專利名稱：用于改進植物的農(nóng)藝學(xué)性狀的udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
領(lǐng)域涉及作物育種和遺傳學(xué)，且具體地，涉及可用于在植物中賦予干旱耐受性和產(chǎn)量增加的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
非生物脅迫是全世界作物損失的主要原因，造成主要作物的超過50%的平均產(chǎn)量損失(Boyer, J.S.(1982) Science 218:443-448; Bray, E.A.等人(2000) InBiochemistry and Molecular Biology of Plants, Edited by Buchannan, B.B.等人,Amer.Soc.Plant Biol.,第1158-1249頁)。在各種非生物脅迫中，干旱是限制全世界作物產(chǎn)量的一個主要因素。處于不同發(fā)育階段的植物向水限制環(huán)境的暴露，似乎會活化多種生理和發(fā)育變化。對干旱脅迫感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐受性的基礎(chǔ)生化和分子機制的理解是生物學(xué)的一項重大挑戰(zhàn)。高等植物中的光合反應(yīng)依賴于葉綠體類囊體膜系統(tǒng)。葉綠體類囊體裝配和維護需要膜組分的連續(xù)供給。含有半乳糖的甘油脂是植物、藻類和藍細菌中的光合膜的主要脂質(zhì)組分。2種最常見的半乳糖脂是單半乳糖基二?；视秃投肴樘腔；视?MGDG和DGDG)，它們分別占總類囊體脂質(zhì)的約50和25 mol%。所有植物脂質(zhì)中的約80%與光合膜有關(guān)，MGDG被認為是地球上最豐富的膜脂質(zhì)。半乳糖脂在光合膜的組構(gòu)中和在它們的光合活性中起重要作用。在植物中，在2個不同的步驟中合成MGDG:⑴UDP-葡萄糖4_差向異構(gòu)酶(UGE)將 UDP-D-葡萄糖(UDP-Glc)轉(zhuǎn)化成 UDP-D-半乳糖(UDP-Gal)JP (ii) MGDG 合酶(MGDl)將半乳糖基殘基從M)P-Gal轉(zhuǎn)移至二酰基甘油(DAG)，用于合成終產(chǎn)物。MGDl定位在內(nèi)葉綠體被膜，并使用M )P-Gal作為底物。植物具有復(fù)雜的糖生物合成機制，所述機制包括這樣核苷酸糖家族，所述核苷酸糖可以在它們的糖基部分處被核苷酸糖互變酶修飾以產(chǎn)生不同的糖。UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(也稱作UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶，UGE; EC 5.1.3.2)會催化UDP-Glc和UDP-Gal的互變。從植物鑒別出的UGE缺少跨膜基序和信號肽，且似乎作為可溶性的實體存在于細胞質(zhì)中。通常，植物UDP-Glc差向異構(gòu)酶定位于胞質(zhì)溶膠，它們的底物UDP-Glc和UDP-Gal在這里以高水平存在。作為用于在葉綠體中合成半乳糖脂MGDG的前體，UDP-Gal被普遍認為是從胞質(zhì)溶膠運動，因為M)P-Gal濃度在質(zhì)體內(nèi)相對較低，MGDG合酶(MGDl)與內(nèi)被摸有關(guān)。為了研究控制植物中的光合活性和碳同化的基因，鑒別出了具有減少的光同化物和產(chǎn)量生成的稻生長矮小突變體光同化物缺陷型7細沿)。本文公開了一種新穎的定位于葉綠體的UDP-Glc差向異構(gòu)酶,其涉及光合膜生物發(fā)生(biogenesis)過程中葉綠體半乳糖脂生物合成的M)P-Gal供給
發(fā)明內(nèi)容
公開了質(zhì)體UDP葡萄糖差向異構(gòu)酶、它的同系物和使用方法。PHDl的轉(zhuǎn)基因表達會增加光合活性和增強生長。本文討論了 PHD1、其同系物和功能片段在光合能力和碳同化物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用。本公開內(nèi)容包括:
在一個實施方案中，一種植物，所述植物在它的基因組內(nèi)包含重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自下述的核苷酸序列:(a)編碼具有質(zhì)體差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有與SEQ ID NO: 1-17相比至少60%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，其中逐對比對的默認參數(shù)為:KTUPLE=1，GAP PENALTY=3,WIND0W=5和DIAGONALS SAVED=5, (b)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交，(c)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個核苷酸，從SEQ ID NO: 18-34衍生出所述核苷酸序列，(d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1，和(e)包含SEQ ID NO: 18的核苷 酸序列，且其中與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出增加的干旱耐受性。所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。在一個實施方案中，所述PHDl多肽不具有SEQ ID NO:1的N-端葉綠體轉(zhuǎn)運肽1-62氨基酸或在其它PHDl同系物中的對應(yīng)等效肽。例如，在植物細胞中(例如，在質(zhì)體中)，表達基本上缺少編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的區(qū)域的核苷酸分子。在一個實施方案中，將葉綠體轉(zhuǎn)運肽(SEQ ID NO:1的1-62氨基酸，或與SEQ IDNO:1的62個氨基酸的N-端區(qū)域基本上類似的序列)與用于將表達的蛋白/肽運輸進葉綠體中的異源肽融合。 在另一個實施方案中，一種植物，所述植物在它的基因組內(nèi)包含重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自下述的核苷酸序列:(a)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有與SEQ ID NO: 1-17相比至少60%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，其中逐對比對的默認參數(shù)為:KTUPLE=I, GAP PENALTY=3,WIND0W=5和DIAGONALS SAVED=5, (b)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交，
(c)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個核苷酸，從SEQ ID NO: 18-34衍生出所述核苷酸序列，(d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1，和(e)包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列，且其中與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出產(chǎn)量增加。在水限制條件下，與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比，所述植物可以表現(xiàn)出所述產(chǎn)量增加。所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。在另一個實施方案中，一種增加植物的干旱耐受性的方法，所述方法包括:(a)向可再生的植物細胞中導(dǎo)入重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自下述的核苷酸序列:(i)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有與SEQ ID NO: 1-17相比至少60%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，其中逐對比對的默認參數(shù)為:KTUPLE=1，GAP PENALTY=3, WINDOW=5 和 DIAGONALS SAVED=5, (ii)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ IDNO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交，(iii)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個核苷酸，從SEQ ID NO: 18-34衍生出所述核苷酸序列，(iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1，和(V)包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列；和(b)從步驟(a)以后的可再生的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在它的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增加的干旱耐受性。所述方法可以另外包括:(c)獲得從所述轉(zhuǎn)基因植物衍生出的后代植物，其中所述后代植物在它的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增加的干旱耐受性。在另一個實施方案中，一種評價植物的干旱耐受性的方法，所述方法包括:(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在它的基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自下述的核苷酸序列:(i)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有與SEQID NO: 1-17相比至少60%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，其中逐對比對的默認參數(shù)為:KTUPLE=1，GAP PENALTY=3，WIND0W=5和DIAGONALS SAVED=5, (ii)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交，(iii)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個核苷酸，從SEQ ID NO: 18-34衍生出所述核苷酸序列，(iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1，和(V)包含SEQ IDNO: 18的核苷酸序列和(b)獲得從(a)的轉(zhuǎn)基因植物衍生出的后代植物，其中所述后代植物在它的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；和(c)與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比，評價所述后代植物的干旱耐受性。在另一個實施方案中，一種測定植物的農(nóng)藝學(xué)特性的改變的方法，所述方法包括:(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在它的基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自下述的核苷酸序列:(i)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有與SEQID NO: 1-17相比至少60%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，其中逐對比對的默認參數(shù)為:KTUPLE=1，GAP PENALTY=3，WIND0W=5和DIAGONALS SAVED=5, (ii)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交，(iii)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個核苷酸，從SEQ ID NO: 18-34衍生出所述核苷酸序列，(iv)編碼多肽的核苷酸序列，其 中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1，和(V)包含SEQID NO: 18的核苷酸序列和(b)獲得從步驟(a)的轉(zhuǎn)基因植物衍生出的后代植物，其中所述后代植物在它的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；和(c)測定所述后代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)藝學(xué)特性的改變。所述測定步驟(c)可以包括:在水限制條件下，與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比，測定所述轉(zhuǎn)基因植物是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)藝學(xué)特性的改變。所述至少一種農(nóng)藝學(xué)特性可以是產(chǎn)量，而且可以是產(chǎn)量增加。在另一個實施方案中，一種分離的多核苷酸，其包含選自下述的核苷酸序列:(a)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有與SEQ ID NO: 1-17相比至少60%、80%、85%、90%或95%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，其中逐對比對的默認參數(shù)為:KTUPLE=1，GAP PENALTY=3，WIND0W=5和DIAGONALS SAVED=5, (b)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交，(c)編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個核苷酸，從SEQ ID NO: 18-34衍生出所述核苷酸序列，(d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1，和(e)包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。在另一個實施方案中，一種分離的多核苷酸，其包含本公開內(nèi)容的核苷酸序列的完整互補體,其中所述完整互補體和本公開內(nèi)容的核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，且是100%互補的。在另一個實施方案中，一種重組DNA構(gòu)建體，其包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的、本公開內(nèi)容的分離的多核苷酸。在另一個實施方案中，一種細胞，其包含本公開內(nèi)容的重組DNA構(gòu)建體，其中所述細胞選自:細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞和植物細胞。

在另一個實施方案中，一種植物或種子，其包含本公開內(nèi)容的重組DNA構(gòu)建體。所述植物或種子可以是單子葉植物或雙子葉植物的植物或種子。在另一個實施方案中，一種用于分離由本公開內(nèi)容的重組DNA構(gòu)建體編碼的多肽的方法，其中所述方法包括下述步驟:(a)用本公開內(nèi)容的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞；(b)在適合表達所述重組DNA構(gòu)建體的條件下，培養(yǎng)步驟(a)的轉(zhuǎn)化的細胞；和(c)從步驟(b)的轉(zhuǎn)化的細胞中分離所述多肽。在另一個實施方案中，一種載體，其包含本公開內(nèi)容的多核苷酸。在另一個實施方案中，一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括:用本公開內(nèi)容的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，和從所述轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容包括本公開內(nèi)容的任一種植物，其中所述植物選自:玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和糖用甜菜。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容包括本公開內(nèi)容的任一種方法，其中所述植物選自:玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和糖用甜菜。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容包括本公開內(nèi)容的任一種植物的種子，其中所述種子在它的基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控元件可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO:1相比至少60%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，且其中從所述種子生產(chǎn)的植物表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增加的干旱耐受性或產(chǎn)量增加或二者。附圖和序列表說明
從下面的詳細描述以及附圖和序列表中，可以更完整地理解本公開內(nèi)容，所述附圖和序列表形成本申請的一部分。

圖1顯示了突變體表型。(A)在MS培養(yǎng)基上生長的2周齡幼苗。(B和C)在水稻田中生長的2月齡(B)和4月齡(C)植物的生長表型。(D)收獲的圓錐花序表現(xiàn)出降低的#沿-7結(jié)籽率。(A-D)野生型(左)和/7M/-7 (右)。(E-G)每株植物分蘗數(shù)(E)、結(jié)實率(F)和粒重(G)的農(nóng)業(yè)特性定量。每個條是30個重復(fù)樣品的平均值土標準差。(H，I) Phdl-1和野生型的蔗糖(H)和淀粉(I)含量的晝夜變化。收獲處于開花期的各個野生型和/At/7-7植物的成熟葉子，并立即在液氮中冷凍。每個點是10個重復(fù)樣品的平均值土標準差。圖2顯示了的分子鑒別。(A) PHDl基因的結(jié)構(gòu)和它在3個phdl等位基因中的突變位點。PHDl基因由9個 外顯子(綠框)和8個內(nèi)含子(灰線)組成。指示了在3個/等位基因中的核苷酸插入和置換。(B，C) 突變體的功能互補。(B)處于分蘗期的野生型、/^￠/7-7取IWM^phcn-1+PHDl植物的表型。通過半定量RT-PCR，檢測轉(zhuǎn)錄物的表達水平。(C)處于開花期的野生型、/At//-7和互補系-7+/%07植物在白天正午時旗葉中的蔗糖和淀粉含量。誤差棒代表8個不同個體的標準差。突變體和野生型之間的顯著差異Od=0.05)。圖3顯示了 PHDl的系統(tǒng)進化分析。從綠色植物中的PHDl (0s01g0367100)同系物的氨基酸序列，推斷出MEGA4鄰近連接樹。自展值(Bootstrap value)是基于1000次復(fù)制，并指示在它們各自的結(jié)點處。比例條指示基于分支長度的遺傳距離。構(gòu)建的樹的比對顯示在圖S3中。圖4 Ml示飛PHDl表達分析和PHDl蛋白亞細胞定位。(A)在即將到開花期之前，根、桿、花、葉片和葉鞘中的基因的RNA凝膠印跡分析。(B-E)通過mRNA原位雜交檢測的表達譜。在莖干頂端分生組織和嫩葉(B)、維管束周圍的葉肉細胞(C)、幼花序(D)和腋芽(E)處檢測到的/^2信號。在(B), (C)和(E)中，條=150im在(D)中條=500im。(F)用35S::GFP (下圖)和35S: -.PHDl-GW (上圖)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的稻原生質(zhì)體。葉綠素自發(fā)熒光(中)；GFP熒光(左)；合并的圖像(右)。條=5im0圖5 Ml示飛在phdH植物的葉子的UDP-Gal生物合成和碳水化合物分配中涉及的關(guān)鍵基因的表達分析。(A)在UDP-Gal生物合成途徑中涉及的基因的表達在-7中被增量調(diào)節(jié)。(B)淀粉生物合成基因的表達在#沿-7中被減量調(diào)節(jié)。(C)蔗糖裂解基因的表跳PhdH中被增量調(diào)節(jié)。將表達值顯示為相對于稻18S RNA的表達比(平均值土標準誤)。用3個生物學(xué)重復(fù)樣本進行所有試驗。圖6顯示了phdl植物中的UDP-糖含量和糖脂組成。⑷在野生型、#￠/7-7和PHDl-補足的植物的葉子中的UDP-Glc和UDP-Gal含量。所述值代表6個獨立實驗的平均值土標準誤。(B)在水稻田中生長的野生型、-7和補足的植物的葉子中的極性脂質(zhì)組成。通過TLC分離葉脂質(zhì)，通過GC定量甘油脂。所述條顯示了以mol%計的脂質(zhì)組成，并指示3次測量的平均值土標準差。UDP-Glc，UDP-葡萄糖；UDP-Gal，UDP-半乳糖；FW，鮮重；PC，磷脂酰膽堿；PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；SQDG，磺基奎諾
糖基二?；视汀D7顯示了過表達的轉(zhuǎn)基因稻的改良的農(nóng)業(yè)特性。(A)在水稻田中生長的處于灌漿期的野生型、-7和轉(zhuǎn)基因系S3的表型差異。(B)野生型、/^沿-7和過表達的轉(zhuǎn)基因系(S3、S5和S8)中的PHDl蛋白表達的免疫印跡分析。顯示了微管蛋白作為加載對照。在轉(zhuǎn)基因系中觀察到增加的PHDl蛋白積累。(C，D)在轉(zhuǎn)基因植物中，每株籽粒產(chǎn)量(C)和收獲后營養(yǎng)器官干重(D)增加。值是得自至少30個植物/系的平均值土標準差。*顯著差異0° < 0.05)。圖8顯示了 PHDl在葉綠體膜的半乳糖脂生物合成途徑中的作用的示意模型。與包含PHDl的途徑一起，指示了在正常生長條件下的2種甘油糖脂的生物合成路線圖。Glc-1-P，葡萄糖-1-磷酸；UGP，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；DAG，二?；视?；UTP，尿苷-5’ -三磷酸鹽；PPi，焦磷酸鹽。圖9顯示了 #沿-7和WT的己糖濃度的晝夜變化。收獲各個野生型( 黑色符號+實線)^phdl-1 (〇空心符號+虛線)植物的成熟葉子，并立即在液氮中冷凍。每個點是10個重復(fù)樣品的平均值土標準差。圖10顯示了在野生型和3個等位基因突變體中的轉(zhuǎn)錄物水平。通過ACTINl轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR檢測，證實了樣品中RNA的相同豐度。phdl~l至-3, 3個等位基因Phdl突變體系；S3-1，過表達的轉(zhuǎn)基因系。圖11是得自PHDl和綠色植物同系物序列的17個保守區(qū)的對比。使用BLASTP，搜索所述序列，并使用CLUSTALW進行比對。相同的氨基酸殘基帶有框，類似的殘基帶有陰影。紅色條指示保守基序GXGXXG (NAD+-結(jié)合)，活性部位的催化氨基酸殘基帶有紅色框。PHDl: 0s01g0367100。

圖12顯示了 PHDl的生化功能和遺傳互補試驗。(A) PHDl的體外UGE活性試驗。純化的重組PHDl UGE活性在30°C (■)和在37°C (□)時的利-伯二氏標繪圖。(B) PHDl可以互補釀酒酵母識770突變體。用含有cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母識770突變株，并在葡萄糖或半乳糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。序列描述和所附序列表符合在37 C.F.R.§1.821-1.825中闡述的關(guān)于專利申請的核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)則。序列表含有核苷酸序列字符的單字母代碼和氨基酸的3字母代碼，它們的定義與通過引用并入本文中的Acids Res.7J: 3021-3030 (1985) M Biochemical J.219 (N0.J ；:345-373 (1984)所述的IUPAC-1UBMB標準相一致。為核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)使用的標識和格式符合在37 C.F.R.§1.822中所述的規(guī)則。
具體實施例方式PHDl編碼參與葉綠體半乳糖脂的生物合成的新穎的稻質(zhì)體UGE。在中的突變會導(dǎo)致被擾亂的碳同化體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和受損的光合效率。PHDl編碼定位于葉綠體的有活性的差向異構(gòu)酶，因此，可以在葉綠體中在原位產(chǎn)生用于MGDG生物合成的UDP-Gal底物(圖8)。該令人驚訝的結(jié)果提供了一種遺傳和生化框架，以工程化質(zhì)體中的該UGE的新穎功能機制，并評價半乳糖脂在植物(包括稻)的光合活性中的作用。
MGDl被視作對于類囊體膜生物發(fā)生而言最重要的MGDG合酶的一種同種型。在擬南芥屬中，另外兩種MGDG合酶MGD2和MGD3被靶向外葉綠體被膜，在此處可以從胞質(zhì)溶膠補充底物。由它們產(chǎn)生的MGDG可以從外被膜移動至內(nèi)被膜和移動至類囊體。在本文中，經(jīng)證實，與野生型相比，在-7中的主要半乳糖脂MGDG的相對量減少了 19%，而D⑶G的相對量僅輕微減少了 2.5%。但是，發(fā)現(xiàn)幾種磷脂的mol%量的輕微增加會補償在/^沿-7突變體中喪失的大約7 mol%的半乳糖脂。這些結(jié)果與下述觀念相一致:在植物中相反地控制糖脂和磷脂的量，以維持類囊體膜中的脂質(zhì)的適當平衡。在正常生長和發(fā)育過程中，大部分半乳糖脂定位于質(zhì)體膜，但是，在磷酸鹽(Pi)饑餓以后，DGDG還可以存在于質(zhì)體外膜中。另外，在藍細菌中的光合蛋白的X-射線結(jié)晶分析，揭示了 MGDG與光系統(tǒng)I和II (PSI和PSII)的反應(yīng)中心的核心有關(guān)，這表明，這些脂質(zhì)不僅作為光合膜的主要組分而被需求，而且被用于光合反應(yīng)本身。Iphdl-1突變體中，光系統(tǒng)II的光化學(xué)能量轉(zhuǎn)換的有效量子產(chǎn)率(Gpsii)下降。缺少MGDG的幼苗被證實具有破裂的光合膜，這會導(dǎo)致光合能力和光合自養(yǎng)生長的完全損害。MGDG在/^沿-7突變體中下降至野生型水平的80%，會導(dǎo)致生長緩慢、光合能力下降和光同化物積累減少的顯著表型。phdl-1突變體的生長矮小表型可以歸因于，在植物生長過程中支持葉綠體增殖的膜結(jié)構(gòu)單元的供給不足,這也與突變體植物中的葉綠體尺寸減小相一致。這些效應(yīng)可以歸因于葉綠體膜中的MGDG的絕對量的減少或半乳糖脂與磷脂之比的減小。在植物中，淀粉 的作用是，作為白天在葉子中生產(chǎn)的還原碳的倉庫，并作為夜間化學(xué)能和合成代謝源分子的補給。在Phdl-1突變體中，淀粉生物合成基因(諸如
和M)在源葉中的表達水平顯著地減量調(diào)節(jié)，這會導(dǎo)致淀粉含量的急劇下降。但是，減少的淀粉不會導(dǎo)致增加的蔗糖水平，因為蔗糖裂解基因SuSyl和WV1I3的活化會導(dǎo)致減少的蔗糖和增加的己糖-磷酸和UDP-Glc水平。因此，蔗糖作為在源器官中生產(chǎn)的光同化物的主要運輸形式，不能有效地運輸至庫器官。此外，由SuSyl或UGP2催化的大量UDP-Glc會被細胞溶質(zhì)的OsUGEl/4轉(zhuǎn)化成UDP-Gal，并作為葉綠體糖脂的半乳糖基供體運輸進葉綠體中，以補償#沿-7突變體中的PHDl活性損失。相比而言，在稻中的/%幻2過表達(其會增強葉綠體中的PHDl活性，且可能增加MGDG的相對量，并增加類囊體膜中的光化學(xué)能量轉(zhuǎn)換的有效量子產(chǎn)率)會導(dǎo)致增加的光合效率和生長速率，這暗示PHDl在植物(包括稻)的光合系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。生物量生產(chǎn)和籽粒產(chǎn)量的這些提高，在傳統(tǒng)的作物改良和生物能作物生產(chǎn)中都具有重大的經(jīng)濟意義。本文所述的每篇參考文獻的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。如在本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一種”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文清楚地作出相反說明。因而，例如，“一種植物”包括多種這樣的植物，“一個細胞”包括I個或多個細胞和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，依此類推。如本文使用的:
多肽的“差向異構(gòu)酶活性”是指，能夠執(zhí)行UDP-Gal向UDP-Glc的催化的肽。術(shù)語“單子葉植物”和“單子葉的植物”在本文中可互換地使用。本公開內(nèi)容的單子葉植物包括禾本科。術(shù)語“雙子葉植物”和“雙子葉的植物”在本文中可互換地使用。本公開內(nèi)容的雙子葉植物包括下述科:十字花科、豆科和茄科。
術(shù)語“完整互補體”和“全長互補體”在本文中可互換地使用，并表示給定的核苷酸序列的互補體，其中所述補體和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，且是100%互補的。“擬南芥屬”和“擬南芥”在本文中可互換地使用，除非另外指出?！耙驯磉_序列標志”(“EST”)是從cDNA文庫衍生出的DNA序列，并因此是已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的序列。EST通常通過cDNA插入片段的單個測序通路而得到。整個cDNA插入片段的序列稱作“全插入物序列”(“FIS”)。“毗連群”序列是從2個或更多個序列(其可以選自、但不限于EST、FIS和PCR序列)裝配成的序列。編碼整個蛋白或功能蛋白的序列被稱作“完整基因序列”(“CGS”)，且可以從FIS或毗連群衍生出。“農(nóng)藝學(xué)特性”是一種可測量的參數(shù)，包括、但不限于:綠度(greenness)、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟鮮重、成熟干重、果實產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物氮含量、果實氮含量、種子氮含量、營養(yǎng)組織中的氮含量、總植物游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織中的游離氨基酸含量、總植物蛋白含量、果實蛋白含量、種子蛋白含量、營養(yǎng)組織中的蛋白含量、干旱耐受性、氮吸收、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植物高度、穗高度、穗長度、鹽耐受性、早期幼苗活力和在低溫脅迫下的出苗?！稗D(zhuǎn)基因的”是指，其基因組已經(jīng)因為存在異源核酸而改變的任意細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，所述異源核酸是例如重組DNA構(gòu)建體，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性繁殖建立的那些。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”不包括通過常規(guī)植物育種方法或通過天然存在的事件對基因組(染色體的或染色體外)的改變，所述天然存在的事件例如隨機的異體受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變。當應(yīng)用于植物細胞時，“基因組”不僅包括在核內(nèi)發(fā)現(xiàn)的染色體DNA，而且包括在細胞的亞細胞組分(例如，線粒體、質(zhì)體)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細胞器DNA。“植物”包括完整植物、植物器官、植物組織、種子和植物細胞和它們的后代。植物細胞包括、但不限于，來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細胞?！昂蟠卑参锏娜我夂罄m(xù)世代?！稗D(zhuǎn)基因植物”包括在基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如，所述異源多核苷酸穩(wěn)定整合入基因組中，使得該多核苷酸傳遞連續(xù)世代。所述異源多核苷酸可以單獨地或作為重組DNA構(gòu)建體的一部分整合入基因組中。“異源”序列是指源自外來物種的序列，或者，如果來自相同物種，通過故意的人工干預(yù)組成和/或基因組基因座從它的天然形式顯著修飾?！岸嗪塑账帷?、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，其任選地含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5’-單磷酸形式存在)用如下的單字母命名來表示:“A”表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對于RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，且“N”表示任意核苷酸。

“多肽”、”肽”、“氨基酸序列”和”蛋白”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于氨基酸聚合物，其中的一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物，也應(yīng)用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語”多肽”、”肽”、“氨基酸序列”和”蛋白”也包括修飾，包括、但不限于，糖基化、脂質(zhì)結(jié)合、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧基化、羥基化和ADP-核糖基化?！靶攀筊NA (mRNA) ”指沒有內(nèi)含子、且可以被細胞翻譯成蛋白的RNA?！癱DNA”是指與mRNA模板互補且使用反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的，或可以使用DNA聚合酶I的克列諾片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式?！俺墒斓摹钡鞍字阜g后加工的多肽；S卩，已經(jīng)從其中去除最初翻譯產(chǎn)物中存在的任意前肽或肽原的多肽。“前體”蛋白指mRNA翻譯的最初產(chǎn)物；即，前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是，但不限于，細胞內(nèi)定位信號?！胺蛛x的”指以下材料，例如核酸分子和/或蛋白，其基本上不含有或去除了在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該材料或與該材料相互作用的組分。分離的多核苷酸可以從它們天然存在的宿主細胞純化而來。可以使用技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法，來獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也包括重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸?！爸亟M”指2個原本是分開的序列區(qū)段的人工組合，例如，通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操縱分離的核酸區(qū)段?！敝亟M”也包括已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸而修飾的細胞或載體，或源自這樣修飾的細胞的細胞，但是不包括通過天然存在的事件(例如，自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對細胞或載體的改變，例如不經(jīng)故意的人工干預(yù)而產(chǎn)生的那些。“重組DNA構(gòu)建體”是指天然通常不會一起發(fā)現(xiàn)的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可以包含源自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或源自相同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，但是以不同于天然通常發(fā)現(xiàn)的方式排列。術(shù)語“輸入克隆”和“輸入載體”在本文中可互換地使用。“調(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其會影響相關(guān)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括、但不限于，啟動子、翻譯先導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識別序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”和“調(diào)控元件”在本文中可互換地使用?！皢幼印笔侵改芸刂屏硪粋€核酸片段的轉(zhuǎn)錄的核酸片段?！霸谥参镏杏泄δ艿膯幼印笔悄芸刂浦参锛毎械霓D(zhuǎn)錄的啟動子，無論它的起源是否來自植物細胞。“組織特異性的啟動子”和“組織偏愛型啟動子”可互換地使用，是指在一種組織或器官中優(yōu)勢地、但是不一定排它地表達的啟動子，但是其也可能在一種特定細胞中表達?！鞍l(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子”是指，其活性由發(fā)育事件決定的啟動子?！翱刹僮鞯剡B接的”指單個片段中核酸片段的締合，使得一個片段的功能受到其它片段的調(diào)節(jié)。例如，當能調(diào)節(jié)核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，啟動子與該核酸片段可操作地連接?！氨磉_”指功能產(chǎn)物的生成。例如，核酸片段的表達可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(例如，產(chǎn)生mRNA或功能性RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或mRNA翻譯為前體或成熟蛋白。

“表型”是指細胞或生物體的可檢測的特征。在將核酸片段(例如，重組DNA構(gòu)建體)插入細胞中的上下文中，“導(dǎo)入”指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括核酸片段向真核或原核細胞中的摻入，其中所述核酸片段可以摻入細胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體的DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子，或瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。“轉(zhuǎn)化的細胞”是其中已經(jīng)導(dǎo)入了核酸片段(例如，重組DNA構(gòu)建體)的任意細胞。本文使用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指核酸片段向宿主生物體基因組中的導(dǎo)入，導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，將核酸片段穩(wěn)定整合入宿主生物體和任意后代的基因組中?！八矔r轉(zhuǎn)化”是指核酸片段向宿主生物體的細胞核、或含有DNA的細胞器中的導(dǎo)入，導(dǎo)致沒有遺傳上穩(wěn)定的遺傳的基因表達。“等位基因”是占據(jù)染色體上的特定基因座的基因的幾種替代形式之一。當在二倍體植物的一對同源染色體上的特定基因座處存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果在二倍體植物的一對同源染色體上的特定基因座處存在的等位基因不同，該植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物的一對同源染色體之一上，該植物在該基因座處是半合的?！叭~綠體轉(zhuǎn)運肽”是這樣的氨基酸序列:其與蛋白一起翻譯，并將所述蛋白引導(dǎo)至在特定細胞(在其中生產(chǎn)所述蛋白)內(nèi)存在的葉綠體或其它質(zhì)體類型?！叭~綠體轉(zhuǎn)運序列”是指，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列?！靶盘栯摹笔沁@樣的氨基酸序列:其與蛋白一起翻譯，并將所述蛋白引導(dǎo)至分泌系統(tǒng)(Chrispeels (1991) Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mo1.Biol.^:21-53) o如果所述蛋白要導(dǎo)向液泡，可以另外添加液泡革巴向信號(出處同上)，或者，如果所述蛋白要導(dǎo)向 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(出處同上)。如果所述蛋白要導(dǎo)向細胞核，將除去存在的任意信號肽，并包括替代的細胞核定位信號(Raikhel (1992)Plant Phys.7^:1627-1632)?！熬€粒體信號肽”是將前體蛋白引導(dǎo)進線粒體中的氨基酸序列(Zhang 和 Glaser (2002) Trends Plant Sci 7:14-21)。通過目檢和數(shù)學(xué)計算，可以確定2個氨基酸或核酸序列之間的同一性百分比。或者，使用許多用于檢測同源序列的對比方法，包括、但不限于，LASERGENE 生物信息計算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的MEGALIGN 程序，可以測定序列比對和同一丨I"生百分比計算。除非另有說明，使用Clustal V比對方法(Higgins和Sharp (1989)CABI OS.5:151 153)，利用默認參數(shù)(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY= 10)，進行本文提供的序列的多個比對。使用Clustal V方法逐對比對和計算蛋白序列的同一性百分比的默認參數(shù)是:KTUPLE=1，GAP PENALTY=3，WIND0W=5 和 DIAGONALS SAVED=5。對于核酸，這些參數(shù)是 KTUPLE=2，GAP PENALTY=5，WIND0W=4 和 DIAGONALS SAVED=4。比對序列后，通過在相同程序上觀察“序列距離”表，使用Clustal V程序，可以得到“同一性百分比”和“趨異性”值；除非另有說明，以該方式計算在本文中提供和要求保護的同一性百分比和趨異性?；蛘撸贜eedleman, S.B.和 Wunsch, C.D.的算法(J.Mol.Biol.,48:443-453，1970),和使用可從威斯康辛大學(xué)遺傳學(xué)計算機組(University ofWisconsin Genetics Computer Group, UWGCG)得到的GAP計算機程序,通過對比序列信息，可以測定2個蛋白序列之間的同一性百分比。GAP程序的優(yōu)選默認參數(shù)包括:(I)評分矩陣，blosum62,參見 Henikoff, S.和 Henikoff, J.G.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89:10915-10919, 1992) ； (2) 12的間隙權(quán)重；(3) 4的間隙長度權(quán)重；和(4)對末端間隙沒有罰分。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員用于序列對比的其它程序。例如，通過使用Altschul等人(Nuc1.Acids.Res., 25，第3389-3402頁，1997)描述的BLAST程序，通過對比序列信息，可以測定同一性百分比。該程序可在因特網(wǎng)上在國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI)或日本 DNA 數(shù)據(jù)庫(DNA Data Bank ofJapan, DDBJ)的網(wǎng)站得到。在這些網(wǎng)站上，顯示了使用BLAST程序進行同一性搜索時的各種條件(參數(shù))的細節(jié)，默認值常用于搜索，盡管在適當時可以改變部分設(shè)置?；蛘撸褂弥T如遺傳信息處理軟件GENETYX Ver.7 (Genetyx Corporation, Japan)等程序,或使用諸如FASTA等算法，可以測定2個氨基酸序列之間的同一性百分比。在該情況下，默認值可以用于搜索。通過目檢和數(shù)學(xué)計算，可以測定2個核酸序列之間的同一性百分比，或更優(yōu)選地，通過使用計算機程序?qū)Ρ刃蛄行畔ⅲM行對比。一種示例性的、優(yōu)選的計算機程序是遺傳學(xué)計算機組(Genetic Computer Group, GCG ; Madison, WI) WISCONSIN PACKAGE 10.0 版程序，“GAP”(Devereux 等人，1984, Nuc1.Acids Res., 12:387)。除了在 2 個核酸序列之間進行對比以外，該“GAP”程序可以用于在2個氨基酸序列之間的對比，以及核酸序列和氨基酸序列之間的對比?！癎AP”程序的優(yōu)選的默認參數(shù)包括:(I)核苷酸的一元對比矩陣(對于同一性，含有I的值；對于不同一性，含有0的值)的GCG 實現(xiàn)，和Gribskov和Burgess, Nucl.Acids Res., 14:6745, 1986 的加權(quán)的氨基酸對比矩陣，參見 Schwartz和 Dayhoff,編，“Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, ”全國生物醫(yī)學(xué)研究基金會(National Biomedical Research Foundation),第 353-358 頁，1979,或其它相當?shù)膶Ρ染仃嚕?2)對于氨基酸序列，每個間隙的罰分為30，每個間隙中的每個符號的額外罰分為I ;或者，對于核苷酸序列，每個間隙的罰分為50，每個間隙中的每個符號的額外罰分為3 ;(3)對末端間隙沒有罰分；和⑷對長間隙沒有最大罰分。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員用于序列對比的其它程序，諸如，例如，BLASTN程序2.2.7版，其可從國立醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine)網(wǎng)站得到進行使用，或 WU-BLAST 2.0 算法(AdvancedBiocomputing, LLC )。另外，BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸評分矩陣，可以使用的任選的參數(shù)如下:(A)包括過濾器，以掩蔽查詢序列的具有低組成復(fù)雜性的區(qū)段(通過Wootton和 Federhen (Computers and Chemistry, 1993)的 SEG 程序來測定；也參見 Wootton和 Federhen, 1996, “Analysis of compositionalIy biased regions in sequencedatabases, ”Methods Enzymo1., 266: 554-71),或由短周期性內(nèi)部重復(fù)序列組成的區(qū)段(通過 Claverie 和 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程序來測定)，和(B)用于報告相對于數(shù)據(jù)庫序列的匹配的統(tǒng)計顯著性閾值，或E-評分(僅僅隨機地發(fā)現(xiàn)預(yù)期的匹配概率，根據(jù)Karlin和Altschul，1990的隨機模型；如果歸于匹配的統(tǒng)計顯著性大于該E-評分閾值，將不報告該匹配)；優(yōu)選的E-評分閾值是0.5，或按照遞增的優(yōu)選次序，為:0.25,0.1,0.05,0.01,0.001,0.0001、le_5、le_10、le_15、le_20、le_25、le_30、le_40、le-50、le-75 或 Ie-1OO0本文使用的標準的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，更完整地描述在 Sambrook, J., Fritsch, E.F.和 Maniatis, T.Molecular Cloning:A LaboratoryManual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor, 1989 (在下文中“Sambrook”)?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)至實施方案:
實施方案包括:可用于賦予干旱耐受性的分離的多核苷酸和多肽、重組DNA構(gòu)建體，包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(諸如植物或種子),以及使用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。分離的多核苷酸和多肽:
本公開內(nèi)容包括下述的分離的多核苷酸和多肽:
一種分離的多核苷酸，其包含:(i)編碼特定多肽的核酸序列，所述多肽具有與SEQID NO:1 相比至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法，或(ii) (i)的核酸序列的完整互補體，其中所述完整互補體和(i)的核 酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，且是100%互補的。任一種前述分離的多核苷酸可以用于本公開內(nèi)容的任意重組DNA構(gòu)建體中。所述多肽優(yōu)選地是PHDl多肽。一種分離的多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO:1相比至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列，這基于Clustal V比對方法。所述多肽優(yōu)選地是PHDl多肽。一種分離的多肽，其中通過至少一種選自缺失、置換、添加和插入的方法，通過改變一個或多個氨基酸，從SEQ ID NO:1衍生出所述氨基酸序列；和(c) 一種多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1。所述多肽優(yōu)選地是PHDl多肽。一種分離的多核苷酸，其包含編碼具有差向異構(gòu)酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO: 18-34的完整互補體的DNA分子雜交。例如，可以如下完成定位誘變:使用合成的寡核苷酸引物，除了具有特定錯配(即，希望的突變)以外，所述引物與要突變的單鏈噬菌體DNA互補。也就是說，使用上述的合成的寡核苷酸作為引物，以造成噬菌體合成互補鏈，然后使用得到的雙鏈體DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞。將轉(zhuǎn)化的細菌培養(yǎng)物鋪板在瓊脂上，從而允許從含有噬菌體的單個細胞形成噬斑。作為結(jié)果，在理論上，50%的新菌落含有具有單鏈突變的噬菌體，而剩下的50%具有原始序列。在特定溫度(該溫度允許與具有上述希望突變的DNA的完全相同的DNA雜交，但是不允許與具有原始鏈的DNA雜交)，使得到的噬斑與通過激酶處理進行標記的合成探針雜交。隨后，挑取與所述探針雜交的噬斑，并培養(yǎng)，用于收集它們的DNA。術(shù)語“在嚴謹條件下”是指，2個序列在中等或非常嚴謹?shù)臈l件下雜交。更具體地，中等嚴謹?shù)臈l件可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，例如，取決于DNA的長度?；緱l件參見:Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 3版，第 6和 7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001,且包括使用硝酸纖維素過濾器的預(yù)洗溶液5xSSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)，約50% 甲酰胺、2xSSC至6xSSC在約40_50°C的雜交條件(或其它類似的雜交溶液，諸如Stark氏溶液，在約50%甲酰胺中，在約42°C )和例如約40-60°C、0.5-6xSSC、0.1% SDS的洗滌條件。優(yōu)選地，中等嚴謹?shù)臈l件包括:在約50°C和6xSSC的雜交(和洗滌)。非常嚴謹?shù)臈l件還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，例如，取決于DNA的長度。通常，這樣的條件包括，與中等嚴謹?shù)臈l件相比，在更高的溫度和/或更低的鹽濃度雜交和/或洗滌(諸如在約65°C、6xSSC至0.2xSSC、優(yōu)選地6xSSC、更優(yōu)選地2xSSC、最優(yōu)選地0.2xSSC雜交)。例如，非常嚴謹?shù)臈l件可以包括:如上定義的雜交，和在大約65-68°C、0.2xSSC、0.1% SDS 洗滌。SSPE (IxSSPE 是 0.15 M NaClUO mM NaH2P04 和1.25 mM EDTA,pH 7.4)可以替代在雜交和洗滌緩沖液中的SSC (IxSSC是0.15 M NaCl和15 mM檸檬酸鈉)；在雜交結(jié)束以后，進行洗滌15分鐘?！耙种艱NA構(gòu)建體”是一種重組DNA構(gòu)建體，當轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合入植物的基因組中時，導(dǎo)致植物中靶基因的“沉默”。所述靶基因可以是該植物內(nèi)源的或轉(zhuǎn)基因的。本文關(guān)于靶基因使用的“沉默”，通常是指靶基因表達的mRNA或蛋白/酶的水平的抑制，和/或酶活性水平或蛋白功能性的抑制。術(shù)語“抑制”和“沉默”在本文中可互換地使用，包括降低、減少、下降、減退、抑制、消除和阻止。“沉默”或“基因沉默”不特指機制，且是包含性的，不限于，反義、共抑制、病毒抑制、發(fā)夾抑制、莖-環(huán)抑制、基于RNAi的方案、和基于小RNA的方案。抑制DNA構(gòu)建體可以包含源自目標靶基因的區(qū)域，且可以包含目標靶基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分核酸序列。根據(jù)要使用的方案，所述區(qū)域可以與目標基因的全部或部分有義鏈(或反義鏈)具有100%同一性或小于100%同一性(例如，至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性)。抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域已知的，一旦選定目標靶基因后可以容易地構(gòu)建，包括、但不限于，共抑制構(gòu)建體，反義構(gòu)建體，病毒抑制構(gòu)建體，發(fā)夾抑制構(gòu)建體，莖-環(huán)抑制構(gòu)建體，雙鏈RNA-生產(chǎn)構(gòu)建體，和更一般地，RNAi (RNA干擾)構(gòu)建體和小RNA構(gòu)建體例如siRNA(短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA (微RNA)構(gòu)建體?！胺戳x抑制”指能抑制靶基因或基因產(chǎn)物的表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的生產(chǎn)?！胺戳xRNA”是指與全部或部分的靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA互補、且阻斷分離的靶核酸片段的表達的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利號5，107，065)。反義RNA的互補性可以是與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任意部分，即，在5’非編碼序列、3’非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列處。“共抑制”是指能抑制靶基因或基因產(chǎn)物的表達的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的生產(chǎn)?！坝辛x” RNA是指一種RNA轉(zhuǎn)錄物，其包括mRNA，且可以在細胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白。通過集中在與天然mRNA在有義方向具有同源性的核酸序列的過表達，以前已經(jīng)設(shè)計了植物中的共抑制構(gòu)建體，它會導(dǎo)致與過表達的序列具有同源性的所有RNA的減少(參見Vaucheret等人，Plant J.16:651-659 (1998);和 Gura, Nature 404:804-808 (2000))。另一個變化形式描述了植物病毒序列用于指導(dǎo)鄰近mRNA編碼序列的抑制的應(yīng)用(PCT
發(fā)明者C.楚, C.李 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所