專利名稱：：用于絲狀真菌中c4-二羧酸的改善的產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在絲狀真菌中改善C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
：有機(jī)酸在多種工業(yè)中具有悠久歷史的商業(yè)使用。舉例而言，有機(jī)酸用于食品和飼·料工業(yè)(檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸)，作為用于產(chǎn)生多種聚合物的單體(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸)，作為金屬螯合劑(葡糖酸)和作為“綠色”溶劑(乙酸)(Sauer等，2008，TrendsinBiotechnology26:100-108)。有機(jī)酸自身可為商業(yè)產(chǎn)品或其可為用于制造其他化學(xué)品的化學(xué)構(gòu)件(buildingblock)。除了專門(mén)用途之外，長(zhǎng)久以來(lái)公認(rèn)C4-二羧酸亦可充當(dāng)構(gòu)件化合物以供產(chǎn)生大體積的工業(yè)化學(xué)品，如1，4-丁二醇，四氫呋喃和Y-丁內(nèi)酯。由于石油衍生構(gòu)件的高成本,通過(guò)傳統(tǒng)石油化學(xué)途徑產(chǎn)生這些大體積工業(yè)化學(xué)品的成本顯著增加。有機(jī)酸在商業(yè)上是通過(guò)從石油衍生原料的化學(xué)合成(例如，延胡索酸、蘋(píng)果酸、丙烯酸和己二酸)或通過(guò)微生物發(fā)酵(例如檸檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)產(chǎn)生的。一些有機(jī)酸如延胡索酸和蘋(píng)果酸亦可通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生，但由于更低的生產(chǎn)成本，目前在商業(yè)上仍通過(guò)化學(xué)合成從石油化學(xué)原料產(chǎn)生。然而，石油衍生構(gòu)件化學(xué)品的成本的日益升高，地緣政治的不穩(wěn)定性對(duì)原油價(jià)格的影響，以及對(duì)實(shí)施利用來(lái)源于可再生資源的原料的制造工藝的期望，刺激了通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸和其他化學(xué)品中的重建的興趣。雖然現(xiàn)在通過(guò)化學(xué)合成從石油化學(xué)原料商業(yè)性產(chǎn)生蘋(píng)果酸，其亦可通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生。蘋(píng)果酸已在基因工程改造的酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisia))(Zelle等，2008,Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的絲狀真菌如曲霉屬菌種(Aspergillusspp.)(美國(guó)專利號(hào)3,063,910;Bercovitz等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中以高水平產(chǎn)生。Abe等(美國(guó)專利號(hào)3，063，910)和Bercovitz等(1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)報(bào)道了在幾種曲霉屬菌種中高水平的蘋(píng)果酸產(chǎn)生。而且，Battat等(1991，Biotechnol.Bioengineering,37:1108-1116)報(bào)道了在優(yōu)化條件下在攪拌的發(fā)酵罐中由黃曲霉(Aspergillusflavus)產(chǎn)生了高至113g/L的蘋(píng)果酸。在W02010/003728中描述了在酵母中通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生二羧酸。亦在W02009/011974和W02009/155382中描述了通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生蘋(píng)果酸。通過(guò)對(duì)曲霉屬(Aspergillus)進(jìn)行遺傳工程改造改善蘋(píng)果酸產(chǎn)生會(huì)使得能夠通過(guò)發(fā)酵經(jīng)濟(jì)地商業(yè)性生產(chǎn)蘋(píng)果酸。在曲霉屬菌種(Aspergillusspp.)中的蘋(píng)果酸過(guò)量產(chǎn)生在特定的培養(yǎng)條件(有氧條件和高C:N比；碳酸鈣亦作為中和劑和作為用于蘋(píng)果酸生物合成的CO2源添加)下發(fā)生。在這些條件下，通過(guò)胞質(zhì)溶膠的、還原性三羧酸(TCA)循環(huán)的溢出代謝(overflowmetabolism)導(dǎo)致增加的蘋(píng)果酸生物合成和分泌入培養(yǎng)基。已在釀酒酵母中報(bào)道了通過(guò)使用遺傳工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等，1999，F(xiàn)EMSMicrobiolLett.179:107-113)或蘋(píng)果酸脫氫酶(Pines等,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)(Zelle等，2008，見(jiàn)上)增加蘋(píng)果酸產(chǎn)生。基于生物化學(xué)證據(jù)，提出了在黃曲霉菌株ATCC13697中，蘋(píng)果酸脫氫酶活性限制蘋(píng)果酸產(chǎn)生(Peleg等，1988，Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。2010年8月27日提交、標(biāo)題為“MethodsforImprovingMalicAcidProductioninFilamentousFungi”的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002(其內(nèi)容通過(guò)提述以其整體并入本文)描述了在絲狀真菌中的蘋(píng)果酸產(chǎn)生。在本領(lǐng)域中，在曲霉屬中作為使用重組DNA技術(shù)的遺傳工程改造的結(jié)果而改善C4-二羧酸產(chǎn)生如蘋(píng)果酸產(chǎn)生會(huì)是有益的。本發(fā)明提供了用于改善C4-二羧酸產(chǎn)生(例如如蘋(píng)果酸產(chǎn)生)的方法等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的方法。在一個(gè)方面，該方法包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞(例如絲狀真菌宿主細(xì)胞)，所述宿主細(xì)胞包含編碼本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸；和(b)回收所述C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)。在另一個(gè)方面，該方法包括(a)將編碼本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞(例如絲狀真菌宿主細(xì)胞)；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物；和(c)回收所述C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)。在所述方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞(例如絲狀真菌宿主細(xì)胞，如米曲霉(AspergiIIusoryzae)),所述宿主細(xì)胞包含本文中所述的多核苷酸,其中所述宿主細(xì)胞分泌和/或能夠分泌增加水平的C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)。在一些方面，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。圖I顯示pAcC4T的限制圖譜。圖2顯示pShTh60的限制圖譜。圖3顯示PShThl20AcC4T的限制圖譜。圖4顯示棒曲霉(Aspergillusclavatus)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:I和2)。圖5顯示pAfC4T的限制圖譜。圖6顯示PShThl21AfC4T的限制圖譜。圖7顯示煙曲霉(Aspergillusfumigates)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:3和4)。圖8顯不米曲霉(Aspergillusoryzae)NRRL3488蘋(píng)果酸脫氫酶基因(mdh3)的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:11和12)。圖9A和9B—同顯示了米曲霉NRRL3488丙酮酸羧化酶(pyc)的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:13和14)。定義C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白術(shù)語(yǔ)“C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”在本文中定義為可將蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的二羧酸通透酶(Grobler等,1995,Yeast11:1485-1491;Camarasa等,2001,AppliedandEnvironmentalMicrobiology67:4144-4151)。用于預(yù)測(cè)線粒體輸入的蛋白及其祀向序列的計(jì)算方法由Claros和Vincens,1996，Eur.J.Biochem.241:779-786描述。在一些方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有SEQIDNO:2的成熟多肽序列或SEQIDNO:4的成熟多肽序列的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(例如蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性)的至少20%,例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%。·蘋(píng)果酸脫氫酶術(shù)語(yǔ)“蘋(píng)果酸脫氫酶”在本文中定義為在NADH+H+的存在下催化將草酰乙酸還原為蘋(píng)果酸和NAD+的蘋(píng)果酸NAD+氧還酶(EC1.I.I.37)。就本發(fā)明而言，根據(jù)下述步驟確定蘋(píng)果酸脫氫酶活性。測(cè)定溶液由ImM草酰乙酸，IOOmMTrispH8.0，IOmMNaHCO3,5mMMgCl2，和O.ImMNADH(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)組成。將不含草酰乙酸作為底物的測(cè)定溶液作為對(duì)照運(yùn)行以測(cè)量背景NADH降解率。用雙蒸水制備每種上清的1/100，1/500，1/2500和1/12500的稀釋。將測(cè)定溶液的270μI的等分試樣分配入96孔聚苯乙烯平底板。添加每種稀釋的上清的30μI樣品以起始測(cè)定。使用SPECTRA1V1AX340PC讀板器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)以下述設(shè)定監(jiān)測(cè)反應(yīng)340nm，動(dòng)力學(xué)讀取。使用NADH的濃度系列以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用純化的蘋(píng)果酸脫氫酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)的稀釋系列作為陽(yáng)性對(duì)照。一單位的蘋(píng)果酸脫氫酶活性等于能夠在PH8.O,25°C每分鐘將I微摩爾草酰乙酸和NADH+H+轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸和NAD+的酶量。在一些方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶具有SEQIDNO:12的成熟多肽序列的蘋(píng)果酸脫氫酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或至少100%。丙酮酸羧化酶術(shù)語(yǔ)“丙酮酸羧化酶”在本文中定義為在ATP和HC03_存在下催化將丙酮酸羧化為草酰乙酸、ADP和磷酸的丙酮酸二氧化碳連接酶(ADP-形成)(EC6.4.I.I)。就本發(fā)明而言，根據(jù)針對(duì)丙酮酸羧化酶的STGMA.QualityControlTest方法(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)的步驟確定丙酮酸羧化酶活性,只是該測(cè)定使用pH8.O的Tris緩沖液。一單位的丙酮酸羧化酶活性等于能夠在pH7.8，30°C每分鐘將I微摩爾的丙酮酸和CO2轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶量。在一些方面，所述丙酮酸羧化酶具有SEQIDNO:14的成熟多肽序列的丙酮酸羧化酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或至少100%。異源多核苷酸術(shù)語(yǔ)“異源多核苷酸”在本文中定義為對(duì)于宿主細(xì)胞并非天然的多核苷酸；其中已對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的天然多核苷酸；作為通過(guò)重組DNA技術(shù)(例如，不同的(外源)啟動(dòng)子)操縱DNA的結(jié)果其表達(dá)定量改變的天然多核苷酸；或其表達(dá)通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)(例如，兩個(gè)、幾個(gè))額外拷貝的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞而定量改變的天然多核苷酸。分離的/純化的術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”意指從至少一種與其天然結(jié)合(associated)的成分分離的多肽或多核苷酸。舉例而言，如通過(guò)SDS-PAGE確定的,該多肽可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，至少93%純，至少95%純，至少97%純，至少98%純，或至少99%純；且如通過(guò)瓊脂糖電泳確定的，該多核苷酸可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，至少93%純，至少95%純，至少97%純，至少98%純，或至少99%純。編碼序列術(shù)語(yǔ)“編碼序列”的意思是指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框確定，所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開(kāi)始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重組多核苷酸。cDNA序列術(shù)語(yǔ)“cDNA序列”意指從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子在反轉(zhuǎn)錄之后所得的DNA。來(lái)自基因組DNA起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過(guò)一系列包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。cDNA序列缺乏可存在于相應(yīng)基因組DNA序列中的插入的內(nèi)含子。相應(yīng)地，短語(yǔ)“SEQIDΝ0:Χ的cDNA序列”意指將SEQIDΝ0:Χ中插入的內(nèi)含子序列(若存在)去除之后所得的序列。在一些情況下一當(dāng)參照的基因組DNA序列缺乏插入的內(nèi)含子序列時(shí)一cDNA序列可與相應(yīng)的基因組DNA序列完全相同?；蚪MDNA序列術(shù)語(yǔ)“基因組DNA序列”意指見(jiàn)于來(lái)源生物的基因組(例如真核或原核基因組)的DNA序列。在一些情況下，來(lái)自真核基因組的基因組DNA序列含有一個(gè)或多個(gè)插入的內(nèi)含子序列，其作為RNA剪接的結(jié)果從初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物去除。相應(yīng)地，短語(yǔ)“SEQIDNO:Y的基因組DNA序列”意指來(lái)自來(lái)源生物的相應(yīng)DNA序列，其含有在RNA剪接之前存在的插入的內(nèi)含子序列(若存在)。成熟多肽序列術(shù)語(yǔ)“成熟多肽序列”意指參照的多核苷酸序列在任何翻譯后序列修飾(如N端加工和/或C端截短)之后的部分。在一些情況下，所述成熟多肽序列可以與整個(gè)參照的多肽序列完全相同。在一個(gè)方面，基于預(yù)測(cè)SEQIDNO:2的氨基酸I至52為信號(hào)肽的VectorISi「丨丨“呈序(Invitrogen,CA,USA),所述成熟多肽序列是SEQIDNO:2的氨基酸53至392。在另一個(gè)方面，所述成熟多肽序列是SEQIDNO:4的氨基酸I至393。成熟多肽編碼序列術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”意指參照的多核苷酸序列(例如基因組或cDNA序列)編碼成熟多肽序列的部分。在一些情況下，所述成熟多肽編碼序列可以與整個(gè)參照的多核苷酸序列完全相同。在一個(gè)方面，基于預(yù)測(cè)SEQIDNO:I的核苷酸I至156編碼信號(hào)肽的VectorNTI程序(Invitrogen,CA,USA),所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸157至1179。在另一個(gè)方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:3的核苷酸I至1182。片段術(shù)語(yǔ)“片段”意指從參照的多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的多肽。在一個(gè)方面，所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在另一個(gè)方面，片段包含SEQIDNO:2的至少332個(gè)氨基酸殘基，例如至少352個(gè)氨基酸殘基或至少372個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)方面，片段包含SEQIDNO:4的至少332個(gè)氨基酸殘基，例如至少352個(gè)氨基酸殘基或至少372個(gè)氨基酸殘基。亞序列術(shù)語(yǔ)“亞序列(subsequence)”意指從參照的核苷酸序列的5’和/或3’端缺失了一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))核苷酸的多核苷酸。在一個(gè)方面，所述亞序列編碼具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段。在另一個(gè)方面，亞序列包含SEQIDN0:1的至少996個(gè)核苷酸，例如至少1056個(gè)核苷酸或至少1116個(gè)核苷酸。在另一個(gè)方面，亞序列包含SEQIDNO:3的至少996個(gè)核苷酸，例如至少1056個(gè)核苷酸或至少1116個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語(yǔ)“等位變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種以上可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。序列同一性兩個(gè)氨基酸序列間或兩個(gè)核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)“序列同一性”所描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(優(yōu)選為3.0.0版或之后的版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)確定的。所用的可選參數(shù)為缺口開(kāi)放罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)O.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并如下計(jì)算(相同的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，Rice等,2000,見(jiàn)上)的Needle程序(優(yōu)選為3.O.O版或之后的版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見(jiàn)上)確定的。所用的可選參數(shù)為缺口開(kāi)放罰分10，缺口延伸罰分O.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用標(biāo)記為”最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并如下計(jì)算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口總數(shù))。表達(dá)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或經(jīng)修飾以本來(lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或?yàn)楹铣傻模渲兴龊怂岱肿影粋€(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))調(diào)控序列調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”意指對(duì)于多肽表達(dá)必需的核酸序列。調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，以及對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子序列、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并與調(diào)控序列可操作地連接，其中所述調(diào)控序列提供編碼所述多肽的多核苷酸的表達(dá)。最少的情況，所述表達(dá)載體包含啟動(dòng)子序列，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)序列。宿主細(xì)胞術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指任何細(xì)胞類(lèi)型，所述細(xì)胞類(lèi)型對(duì)于用包含本發(fā)明的多核苷酸(例如編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸)的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，其由于在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。變體術(shù)語(yǔ)“變體”意指在一個(gè)或多個(gè)位置包含變化即取代、插入和/或缺失一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸殘基的，具有活性例如C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽。取代意指將占據(jù)某位置的氨基酸用不同氨基酸替換；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在占據(jù)某位置的氨基酸的相鄰處添加一個(gè)或多個(gè)，例如1-3個(gè)氨基酸。體積產(chǎn)量術(shù)語(yǔ)“體積產(chǎn)量”指每單位時(shí)間每體積(例如，培養(yǎng)基及其中內(nèi)含物的總體積)使用的系統(tǒng)所產(chǎn)生的參照的產(chǎn)物的量(例如，產(chǎn)生的C4-二羧酸的量)。發(fā)酵培養(yǎng)基術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”指包含一種或多種(例如,兩種,幾種)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基能夠部分地通過(guò)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化(發(fā)酵)為所需產(chǎn)物，如C4-二羧酸。在一些情況下，所述發(fā)酵培養(yǎng)基源自天然來(lái)源，如甘蔗，淀粉，或纖維素，并可為通過(guò)酶水解(糖化)而預(yù)處理所述來(lái)源的結(jié)果。在本文中，提及“約”某值或參數(shù)包括了涉及該值或參數(shù)本身的方面。舉例而言，提及“約X”的描述包括了“X”的方面。如用于本文中和所附權(quán)利要求中，除非上下文明確地表示相反，單數(shù)形式“一(個(gè)/種···)&)”或“所述/該(the)”包括了對(duì)復(fù)數(shù)的提及。應(yīng)理解本文中所述的發(fā)明的各方面包括了“由…組成(consisting)”和/或“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”的方面。除非另行定義或上下文明確指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的相同的含意。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了特定基因在宿主細(xì)胞如絲狀真菌(例如曲霉屬(Aspergillus))中的過(guò)量表達(dá)以增強(qiáng)C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的產(chǎn)生，其涵蓋通過(guò)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。在本發(fā)明中，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可為任何適于實(shí)踐本發(fā)明的、描述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是在培養(yǎng)條件下過(guò)表達(dá)，以高效價(jià)產(chǎn)生C4-二羧酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。所述重組宿主細(xì)胞可進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源多核苷酸和/或編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸在本文所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(a)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性；(b)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:I或3，或其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交；(c)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少60%序列同一性；(d)SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列相差不多于十個(gè)氨·基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或一個(gè)氨基酸。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%,至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2或其成熟多肽序列相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或一個(gè)氨基酸。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:4或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:4或其成熟多肽序列相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或一個(gè)氨基酸。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸序列，SEQIDNO:2的成熟多肽序列，其等位變體，或前述序列的具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的序列。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2的成熟多肽序列。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸I至392。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:4的氨基酸序列，SEQIDN0:4的成熟多肽序列，其等位變體，或前述序列的具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的序列。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:4的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:4的成熟多肽序列。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDNO:4的氨基酸I至393。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:1或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見(jiàn)，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)0在一個(gè)方面，所述C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDNO:1，其成熟多肽編碼序列；或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:3，其成熟多肽編碼序列；或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼,所述多核苷酸與SEQIDNO:1，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少65%，例如至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少65%，例如至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:I或3，或其成熟多肽編碼序列編碼。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:I或其成熟多肽編碼序列編·碼。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:I編碼。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:3或其成熟多肽編碼序列編碼。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:3編碼。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:I或3的亞序列編碼，其中所述亞序列編碼具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDNO:I的亞序列編碼，其中所述亞序列編碼具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由SEQIDN0:3的亞序列編碼，其中所述亞序列編碼具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:2或4或其成熟多肽編碼序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:2的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:2的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:4的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:4的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。優(yōu)選地,氨基酸改變的性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly?；蛘?，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改善多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的活性(例如C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見(jiàn)Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)確定。參見(jiàn)例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；fflodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一11"生分析來(lái)推斷，所述多肽與參照的親本多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法接著進(jìn)行有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；W095/17413;或冊(cè)95/22625公開(kāi)的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、曬菌體展不(例如，Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837；美國(guó)專利No.5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。在一些方面，SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:2或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一個(gè)方面，所述片段含有SEQIDNO:2的至少332個(gè)氨基酸殘基，例如至少352個(gè)氨基酸殘基，或至少372個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)方面，所述片段含有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域，例如，SEQIDN0:2的氨基酸39至337的推定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:4或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一個(gè)方面，所述片段含有SEQIDNO:4的至少332個(gè)氨基酸殘基，例如至少352個(gè)氨基酸殘基，或至少372個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)方面，所述片段含有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域，例如，SEQIDNO:4的氨基酸41至338的推定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域。所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于本發(fā)明多肽的N端或C端。通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術(shù)構(gòu)建,其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993,EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。融合多肽還可以包含在兩個(gè)多肽之間的切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，釋放所述兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，公開(kāi)于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-ffiIson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnology13:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381；Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987；Carter等，1989，Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點(diǎn)。用于分離或克隆編碼用于本文中提及的任何方面的多核苷酸一例如編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸一以及其它多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法,如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)ο可以從曲霉屬(Aspergillus)菌株,或其他或相關(guān)生物體克隆所述多核苷酸,并且因此可為例如核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。SEQIDNO:I或3的多核苷酸，或亞序列，以及SEQIDNO:2或4的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，例如長(zhǎng)度上為至少14個(gè)核苷酸，至少25個(gè)核苷酸，至少35個(gè)核苷酸，或至少70個(gè)核苷酸。所述核酸探針可以更長(zhǎng)，例如至少100個(gè)核苷酸，至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，或至少500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，可使用甚至更長(zhǎng)的探針，如至少600個(gè)核苷酸，例如至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸，或至少900個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以供檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中?？蓮挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽的DNA。可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過(guò)其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它株的基因組或其它DNA?？梢詫?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDN0:1或3的成熟多肽編碼序列，或它們的亞序列同源的克隆或DNA，所述載體材料優(yōu)選用于Sounthern印跡。就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:I或3，SEQIDNO:I或3的成熟多肽編碼序列，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或前述序列的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:I或3。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDN0:1或3的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:I。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDN0:3。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:4的多肽或其片段的多核苷酸。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在45。。(非常低嚴(yán)格性)，在50°C(低嚴(yán)格性)，在55°C(中嚴(yán)格性)，在60°C(中-高嚴(yán)格性)，在65°C(高嚴(yán)格性)，和在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)計(jì)算的Tni低大約5至大約1(TC，在O.9MNaCl,O.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，O.5%NP_40，IXDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM憐酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算的Tm低5°C至I(TC的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。本發(fā)明C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以獲得自任何屬的微生物。如用于本文，與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，意思應(yīng)為由多核苷酸編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的多核苷酸的細(xì)胞產(chǎn)生。所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是細(xì)菌C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。例如，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌(BaciIluspumiIus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。·在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲(chóng)鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可為真菌C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一個(gè)方面，所述真菌C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為酵母C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是絲狀真菌C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cyphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二抱屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲(chóng)屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤(pán)菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)^If菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)C4-二駿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、黃曲霉、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Asperigullusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、醬油曲霉(Aspergillussojae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminopsλ租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫(kù)威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(IrpexIacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(TrichodermaIongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是曲霉屬C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如棒曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或煙曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:2的棒曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:4的煙曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?？衫斫獾氖菍?duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類(lèi)學(xué)的等同物(equivalent)，例如無(wú)性型(anamorph),而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識(shí)別適合的等同物的身份。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)0亦可使用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。用于從天然生境(habitat)分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。然后可通過(guò)相似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品來(lái)獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合適探針檢測(cè)到編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)將所述序列分離或克隆(參見(jiàn)，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。蘋(píng)果酸脫氫酶和編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的多核苷酸在重組宿主細(xì)胞及其使用方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性。在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源多肽。所述蘋(píng)果酸脫氫酶可為任何適于實(shí)踐本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶是存在于宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的酶。在本文所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶是(a)蘋(píng)果酸脫氫酶，其與SEQIDNO:12或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性；(b)蘋(píng)果酸脫氫酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:11，或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:11的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)蘋(píng)果酸脫氫酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與以下具有至少60%序列同一性(iv)SEQIDNO:11，或其成熟多肽編碼序列，(v)SEQIDNO:11的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(d)SEQIDN0:12或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的蘋(píng)果酸脫氫酶變體；和(e)(a)、(b)、(C)或(d)的多肽具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性的片段。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:12或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,或至少99%序列同一'丨生。在一個(gè)方面,所述蘋(píng)果酸脫氫酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:12或其成熟多肽序列相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或一個(gè)氨基酸。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶包含或組成為SEQIDNO:12的氨基酸序列，SEQIDNO:12的成熟多肽序列，其等位變體，或前述的具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性的序列。在另一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶包含或組成為SEQIDN0:12的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶包含或組成為SEQIDNO:12的成熟多肽序列。在另一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶包含或組成為SEQIDNO:12的氨基酸I至330。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交(i)SEQIDNO:11或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDN0:11的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見(jiàn)，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,見(jiàn)上文)。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與(iv)SEQIDNO:11或其成熟多肽編碼序列，(V)SEQIDNO:11的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，·至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶由SEQIDNO:11，或其成熟多肽編碼序列編碼。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶由SEQIDNO:11編碼。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶由SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列編碼。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶由SEQIDNO:11的亞序列編碼，其中所述亞序列編碼具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列含有SEQIDNO:11的至少885個(gè)核苷酸，例如至少930個(gè)核苷酸或至少975個(gè)核苷酸。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶為SEQIDNO:12或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體，如上文所述。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶為SEQIDNO:12的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶為SEQIDN0:12的成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一些方面，SEQIDNO:12或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶是SEQIDNO:12或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性。在一個(gè)方面，所述的片段含有SEQIDN0:12的至少295個(gè)氨基酸殘基，例如至少310個(gè)氨基酸殘基，或至少325個(gè)氨基酸殘基。所述蘋(píng)果酸脫氫酶亦可為蘋(píng)果酸脫氫酶的等位變體或人工變體。所述蘋(píng)果酸脫氫酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。用于分離或克隆編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的多核苷酸的技術(shù)如上文中所述。SEQIDNO:11的多核苷酸；或其亞序列；以及SEQIDNO:12的氨基酸序列；或其片段；可用于設(shè)計(jì)核酸探針以從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的DNA，如上文中所述。本發(fā)明涵蓋此類(lèi)探針?？蓪?duì)從此類(lèi)其它生物制備的基因組DNA或cDNA篩選與如上所述的探針雜交并編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的DNA，如上文中所述。在一個(gè)方面，所述核酸探針為SEQIDNO:11。在另一個(gè)方面，所述核酸探針為SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)方面，所述核酸探針是多核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:12，其成熟多肽序列或前述序列的片段。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格條件和洗滌條件如上文中所述定義。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件和洗滌條件如上文中所述定義。所述蘋(píng)果酸脫氫酶可獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶可為從本文中所述的微生物獲得的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌蘋(píng)果酸脫氫酶。在另一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶是米曲霉蘋(píng)果酸脫氫酶，例如SEQIDN0:12的米曲霉蘋(píng)果酸脫氫酶。其它可用于實(shí)踐本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶包括但不限于構(gòu)巢曲霉蘋(píng)果酸脫氫酶(AN6717.I；SIMS等，2004，Mycol.Res.108:853-857);黑曲霉蘋(píng)果酸脫氫酶(Anl6g00120;Pel等，2007，NatureBiotechnology25:221-231)；Phytophthorainfestans蘋(píng)果酸脫氧酶(PITG13614.I；Calcagno等,2009,MycologicalResearch113:771-781);釀酒酵母蘋(píng)果酸脫氫酶(YKL085W；McAlister-Henn和Thompson,1987，JBacteriol.169:5157-5166);埃默森踝節(jié)菌蘋(píng)果酸脫氫酶(AF439996,AF487682；Maloney等，2004，Eur.J.Biochem.271:3115-3126);以及玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)蘋(píng)果酸脫氫酶(um00403,uml1161;McCann和Snetselaar,2008，F(xiàn)ungalGeneticsandBiology45:S77-S87),SEQIDNO:16的米曲霉蘋(píng)果酸脫氫酶(其由SEQIDNO:15的核苷酸序列所編碼；參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?2/870，523,標(biāo)題為“MethodsforImprovingMalicAcidProductioninFilamentousFungi”,2010年8月27日提交)，或任何相應(yīng)的參考文獻(xiàn)中所述的蘋(píng)果酸脫氫酶的任何方面。本發(fā)明涵蓋將本文中所述的序列同一性、雜交、變體和片段的任何方面適用于其它如上所述的蘋(píng)果酸脫氫酶多肽序列和多核苷酸序列。舉例而言，在一個(gè)方面，所述蘋(píng)果酸脫氫酶是(a)蘋(píng)果酸脫氫酶，其與SEQIDNO:16或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)蘋(píng)果酸脫氫酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:15或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:15的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)蘋(píng)果酸脫氫酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與(iv)SEQIDNO:15或其成熟多肽編碼序列，(V)SEQIDNO:15的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQIDNO:16或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的蘋(píng)果酸脫氫酶變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性的片段。所述蘋(píng)果酸脫氫酶亦可從其它來(lái)源鑒定和獲取，所述來(lái)源包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從自然材料(例如土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品，如上文中所述。丙酮酸羧化酶和編碼丙酮酸羧化酶的多核苷酸在重組宿主細(xì)胞及其使用方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有丙酮酸羧化酶活性。在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼丙酮酸羧化酶的異源多肽。所述丙酮酸羧化酶可為任何適于實(shí)踐本發(fā)明的丙酮酸羧化酶。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶是存在于宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的酶。在本文所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶是(a)丙酮酸羧化酶，其與SEQIDNO:14或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性；(b)丙酮酸羧化酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:13，或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:13的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)丙酮酸羧化酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與以下具有至少60%序列同一性(iv)SEQIDNO:13，或其成熟多肽編碼序列，(v)SEQID勵(lì):13的。0應(yīng)序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(d)SEQIDN0:14或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的丙酮酸羧化酶變體；和(e)(a)、(b)、(C)或(d)的多肽具有丙酮酸羧化酶活性的片段。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:14或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少·98%，或至少99%序列同一性。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:14或其成熟多肽序列相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或一個(gè)氨基酸。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為SEQIDNO:14的氨基酸序列，SEQIDNO:14的成熟多肽序列，其等位變體，或前述序列的具有丙酮酸羧化酶活性的序列。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為SEQIDNO:14的成熟多肽序列。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為SEQIDNO:14的氨基酸I至1193。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交(i)SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDN0:13的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見(jiàn)，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,見(jiàn)上文)。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與(iv)SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列，(V)SEQIDNO:13的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶由SEQIDNO:13，或其成熟多肽編碼序列編碼。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶由SEQIDNO:13編碼。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶由SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列編碼。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶由SEQIDNO:13的亞序列編碼，其中所述亞序列編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列含有SEQIDNO:13的至少3060個(gè)核苷酸，例如至少3240個(gè)核苷酸或至少3420個(gè)核苷酸。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶為SEQIDNO:14或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體，如上文所述。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶為SEQIDNO:14的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶為SEQIDNO:14的成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。在一些方面，SEQIDNO:14或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于14，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶是SEQIDNO:14或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有丙酮酸羧化酶活性。在一個(gè)方面，所述的片段含有SEQIDN0:14的至少1020個(gè)氨基酸殘基，例如至少1080個(gè)氨基酸殘基，或至少1140個(gè)氨基酸殘基。所述丙酮酸羧化酶亦可為丙酮酸羧化酶的等位變體或人工變體。所述丙酮酸羧化酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。所述丙酮酸羧化酶可為線粒體丙酮酸羧化酶的變體，使得體內(nèi)輸入線粒體減少，由此增加所述丙酮酸羧化酶在胞質(zhì)溶膠中的水平。·用于分離或克隆編碼丙酮酸羧化酶的多核苷酸的技術(shù)如上文中所述。SEQIDNO:13的多核苷酸；或其亞序列；以及SEQIDNO:14的氨基酸序列；或其片段；可用于設(shè)計(jì)核酸探針以從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼丙酮酸羧化酶的DNA，如上文中所述。本發(fā)明涵蓋此類(lèi)探針?？蓪?duì)從此類(lèi)其它生物制備的基因組DNA或cDNA篩選與如上所述的探針雜交并編碼丙酮酸羧化酶的DNA，如上文所述。在一個(gè)方面，所述核酸探針為SEQIDN0:13。在另一個(gè)方面，所述核酸探針為SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)方面，所述核酸探針是多核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:14，其成熟多肽序列或前述序列的片段。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格條件和洗滌條件如上文中所述定義。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件和洗滌條件如上文中所述定義。所述丙酮酸羧化酶可獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶可為從本文中所述的微生物獲得的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌丙酮酸羧化酶。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶是米曲霉丙酮酸羧化酶，例如SEQIDNO:14的米曲霉丙酮酸羧化酶。其它可用于實(shí)施本發(fā)明的丙酮酸羧化酶包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)NRRLI丙酮酸羧化酶(XP_001271664;DirectSubmission,Submitted(26-0CT-2006)，TheInstituteforGenomicResearch,9712MedicalCenterDrive,Rockville,MD20850,USA);煙曲霉Af293丙酮酸羧化酶(XP_752054;Nierman等，2005，Nature438:1151-1156);構(gòu)巢曲霉FGSCA4丙酮酸羧化酶(XP_662066;Galagan等，2005，Nature438:1105-1115);黑曲霉丙酮酸羧化酶(Anl5g02820;Pel等，2007，NatureBiotechnology25:221-231;ASPNG5061;Panneman等，(JUL-1998)提交至EMBL/GenBank/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù))；土曲霉丙酮酸羧化酶(093918;DirectSubmission,Submitted(0CT-1998)TheInstituteforGenomicResearch,9712MedicalCenterDrive,Rockville,MD20850,USA);Magnaporthegrisea70-15丙酮酸羧化酶(XP_367852;DirectSubmission,Submitted(26-SEP-2005)BroadInstituteofMITandHarvard,320CharlesStreet,Cambridge,MA02142,USA);粗糖脈抱菌0R74A丙酮酸羧化酶(XP_965636;Galagan等，2003，Nature422:859-868);米根霉(Rhizopusoryzae)丙酮酸羧化酶(R03G_06931.I);釀酒酵母丙酮酸羧化酶(NP_009777;Gaffeau等，1996，Science274:546-547);粟酒裂殖酵母丙酮酸羧化酶(NP_595900;DirectSubmission,Submitted(29-JUN-2007)EuropeanSchizosaccharomycesgenomesequencingproject,SangerInstitute,TheWellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SA);和玉蜀黍黑粉菌丙酮酸羧化酶(um01054;McCann和Snetselaar,2008，F(xiàn)ungalGeneticsandBiology45:S77-S87)。本發(fā)明涵蓋將本文中所述的序列同一性、雜交、變體和片段的任何方面適用于其它如上所述的丙酮酸羧化酶多肽序列和多核苷酸序列。所述丙酮酸羧化酶亦可從其它來(lái)源鑒定和獲取，所述來(lái)源包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從自然材料(例如土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品，如上文中所述。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸，如編碼蘋(píng)果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)與一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))調(diào)控序列連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。此類(lèi)核酸構(gòu)建體可用于本文中所述的任何宿主細(xì)胞和方法。在一個(gè)方面，所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)該多核苷酸外源的啟動(dòng)子。在一個(gè)方面，編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的第二異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)該多核苷酸外源的啟動(dòng)子。在一個(gè)方面編碼丙酮酸羧化酶的第三異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)該多核苷酸外源的啟動(dòng)子。可以用許多方式操作多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可為啟動(dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸，如編碼蘋(píng)果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)的宿主細(xì)胞所識(shí)別的多核苷酸。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核β_內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另夕卜的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria〃于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,見(jiàn)上文描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列已由曲霉屬(Aspergilli)中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列已由構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見(jiàn)上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)其為對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號(hào)肽，并且指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列外源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的。或者，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見(jiàn)上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的，并且能夠通過(guò)前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的N端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及利用重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞和方法，所述重組表達(dá)載體包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸，如編碼蘋(píng)果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸?？晒┻x擇的是，可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)所述多核苷酸。在制備表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。在一個(gè)方面，每個(gè)編碼本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋(píng)果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸包含于各自獨(dú)立的載體上。在一個(gè)方面，兩個(gè)所述多核苷酸包含于一個(gè)載體上。在一個(gè)方面，所有編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋(píng)果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸包含于一個(gè)載體上。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外,可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘撸d體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對(duì)，400至10，000堿基對(duì)，和800至10，000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此夕卜，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1,ARS4,ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開(kāi)于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過(guò)在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上文)。宿主細(xì)胞如本文中所述，本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本文中所述的多核苷酸(例如編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋(píng)果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶)的多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)本文中所述的用于重組產(chǎn)生C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明還涵蓋使用此類(lèi)宿主細(xì)胞產(chǎn)生C4-二羧酸的方法。所述宿主細(xì)胞可包含任何一種或多種本文中所述的多核苷酸的組合。舉例而言，在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多肽，并任選地包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和/或編碼丙酮酸脫羧酶的異源多核苷酸；其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與不含有所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比產(chǎn)生(或能夠產(chǎn)生)更多量的C4-二羧酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含(I)異源多核苷酸，其編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如選自下組的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(a)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性；(b)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:I或3，或其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交；(c)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈具有至少60%序列同一性；(d)SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；(2)任選的異源第二多核苷酸，其編碼蘋(píng)果酸脫氫酶，如選自下組的蘋(píng)果酸脫氫酶(a)蘋(píng)果酸脫氫酶，其與SEQIDNO:12或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性；(b)蘋(píng)果酸脫氫酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:11或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDN0:11的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)蘋(píng)果酸脫氫酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與以下具有至少60%序列同一性(iv)SEQIDNO:11或其成熟多肽編碼序列，(v)SEQIDNO:11的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(d)SEQIDN0:12或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的蘋(píng)果酸脫氫酶變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有蘋(píng)果酸脫氫酶活性的片段；和(3)任選的異源第三多核苷酸，其編碼丙酮酸羧化酶，如選自下組的丙酮酸羧化酶(a)丙酮酸羧化酶，其與SEQIDNO:14或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性；(b)丙酮酸羧化酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:13的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)丙酮酸羧化酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與以下具有至少60%序列同一性(iv)SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列，(v)SEQIDNO:13的cDNA序列或其成熟多肽編碼序列，或(vi)(iv)或(V)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(d)SEQIDNO:14或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)、幾個(gè))的取代、缺失和/或插入的丙酮酸羧化酶變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有丙酮酸羧化酶活性的片段；其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與不含有所述一種或多種多核苷酸(例如不含有編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸)的宿主細(xì)胞相比產(chǎn)生(或能夠產(chǎn)生)更多量的C4-二羧酸。在一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸(例如SEQIDNO:I或3，或任何其所述的方面)和編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在本發(fā)明中，所述蘋(píng)果酸脫氫酶可為任何適于實(shí)踐本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶，如上文所述。在另一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸(例如SEQIDNO:I或3，或任何其所述的方面)和編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在本發(fā)明中，所述丙酮酸羧化酶可為任何適于實(shí)踐本發(fā)明的丙酮酸羧化酶，如上文所述。具體而言，所述丙酮酸羧化酶優(yōu)選為存在于宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的酶。在一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸(例如SEQIDN0:1或3，或任何其所述的方面)，編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的第二異源多核苷酸，和編碼丙酮酸羧化酶的第三異源多核苷酸。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使所述構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋任何親本細(xì)胞的后代，其由于在復(fù)制中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同。在一些情況下，宿主細(xì)胞的選擇會(huì)很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來(lái)源。下文中所述的方面適用于宿主細(xì)胞本身，以及使用宿主細(xì)胞的方法。所述宿主細(xì)胞可為任何能夠重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，和/或任何能夠重組產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的細(xì)胞(例如任何絲狀真菌細(xì)胞)。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲(chóng)鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221),電穿孔(參見(jiàn)，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(參見(jiàn)，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見(jiàn)，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見(jiàn)，例如，Gong等，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見(jiàn),例如,Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見(jiàn)，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見(jiàn)，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見(jiàn)，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tmmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孑L(參見(jiàn)，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見(jiàn)，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T(mén)子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(mén)(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見(jiàn)上，171頁(yè)中所引用)和所有有絲分裂抱子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見(jiàn)上)。所述真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(lèi)(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類(lèi)在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。所述酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細(xì)胞。所述真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(mén)(Eumycota)和卵菌門(mén)的亞門(mén)(如由Hawksworth等，1995，見(jiàn)上文,所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過(guò)菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。所述絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。所述絲狀真菌宿主細(xì)胞可為棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa>Ceriporiopsissubrufa、蟲(chóng)擬臘菌(Ceriporiopsissubvermispora)>Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>熱帶金孢子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺療側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。在另一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞是米曲霉。可以將真菌細(xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鍵抱屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,J.Bacteriol.153:163;和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一種或多種(例如兩種、幾種)本文中所述的多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與不含有所述一種或多種多核苷酸的宿主細(xì)胞相比分泌(或能夠分泌)增加水平的C4-二羧酸。在一些方面，所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與不含有所述一種或多種多核苷酸(例如不含有編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸)的宿主細(xì)胞相比，分泌(或能夠分泌)增加至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%水平的C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)。在本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的任何方面中，所述C4-二羧酸可為蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸或延胡索酸，或其組合。在一些方面中，所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸、琥珀酸或延胡索酸，或其組合。在一些方面中，所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸或延胡索酸，或蘋(píng)果酸和延胡索酸的組合。在一些方面中，所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸。在任何這些方面，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生(和/或能夠產(chǎn)生)高于理論值至少10%，例如至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%或至少90%的產(chǎn)率。在任何這些方面，所述重組宿主具有大于約0.lg/L每小時(shí)，例如，大于約0.2g/L每小時(shí),0.5g/L每小時(shí),0.6g/L每小時(shí),0.7g/L每小時(shí),0.8g/L每小時(shí),0.9g/L每小時(shí)，I.0g/L每小時(shí)，I.lg/L每小時(shí)，I.2g/L每小時(shí)，I.3g/L每小時(shí)，I.5g/L每小時(shí)，I.75g/L每小時(shí)，2.0g/L每小時(shí)，2.25g/L每小時(shí)，2.5g/L每小時(shí)，或3.0g/L每小時(shí)；或約0.lg/L每小時(shí)至約2.0g/L每小時(shí)，例如，約0.3g/L每小時(shí)至約I.7g/L每小時(shí)，約0.5g/L每小時(shí)至約I.5g/L每小時(shí)，約0.7g/L每小時(shí)至約I.3g/L每小時(shí)，約0.8g/L每小時(shí)至約I.2g/L每小時(shí)，或約0.9g/L每小時(shí)至約I.lg/L每小時(shí)的C4-二羧酸體積產(chǎn)量(volumetricproductivity)(例如蘋(píng)果酸體積產(chǎn)量)?？蓪⑺鲋亟M宿主細(xì)胞在適于產(chǎn)生C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋(píng)果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用如下所述的本領(lǐng)域中公知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋(píng)果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶，及其活性，可使用本領(lǐng)域中公知的方法檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可包括使用特異性抗體，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。參見(jiàn)，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999);及Hanai等，Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007))。方法本發(fā)明亦涉及使用本文中所述的重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生C4_二羧酸的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明涵蓋產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的方法，其包括(a)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任一種本文中所述的重組宿主細(xì)胞(例如任何具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，和優(yōu)選地，蘋(píng)果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶活性的宿主細(xì)胞)以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涵蓋產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的方法，其包括在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任一種本文中所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸和任選地，編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和/或編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸，以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。在一個(gè)方面，所述培養(yǎng)基是發(fā)酵培養(yǎng)基。在所述方法的一個(gè)方面，以大于約10g/L，例如，大于約25g/L，50g/L，75g/L，100g/L,125g/L,150g/L,160g/L,170g/L,180g/L,190g/L,200g/L,210g/L,225g/L,250g/L,275g/L，300g/L,325g/L，350g/L,400g/L,或500g/L;或約lOg/L至約500g/L,例如，約50g/L至約350g/L，約lOOg/L至約300g/L，約150g/L至約250g/L，約175g/L至約225g/L，或約190g/L至約210g/L的效價(jià)產(chǎn)生所述C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)。在所述方法的一個(gè)方面，產(chǎn)生的C4-二羧酸(例如蘋(píng)果酸)的量在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與不含有編碼所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，高至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%。在所述方法的一個(gè)方面，所述C4-二羧酸選自下組蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和延胡索酸。在一個(gè)方面，所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸。所述重組的C4-二羧酸可任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基使用任何本領(lǐng)域中已知的方法回收(參見(jiàn)例如，WO1998/022611和U.S.7，601，865)，所述方法包括但不限于層析(例如大小排阻層析，吸附層析，離子交換層析)，電泳方法，差示溶解度，滲透，蒸餾，提取(例如液液萃取)，滲透蒸發(fā)，提取性過(guò)濾(extractivefiItration),膜過(guò)濾，膜分離，反相(reverse)或超濾。在一個(gè)實(shí)例中，所述C4-二羧酸從發(fā)酵培養(yǎng)基中的其它材料通過(guò)過(guò)濾來(lái)回收。在所述方法的一些方面，在任選地純化之前和/或之后的重組C4-二羧酸是基本上純的。對(duì)于產(chǎn)生C4-二羧酸(或其具體C4-二羧酸，如蘋(píng)果酸)的方法，“基本上純的”意指含有不超過(guò)15%雜質(zhì)的回收的C4-二羧酸制備物，其中雜質(zhì)已知除了C4-二羧酸以外的化合物。在一個(gè)變化中，提供了基本上純的C4-二羧酸制備物，其中所述制備物含有不超過(guò)25%雜質(zhì),或不超過(guò)20%雜質(zhì),或不超過(guò)10%雜質(zhì),或不超過(guò)5%雜質(zhì),或不超過(guò)3%雜質(zhì),或不超過(guò)1%雜質(zhì)，或不超過(guò)0.5%雜質(zhì)。對(duì)本文中所述的產(chǎn)生方法和宿主細(xì)胞測(cè)試C4-二羧酸的產(chǎn)生的合適測(cè)定法可使用本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)進(jìn)行。舉例而言，最終C4-二羧酸產(chǎn)物(例如蘋(píng)果酸)和其它有機(jī)化合物，可通過(guò)如HPLC(高效液相色譜)，GG-MS(氣相色譜-質(zhì)譜)，和LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜)的方法或其它合適的分析方法使用本領(lǐng)域中公知的常規(guī)步驟進(jìn)行分析。在發(fā)酵液中C4-二羧酸的釋放亦可用培養(yǎng)上清進(jìn)行測(cè)試。在發(fā)酵培養(yǎng)基中的副產(chǎn)物和剩余的糖(例如葡萄糖)可通過(guò)HPLC使用例如用于葡萄糖和醇類(lèi)的折射率檢測(cè)器，和用于有機(jī)酸的UV檢測(cè)器(Lin等，Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或本領(lǐng)域中公知的其它合適的測(cè)定和檢測(cè)方法來(lái)定量。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下述實(shí)施例描述，其不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例用作緩沖液和底物是至少試劑級(jí)的商品。菌株使用棒曲霉NRRLl和煙曲霉((Sartoryafumigata)Af293作為C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的來(lái)源。使用米曲霉NRRL3488(或ATCC56747)作為丙酮酸羧化酶基因、蘋(píng)果酸脫氫酶基因的來(lái)源，并用于產(chǎn)生C4-二羧酸。培養(yǎng)基YEG培養(yǎng)基組成為20g葡萄糖，5g酵母提取物，和去離子水加至I升。COVE平板組成為1M蔗糖，2%C0VE鹽溶液，IOmM乙酰胺，15mMCsCl，和25g/lAgarNoble0COVE鹽溶液組成為26gKCl，26gMgSO4·7H20，76gKH2PO4,50mlCOVE痕量元素溶液，和去離子水加至I升。COVE痕量元素溶液組成為0.04gNa2B4O7·IOH2O,O.04gCuSO4·5H20，I.2gFeSO4·7Η20，0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20,IOgZnSO4·7H20和去離子水加至I升。種子培養(yǎng)基組成為40g葡萄糖,6gBacto-蛋白胨,750mgKH2PO4,750mgK2HPO4,IOOmgMgSO4·7H20,IOOmgCaCl2·H2O,5mgFeSO4·7H20，5mgNaCl，和去離子水加至I升。種子培養(yǎng)基13組成為30g葡萄糖，BactoPeptone,560mgKH2PO4,56OmgK2HPO4,925mgNaH2PO4·H20，820mgNa2HPO4,75mgMgSO4·7H20,75mgCaCl2·H20,0.75ml的1000X微量營(yíng)養(yǎng)物溶液(MicronutrientSolution),和去離子水加至I升。酸產(chǎn)生培養(yǎng)基C組成為100g葡萄糖，80gCaCO3,6gBactoPeptone,150mgKH2PO4,150mgK2HPO4,IOOmgMgSO4·7H20,IOOmgCaCl2·H2O,Iml1000X微量營(yíng)養(yǎng)物溶液，和去離子水加至I升。1000X微量營(yíng)養(yǎng)物溶液組成為5gNaCl，5gFeSO4·7Η20，Ig檸檬酸，和去離子水加至I升。PDA平板組成為39g/l馬鈴薯右旋糖瓊脂。實(shí)施例I:棒曲霉NRRLlC4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和表達(dá)載體pShThl20AcC4T的構(gòu)建將1179bpC4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因acc4t(ACLA_058030)人工構(gòu)建入pAcC4T(圖I；DNA2.O,MenloPark,CA,USA)。acc4t基因從pAcC4T使用下示的引物069735和069736擴(kuò)增引物069735:5’-GTGTGATAGAACATCGTCCATAATGTTCGAAAATCG-3’(SEQIDNO:5)引物069736:5’-GTCAGTCACCTCTAGTTAATTAACTAGTCTGCAGCATCCTCATC-3’(SEQIDNO:6)PCR反應(yīng)混合物組成為50ngpAcC4T模板，200μMdNTP混合物，50pM引物069735，50pM引物069736，IXPoll反應(yīng)緩沖液(NewEnglandBiolabs,MA,USA)，和I單位的VentPolymerase(NewEnglandBiolabs),和去離子水加至50μI。將PCR反應(yīng)物在EPPEND0RFMASTERCYCLER(EppendorfScientificInc.,ffestbury,NewYork,USA)中溫育，其程序如下1個(gè)循環(huán)，在94°C進(jìn)行3分鐘；35個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行15秒，59°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I分鐘，和I個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行5分鐘。PCR產(chǎn)物通過(guò)TAE緩沖液(50mMTris堿_50mM乙酸(鹽)-0.ImMEDTA二鈉鹽)中的1%瓊脂糖凝膠電泳純化，并使用Q丨AQUICKGelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化。將質(zhì)粒pShTh60(圖2;亦參見(jiàn)PCR申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002標(biāo)題為“MethodsforImprovingMalicAcidProductioninFilamentousFungi”,2010年8月27日提交)用SexAl和PacI消化，然后通過(guò)TBE緩沖液(10.8g/LTris堿，5.5g/L硼酸，2mMEDTA,pH8.O)中的O.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQU丨CKGelExtractionKit純化。然后將上述純化的PCR產(chǎn)物使用In-FusionCloningKit(Clontech,MountainView,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示插入消化的pShTh60,得到PShThl20AcC4T(圖3)。使用QIAfilterMaxiPlasmidIsolationKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分離質(zhì)粒pShThl20AcC4T。使用DNA序列分析使用下示的引物996270和065067使用ABI3130XLDNAAnalyzer(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)和具有染料終止子化學(xué)的引物步移技術(shù)(Giesecke等，1992，J.Virol.Methods38:47-60)以確認(rèn)acc4t編碼序列的完整性。引物996270:5’-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3’(SEQIDNO:7)引物065067:5，-TGACCTTCCACGCTGACCAC-3，(SEQIDNO:8)棒曲霉acc4t基因的核苷酸序列(SEQIDNO:I)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)示于圖4。117%的基因組編碼序列(包括終止密碼子)編碼392個(gè)氨基酸的多肽，其具有預(yù)測(cè)的43.4kDa的分子量和7.85的等電點(diǎn)pH。該基因不含內(nèi)含子。使用VectorNTI程序(Invitrogen，CA,USA)，預(yù)測(cè)了52個(gè)殘基的信號(hào)肽，導(dǎo)致預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有340個(gè)氨基酸。實(shí)施例2:煙曲霉Af293C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和表達(dá)載體pShThl21AfC4T的構(gòu)建。將1182bp的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列afc4t(AFUA_8G04630)人工構(gòu)建入pAfC4T(圖5；DNA2.0)。afc4t基因從pAfC4T使用下示的引物069737和069738擴(kuò)增。引物069737:5-GTGTGATAGAACATCGTCCATAATGTTCAACGATCATGATCA-3’(SEQIDNO:9)引物069738:5’-GTCAGTCACCTCTAGTTAATTAATTAATCTAGCACATCCTCGTC-3’(SEQIDNO:10)PCR反應(yīng)混合物組成為50ngpAtC4T模板，200μMdNTP混合物，50ρΜ引物069737，50ρΜ引物069738,IXPoll反應(yīng)緩沖液，I單位VentPolymerase和去離子水加至50μI。PCR反應(yīng)物在EPPENDORFMASTERCYCLER中溫育，其程序?yàn)?個(gè)循環(huán)在94°C進(jìn)行3分鐘，35個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在94V進(jìn)行15秒，59V進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I分鐘；和I個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行5分鐘。PCR產(chǎn)物在TAE緩沖液(50mMTris堿_50mM乙酸(鹽)-0.ImMEDTA二鈉)中的1%瓊脂糖凝膠電泳純化，并使用QiAQUICKGelExtractionKit純化。質(zhì)粒pShTh60(圖2)如上所述消化并純化。然后將上述純化的PCR產(chǎn)物使用InFusionCloningKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示插入消化的pShTh60,得到質(zhì)粒pShThl21AfC4T(圖6)。質(zhì)粒pShThl21AfC4T使用QIAfilterMaxiPlasmidIsolationKit分離。使用DNA序列分析使用如上所述的引物996270和065067確認(rèn)afc4t編碼序列的完整性。煙曲霉afc4t基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:4)示于圖7。1182bp的基因組編碼序列(包括終止密碼子)編碼393個(gè)氨基酸的多肽，其具有預(yù)測(cè)的43.8kDa的分子量和7.30的等電點(diǎn)pH。該基因不含內(nèi)含子。實(shí)施例3:將PShThl20AcC4T和PShThl21AfC4T的表達(dá)載體片段轉(zhuǎn)化入米曲霉NRRL3488(ShThl200和ShThl210)進(jìn)行米曲霉NRRL3488的原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化，即將大約2xl07個(gè)孢子接種入IOOmLYEG培養(yǎng)基，并將燒瓶在27°C以140rpm溫育16-18小時(shí)。收集菌絲體，即將培養(yǎng)物傾倒透過(guò)襯有MIRACLOTH(Calbiochem，SanDiego,CA,USA)的滅菌漏斗，并用50mL的O.7MKCl漂洗。將經(jīng)洗滌的菌絲體重懸于含有20mL原生質(zhì)體化溶液的125mL燒瓶，所述溶液包含每mLO.7MKCl(經(jīng)過(guò)濾滅菌)5mg的GLUCANEX(NovozymesA/S,BagSVierd,Denmark)和O.5mg的殼多糖酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA),并將該燒瓶在34°C以SOrpm混合溫育30分鐘。將原生質(zhì)體化溶液傾倒透過(guò)襯有MiRACLOTH的滅菌漏斗，并用50mL的STC緩沖液(1M山梨醇-IOmMTris-HClpH6.5-10mMCaCl2)漂洗。將流過(guò)物在兩個(gè)50mL聚丙烯管中收集。將管在室溫在離心機(jī)以1300xg旋轉(zhuǎn)10分鐘。棄去上清并將原生質(zhì)體沉淀重懸于20mL的STC緩沖液。洗滌原生質(zhì)體，即進(jìn)行兩輪的將沉淀重懸于20mL的STC并在室溫在1300xg離心10分鐘。將最終沉淀重懸于2mL的STC。對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，即移取10μI樣品并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(VWR，WestChester,PA,USA)中對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。用STC調(diào)整體積以獲得2xl07每mL的原生質(zhì)體濃度。通過(guò)用PmeI進(jìn)行限制性消化制備質(zhì)粒載體以供轉(zhuǎn)化。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體通過(guò)TBE緩沖液中的O.8%瓊脂糖凝膠電泳從載體序列分離大約5kb表達(dá)盒，并使用QIAQUICKGelExtractionKit進(jìn)行純化。對(duì)于每個(gè)表達(dá)載體準(zhǔn)備了四個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，將100μL原生質(zhì)體制備的溶液轉(zhuǎn)移至12mL聚丙烯管，對(duì)其添加2飛μg上述限制性消化的質(zhì)粒載體和250μI聚乙二醇溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG)，IOmMTris6.5，IOmMCaCl)接著進(jìn)行輕柔地混合，并在37°C溫育30分鐘。將每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)物用6mL的STC稀釋，接著將三個(gè)不同的等分試樣置于COVE平板上。然后將每個(gè)平板在34°C溫育7-10日。將所得的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至單個(gè)COVE平板，并在34°C溫育5日。通過(guò)將孢子收集于0.1%T\VEEN80來(lái)制備孢子儲(chǔ)液。儲(chǔ)藏培養(yǎng)物，即制備每個(gè)的甘油儲(chǔ)液(800μI孢子儲(chǔ)液，200μI0.1%TWEEN80)并凍結(jié)于_80°C。含有PShThl20AcC4T的表達(dá)載體片段的轉(zhuǎn)化體命名為ShThl200。含有PShThl21AfC4T的表達(dá)載體片段的轉(zhuǎn)化體命名為ShThl210。實(shí)施例4:在含有表達(dá)載體片段PShThl20AcC4T和PShThl21AfC4T的米曲霉轉(zhuǎn)化體(ShThl200和ShThl210)的搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生蘋(píng)果酸將來(lái)自如上所述的轉(zhuǎn)化體ShThl200和ShThl210和作為對(duì)照的米曲霉NRRL3488的孢子鋪板于單個(gè)COVE平板，并允許其在34°C進(jìn)行5至7日的孢子形成。在0.1%T\VEEN80中收集孢子，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。在含有IOOml的種子培養(yǎng)基B的250ml燒瓶中制備種子培養(yǎng)物，并用總共2xl08個(gè)孢子接種。將種子培養(yǎng)物在30°C以200rpm振蕩生長(zhǎng)大約17個(gè)小時(shí)。在含有50ml的酸產(chǎn)生培養(yǎng)基C和3ml的17小時(shí)種子培養(yǎng)物的250ml不帶擋板的燒瓶中制備酸產(chǎn)生培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30°C以200rpm振蕩溫育2-10日ο對(duì)于搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的蘋(píng)果酸定量通過(guò)使用1200SeriesBinaryLCSystem和1200SeriesDiodeArrayDetector(DAD)(AgilentTechnologies,SantaClara,CAUSA)的ReversePhaseHighPressureLiquidChromatography(RP-HPLC)進(jìn)行。使用Aqua5μC18!25A205x4.6mmID柱和AQC184x3.OmmSecurityGuardCartridge(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)進(jìn)行反向分離。流動(dòng)相由10%甲醇(HPLC級(jí))和90%145mM憐酸鹽pHI.5緩沖液組成。移出全培養(yǎng)樣品，并將其在由850ml的64mM磷酸鹽緩沖液和150ml的甲醇pHI.65組成的HPLCRunningBuffer中以I:10稀釋。然后將樣品透過(guò)25_0.45微米聚醚砜膜(Whatman,FlorhamPark,NJ,USA)進(jìn)行過(guò)濾，并將I.5ml濾過(guò)物置入HPLC小瓶進(jìn)行酸分析。將剩余量的搖瓶培養(yǎng)物透過(guò)3層粗濾布(cheesecloth)過(guò)濾,并用10體積的雙蒸無(wú)菌水漂洗三次以去除不溶的CaC03。從粗濾布收獲細(xì)胞沉淀，置入15ml培養(yǎng)管，并儲(chǔ)藏于-20。。。使用10μI的注入體積以0.7ml/分鐘(等度洗脫)的流速以25°C的柱溫度和11分鐘的運(yùn)行時(shí)間進(jìn)行RP-HPLC。檢測(cè)設(shè)定為210nm，8nm帶寬，參照為360nm，40nm帶寬。確定空白時(shí)間(voidtime)為3.8分鐘。通過(guò)進(jìn)行濃度范圍為49.2至3.93mM的系列稀釋的蘋(píng)果酸標(biāo)樣的重復(fù)注入，對(duì)于蘋(píng)果酸確定了反相方法的定量能力。對(duì)于重復(fù)注入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為彡5%。蘋(píng)果酸顯示R2彡0.9999。含有PShThl20AcC4T的米曲霉轉(zhuǎn)化體(菌株ShThl200)與米曲霉NRRL3488對(duì)照菌株相比顯示了蘋(píng)果酸產(chǎn)生方面的改善，并與米曲霉ShThl040菌株(參見(jiàn)2010年8月27日提交的PCR申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002)相比顯示相當(dāng)?shù)奶O(píng)果酸產(chǎn)生。含有PShThl21AfC4T的米曲霉轉(zhuǎn)化體(菌株ShThl210)與米曲霉NRRL3488對(duì)照菌株相比顯示了蘋(píng)果酸產(chǎn)生方面的略微改善，并與米曲霉ShThl040菌株相比顯示較低的蘋(píng)果酸產(chǎn)生。實(shí)施例5:含有PShThl20AcC4T的表達(dá)載體片段的米曲霉轉(zhuǎn)化體(ShThl200)的發(fā)酵。上述米曲霉轉(zhuǎn)化體和對(duì)照轉(zhuǎn)化體米曲霉ShThl040(參見(jiàn)2010年8月27日提交的PCR申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002)在32°C在PDA平板上生長(zhǎng)大約7日。將5_6ml體積的含有0.1%TWEEN80的滅菌的50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)添加至每個(gè)平板，并通過(guò)用接種環(huán)刮擦使孢子懸浮。通過(guò)移液將每個(gè)懸液轉(zhuǎn)移至50ml錐形管。對(duì)于每個(gè)管，將25ml的滅菌的磷酸鈉緩沖液添加至含有75ml的種子培養(yǎng)基的500ml不帶擋板的燒瓶，然后將其用2ml的孢子懸液接種。然后將燒瓶在32°C和ISOrpm溫育約24小時(shí)。合并所述種子燒瓶以供應(yīng)每罐所需的144ml接種物。通過(guò)導(dǎo)入144ml(8%)的來(lái)自米曲霉pShThl20AcC4T轉(zhuǎn)化體或米曲霉ShThl040轉(zhuǎn)化體的合并的種子燒瓶的種子培養(yǎng)液來(lái)分別接種含有I.8升的培養(yǎng)基的三升發(fā)酵罐。將發(fā)酵罐平衡于32±0.1°C并以500rpm攪拌。入口空氣流量維持在lv/v/m。每日取出樣品，并就蘋(píng)果酸產(chǎn)生進(jìn)行分析，且發(fā)酵在大約7日之后完成。發(fā)酵中蘋(píng)果酸的定量如實(shí)施例4中所述進(jìn)行。米曲霉PShThl20AcC4T(ShThl200)轉(zhuǎn)化體的相對(duì)蘋(píng)果酸效價(jià)類(lèi)似于米曲霉ShThl040轉(zhuǎn)化體，表明基于之前描述的ShThl040和NRRL3488的比較，米曲霉pShThl20AcC4T轉(zhuǎn)化體與米曲霉NRRL3488對(duì)照(其缺乏過(guò)表達(dá)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)相比性能更好。本發(fā)明可進(jìn)一步通過(guò)下述編號(hào)段落描述[I]一種產(chǎn)生C4-二羧酸的方法，其包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(i)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；·(ii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:1或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(iii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%，或100%序列同一性；(iv)SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；和(b)回收所述C4-二羧酸。[2]一種產(chǎn)生二羧酸的方法，其包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(i)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(ii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:1，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(iii)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一性；(iv)SEQIDN0:2或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；和(b)回收所述C4-二羧酸。[3]一種產(chǎn)生C4-二羧酸的方法，其包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(i)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:4或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(ii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(iii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:3或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一性；(iv)SEQIDN0:4或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；和(b)回收所述C4-二羧酸。[4]段[1]_[3]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDN0:2或4，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一1丨生。[5]段[1]_[4]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，低-中等嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件下，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[6]段[1]_[5]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%,至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[7]段[1]_[6]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2或4。[8]段[1]_[6]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2或4的成熟多肽序列。[9]段[8]的方法，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸53至392。[10]段[8]或[9]的方法，其中所述SEQIDNO:4的成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸I至393。[11]段[1]-[6]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:2或4的片段，其中所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。[12]段[1]_[6]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:2或4，或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。[13]段[1]_[12]任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[14]段[1]_[13]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸(例如，SEQIDNO:11的蘋(píng)果酸脫氫酶，或其任何描述的方面)。[15]段[14]的方法，其中所述編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[16]段[1]_[15]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸(例如SEQIDNO:13的丙酮酸羧化酶，或其任何描述的方面)。[17]段[16]的方法，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[18]段[1]_[17]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。[19]段[18]的方法，其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞選自枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cyptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、根霉屬(Rhizopus)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)和木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。[20]段[19]的方法，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。[21]段[20]的方法，其中所述曲霉屬宿主細(xì)胞是米曲霉宿主細(xì)胞。[22]段[1]_[21]任一項(xiàng)的方法，其中C4-二羧酸的水平在相同條件下培養(yǎng)與不具有所述異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比時(shí)增加至少25%，例如至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%。[23]段[1]_[22]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸選自蘋(píng)果酸，琥珀酸，草酰乙酸，丙二酸，和延胡索酸。[24]段[23]的方法，其中所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸。[25]一種增加C4-二羧酸產(chǎn)生的方法，其包括(a)將編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(i)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(ii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:1或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(iii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%，或100%序列同一性；(iv)SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；和(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的生物；和(C)回收所述C4-二羧酸。[26]一種增加C4-二羧酸產(chǎn)生的方法，其包括(a)將編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(i)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2的成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(ii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:1或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(iii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一性；(iv)SEQIDN0:2的成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；和(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的生物；和(C)回收所述C4-二羧酸。[27]一種增加C4-二羧酸產(chǎn)生的方法，其包括(a)將編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(i)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:4或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性；(ii)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件與以下雜交SEQIDN0:3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(iii)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:3或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一性；(iv)SEQIDN0:4或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；和(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的生物；和(C)回收所述C4-二羧酸。[28]段[25]-[27]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDN0:2或4，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一1丨生。[29]段[25]-[28]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，低-中等嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[30]段[25]-[29]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%,至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[31]段[25]-[30]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2或4。[32]段[25]-[30]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2或4的成熟多肽序列。[33]段[32]的方法，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸53至392。[34]段[32]或[33]的方法，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸I至393。[35]段[25]-[30]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:2或4的片段，其中所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。[36]段[25]-[30]任一項(xiàng)的方法，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。[37]段[25]-[36]任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[38]段[25]_[37]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸(例如SEQIDNO:11的蘋(píng)果酸脫氫酶，或其任何描述的方面)。[39]段[38]的方法，其中所述編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[40]段[25]-[39]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸(例如SEQIDNO:13的丙酮酸羧化酶，或任何其描述的方面)。[41]段[40]的方法，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[42]段[25]-[41]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。[43]段[42]的方法，其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞選自枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、根霉屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬和木霉屬細(xì)胞。[44]段[43]的方法，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。[45]段[44]的方法，其中所述曲霉屬宿主細(xì)胞是米曲霉宿主細(xì)胞。[46]段[25]-[45]任一項(xiàng)的方法,其中C4-二羧酸的水平在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與不具有所述編碼異源多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞相比增加至少25%，例如至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%。[47]段[25]_[46]任一項(xiàng)的方法,其中所述C4-二羧酸選自蘋(píng)果酸,琥拍酸,草酰乙酸，丙二酸，和延胡索酸。[48]段[47]的方法，其中所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸。[49]一種宿主細(xì)胞，其包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(a)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交=SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1或3，或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(e)(a)，(b)，(c)或⑷的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與不具有所述異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比分泌增加水平的C4-二羧酸。[50]一種宿主細(xì)胞，其包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(a)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:2或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交=SEQIDN0:1，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一性；(d)SEQIDNO:2或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(e)(a)，(b)，(c)或⑷的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與不具有所述異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比分泌增加水平的C4-二羧酸。[51]一種宿主細(xì)胞，其包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(a)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDNO:4或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交=SEQIDN0:3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:3或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一性；(d)SEQIDN0:4或其成熟多肽序列的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(e)(a)，(b)，(c)或⑷的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與不具有所述異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比分泌增加水平的C4-二羧酸。[52]段[49]-[51]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:2或4，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[53]段[49]-[52]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格條件，低-中等嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交=SEQIDNO:I或3，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[54]段[49]-[53]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3，或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[55]段[49]_[54]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成·為SEQIDNO:2或4。[56]段[49]_[54]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDNO:2的成熟多肽序列。[57]段[56]的宿主細(xì)胞，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸53至392。[58]段[56]或[57]的宿主細(xì)胞，其中SEQIDNO:4的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸I至393。[59]段[49]_[54]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:2或4的片段，其中所述片段具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。[60]段[49]_[54]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是SEQIDN0:2或4的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。[61]段[49]-[60]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[62]段[49]-[61]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸(例如SEQIDNO:11的蘋(píng)果酸脫氫酶，或其任何描述的方面)。[63]段[63]的宿主細(xì)胞，其中所述編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[64]段[49]-[63]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸(例如SEQIDN0:13的丙酮酸羧化酶，或其任何描述的方面)。[65]段[64]的宿主細(xì)胞，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。[66]段[49]-[64]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。[67]段[66]的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、根霉屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、檢囷屬和木霉屬細(xì)胞。[68]段[67]的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。[69]段[68]的宿主細(xì)胞，其中所述曲霉屬宿主細(xì)胞是米曲霉宿主細(xì)胞。[70]段[49]-[69]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與不具有所述編碼異源多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞相比能夠分泌至少25%，例如至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%的增加水平的C4-二羧酸。[71]段[49]-[70]任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸選自蘋(píng)果酸，琥珀酸，草酰乙酸，丙二酸，和延胡索酸。[72]段[71]的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸。權(quán)利要求1.一種宿主細(xì)胞，其包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自(a)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與SEQIDN0:2或4的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格條件下與以下雜交SEQIDNO:1，3的成熟多肽編碼序列，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I或3的成熟多肽編碼序列具有至少65%序列同一性；(d)SEQIDNO:2或4的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)、幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變體；和(e)(a)，(b)，(c)或(d)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段；其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與不具有所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比分泌增加水平的C4-二羧酸。2.權(quán)利要求I的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:2或4的成熟多肽具有至少90%序列同一性。3.權(quán)利要求I的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:2或4的成熟多肽具有至少95%序列同一'丨生。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與以下雜交SEQIDNO:1、3的成熟多肽編碼序列，或它們的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交SEQIDNO:1、3的成熟多肽編碼序列，或它們的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含SEQIDNO:2或4的成熟多肽或由SEQIDNO:2或4的成熟多肽組成。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸53至392，而SEQIDNO:4的成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸I至393。8.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含SEQIDNO:2或4或由SEQIDNO:2或4組成。9.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含SEQIDNO:2或由SEQIDNO:2組成。10.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含SEQIDNO:4或由SEQIDNO:4組成。11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸。13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸。15.權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對(duì)所述多核苷酸外源的啟動(dòng)子。16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞選自枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cyptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、根霉屬(Rhizopus)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)和木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。18.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。19.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述曲霉屬宿主細(xì)胞是米曲霉(Aspergillusoryzae)宿主細(xì)胞。20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與不具有所述編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞相比能夠分泌至少25%的增加水平的C4-二羧酸。21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸是蘋(píng)果酸。22.—種產(chǎn)生C4-二羧酸的方法，其包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述C4-二羧酸。23.—種增加C4-二羧酸產(chǎn)生的方法，其包括(a)將編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，得到權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(c)回收所述C4-二羧酸。全文摘要本發(fā)明涉及產(chǎn)生C4-二羧酸如蘋(píng)果酸的方法，其包括(a)培養(yǎng)包含編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述C4-二羧酸。本發(fā)明亦涉及增加C4-二羧酸產(chǎn)生的方法，以及包含所述多核苷酸的宿主細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N1/16GK102947458SQ201180030913公開(kāi)日2013年2月27日申請(qǐng)日期2011年6月21日優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日發(fā)明者S.盧特林格,D.亞維爾申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司