強子，終止子，等，其涉及由目標基因編碼的蛋白的表達的調(diào)節(jié)的核酸。如本文所用，術(shù)語“基因”也可包括不編碼蛋白而是提供功能RNA分子諸如tRNA，rRNA，等的轉(zhuǎn)錄用模板的核酸。或者，基因可限定特定事件/功能的基因組位置，諸如蛋白和/或核酸結(jié)合位點。
基因型如本文所用，術(shù)語“基因型”指稱生物的遺傳體質(zhì)。更特別，術(shù)語指稱存在于個體的等位基因的鑒定。個體或DNA樣品的“基因分型”指稱鑒定由個體在知道的多態(tài)位點具有的2個等位基因的關(guān)于核苷酸堿基的性質(zhì)。雜合如本文所用，術(shù)語“雜合”或“HET”指稱具有相同的基因的2個不同等位基因的個體。如本文所用，術(shù)語“雜合”包括“復(fù)合雜合”或“復(fù)合雜合突變體”。如本文所用，術(shù)語“復(fù)合雜合”指稱具有2個不同等位基因的個體。如本文所用，術(shù)語“復(fù)合雜合突變體”指稱具有等位基因的2個不同拷貝的個體，該等位基因特征在于基因的突變形式。本文所用的術(shù)語“突變體”指稱突變的，或潛在地非-功能形式的基因。純合如本文所用，術(shù)語“純合”指稱具有2拷貝的相同的等位基因的個體。如本文所用，術(shù)語“純合突變體”指稱具有2拷貝的相同的等位基因的個體，該等位基因特征在于基因的突變形式。本文所用的術(shù)語“突變體”指稱突變的，或潛在地非-功能形式的基因。雜交如本文所用，術(shù)語“雜交(hybridize)”或“雜交(hybridization)”指稱其中2個互補核酸鏈在適當(dāng)嚴格條件下彼此退火的過程。適合于雜交的寡核苷酸或探針一般含有長度10 100個核苷酸(例如，長度18 50，12 70，10 30，10 24，18 36個核苷酸)。核酸雜交技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。見，例如，Sambrook, et al, 1989,分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港出版社，Plainview, N. Y。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白如何估計及調(diào)整雜交條件的嚴格度，使·得具有至少期望的水平的互補性的序列會穩(wěn)定地雜交，而具有更低互補性的那些不會。作為雜交條件和參數(shù)的例，見，例如，Sambrook，等人，1989，分子克隆實驗室手冊，第 2 版,冷泉港出版社,Plainview, N. Y. ；Ausubel, F. M. et al。1994, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N. J0個別溶解的如本文所用，術(shù)語“個別溶解的”在本文用于指示，當(dāng)可視化時，可能自其相鄰聚合物或克隆區(qū)別一個聚合物或克隆?？梢暬赏ㄟ^使用報告子標記物，例如熒光團實現(xiàn)，其信號個別解析。對個體分辨的需求確?？稍诟骱铣刹襟E檢測個體單體并合。插入或添加如本文所用，術(shù)語“插入”或“添加”指稱導(dǎo)致相比天然存在的分子，分別添加一個或更多氨基酸殘基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的變化。體外如本文所用，術(shù)語“體外”指稱在人工環(huán)境中，例如，在試管或反應(yīng)容器中，在細胞培養(yǎng)中，等，而非在多-細胞生物之內(nèi)發(fā)生的事件。體內(nèi)如本文所用，術(shù)語“體內(nèi)”指稱在多-細胞生物諸如非-人動物之內(nèi)發(fā)生的事件。分離的如本文所用，術(shù)語“分離的”指稱已(I)自當(dāng)起初產(chǎn)生(無論在自然界中和/或在實驗環(huán)境中)時與之關(guān)聯(lián)的至少一些組分分離的，和/或(2)由人工產(chǎn)生的，制備的和/或生產(chǎn)的物質(zhì)和/或?qū)嶓w。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可從起初與它們關(guān)聯(lián)的至少約10%，約 20%，約 30%，約 40%，約 50%，約 60%，約 70%，約 80%，約 90%，約 95%，約 98%，約 99%，基本上100%或100%的其他組分分離。在一些實施方式中，分離的劑是大于約80%，約85%，約90%，約 91%，約 92%，約 93%，約 94%，約 95%，約 96%，約 97%，約 98%，約 99%，基本上 100% 或 100%純。如本文所用，如果其是基本上無其他組分，物質(zhì)是“純”的。如本文所用，術(shù)語“分離的細胞”指稱不含于多-細胞生物的細胞。標記的術(shù)語“標記的”和“用可檢測的劑或部分標記的”在本文互換所用，以特定實體(例如，核酸探針，抗體，等)可被可視化，例如在結(jié)合另一實體(例如，核酸，多肽，等)后。可選擇可檢測的劑或部分，使得其產(chǎn)生可測量的信號，且其強度與結(jié)合的實體量相關(guān)(例如，成比例)。用于標記和/或檢測蛋白和肽的廣泛的系統(tǒng)為本領(lǐng)域所知。標記的蛋白和肽可由并合，或綴合于由光譜，光化學(xué)，生物化學(xué)，免疫化學(xué)，電，光學(xué)，化學(xué)或其他手段可檢測的標記物來制備。標記物或標記部分可為直接可檢測的(即，其不需要待可檢測的任何進一步反應(yīng)或操作，例如，熒光團是直接可檢測的)或其可為間接可檢測的(即，其通過與可檢測的另一實體反應(yīng)或結(jié)合而變得可檢測，例如，半抗原在與包含報告子諸如熒光團的適當(dāng)?shù)目贵w反應(yīng)后可通過免疫染色檢測)。適合的可檢測的劑包括，但不限于，放射性核素，熒光團，化學(xué)發(fā)光劑，微粒，酶，比色標記物，磁標記物，半抗原，分子信標，適體信標
坐寸O座位如本文所用，術(shù)語“座位”指稱染色體上特定DNA序列的特定位置。如本文所用，特定DNA序列可為任何長度(例如，1，2，3，10, 50或更多核苷酸)。在一些實施方式中，座位是或包含基因或部分基因。在一些實施方式中，座位是或包含基因的外顯子或部分外顯子。在一些實施方式中，座位是或包含基因的內(nèi)含子或部分內(nèi)含子。在一些實施方式中，座位是或包含基因的調(diào)控元件或部分調(diào)控元件。在一些實施方式中，座位相關(guān)于疾病，病癥和/或病情。例如，在座位的突變(包括缺失，插入，剪接突變，點突變，等)可與疾病，病癥和/或病情相關(guān)。核型分析如本文所用，術(shù)語“核型分析”包括真核生物細胞中的染色體數(shù)的確定。正常如本文所用，術(shù)語“正常”，當(dāng)用以修飾術(shù)語“拷貝數(shù)”或“座位”或“基因”或“等位基因”時，指稱在群中以最高百分率存在的拷貝數(shù)或座位，基因或等位基因，例如，野生型數(shù)或等位基因。當(dāng)用以修飾術(shù)語“個體”或“受試者”時，它們指稱攜帶在群中以最高百分率存在的拷貝數(shù)或座位，基因或等位基因的個體或個體的組，例如，野生型個體或受試者。一般而言，正?！皞€體”或“受試者”不具有特定疾病或病情，且也不是疾病或病情的攜帶者。術(shù)語“正?！币苍诒?文用以定性自正常或野生型個體或受試者分離的生物學(xué)樣本或樣品，例如，“正常生物學(xué)樣品”。多重PCR:如本文所用，術(shù)語“多重PCR”指稱各通過使用不同引物對引發(fā)的2個或更多區(qū)的擴增。弓丨物如本文所用，術(shù)語“引物”指稱能與核酸樣品中的互補序列雜交的短單鏈寡核苷酸。一般而言，引物作為模板依賴性DNA合成的起始點?？蓪⒚撗鹾颂呛塑账嵊蒁NA聚合酶加入引物。在一些實施方式中，該脫氧核糖核苷酸添加到引物也被稱為引物延伸。術(shù)語引物，如本文所用，包括可為合成的全部形式的引物，包括肽核酸引物，鎖核酸引物，硫代磷酸酯修飾的引物，標記的引物等。對于PCR反應(yīng)，“引物對”或“引物組” 一般指稱一般包括“正向引物”和“反向引物”的一組引物。如本文所用，“正向引物”指稱退火到dsDNA的反義鏈的引物。“反向引物”退火到dsDNA的正義鏈。多態(tài)性如本文所用，術(shù)語“多態(tài)性”指稱多于一種形式的基因或其部分的共存。探針如本文所用，術(shù)語“探針”，當(dāng)參照核酸探針使用時，指稱具有可與目標核酸結(jié)合或雜交的特定核苷酸序列(例如，RNA或DNA)的核酸分子。一般而言，探針通過一種或更多類型的化學(xué)鍵，通常通過氫鍵形成特異性結(jié)合(或特異性雜交)互補或基本上互補序列的核酸。在一些實施方式中，探針可在實時PCR反應(yīng)中結(jié)合DNA擴增子的核酸。正義鏈對比反義鏈如本文所用，術(shù)語“正義鏈”指稱包括功能蛋白的至少部分編碼序列的雙鏈DNA (dsDNA)的鏈。如本文所用，術(shù)語“反義鏈”指稱是正義鏈的反向互補體的dsDNA鏈。信號如本文所用，術(shù)語“信號”指稱可檢測的和/或可測量的實體。在特定實施方式中，信號是由人眼可檢測的，例如，可見。例如，信號可為或可涉及可見光譜中顏色的強度和/或波長。該信號的非限制性例包括自化學(xué)反應(yīng)諸如酶促反應(yīng)得到的著色的沉淀物及著色的可溶性產(chǎn)物。在特定實施方式中，信號是使用設(shè)備可檢測的。在一些實施方式中，信號由當(dāng)激發(fā)時發(fā)射熒光的熒光團產(chǎn)生，其中光是用熒光檢測器可檢測的。在一些實施方式中，信號是或涉及由分光光度計可檢測的光(例如，可見光和/或紫外線光)。例如，可將由化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光用作信號。在一些實施方式中，信號是或涉及輻射，例如，由放射性同位素發(fā)射的輻射，紅外線輻射，等。在特定實施方式中，信號是物理實體的性質(zhì)的直接或間接指示物。例如，可將信號用作生物學(xué)樣品中和/或反應(yīng)容器中核酸的量和/或濃度的指示物。特定如本文所用，術(shù)語“特異性”，當(dāng)關(guān)聯(lián)寡核苷酸引物使用時，指稱在適當(dāng)?shù)碾s交或洗滌條件下，能與目標靶雜交及基本上不與非目標核酸雜交的寡核苷酸或引物。更高水平的序列同一性優(yōu)選及包括至少60%，65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%，96%，97%，98%，99%或100%序列同一性。在一些實施方式中，當(dāng)比對寡核苷酸和核酸時，特定寡核苷酸或引物含有與待雜交或擴增的部分核酸具有序列同一性的至少4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50，55，60，65，70 或更多堿基。受試者如本文所用，術(shù)語“受試者”指稱人或任何非-人動物(例如，小鼠，大鼠，兔，狗，貓，牛，豬，綿羊，馬或靈長類動物)。人包括出生前和出生后形式。在許多實施方式中，受試者是人。受試者可為患者，其指稱送到用于診斷或治療疾病的醫(yī)療提供者的人。術(shù)語“受試者”在本文與“個體”或“患者”互換使用。受試者可患或敏感于疾病或病癥,但可或可不顯示疾病或病癥的癥狀?；旧先绫疚乃?，術(shù)語“基本上”指稱呈現(xiàn)總或接近-總程度或目標特征或性質(zhì)的程度的定性條件。生物學(xué) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會明白，生物學(xué)和化學(xué)現(xiàn)象罕見，即便有，完成和/或進行到完全性或達到或避免絕對結(jié)果。因此，本文所用的術(shù)語“基本上”捕獲在許多生物學(xué)和化學(xué)現(xiàn)象中固有的完全性的潛在缺乏?；旧匣パa如本文所用，術(shù)語“基本上互補”指稱可在嚴格雜交條件下雜交的2個序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，基本上互補序列需求沿著它們的全長不雜交。在一些實施方式中，“嚴格雜交條件”指稱至少如以下嚴格的雜交條件在50%甲酰胺，5XSSC，50mMNaH2PO4,pH6. 8,0. 5% SDS,0. lmg/mL超聲處理鮭魚精子DNA，及 5X Denhart 氏溶液中于42°C過夜雜交；用2XSSC，0. 1% 305于451洗滌；及用0.2\55(，0.1% SDS于45°C洗滌。在一些實施方式中，嚴格雜交條件應(yīng)不允許在20個連續(xù)的核苷酸的延伸物上多于2個堿基不同的2個核酸的雜交。取代如本文所用，術(shù)語“取代”指稱相比天然存在的分子，一個或更多氨基酸或核苷酸分別被不同氨基酸或核苷酸取代?；家驯辉\斷“患”疾病，病癥和/或病情或顯示疾病,病癥和/或病情的一種或更多癥狀的個體。靈敏于未被診斷為疾病,病癥和/或病情的“敏感于”疾病，病癥和/或病情的個體。在一些實施方式中,敏感于疾病,病癥和/或病情的個體可不呈現(xiàn)疾病，病癥和/或病情的癥狀。在一些實施方式中，敏感于疾病，病癥和/或病情的個體會發(fā)展疾病，病癥和/或病情。在一些實施方式中，敏感于疾病，病癥和/或病情的個體會不發(fā)展疾病，病癥和/或病情。野生型如本文所用，術(shù)語“野生型”指稱自然界存在的典型或最常見的形式。發(fā)明詳述本發(fā)明提供，尤其是，用于分析(例如，檢測和/或計數(shù))生物學(xué)樣品中的靶核酸的方法和系統(tǒng)。一般而言，本發(fā)明涉及使用基于雜交的探查的含有靶核酸或其部分的擴增產(chǎn)物的單分子擴增和檢測。在一些實施方式中，適合的探針可多重化到高水平，和可通過標記物諸如尤其是熒光，比色，發(fā)光等手段檢測。由此，本發(fā)明提供檢測生物學(xué)樣品中的靶核酸的靈敏的方法。本發(fā)明是對于檢測作為在生物學(xué)樣品中的罕見事件存在的靶核酸特別有用的，所述罕見事件例如，尤其是與胚胎病情關(guān)聯(lián)的突變，疾病諸如癌，感染性疾病，自身免疫疾病，與移植物或胚胎植入物關(guān)聯(lián)的免疫學(xué)病情。在一些實施方式中，可將探針用可歸因于不同核酸的不同色彩標記(例如，靶對比參照)，使得擴增產(chǎn)物可歸因于不同核酸(例如，靶對比參照)及計數(shù)。由此，本發(fā)明的方法也可用于測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量，例如，生物學(xué)樣品中靶和參照核酸之間的t匕。在一些實施方式中，探針可深深多重化，及用可歸因于不同染色體的不同色彩標記，使得擴增產(chǎn)物可歸因于不同染色體及計數(shù)。歸因于不同染色體的產(chǎn)物的比的差異可用于診斷非整倍體懷孕。由此，本發(fā)明是尤其有利的，因為其提供多重座位檢測的能力，和由此使得尤其有效使用珍貴的樣本，超過通過多重化TAQMAN探針或本領(lǐng)域知道的其他既有方法所能達到。在許多實施方式中，本發(fā)明可關(guān)于樣本使用達到與單分子的高通量測序相同的水平的效率，但達到這些結(jié)果更廉價 和快速得多。本發(fā)明的各方面在以下部分詳細描述。部分的使用未意指限制本發(fā)明。各部分可應(yīng)用于本發(fā)明的任何方面。在本申請中，“或”是指“和/或”，除非另外陳述。靶核酸及關(guān)聯(lián)的遺傳疾病，病癥和病情本發(fā)明可用于檢測任何類型的靶核酸。在一些實施方式中，本發(fā)明可用于檢測與疾病，病癥或病情關(guān)聯(lián)的靶核酸。例如，靶核酸可攜帶突變諸如核酸堿基取代，復(fù)制，插入，缺失和/或轉(zhuǎn)位。在一些實施方式中，本發(fā)明可用于檢測與在生物學(xué)樣品中的罕見事件關(guān)聯(lián)的突變。例如，本發(fā)明可用于檢測存在于生物學(xué)樣品的罕見細胞中的突變。在一些實施方式中，該罕見細胞是存在于自患者的生物學(xué)樣品(例如，全血)中的癌細胞。在一些實施方式中，該罕見細胞是存在于母源血的胚胎細胞。在一些實施方式中，該罕見細胞是與感染性疾病關(guān)聯(lián)的病原體。在一些實施方式中，該罕見細胞是與自身免疫疾病或與移植物關(guān)聯(lián)的免疫學(xué)病情關(guān)聯(lián)的免疫細胞，等。由此，本發(fā)明的實施方式可用于胚胎異常的出生前診斷和癌和其他病理學(xué)病情的早期診斷。在一些實施方式中，本發(fā)明可用于測定靶核酸的相對量，諸如測定靶和參照核酸之間的比。因此，本發(fā)明在檢測在遺傳疾病中牽涉的任何染色體或許多遺傳座位的不平衡中特別有用。由此，本文公開的方法可輔助攜帶者檢測，患者診斷，出生前診斷和/或移植用胚胎的基因分型，等。如由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員同意，靶核酸所關(guān)聯(lián)的遺傳疾病可跟隨任何許多遺傳模式，包括，例如，常染色體隱性，常染色體顯性，性別-聯(lián)鎖的顯性和性別-聯(lián)鎖的隱性。在一些實施方式中，本發(fā)明特別適應(yīng)于檢測涉及母源和胚胎遺傳核酸之間的定量差異的遺傳異常。這些遺傳異常包括可為母源和胚胎DNA之間雜合和純合，及非整倍性的突變。例如，第X染色體的丟失的拷貝(單體性X)導(dǎo)致Turner氏綜合征，而另外的拷貝的第21染色體導(dǎo)致Down綜合征。其他疾病諸如Edward氏綜合征和Patau綜合征分別由另外的拷貝的第18染色體，及第13染色體導(dǎo)致。本方法可用于檢測轉(zhuǎn)位，添加，擴增，顛換，逆轉(zhuǎn)，非整倍性，多倍性，單體性，三體性，包括但不限于三體性21，三體性13，三體性14，三體性15，三體性16，三體性18，三體性22，三倍性，四倍性及性染色體異常包括但不限于X0，XXY，XYY 和 XXX。此外，可根據(jù)本發(fā)明分析的靶核酸包含特定遺傳座位諸如基因或其部分(例如，外顯子，內(nèi)含子，啟動子或其他調(diào)控區(qū))。表I列出該基因及關(guān)聯(lián)的遺傳疾病，病癥或病情的非限制性例。如由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白，基因可知道有多于一種名稱。表I中的列表不排除可相關(guān)于特定疾病的另外的基因的存在。本發(fā)明包括那些另外的基因，包括會在未來發(fā)現(xiàn)與各特定疾病關(guān)聯(lián)的那些。表1:與遺傳疾病，病癥或病情關(guān)聯(lián)的例示基因
權(quán)利要求
1.測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量的方法，所述方法包括 排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個反應(yīng)位點，其中各反應(yīng)位點含有平均一個多核苷酸； 擴增多個反應(yīng)位點中的多核苷酸； 由核酸雜交測定(i)含有靶核酸序列、或其部分的第I反應(yīng)位點的第I數(shù)，及(ii)含有參照核酸序列、或其部分的第2反應(yīng)位點的第2數(shù)； 比較第I反應(yīng)位點的第I數(shù)與第2反應(yīng)位點的第2數(shù)以測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量。
2.測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量的方法，所述方法包括 排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個擴增位點，其中各擴增位點含有平均一個多核苷酸； 擴增多個擴增位點中的多核苷酸以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物； 使擴增產(chǎn)物與特異于多個檢測位點中的(i)靶核酸、或其部分，及(ii)參照核酸、或其部分的核酸探針雜交，其中各檢測位點含有平均一個來自擴增產(chǎn)物的多核苷酸； 測定(i)含有與靶核酸、或其部分雜交的探針的第I檢測位點的第I數(shù)，及(ii)含有與參照核酸、或其部分雜交的探針的第2檢測位點的第2數(shù)；以及 比較第I檢測位點的第I數(shù)與第2檢測位點的第2數(shù)以測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量。
3.權(quán)利要求1的方法，其中方法還在雜交步驟之前包括收獲擴增產(chǎn)物的步驟。
4.權(quán)利要求3的方法，其中雜交步驟用微陣列實施。
5.權(quán)利要求1的方法，其中排列步驟通過使用固體，半-固體和/或液體支持物實施。
6.權(quán)利要求5的方法，其中排列步驟在固體支持物上實施。
7.權(quán)利要求6的方法，其中固體支持物選自玻璃，光學(xué)纖維，氧化硅，微芯片，塑料，珠；生物膜，纖維素。
8.權(quán)利要求6的方法，其中排列步驟包括使用流動細胞技術(shù)的步驟。
9.權(quán)利要求6的方法，其中排列步驟包括在凝膠基質(zhì)之內(nèi)分布核酸分子收集物的步驟。
10.權(quán)利要求6的方法，其中排列步驟包括使核酸分子收集物與乳劑珠混合的步驟。
11.權(quán)利要求5的方法，其中支持物包含多個其上固定的捕獲部分以捕獲個體多核苷酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中捕獲部分包含捕獲寡核苷酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中方法還包括首先處理多核苷酸使得個體多核苷酸在5’和3’端含有適配體序列的步驟，其中適配體序列與固定的捕獲寡核苷酸雜交。
14.權(quán)利要求1的方法，其中擴增步驟包括實施PCR反應(yīng)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中擴增步驟包括實施滾環(huán)擴增。
16.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸是靶染色體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中靶染色體選自第X，Y，13，18或21染色體。
18.權(quán)利要求1的方法，其中參照核酸是參照染色體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中參照染色體是第1，X，Y，13，18或21染色體。
20.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸含有突變。
21.權(quán)利要求20的方法，其中突變選自SNP，缺失，插入，復(fù)制和其組合。
22.權(quán)利要求1的方法，其中生物學(xué)樣品包含過豐或亞豐的靶核酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中生物學(xué)樣品包含非整倍體染色體。
24.權(quán)利要求2的方法，其中特異于靶核酸、或其部分的核酸探針特異于單個座位。
25.權(quán)利要求2的方法，其中特異于靶核酸、或其部分的核酸探針特異于多個座位。
26.權(quán)利要求2的方法，其中將特異于靶核酸、或其部分的核酸探針多重化。
27.權(quán)利要求26的方法，其中多重化的探針包含2 10，000個探針。
28.權(quán)利要求27的方法，其中多重化的特異于靶核酸、或其部分的探針包含500個探針。
29.權(quán)利要求2的方法，其中特異于參照核酸、或其部分的核酸探針特異于單個座位。
30.權(quán)利要求2的方法，其中特異于靶核酸、或其部分的核酸探針特異于多個座位。
31.權(quán)利要求2的方法，其中將特異于參照核酸、或其部分的核酸探針多重化。
32.權(quán)利要求31的方法，其中多重化的探針包含2 10，000個探針。
33.權(quán)利要求31的方法，其中多重化的特異于參照核酸、或其部分的探針包含500個探針。
34.權(quán)利要求2的方法，其中特異于靶核酸、或其部分的探針，及特異于參照核酸、或其部分的探針，用特殊地可檢測的信號標記。
35.權(quán)利要求34的方法，其中特殊地可檢測的信號是不同光信號。
36.權(quán)利要求35的方法，其中不同光信號是不同熒光或發(fā)光信號。
37.權(quán)利要求1的方法，其中測定步驟包括測定靶核酸的相對拷貝數(shù)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中測定靶核酸的相對拷貝數(shù)的步驟包括以下步驟 Ca)測定指示含有靶核酸、或其部分的檢測位點的第I數(shù)的第I熒光信號水平，將其相對背景信號標準化； (b)測定指示含有參照核酸、或其部分的檢測位點的第2數(shù)的第2熒光信號水平，將其相對背景信號標準化； (c)測定第I熒光信號水平與第2熒光信號水平的比；以及 (d)通過相對特異于靶核酸的探針數(shù)和特異于參照核酸的探針數(shù)之間的比標準化在步驟(c)中測定的比來測定靶核酸的相對拷貝數(shù)。
39.權(quán)利要求1的方法，其中自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以小于一個基因組當(dāng)量的量含有基因組DNA。
40.權(quán)利要求1的方法，其中擴增產(chǎn)物以預(yù)定的水平的基因組當(dāng)量含有擴增的基因組DNA。
41.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于1%。
42.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于O.1%。
43.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于I百萬分之Io
44.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸占自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸的小于I千萬分之Io
45.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸源于胚胎細胞。
46.權(quán)利要求45的方法，其中靶核酸包含胚胎染色體。
47.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸源于患病的細胞。
48.權(quán)利要求47的方法，其中患病的細胞是癌細胞。
49.權(quán)利要求1的方法，其中方法還在排列步驟之前包括全基因組擴增的步驟。
50.權(quán)利要求1的方法，其中方法還包括測定是否靶核酸的相對量相比對照異常的步驟。
51.權(quán)利要求1的方法，其中方法用于檢測與異常量的靶核酸關(guān)聯(lián)的疾病，病癥或病情，或其攜帶者。
52.權(quán)利要求1的方法，其中方法用于胚胎非整倍性的出生前診斷。
53.權(quán)利要求1的方法，其中生物學(xué)樣品選自細胞,組織,全血,血漿,血清,尿,糞便，唾液，臍帶血，絨毛膜絨毛樣品，絨毛膜絨毛樣品培養(yǎng)物，羊水，羊水培養(yǎng)物，經(jīng)子宮頸灌洗液，及其組合。
54.檢測生物學(xué)樣品中的靶核酸的方法，包括 排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個反應(yīng)位點，其中各反應(yīng)位點含有平均一個多核苷酸； 擴增多個反應(yīng)位點中的多核苷酸以產(chǎn)生多個簇使得各簇含有擴增的核酸產(chǎn)物；以及通過使用一種或更多特異于靶核酸的探針雜交檢測含有靶核酸、或其部分的簇或反應(yīng)位點，由此檢測生物學(xué)樣品中的靶核酸。
55.測定靶核酸的相對量的系統(tǒng)，包含 擴增在多個擴增位點上的多核苷酸以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的裝置； 實施擴增產(chǎn)物與用特異于靶核酸、或其部分的第I可檢測的信號標記的探針，及用特異于參照核酸、或其部分的第2可檢測的信號標記的探針的雜交的裝置； 適應(yīng)于(i )測定第I可檢測的信號的水平，及(ii )測定第2可檢測的信號的水平的測定模塊； 配置為存儲(iii)來自測定模塊的信號信息及(iv)由用戶提供的指示特異于靶核酸、或其部分的探針數(shù)，及特異于參照核酸、或其部分的探針數(shù)的信息的存儲裝置；以及 適應(yīng)于(V)計算第I可檢測的信號的水平與第2可檢測的信號的水平的比及(vi)通過相對特異于靶核酸、或其部分的探針數(shù)和特異于參照核酸、或其部分的探針數(shù)之間的比標準化信號水平比來測定靶核酸的相對量的計算模塊。
全文摘要
公開的是用于核酸計數(shù)的方法和系統(tǒng)，包括檢測生物學(xué)樣品中的罕見事件。在特定實施方式中，方法可包括排列自生物學(xué)樣品獲得的多核苷酸以形成多個反應(yīng)位點，其中各反應(yīng)位點含有平均一個多核苷酸；擴增多個反應(yīng)位點中的多核苷酸；由核酸雜交測定(i)含有靶核酸序列、或其部分的第1反應(yīng)位點的第1數(shù)，及(ii)含有參照核酸序列、或其部分的第2反應(yīng)位點的第2數(shù)；比較第1反應(yīng)位點的第1數(shù)與第2反應(yīng)位點的第2數(shù)以測定生物學(xué)樣品中靶核酸的相對量。
文檔編號C12Q1/68GK103069005SQ201180030604
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者T·肖勒, B·亨德里克森 申請人:艾索特里克斯遺傳實驗室有限責(zé)任公司