專利名稱：通過雜交的dna測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定核酸(DNA或RNA)序列的快速方法，其特別適用于未知核酸的測(cè)序，或者用于檢測(cè)用于診斷的特異性核酸序列。
背景技術(shù)：
如今，核酸序列的測(cè)定是分子生物學(xué)的核心。例如，可以通過高通量DNA測(cè)序評(píng)估廣泛范圍的生物現(xiàn)象，如遺傳變異、RNA表達(dá)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用和染色體構(gòu)象(參見例如幾個(gè)實(shí)例，Mitreva&Mardis, Methods Mol Biol, 533:153-87，2009 ；Mardis, GenomeMed. , I (4) :40, 2009 ；Cloonan 等人，Nat Methods, 5(7) :613-619, 2008 ；Valouev 等人,Genome Res. , 18 (7) : 1051-63，2008, Valouev 等人,Nat Methods. , 5 (9) : 829-34，2008 ；Orscheln等人，Clin Infect Dis.，49 (4) : 536-42，2009 ;Walter 等人，Proc Natl Acad SciU S A.，106(31) :12950-5, 2009 ;Mardis 等人，N Engl J Med.，361 (11) : 1058-66，2009，Hutchinson, Nuc1. Acids Res. , 35(18):6227-6237，2007)。此外，證明生理樣本存在特異性的DNA序列在目前構(gòu)成了開發(fā)診斷方法的主線，所述診斷方法如用于鑒定細(xì)菌發(fā)展成抗生素抗性的概率、遺傳異常、與遺傳修飾相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)以及病毒感染(例如HIV相關(guān)的或肝炎病毒相關(guān)的感染)的診斷方法(參見例如Zhang等人，Nature, 358:59 1-593，1992 ；Turner 等人，J Bacteriol, 176(12) :3708-3722, 1994 ；Weston 等人,Infection and Immunity. , 77 (7) : 2840-2848, 2009)。如今，主要采用基于毛細(xì)管的、Sanger生物化學(xué)的半自動(dòng)化實(shí)施來進(jìn)行核酸測(cè)序。經(jīng)典的方法包括目標(biāo)DN A擴(kuò)增的步驟，然后是“循環(huán)測(cè)序”的步驟，其中通過摻入熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(ddNTPs)隨機(jī)終止每輪引物延伸。通過在基于毛細(xì)管的聚合物凝膠中的高分辨率電泳分離單鏈的、末端標(biāo)記的延伸產(chǎn)物來測(cè)定序列。在96或384個(gè)獨(dú)立毛細(xì)管中同時(shí)進(jìn)行的電泳提供有限的并行水平。對(duì)低成本測(cè)序的高度需求帶動(dòng)了高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，這樣的高通量測(cè)序技術(shù)使得測(cè)序過程并行進(jìn)行，立刻產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬的序列(Shendure&Ji, Nat Biotechnol,26(10) :1135-45. 2008)。高通量測(cè)序技術(shù)旨在降低DNA測(cè)序的成本至標(biāo)準(zhǔn)的染料終止劑法的成本以下。目前，在實(shí)質(zhì)性犧牲各個(gè)讀取的長(zhǎng)度和精確度的情況下才能獲得這種和Sanger測(cè)序相比非常高的通量。這樣的新方法的實(shí)例包括454和Solexa技術(shù)。這些技術(shù)允許全基因組的鳥槍法測(cè)序，而無需在大腸桿菌中或任何宿主細(xì)胞中進(jìn)行克隆。捕獲于珠子表面的短的、兩側(cè)帶接頭的DNA片段的文庫(kù)通過乳液PCR進(jìn)行擴(kuò)增。通過使用DNA聚合酶引發(fā)的合成進(jìn)行測(cè)序。在454方法(也被稱為“焦磷酸測(cè)序”)中，用4種dNTP中的每一個(gè)依次呈現(xiàn)陣列，利用釋放的焦磷酸的發(fā)光計(jì)檢測(cè)(luminometric detection)來監(jiān)測(cè)摻入的量。該方法和Solexa之間的主要差異是后者使用鏈終止核苷酸。可以除去終止堿基上的熒光標(biāo)記，留下未封閉的3’末端，使得鏈終止成為一個(gè)可逆的過程。SOLiD技術(shù)取決于熒光標(biāo)記的雙堿基探針與雜交到克隆擴(kuò)增的文庫(kù)模板中的接頭序列的測(cè)序引物的連接。雙堿基探針的特異性是通過在每個(gè)連接反應(yīng)中詢問每個(gè)第一和第二堿基而獲得的。以測(cè)定最終的讀取長(zhǎng)度的循環(huán)數(shù)進(jìn)行多個(gè)連接、檢測(cè)和切割的循環(huán)。與三種以前的技術(shù)相反，Helic0S平臺(tái)允許單個(gè)DNA分子的測(cè)序，而以前的技術(shù)都需要擴(kuò)增的第一步驟。這種技術(shù)基于對(duì)摻入熒光核苷酸的高靈敏度檢測(cè)系統(tǒng)的使用，以經(jīng)由通過合成的測(cè)序直接詢問單個(gè)DNA分子。這樣的方法公開于例如美國(guó)專利No. 4，882，127、美國(guó)專利No. 4，849，077 ；美國(guó)專利 No. 7，556，922 ;美國(guó)專利 No. 6，723，513 ；PCT 專利申請(qǐng) No. WO 03/066896 ；PCT 專利申請(qǐng) No. W02007111924 ;美國(guó)專利申請(qǐng) No. US2008/0020392 ；PCT 專利申請(qǐng) No. W02006/084132 ;美國(guó)專利申請(qǐng) No. US2009/0186349 ;美國(guó)專利申請(qǐng) No. US2009/0181860 ;美國(guó)專利申請(qǐng) No. US 2009/0181385 ;美國(guó)專利申請(qǐng) No. US 2006/0275782 ；歐洲專利 EP-Bl-1141399 ;Shendure& Ji, Nat Biotechnol，26(10):1135-45. 2008 ;Pihlak 等人，Nat Biotechnol, 26 (6) : 676-684，2008 ；Fuller 等人，Nature BiotechnoI,27 (11):1013-1023, 2009 ；Mardis, Genome Med. , I(4):40, 2009 ；Metzker, Nature Rev.Genet.，11(1) :31-46, 2010。然而，至今開發(fā)的所有方法均受累于嚴(yán)重的缺點(diǎn)。特別是，它們都利用標(biāo)記的核苷酸(例如，熒光的)，從而致使整體成本的嚴(yán)重增加。此外，除了一個(gè)(Helicos平臺(tái))以外，所有這些新方法都需要在測(cè)序之前擴(kuò)增靶序列，這一方面耗時(shí)，另一方面增加錯(cuò)誤的概率，并且極易被污染。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的方法基于物理技術(shù)和電子處理，不同于當(dāng)前的化學(xué)的或生化的方法。它的優(yōu)點(diǎn)是多方面的I)它允許單個(gè)分子的測(cè)序，從而不需要在先的擴(kuò)增步驟(例如，通過PCR)。2)它遠(yuǎn)比本領(lǐng)域的方法便宜，由于標(biāo)準(zhǔn)單鏈核酸分子的使用，其遠(yuǎn)不及標(biāo)記的核苷酸(有熒光團(tuán)或一些其它基團(tuán))昂貴。此外，由于單個(gè)雙鏈核酸分子的序列被測(cè)定，因此標(biāo)準(zhǔn)單鏈核酸分子的量被降 到了最低。此外，在一些實(shí)施方式中，至少探針鏈可以被重復(fù)使用，因?yàn)樗鼈冊(cè)跍y(cè)序過程中并未被消耗。3)它使得通過測(cè)量所述雙鏈核酸分子兩端之間的距離來確定配對(duì)單鏈核酸分子沿著雙鏈核酸的定位(以bp為單位)成為可能。4)它允許在一個(gè)復(fù)性分析中確定寡核苷酸在給定雙鏈核酸發(fā)夾中的不同雜交位置。5)該測(cè)量可以在另一個(gè)時(shí)間尺度上周期性地重復(fù)，從而導(dǎo)致假陽性(偽部分雜交)的消除、改進(jìn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)并允許顯著降低儀器漂移。6)在同一分子上可以多次重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，由于可以在復(fù)性階段完成期間驅(qū)除(eject)雜交的單鏈核酸(例如，通過降低力或離子強(qiáng)度，或通過使用解旋酶或核酸酶)，從而改進(jìn)了測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)和可靠性。7)它允許不同的雙鏈核酸分子的平行測(cè)序，因?yàn)槊總€(gè)分子可以獨(dú)立于其它分子而進(jìn)行操縱。本發(fā)明涉及用于測(cè)定核酸序列的方法，其中對(duì)應(yīng)于所述核酸序列的變性雙鏈核酸的復(fù)性被阻斷?！昂怂嵝蛄械臏y(cè)定”此處不僅表示破譯核酸中堿基的實(shí)際連續(xù)，也表示直接或間接導(dǎo)致核酸序列上一些信息的獲得的所有活動(dòng)，比如檢測(cè)核酸分子中的特定序列，或檢測(cè)兩個(gè)不同核酸分子序列之間的差異。本發(fā)明基于這樣的觀察，即變性雙鏈核酸的兩條鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下將重新雜交。如果一些分子在復(fù)性步驟期間結(jié)合至所述變性雙鏈核酸的任意鏈，重新雜交僅僅是部分的。本發(fā)明人現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，在確定條件下，永久或短暫的重新雜交的這種暫?？捎糜讷@得有關(guān)變性雙鏈核酸分子中所包含的序列的信息。根據(jù)本發(fā)明，有可能檢測(cè)雙鏈核酸分子重新雜交的阻斷；與這種阻斷相關(guān)的物理參數(shù)(如，阻斷持續(xù)時(shí)間，阻斷在雙鏈核酸分子上的位置)，然后允許確定核酸序列。因此，本發(fā)明涉及用于測(cè)定核酸序列的方法，所述方法包括步驟檢測(cè)對(duì)應(yīng)于所述核酸序列的變性雙鏈核酸復(fù)性的阻斷?！白冃浴痹诖颂幈硎舅鲦溨g的大部分氫鍵斷裂時(shí)發(fā)生的雙鏈核酸分子的鏈分離的過程。變性過程產(chǎn)生變性的核酸分子，其在此處表示雙鏈核酸分子變性所產(chǎn)生的兩條分離的互補(bǔ)鏈?！皬?fù)性”在此處涉及這樣的過程，通過這種過程兩條分離的互補(bǔ)鏈通過雜交重新形成雙螺旋。如此處所用，“雜交”是核酸的兩條或兩條以上互補(bǔ)鏈之間建立非共價(jià)的、序列特異性的相互作用從而形成單個(gè)雜交體的過程。有本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的變性核酸的幾種可能。在一個(gè)最優(yōu)選的方式中，通過向它們施加物理力將兩條鏈分開。例如，所述雙鏈核酸的游離端可被拉開，從而斷裂配對(duì)堿基之間的所有鍵并打開雙鏈核酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涉及用于測(cè)定核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟·通過向所述分子施加物理力，使對(duì)應(yīng)于所述核酸序列的雙鏈核酸分子變性；以及·檢測(cè)雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。在這種類型的序列測(cè)定方法中，為了促進(jìn)重新配對(duì)，安排雙鏈DNA的游離端(即沒有附著至支持物的端)在被拉開之前共價(jià)或準(zhǔn)共價(jià)連接至另一端是有利的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈核酸分子是發(fā)夾。如果想要雙鏈核酸示意性表示在本發(fā)明的上下文中，可以將其比作“拉鏈”(zip fastener)，其打開(或關(guān)閉):雙鏈核酸的變性就是拉開拉鏈，復(fù)性是重新拉上拉鏈。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，在一定條件下，當(dāng)分子結(jié)合至變性雙鏈核酸分子時(shí)，所述分子的復(fù)性被阻斷。結(jié)合的分子可以是對(duì)所述變性雙鏈核酸分子上的特異性序列具有親和性的任何類型的分子，如核酸、蛋白質(zhì)或小分子。然而，優(yōu)選使用單鏈核酸，因?yàn)樗鰡捂満怂峥梢耘c變性雙鏈核酸鏈的一條鏈上的互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。這種單鏈核酸可以是任何長(zhǎng)度的，只要它長(zhǎng)到足以阻斷復(fù)性過程。優(yōu)選地，單鏈核酸的長(zhǎng)度包括3和20個(gè)之間的核苷酸，更優(yōu)選7和15個(gè)之間，甚至更優(yōu)選8和12個(gè)之間。本發(fā)明的單鏈核酸尤其可以是DNA或RNA分子，天然的或修飾的。所述單鏈核酸也可以由修飾的核苷酸構(gòu)成，如鎖核酸(LNA)，其是其中核糖部分修飾有連接2’氧和4’碳的額外橋的核苷酸，或者肽核酸(PNA)，其中主鏈由通過肽鍵連接的重復(fù)的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元組成。當(dāng)單鏈核酸分子在復(fù)性之前添加至變性雙鏈核酸時(shí)，重新雜交的阻斷表明單鏈核酸分子的序列與雙鏈核酸分子的至少部分序列是互補(bǔ)的。
因此，本發(fā)明的方法還涉及用于測(cè)定核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟a)通過向所述分子施加物理力，使對(duì)應(yīng)于所述核酸序列的雙鏈核酸分子變性；
b )提供單鏈核酸分子；c)在所述單鏈核酸分子存在下使所述雙鏈核酸分子復(fù)性；以及d)檢測(cè)雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。本發(fā)明適用于任何類型的雙鏈核酸。大多數(shù)情況下，雙鏈核酸將是DNA，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明也適用于完全配對(duì)的或者不完全配對(duì)的單鏈DNA-單鏈DNA雙鏈體，或適用于完全配對(duì)的或者不完全配對(duì)的單鏈DNA-單鏈RNA雙鏈體，或適用于完全配對(duì)的或者不完全配對(duì)的單鏈RNA-單鏈RNA雙鏈體。此外，雙鏈體可能由獲自不同來源的樣本的兩條單鏈的至少部分重新配對(duì)組成。最后，本發(fā)明也適用于唯一單鏈DNA或唯一單鏈RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在典型的結(jié)構(gòu)中，雙鏈核酸分子可以特異性地錨定在兩種固體基質(zhì)上(如顯微鏡載玻片、微量吸移器、微粒)。末端之一可直接或間接地連接到表面上，而另一端直接或間接連接到一個(gè)可移動(dòng)的表面。在本實(shí)施方式中，當(dāng)支持物移開時(shí)，在雙鏈核酸的兩端施加了張力。當(dāng)張力高于閾值時(shí)，兩條鏈分離并且核酸分子被變性。施加的張力優(yōu)選高于或等于15pN ;更優(yōu)選高于或等于16pN ;甚至更優(yōu)選高于或等于17pN ;在非常優(yōu)選的方面，它高于或等于18pN。這種力可隨溫度、核苷酸類型和緩沖液而變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些參數(shù)將很容易調(diào)整所述力，以獲得兩條鏈的分離。另一方面，當(dāng)張力下降到低于最小值時(shí)，變性雙鏈核酸的兩條鏈可以重新雜交。要獲得所述兩條鏈的重新雜交，優(yōu)選施加小于或等于12pN的張力；更優(yōu)選它小于或等于IlpN ;甚至更優(yōu)選，它小于或等于ΙΟρΝ。最優(yōu)選地，雙鏈核酸是發(fā)夾。如此處所用，“發(fā)夾”是指這樣的雙螺旋，其中一條鏈的5’端通過未配對(duì)的環(huán)物理連接到另一條鏈的3’端。所述物理連接可以是共價(jià)或非共價(jià)的。優(yōu)選地，所述物理連接是共價(jià)鍵。因此，發(fā)夾由雙鏈莖和未配對(duì)的環(huán)組成。在發(fā)夾中，兩條鏈的未參與到環(huán)中的端是游離的，因此可被拉開。這導(dǎo)致雙鏈核酸的未配對(duì)，從而產(chǎn)生變性的雙鏈核酸分子。有可能通過用高于閾值的力拉所述核酸分子的每一端而完全打開發(fā)夾雙鏈核酸分子。當(dāng)施加到分子的張力下降到低于最小 值時(shí)，核酸分子重新雜交并重新形成發(fā)夾。雜交至核酸鏈之一的單鏈核酸分子的存在導(dǎo)致重新雜交的暫停。因此，檢測(cè)到這樣的暫停表明單鏈核酸分子包括與雙鏈莖的至少部分互補(bǔ)的序列。在這方面，有利的是設(shè)計(jì)環(huán)序列和長(zhǎng)度以便短的瞬態(tài)后發(fā)夾重新折疊，如I秒。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了這種效果的方法，如在Woodside等人,Proc. Natl. Acad. Sc1.U. S. A.，103(16) :6190-6195, 2006中。當(dāng)力從打開降低至測(cè)試值時(shí)，開放發(fā)夾的伸展因?yàn)閱捂淒NA的彈性而變化。發(fā)夾重新折疊前的小延遲允許用戶在與用于檢測(cè)阻斷狀態(tài)所用的力相同的力下確定發(fā)夾的伸展。特別是，使用發(fā)夾使得有可能進(jìn)行配對(duì)和解除配對(duì)的循環(huán)，從而改善信號(hào)/噪音比。允許雙鏈核酸的游離端連接在一起的技術(shù)是已知的，將在下面更詳細(xì)地描述一些。阻斷的確定在此處意味著與阻斷相關(guān)的物理參數(shù)的確定。這些參數(shù)中最有用的是阻斷在雙鏈核酸分子上的位置，所述位置對(duì)應(yīng)單鏈核酸分子在雙鏈核酸分子上雜交的位置。事實(shí)上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)能夠精確確定雙鏈核酸上發(fā)生復(fù)性暫停的位置發(fā)夾的使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供一種手段，以便在變性/復(fù)性過程的任何時(shí)間確定發(fā)夾兩個(gè)游離端之間的物理距離。“游離端”在此處意味著一條鏈的末端沒有共價(jià)連接到另一條鏈的末端；如上面所解釋的,這些游離端中的每一個(gè)均可以結(jié)合至不同的表面。例如,這些表面中的一個(gè)可以是可移動(dòng)的，而另一個(gè)可以是靜止的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地認(rèn)識(shí)到，為了測(cè)量發(fā)夾雙鏈核酸游離端之間的距離，簡(jiǎn)單地測(cè)量?jī)蓚€(gè)表面之間的距離是有可能的。當(dāng)發(fā)夾分子完全變性時(shí)，這種距離為最大值(Zs(Fffff)),因?yàn)榘l(fā)夾核酸之后完全伸展；當(dāng)所述發(fā)夾分子完全復(fù)性時(shí)，它是最小值(Zffi(F#w))。有利的是在相同力F#w下進(jìn)行所有的長(zhǎng)度比較，從而單鏈核酸具有相同的彈性特性。通過使用環(huán)關(guān)閉中的延遲，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以測(cè)同樣地，復(fù)性過程暫時(shí)地暫停時(shí)，可以測(cè)量?jī)蓚€(gè)游離端之間的距離如預(yù)期地，這種距離z介于。和間(所有z以F=Fwi進(jìn)行測(cè)量)。立即清楚的是，距離z隨著序列在發(fā)夾分子中的位置而不同，其中單鏈核酸的序列互補(bǔ)于所述序列。如果所述單鏈核酸和位于接近發(fā)夾游離端的序列雜交，自我重新雜交過程就在重新形成完整發(fā)夾之間被阻斷；在這種情況下，Zwf是最小值。另一方面，如果所述單鏈核酸和接近未配對(duì)環(huán)的發(fā)夾部分雜交，復(fù)性過程將被停滯在這樣一個(gè)情況下其中發(fā)夾完全或幾乎完全變性；在這種情況下，Zwf是最大值(圖1)。有可能精確地將雙鏈核酸分子中的物理距離與一些堿基相關(guān)聯(lián)。例如，在IOpN力下，Inm的距離對(duì)應(yīng)著核酸中由兩個(gè)核苷酸(Ibp)所跨越的距離。由單鏈核酸的彈性給出相對(duì)于力的準(zhǔn)確校準(zhǔn)。因此，通過簡(jiǎn)單測(cè)量雙鏈核酸分子兩個(gè)游離端之間的距離能夠精確確定復(fù)性在何處被阻斷。因此，在一個(gè)實(shí)施 方式中，本發(fā)明由用于測(cè)定核酸序列的方法組成，其中對(duì)應(yīng)于待測(cè)定序列的雙鏈核酸分子首先通過施加物理力進(jìn)行變性，然后在單鏈核酸存在下重新雜交，以及檢測(cè)重新雜交中阻斷的存在。在一個(gè)方面中，當(dāng)復(fù)性過程被阻斷時(shí)，確定雙鏈分子兩端之間的距離。優(yōu)選地，當(dāng)分子完全變性時(shí)，確定所述分子兩端之間的距離。甚至更優(yōu)選，比較兩個(gè)距離并確定阻斷的位置。另一個(gè)與復(fù)性中的阻斷相關(guān)的有用參數(shù)是復(fù)性阻斷期間的時(shí)間長(zhǎng)短(此處稱為復(fù)性暫停的持續(xù)時(shí)間)。事實(shí)上，有可能測(cè)量重新雜交阻斷期間的時(shí)間長(zhǎng)短。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定雙鏈核酸的兩端之間距離為如上所定義的z期間的時(shí)間長(zhǎng)短，即介于2胃和Z低之間的中間值。阻斷的持續(xù)時(shí)間取決于兩條序列之間的互補(bǔ)程度?；パa(bǔ)性越高，兩分子之間建立的鍵的數(shù)目越多，并且因此，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。同樣清楚的是，阻斷時(shí)間將取決于兩條序列之間互補(bǔ)性區(qū)域的長(zhǎng)度。區(qū)域越長(zhǎng)，兩分子之間建立的鍵的數(shù)目越多，因此，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。因此，容易想到，在一定條件下，復(fù)性暫停的持續(xù)時(shí)間將幾乎是永久的。特別是，當(dāng)單鏈核酸包括能夠與變性雙鏈核酸雜交的超過20個(gè)，優(yōu)選超過25個(gè)，甚至更優(yōu)選超過30個(gè)核苷酸時(shí)，即使當(dāng)向所述雙鏈核酸施加的力降低到Fem時(shí)，單鏈核酸仍然與雙鏈發(fā)夾雜交(許多分鐘)，從而防止所述雙鏈發(fā)夾的自我重新雜交。在這樣的情況下，使用酶去除單鏈核酸分子可能是有利的。因此，所述單鏈核酸分子的去除使得能夠進(jìn)行配對(duì)和解除配對(duì)的循環(huán)，從而改善信號(hào)/噪音比。作為合適的酶的例子，可以舉出例如解旋酶，包括UvrD解旋酶、大腸桿菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、T4Uvsff解旋酶、SV40大T抗原解旋酶、皰疹病毒解旋酶、酵母Sgsl解旋酶、DEAH_ATP依賴的解旋酶和乳頭狀瘤病毒解旋酶El蛋白及其同源物。優(yōu)選地，使用T4UvsW解旋酶。暫停的持續(xù)時(shí)間也可隨著反應(yīng)條件變化。所述持續(xù)時(shí)間將隨著溫度的升高而減少。同樣，緩沖條件也可以調(diào)節(jié)暫停的持續(xù)時(shí)間例如，鎂、甜菜堿和氯化四甲銨(以摩爾濃度使用的TMAC)增加阻斷時(shí)間。這些化合物比GC更加加強(qiáng)AT對(duì)，從而減少這些對(duì)之間強(qiáng)度的差異。然而，當(dāng)固定溫度和緩沖液時(shí)，暫停的持續(xù)時(shí)間將只取決于拉變性雙鏈核酸的力，以及其與單鏈核酸的互補(bǔ)性。因此，在一 個(gè)具體方面中，本發(fā)明的方法包括以下步驟·通過向所述分子施加物理力，使對(duì)應(yīng)于所述核酸序列的雙鏈核酸分子變性；·提供單鏈核酸分子；·在所述單鏈核酸分子存在下，使所述雙鏈核酸分子復(fù)性；以及·檢測(cè)所述雙鏈核酸分子復(fù)性的阻斷；以及 確定暫停的持續(xù)時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，檢測(cè)所述雙鏈核酸分子復(fù)性的阻斷包括確定雙鏈核酸分子上阻斷的位置，如上所述。在這個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于診斷目的，從而允許尤其是對(duì)應(yīng)著要尋找的異常的核酸可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序；該技術(shù)之后和此后所述的針對(duì)測(cè)序的技術(shù)相似。然而，有可能基于這樣的觀察提供簡(jiǎn)化的技術(shù)，即寡核苷酸和DNA序列之間的錯(cuò)配導(dǎo)致更短壽命的雜交。在首先的方面中，利用任何上述的方法使發(fā)夾雙鏈核酸分子的復(fù)性被單鏈核酸阻斷，并確定阻斷的持續(xù)時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，該值和參考值進(jìn)行比較。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，參考值對(duì)應(yīng)著用參考單鏈核酸所觀察到的暫停長(zhǎng)度，如通過任何上述方法所確定的。出于診斷目的，如尋找基因組DNA中的突變，該技術(shù)可以以兩種方式實(shí)現(xiàn)I)用溶液中的寡核苷酸探測(cè)基因組DNA形成的發(fā)夾，所述基因組DNA包括待尋找的突變。2)通過以固定大小的單鏈DNA片段形式存在于溶液中的基因組DNA來探測(cè)發(fā)夾，所述發(fā)夾包含具有待尋找的突變的序列。這將是顯而易見的，即如果分析的目標(biāo)只是找到這種序列中特異性序列或可能的突變的存在，把這種序列置于發(fā)夾環(huán)中則提供一個(gè)非常簡(jiǎn)單的檢測(cè)方案。如果寡核苷酸在環(huán)中雜交，它完全阻止發(fā)夾的再折疊，導(dǎo)致非常大程度的變化，其從而可以輕易檢測(cè)到，如下文所述。本發(fā)明的方法也可以用于未知核酸的直接測(cè)序。本發(fā)明的測(cè)序方法提供多個(gè)實(shí)施方式。在首先的實(shí)施方式中，用本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)物理測(cè)序。通過接連地將不同的已知單鏈核酸探針去雜交核酸發(fā)夾(經(jīng)歷變性和復(fù)性的循環(huán))，從復(fù)性階段期間的暫停位置(以nm的精確度測(cè)量的)可以推斷所述核酸發(fā)夾的序列。并非采用一組代表所有可能的序列組合的單鏈核酸去雜交待測(cè)序的雙鏈核酸，有利地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將采用將不同單鏈核酸探針的數(shù)目最小化的策略。根據(jù)是否優(yōu)化單鏈探針、雙鏈靶分子或兩者皆有，可以獲得各種選擇。
在一個(gè)方面中，用一系列單鏈核酸探針進(jìn)行本發(fā)明，其中只有有限數(shù)目的堿基是特異性的，其余的沒有特異性。例如，這一系列的探針可以由η個(gè)堿基的單鏈核酸分子組成，其中所有可能的二核苷酸(例如，ΑΑ、AT、AG、……共16種可能的組合)，或者所有可能的三核苷酸(例如AAA、AAT、AAG、……共64種可能的組合)分別連接有所有可能的η_2或η-3個(gè)核苷酸的組合，η優(yōu)選為小于或等于30的整數(shù)，更優(yōu)選η小于或等于20，甚至更優(yōu)選η小于或等于8。當(dāng)只有2或3個(gè)堿基是特異性的時(shí)(即一系列16或64個(gè)不同的探針)，在每一個(gè)雜交確定二核苷酸或三核苷酸的位置。這允許混合一系列單鏈核酸分子以減少緩沖交換的數(shù)目。比如,在ΑΑΝΝΝΝΝΝ的情況下,如在Applied Biosystems所開發(fā)的Solid測(cè)序平臺(tái)上所實(shí)施的，只有四批探針是嚴(yán)格必需的。二核苷酸或三核苷酸可位于η聚探針的任何位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，測(cè)試的核苷酸位于寡核苷酸的中心；因?yàn)檫@個(gè)位置對(duì)錯(cuò)配更敏感，將提高方法的靈敏度。本發(fā)明方法的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是，所述方法允許在同一時(shí)間測(cè)序雙鏈分子的兩條鏈。事實(shí)上，每一條探針將雜交至包括互補(bǔ)于探針?biāo)鶖y帶的序列的序列的鏈。然后，利用如上所述的打開/拉上方法確定雜交探針的位置。因此，通過提供一個(gè)內(nèi)對(duì)照，可在同一運(yùn)行中確定兩條鏈的序列。為了能夠鑒定探針?biāo)Y(jié)合的鏈，可以方便地設(shè)計(jì)探針，以使二核苷酸或三核苷酸位于靠近探針的中心的位置，但稍微偏離中心。本方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及這樣的探針，其中這些核苷酸稍微偏離中心，從而阻斷將取決于寡核苷酸結(jié)合哪條鏈而轉(zhuǎn)移。例如，二核苷酸可直接位于探針中心的5’或3’。也可以使用這樣的探針，其中，中心核苷酸是三核苷酸的最5’或最3’的核苷酸。例如，8聚寡核苷酸的可能選擇是ΝΝΧΧΝΝΝΝ或 ΝΝΧΧΧΝΝΝ。最后，也可能使用通用堿基(Z)而不是所有核苷酸的組合(N)。通用堿基(Ζ，如5-硝基n引哚或3-硝基卩比咯(nitropyrole))表現(xiàn)出與所有四種堿基均一的相互作用并減少寡核苷酸的稀釋。通過雜交的機(jī)械檢測(cè)進(jìn)行的測(cè)序的分辨率受限于珠子和錨定表面之間的距離的測(cè)量中可達(dá)到的空間分辨率。通過栓系分子(其決定了珠子的布朗運(yùn)動(dòng)的幅度)的剛性最終確定分辨率。對(duì)于約IOOObp的分子，在約IOpN張力下，其空間分辨率(平均I秒)為約2nm(即約2bp (打開的))。由于布朗噪音隨著DNA長(zhǎng)度的平方(即核苷酸數(shù)目的平方)而減小，該技術(shù)非常適合較短分子的測(cè)序。在另一個(gè)方面中，重新設(shè)計(jì)待測(cè)序的核酸以增強(qiáng)雜交探針位置的確定。例如，美國(guó)專利No. 6，723，513中公開了一種涉及擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)堿基以幫助鑒定位置的測(cè)序技術(shù)。在這種技術(shù)中，靶核酸中的堿基對(duì)與代表著四種堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶(或者，如果核酸是RNA時(shí)，是尿嘧啶)中每一個(gè)的四種不同標(biāo)簽(擴(kuò)增標(biāo)簽)相關(guān)。然后，每一個(gè)特異性堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶的每一個(gè)發(fā)生被相應(yīng)的擴(kuò)增標(biāo)簽替換。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，每一個(gè)擴(kuò)增標(biāo)簽是特定長(zhǎng)度(如η個(gè)堿基)和特定序列的寡核苷酸。因此，根據(jù)上面描述的方法，通過打開/拉上，在互補(bǔ)于針對(duì)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶的擴(kuò)增標(biāo)簽的寡核苷酸的連續(xù)存在下，可以確定原始雙鏈核酸。這些寡核苷酸將與相應(yīng)的雙鏈核酸的鏈配對(duì)，并在對(duì)應(yīng)的編碼堿基處阻斷其重新雜交。因此，在這個(gè)方面，本發(fā)明提供用于測(cè)定如上所述序列的方法，其中單鏈核酸是互補(bǔ)于擴(kuò)增標(biāo)簽之一的寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，該方法包括確定所述單鏈核酸在雙鏈核酸分子上每一個(gè)阻斷位置的另一個(gè)步驟。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，用互補(bǔ)于擴(kuò)增標(biāo)簽的每一個(gè)寡核苷酸接連地重復(fù)用于測(cè)定序列的所述方法的所有步驟以及確定每一個(gè)阻斷位置的步驟。由于每個(gè)堿基均被擴(kuò)增，即被η聚寡核苷酸替換，用于確定雜交探針位置所需的精確性只需低于n nm。例如，如果擴(kuò)增標(biāo)簽是8聚寡核苷酸，當(dāng)有可能以小于8個(gè)堿基(即小于8nm)的精確度確定分子兩個(gè)游離端之間的物理距離時(shí)，可以精確地確定堿基的位置。這種方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，只需四個(gè)連續(xù)分析就可以平行測(cè)序許多珠子。在其次的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括酶的步驟。這種方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式由利用互補(bǔ)序列的連續(xù)雜交和連接的發(fā)夾測(cè)序組成。在本發(fā)明方法的本實(shí)施方式中，有可能測(cè)定長(zhǎng)雙鏈核酸分子的序列；長(zhǎng)的雙鏈核酸分子在此處理解為大于500bp的分子，更優(yōu)選大于750bp，甚至更優(yōu)選大于lOOObp。該技術(shù)由將相鄰的雜交單鏈核酸連接至上游的單鏈核酸引物組成。然后通過發(fā)夾雙鏈核酸分子的變性和復(fù)性以及檢測(cè)復(fù)性中的阻斷來監(jiān)測(cè)引物的延伸，如上所述。然后，用不同的單鏈核酸分子重復(fù)該方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，不需要預(yù)先擴(kuò)增待測(cè)序的雙鏈核酸分子；本發(fā)明的方法可以在單個(gè)雙鏈核酸分子上進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用單鏈核酸分子的文庫(kù)(參見例如美國(guó)專利No. 4，882，127和No. 4，849，077)。所述文庫(kù)由η堿基的單鏈核酸分子組成，其中所有可能的二核苷酸(如AA、AT、AG、……共16種組合)通過所有可能的n-2核苷酸組合連接在其3’端，η優(yōu)選為小于或等于20的整數(shù)，更優(yōu)選η小于或等于12，甚至更優(yōu)選η小于或等于8。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，在進(jìn)行下一輪雜交和連接之前切掉最后m個(gè)核苷酸，m是包含在I和 n-Ι 之間的整數(shù)；優(yōu)選地,m 等于 n-1 (Mir 等人,Nucleic Acids Res.，37 (I) : e5, 2009)。使用可切割的序列允許檢測(cè)對(duì)阻斷位置的精確度要求不太嚴(yán)格(幾nm)且同時(shí)仍保持較少合成步驟的雜交。替代方法是使用在其5’端缺少磷酸的寡核苷酸，以便一次只可以連接一個(gè)寡核苷酸；在下一輪運(yùn)行之前，使用激酶來添加缺少的磷酸，從而允許下一個(gè)連接。通過用16種可能的二核苷酸中的每一個(gè)來重復(fù)這一過程，有可能根據(jù)每一個(gè)連續(xù)單鏈寡核苷酸的連接檢測(cè)互補(bǔ)鏈長(zhǎng)度上的連續(xù)增加。也有可能合并16種寡核苷酸在4批中，以減少分析的數(shù)目。由于每一個(gè)二核苷酸序列被檢測(cè)兩次，這足以確定序列。因此，一旦整個(gè)雙鏈核酸被單鏈核酸分子的文庫(kù)所 互補(bǔ)，便去除合成的鏈(例如，在解旋酶或核酸外切酶的幫助下)，并且用上游單鏈核酸引物重新開始該過程，該引物相對(duì)于以前的引物向上游或下游移動(dòng)一個(gè)核苷酸。重復(fù)該過程n-m次允許獲得雙鏈核酸序列的完整確定例如，對(duì)于8聚寡聚物的文庫(kù)，當(dāng)m=3時(shí)，只需要5個(gè)程序的重復(fù)(即互補(bǔ)鏈的合成)來獲得雙鏈分子的完整序列。然而，現(xiàn)有技術(shù)的方法都使用熒光核苷酸，本發(fā)明的方法只涉及探針延伸的機(jī)械檢測(cè)。因此，本發(fā)明的方法不會(huì)受到任何與現(xiàn)有技術(shù)方法有關(guān)的缺點(diǎn)的困擾。例如，8聚寡聚物的成功連接代表8nm雙鏈發(fā)夾的伸展變化。這可以用2nm分辨率容易地檢測(cè)到，該2nm分辨率是約IOOObp的分子在約IOpN張力下的空間分辨率(一秒平均)。因?yàn)樵诿恳徊襟E中連接了單一寡核苷酸，其檢測(cè)只意味著伸展相對(duì)變化的檢測(cè)，即成功連接之前和之后。本發(fā)明方法的實(shí)現(xiàn)已成為可能，特別是利用設(shè)計(jì)用于在單分子水平探測(cè)實(shí)時(shí)核酸相互作用的裝置(device)的存在。這樣的裝置(device)描述于，例如美國(guó)專利No. 7，052，650和No. 7，244，391。其中描述的設(shè)備(apparatus)使用磁阱來向微米尺寸的超順磁性珠施加皮牛頓尺度的力。簡(jiǎn)要地說，所述設(shè)備包括光學(xué)顯微鏡、磁體和PC。雙鏈核酸分子的一端在多個(gè)點(diǎn)上被錨定至靜止元件(如表面)，并且另一端被錨定至可移動(dòng)的表面，在這種情況下是磁珠。提供磁體以便作用于珠子。尤其是，磁體可用于拉動(dòng)珠子以離開表面。然而，本發(fā)明方法的實(shí)施并不限于上述設(shè)備。任何允許雙鏈核酸分子完全伸展并然后再折疊并在同一時(shí)間同時(shí)監(jiān)測(cè)所述分子的伸展的裝置可用來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。例如，可使用光鑷(optical tweezer);然而它們需要事先進(jìn)行力的校準(zhǔn)，并且不容易進(jìn)行并行化用于高通量測(cè)量。其它缺點(diǎn)是缺乏核酸的總扭轉(zhuǎn)控制(total torsional control)以及通過聚焦激光進(jìn)行的可能的溶液局部加熱，其會(huì)改變雜交的條件。雙鏈核酸在足夠珠子(例如，鏈霉親和素包被的珠子)的溶液中孵育數(shù)分鐘，其標(biāo)記(例如生物素)端之一結(jié)合至珠子。如果之后使用光鑷進(jìn)行操作，那么珠子可以是透明的，或者如果使用磁阱或鑷子進(jìn)行操作，那么珠子可以是磁性的。珠子-核酸組裝體注射至流體室，其表面已被處理過，例如以便結(jié)合分子的其它標(biāo)記端(例如包被有抗地高辛抗體的表面，以結(jié)合至核酸的地高辛標(biāo)記端)。因此，珠子經(jīng)由核酸發(fā)夾錨定至表面，參見圖la。然后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種手段監(jiān)測(cè)珠子到表面的距離例如其在相機(jī)圖像上的衍射環(huán)可以用來推導(dǎo)其距離，或者當(dāng)以隱失模式(evanescent mode)照亮?xí)r，它們散射(或通過熒光發(fā)射)的光強(qiáng)度可以用來測(cè)量其距離。或者，可以測(cè)量它們所產(chǎn)生的磁場(chǎng)(使用如GMR或Hall傳感器的磁傳感器)來推導(dǎo)它們到錨定表面上的傳感器的距離。為了將錨定核酸分子的珠子拉至表面，各種技術(shù)已被描述。可以使用聚焦激光束的光捕獲聚焦點(diǎn)附近的透明珠子。通過相對(duì)于錨定表面的光束的相對(duì)平移(translation)，可以向栓系分子施加力(典型的光鑷分析)。表現(xiàn)出的力與珠子距離其平衡位置的位移(displacement)成比例，為了在栓系分子上表現(xiàn)恒定的力需要在捕獲束上的反饋環(huán)路。為了在珠子上表現(xiàn)恒定的力，已描述了使用通過環(huán)繞珠子的流動(dòng)所產(chǎn)生的動(dòng)水拖曳力(hydrodynamic drag),但它通常產(chǎn)生低的空間精確度(>100nm)。優(yōu)選的實(shí)施方式使用磁阱來拉動(dòng)通過如上所述 的核酸發(fā)夾錨定到表面上的超順磁性珠子。在此結(jié)構(gòu)中，放置在樣本上的小磁體用于在錨定的珠子上施加恒定的力，可以以〈lnm的精確度確定其位置(取決于拉力和歸因于動(dòng)水拖曳力的消耗)。在每一個(gè)情況下，注意到，可以通過用大于約16pN的力拉動(dòng)珠子來機(jī)械地完全打開栓系發(fā)夾。施加到分子上的張力降低至低于約IlpN時(shí)允許發(fā)夾自發(fā)地重新拉上(盡管是遲滯的，拉開轉(zhuǎn)換是可逆的)。如果，在打開階段期間，溶液中一些分子(例如蛋白質(zhì)或DNA、RNA、LNA或PNA的互補(bǔ)寡核苷酸)結(jié)合至拉伸的單鏈核酸，當(dāng)力降低到低于IlpN時(shí)這些分子將阻斷發(fā)夾重新拉上。因此，分析原理是兩種力之間的切換大的一個(gè)Fffff來打開發(fā)夾以及較小的一個(gè)F#w來允許重新拉上以及測(cè)量短暫阻斷時(shí)分子的伸展。通過充分伸展和阻斷之間的線性關(guān)系，阻斷位置和序列聯(lián)系起來。對(duì)于最佳的精確度，優(yōu)選于測(cè)試力F#w下測(cè)量充分伸展。這通過設(shè)計(jì)這樣的發(fā)夾環(huán)來實(shí)現(xiàn)，即一旦力從Fffff降低到Fww,發(fā)夾環(huán)需要一秒的間隔(fraction)來重新折疊。為了將核酸附著至表面或支持物，可以使用本領(lǐng)域中已知的任一技術(shù)。實(shí)質(zhì)上，核酸直接錨定至支持物，例如微珠，其涉及該表面的官能化，例如通過包被有能夠與核酸的官能化末端反應(yīng)的鏈霉親和素、C00H基團(tuán)等。在一般情況下，這樣的方法使核酸的官能化成為必需，特別是在3’和5’端，也就是說在其上接枝合適的化學(xué)基團(tuán)。此外，優(yōu)選通過環(huán)連接分子的另兩個(gè)游離端以防止鏈在操作結(jié)束時(shí)解離，從而如果適當(dāng)時(shí)可以重復(fù)后者。為了這個(gè)目的，可以采用不同的程序。最簡(jiǎn)單的是使用 合成的寡核苷酸用兩個(gè)不同的官能團(tuán)(例如生物素和胺)將雙鏈核酸的末端之一官能化，其允許錨定到兩個(gè)不同的預(yù)處理表面。使用部分配對(duì)的合成核苷酸，可以使另一端的兩條鏈連接成環(huán)的形式。以這種方式，從雙鏈核酸產(chǎn)生配對(duì)的單鏈核酸，即發(fā)夾。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于它能夠官能化大核酸片段的不同群(如通過基因或染色體的片段化所獲得的)，其然后可以同時(shí)進(jìn)行分析。在這種情況下，使用兩種(或更多)限制性酶將核酸樣本片段化，其使得能夠在其端部用兩種不同的限制性位點(diǎn)獲得亞群，其端部在所有片段中都是相似的。這可以使兩端被差別處理(例如通過以環(huán)的形式將一端連接到寡核苷酸，在其端部具有適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn))。這種方法的缺點(diǎn)在于兩個(gè)相鄰官能團(tuán)之間的立體干擾，其可以使得難以偶聯(lián)至表面。為了解決這個(gè)問題，有利地的是，在發(fā)夾分子每一個(gè)游離端添加堿基“間隔”序列，然后向堿基“間隔”序列的末端加入官能團(tuán)；兩個(gè)間隔序列是非互補(bǔ)的，為每一個(gè)官能團(tuán)提供足夠的空間來結(jié)合至其專門的表面。更有利的是，設(shè)計(jì)每一個(gè)間隔序列的序列，以便在本發(fā)明的測(cè)序方法中使用已知序列的單鏈測(cè)序引物?？梢杂梅肿由飳W(xué)中任何常用方法向雙鏈核酸分子添加環(huán)和/或間隔。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，因此沒有必要在此詳述。至于實(shí)際的錨定技術(shù)，有許多這種技術(shù)并且它們?cè)醋杂糜谙蚴惺劭色@得的預(yù)處理表面錨定大分子(蛋白質(zhì)、DNA等)的技術(shù)。大多數(shù)這些技術(shù)已被開發(fā)用于免疫學(xué)測(cè)試，以及將蛋白(免疫球蛋白)連接至帶有能夠和蛋白羧基(-C00H)端或氨基(-NH2)端反應(yīng)的基團(tuán)(-C00H、-NH2、-OH 等)的表面?？梢酝ㄟ^分子5’端的游離磷酸直接完成核酸的共價(jià)錨定，其中游離磷酸與仲胺(由斯特拉斯堡的Polylabo市場(chǎng)化的Covalink-NH表面)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。也可以用氨基將DNA官能化，然后如同處理蛋白質(zhì)一樣進(jìn)行處理。也有包被有鏈霉親和素的表面(Dynal珠子等)，其允許鏈霉親和素和生物素化DNA分子之間的準(zhǔn)共價(jià)錨定。最后，通過將針對(duì)地高辛的抗體接枝到表面上(通過上面提到的方法)，用地高辛官能化的核酸可以錨定于此。這僅僅代表許多可能的錨定技術(shù)中的一個(gè)示例。在附著和錨定技術(shù)當(dāng)中還應(yīng)該提到的是，例如在專利EP 152 886中所描述的技術(shù)，其使用酶偶聯(lián)用于將DNA附著到固體支持物如纖維素上。專利EP 146 815也描述了各種將DNA附著到支持物上的方法。相似地，專利申請(qǐng)W092/16659提出使用聚合物來附著DNA的方法。當(dāng)然，核酸可以直接附著至支持物，但在必要的情況下，特別是考慮到要限制表面的影響時(shí)，核酸可以附著至肽或其他種類的惰性臂的末端，例如在專利EP 329 198中描述的。下面的實(shí)施例將使得本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)變得明顯。


圖1 :寡核苷酸雜交至 其在發(fā)夾DNA上的互補(bǔ)序列的檢測(cè)原理。將珠子錨定至表面的發(fā)夾DNA (a)通過將對(duì)珠子的拉力增加到16pN以上的值被瞬間拉開。在該階段，溶液中的互補(bǔ)片段雜交至開放DNA發(fā)夾上的靶點(diǎn)，因此防止當(dāng)力降低回到其初始值時(shí)發(fā)夾(b)重新拉上。發(fā)夾重新折疊表現(xiàn)出在明確伸展時(shí)發(fā)生的四個(gè)平臺(tái)，但持續(xù)時(shí)間可變。73.71nm處的最高平臺(tái)與在83bp完全打開的發(fā)夾有關(guān),而底部的一個(gè)對(duì)應(yīng)著完全重新折疊的發(fā)夾。因?yàn)閮蓚€(gè)寡核苷酸已被置于溶液中，在25.47nm和35.17nm處發(fā)生兩個(gè)中間平臺(tái)。從伸展中的這些變化(Zs-Z)有可能推導(dǎo)出互補(bǔ)序列沿著發(fā)夾在何處配對(duì)。此處，根據(jù)其位置，阻斷與28. 66bp和39. 60bp定位符合，這與預(yù)期的29bp和40bp的位置非常吻合。通過高斯擬合至獲自多種打開/關(guān)閉循環(huán)(此處 20個(gè)循環(huán))的圖，更好地估計(jì)平臺(tái)位置。圖2 :阻斷時(shí)間強(qiáng)烈地取決于寡核苷酸長(zhǎng)度和拉力。A)歸因于10個(gè)堿基的寡核苷酸在1200bp的發(fā)夾上的阻斷時(shí)間τ ο B)阻斷時(shí)間的圖顯示2秒平均值的泊松分布。C)阻斷時(shí)間隨著核苷酸大小而變化并隨著測(cè)試階段期間所用的力Fem而呈指數(shù)變化。圖3 :在9個(gè)堿基的寡核苷酸情況下，阻斷概率和阻斷時(shí)間與寡核苷酸濃度的演變。阻斷時(shí)間獨(dú)立于濃度。阻斷概率表現(xiàn)為IOnM的Km。圖4 :具有12個(gè)核苷酸的寡核苷酸的阻斷時(shí)間相對(duì)于力作圖。除了帶有圓形符號(hào)的曲線，所有這些寡核苷酸具有一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)配，盡管在這后一種情況下，阻斷太短以至于不能測(cè)量。如果錯(cuò)配位于最后一個(gè)或第一個(gè)堿基，阻斷時(shí)間減少了 4/5 (by a factor5)0如果錯(cuò)配涉及寡核苷酸中間的AT堿基對(duì)，阻斷時(shí)間減少了 20倍以上，然而如果其涉及GC堿基對(duì)，其達(dá)到60倍。雙錯(cuò)配減少阻斷時(shí)間太多以至于它不能被測(cè)量。圖5a :對(duì)于10堿基寡核苷酸ACAGCCAGCC的阻斷時(shí)間與溫度的演變。通常情況下，當(dāng)溫度升高10度時(shí)阻斷時(shí)間減少了 2/3。圖5b :具有IObp核苷酸的寡核苷酸的阻斷時(shí)間相對(duì)于力作圖。除了帶有圓形符號(hào)的曲線，所有寡核苷酸具有一個(gè)或三個(gè)LNA (標(biāo)有方形符號(hào))。取代DNA的一個(gè)LNA使阻斷時(shí)間增加了 2倍以上。
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圖6 :在如圖1c中顯示的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，DNA伸展分布的圖，其中溶液中的寡核苷酸可以和打開的DNA在沿著分子的不同位置上進(jìn)行配對(duì)。根據(jù)圖的峰位置(其與3種不同分子，即不同的結(jié)合珠子，高度關(guān)聯(lián))可以推導(dǎo)出沿著DNA的雜交位置。圖7 :對(duì)于對(duì)應(yīng)著擴(kuò)增序列的DNA發(fā)夾的對(duì)應(yīng)于四種8堿基核苷酸A8、C8、T8、G8的阻斷位置的圖。這些阻斷位置精確對(duì)應(yīng)著其預(yù)期的位置。我們此處有g(shù)8=gcacgcac、c8=tcgctcgc、t8=gccagcca 和 a8=ccgaccga。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例-DNA 的制備未知序列的以及包括在幾十至幾千個(gè)堿基對(duì)之間尺寸的雙鏈(ds) DNA片段在其端之一被連接至DNA環(huán)。其另一端被連接到dsDNA片段，從而允許其兩條鏈結(jié)合至不同包被的表面。例如，一條鏈的游離3’端可標(biāo)記有生物素，從而允許結(jié)合到鏈霉親和素包被的珠子，而另一條鏈的5’端可標(biāo)記有地高辛(digoxigenine),從而允許其結(jié)合至包被有抗地高辛抗體的表面。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法可以實(shí)現(xiàn)這種末端標(biāo)記，如使用末端轉(zhuǎn)移酶來添加生物素(或地高辛)修飾的核苷酸，或者與適當(dāng)標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行雜交。-力拉伸設(shè)備這種DNA構(gòu)建體在足夠珠子(例如鏈霉親和素包被的珠子)的溶液中孵育數(shù)分鐘，其標(biāo)記(例如生物素)端之一結(jié)合至珠子。如果之后使用光鑷進(jìn)行操作，那么珠子可以是透明的，或者如果使用磁阱或鑷進(jìn)行操作，那么珠子可以是磁性的。珠子-核酸組裝體注射至流體室，其表面已被處理過例如以便結(jié)合分子的其它標(biāo)記端(例如包被有抗地高辛抗體的表面，以結(jié)合至DNA的地高辛標(biāo)記端)。因此，珠子經(jīng)由DNA-發(fā)夾錨定至表面，參見圖la。然后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種手段監(jiān)測(cè)珠子到表面的距離例如其在相機(jī)圖像上的衍射環(huán)可以用來推導(dǎo)其距離，或者當(dāng)以衰減模式照亮?xí)r，它們散射(或通過熒光發(fā)射)的光強(qiáng)度可以用來測(cè)量其距離?；蛘撸梢詼y(cè)量它們所產(chǎn)生的磁場(chǎng)(使用如GMR或Hall傳感器的磁傳感器)來推導(dǎo)它們到錨定表面上的傳感器的距離。為了將錨定核酸分子的珠子拉至表面，各種技術(shù)已被描述。優(yōu)選的實(shí)施方式使用磁阱來拉動(dòng)通過如上所述的DNA發(fā)夾錨定到表面上的超順磁性珠子。在此結(jié)構(gòu)中，放置在樣本上的小磁體用于在錨定的珠子上施加恒定的力，可以以〈lnm的精確度確定其位置(取決于拉力和歸因于動(dòng)水拖曳力的消耗)。在這一系列實(shí)驗(yàn)中，使用了美國(guó)專利No. 7，052，650和No. 7，244，391中公開的設(shè)備。此外，除非另有指明，在25mM Tris pH7. 5、150mM KAcUOmMMgCl2、O. 2% BSA中進(jìn)行此處報(bào)道的實(shí)驗(yàn)。在每一個(gè)情況下，通過用大于約16pN的力拉動(dòng)珠子來機(jī)械地完全打開栓系發(fā)夾。施加到分子上的張力降低至低于約IlpN時(shí)允許發(fā)夾自發(fā)地重新拉上(盡管是遲滯的，拉開轉(zhuǎn)換是可逆的)。如果，在打開階段期間，溶液中一些分子(例如蛋白質(zhì)或DNA、RNA、LNA或PNA的互補(bǔ)寡核苷酸)結(jié)合至拉伸的單鏈核酸(Ss) DNA,當(dāng)力降低到低于IlpN時(shí)這些分子將瞬間阻斷發(fā)夾重新拉上。分析原理是兩種力之間的切換大的一個(gè)Fffff來打開發(fā)夾以及較小的一個(gè)1^^來允許重新拉上以及測(cè)量短暫阻斷時(shí)分子的伸展。通過充分伸展和阻斷之間的線性關(guān)系，阻斷位置和序列聯(lián)系起來。對(duì)于最佳的精確度，優(yōu)選于測(cè)試力F#w下測(cè)量充分伸展。這通過設(shè)計(jì)這樣的發(fā)夾環(huán)來實(shí)現(xiàn)，即一旦力從Fffff降低到F#w，發(fā)夾環(huán)需要一秒的間隔來重新折疊。

-可以用堿基對(duì)分辨率測(cè)量寡核苷酸的雜交位置有可能通過測(cè)量這些重新拉上的暫停之一期間DNA分子的伸展(珠子到表面的距離)以納米精確度確定阻斷的位置(Inm對(duì)應(yīng)著在IOpN力下，ssDNA中由兩個(gè)核苷酸(Ibp)所跨越的距離)。打開的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出伸展相對(duì)于堿基對(duì)的最大比率(在dsDNA中，比率只有O. 34nm 每 bp)。這種測(cè)量的精確度受限于兩種噪音的影響·測(cè)量方法的精確度， 珠子的布朗運(yùn)動(dòng)。可以使用不同的技術(shù)來測(cè)量珠子的垂直位置。最簡(jiǎn)單的技術(shù)之一取決于電視顯微鏡檢查(美國(guó)專利No. 7，052，650和No. 7，244，391)。圖1中的結(jié)果是用這種方法得到的，對(duì)于I秒平均，典型的分辨率達(dá)到lnm。具有更好的分辨率的其它方法已被證明，如帶有PSD傳感器的激光照射，其達(dá)到O.1nm的分辨率(Greenleaf和Block，Science，313 :801,2006)以及隱失波照射(Singh-Zocchi 等人，Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13) :7605-7610,2003、Liu 等人，Biophys J，96 (9) :3810-3821，2009)。分辨率的固有限制由珠子拉動(dòng)ssDNA分子的布朗波動(dòng)給出。<x2> =4kBT Λ f (6 π nr) /k2ssDNA(F)，其中kssDNA (F)是ssDNA分子的剛度，Kb是玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，H為水的粘度，r是珠子的半徑和Af是測(cè)量的頻率范圍。kssDNA (F=IOpN) =0.05/Nb (N/m)，其中Nb是ssDNA的堿基數(shù)。對(duì)于84bp的發(fā)夾，這將導(dǎo)致I秒(Λ f=l赫茲)平均以上的O. 04nm的噪音。圖1中更大的噪音(σ >4 nm)基本上歸因于測(cè)量裝置,而不是固有波動(dòng)。固有的布朗噪音隨著發(fā)夾的大小而增加當(dāng)平均超過I秒時(shí)，1200bp的發(fā)夾導(dǎo)致O. 6nm的噪音。通過阻斷時(shí)間的平均值測(cè)量雜交質(zhì)量。阻斷強(qiáng)度可以用兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行特征化阻斷概率PPM( =體現(xiàn)阻斷的循環(huán)數(shù)/總循環(huán)數(shù))和平均阻斷時(shí)間τ ρ_。P取決于k和寡核苷酸的濃度,而τ 只取決于1^,其中別是結(jié)合和解離反應(yīng)常數(shù)。在圖2上顯示的是τ 隨著寡核苷酸長(zhǎng)度和力的典型波動(dòng)。單個(gè)堿基錯(cuò)配對(duì)τ 有劇烈影響，相當(dāng)于寡核苷酸長(zhǎng)度減少了至少一個(gè)核苷酸，并且阻斷時(shí)間減少了 4/5。實(shí)際上，τ 以及因此的1^#是更易于測(cè)量的，因?yàn)樗蝗Q于寡核苷酸的濃度(圖3)。然而也有可能測(cè)量kff。平均阻斷時(shí)間取決于寡核苷酸序列，但不取決于其沿著發(fā)夾的位置。研究了沿著發(fā)夾匹配兩個(gè)特定位置的序列對(duì)于兩個(gè)阻斷，盡管它們出現(xiàn)在不同的位置，阻斷時(shí)間是一樣的。單一突變對(duì)阻斷時(shí)間有劇烈影響如圖4所示，與具有單個(gè)錯(cuò)配的同一寡核苷酸相比，與發(fā)夾形成完美匹配的12個(gè)堿基的寡核苷酸表現(xiàn)出非常不同的阻斷時(shí)間。在圖4中，顯示了不同寡核苷酸的相對(duì)于力的阻斷時(shí)間。增加的力增加阻斷時(shí)間。當(dāng)突變僅僅是在第一或最后一個(gè)核苷酸時(shí)，其對(duì)阻斷時(shí)間的影響是最小的，降低了 4/5。正如預(yù)期的那樣，這種減少取決于錯(cuò)配性質(zhì)，在AT上的錯(cuò)配通常會(huì)導(dǎo)致阻斷時(shí)間19/20的減少，而GC錯(cuò)配導(dǎo)致59/60的減少。當(dāng)錯(cuò)配位于寡核苷 酸的中心時(shí)，阻斷時(shí)間劇烈減少。正如圖4上可以看出的，只有當(dāng)力最大時(shí)才可以觀察到寡核苷酸中心的錯(cuò)配會(huì)引起非常短的阻斷。這樣的錯(cuò)配造成的阻斷時(shí)間上的減少對(duì)于相同的力條件而言超過100倍。阻斷時(shí)間取決于溫度和緩沖條件。如圖5a中可見的，增加溫度顯著減少阻斷時(shí)間。緩沖條件也可以調(diào)節(jié)阻斷時(shí)間通過與這些實(shí)驗(yàn)中所用的緩沖液(25mM Tris pH7. 5、150mM KAcUOmM MgCl2、0. 2% BSA)進(jìn)行比較，鎂、甜菜堿和氯化四甲銨(以摩爾濃度使用的TMAC)顯著增加阻斷時(shí)間。在降低這些堿基對(duì)之間強(qiáng)度的差異方面，相對(duì)于GC，這些化合物更加加強(qiáng)AT對(duì)。使用RNA或LNA寡核苷酸增加阻斷時(shí)間。和DNA寡核苷酸相比，RNA和LNA寡核苷酸與ssDNA形成更強(qiáng)的雜交體。對(duì)于相同的靶序列，與DNA寡核苷酸相比，RNA寡核苷酸的阻斷時(shí)間增加了 2倍。LNA核苷酸有一個(gè)更強(qiáng)烈的作用如果單個(gè)核苷酸從DNA轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)NA，全部寡核苷酸的阻斷時(shí)間增加了 2倍。將三個(gè)堿基從DNA轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)NA，阻斷時(shí)間增加了 5倍。當(dāng)所有核苷酸從DNA轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)NA時(shí)，其作用如此劇烈以至于10個(gè)堿基的LNA寡核苷酸的阻斷時(shí)間超過lh。將寡核苷酸的大小減少至6個(gè)堿基的LNA導(dǎo)致I秒的合理阻斷時(shí)間。至于DNA寡核苷酸，可以通過測(cè)量這些替代寡核苷酸之一(LNA或RNA)的平均阻斷時(shí)間確定其性質(zhì)是或不是歸因于與互補(bǔ)寡核苷酸的完美雜交，以及如果不是，錯(cuò)配位于何處(例如在雜交的寡核苷酸的中心或接近其中的一端)?？蓹z測(cè)的寡核苷酸的長(zhǎng)度。由于阻斷時(shí)間指數(shù)性地取決于寡核苷酸的長(zhǎng)度，這個(gè)參數(shù)不能變化太大。如果寡核苷酸太小(在室溫下少于8個(gè)堿基)，阻斷時(shí)間太短以至無法檢測(cè)到。如果寡核苷酸過大(在室溫下多于12個(gè)堿基)，阻斷時(shí)間變得太長(zhǎng)。酶可以穩(wěn)定雜交體。添加不含NTP的gp43DNA聚合酶增加寡核苷酸的阻斷時(shí)間。因?yàn)殡s交的引物是聚合酶的底物，這是可預(yù)期的。gp43聚合酶使得寡核苷酸的阻斷時(shí)間增加了 10倍。雜交參數(shù)概述寡核苷酸的長(zhǎng)度是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)在室溫下，具有實(shí)用的阻斷時(shí)間的寡核苷酸的長(zhǎng)度從8至12個(gè)堿基不等。人們可以很容易地在同一分子上進(jìn)行一系列打開/重新拉上實(shí)驗(yàn)，并測(cè)量利用歸因于寡核苷酸和打開階段的DNA的配對(duì)而重新拉上的阻斷的平均時(shí)間。這種時(shí)間取決于寡核苷酸的大小、重新拉上期間所施加的力、溫度和離子濃度。如果配對(duì)的片段顯示錯(cuò)配，阻斷時(shí)間將顯著地并且以可量化的方式減少(至少10倍)。因此，機(jī)械的打開/重新拉上技術(shù)允許快速探測(cè)已知寡核苷酸序列和具有未知序列的DNA片段之間配對(duì)的位置和穩(wěn)定性，見圖1c和圖2。這些觀察表明了應(yīng)用于DNA測(cè)序和診斷中的各種實(shí)施。通過雜交的機(jī)械檢測(cè)進(jìn)行的診斷和測(cè)序。通過用不同的寡核苷酸探測(cè)將珠子錨定至表面的DNA發(fā)夾(連續(xù)引入流體室)，可以確定已知序列上可能的突變的存在(其導(dǎo)致與探針寡核苷酸的錯(cuò)配以及重新拉上期間更短的暫停)或者通過確定已知 探針沿著分子的位置對(duì)未知DNA進(jìn)行測(cè)序，見圖6。在另一個(gè)方面中，通過使用擴(kuò)增標(biāo)簽重新設(shè)計(jì)待測(cè)序的核酸，以增強(qiáng)對(duì)雜交探針位置的確定。在圖7所報(bào)告的實(shí)驗(yàn)中，在8聚寡核苷酸的這種情況下，每一種特定堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶的每一次發(fā)生都被相應(yīng)的擴(kuò)增標(biāo)簽替換。如圖7中所示，阻斷位置完美對(duì)應(yīng)著序列中的預(yù)期位置。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定核酸序列的方法，所述方法包括步驟 a)通過向?qū)?yīng)于所述核酸序列的雙鏈核酸分子施加物理力，使所述分子變性； b)提供單鏈核酸分子； c)在所述單鏈核酸分子存在下，使所述雙鏈核酸分子復(fù)性；以及 d)檢測(cè)雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述雙鏈核酸分子是發(fā)夾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的方法,其中雙鏈核酸鏈之一的堿基的至少一個(gè)直接或間接地附著至表面，并且其中雙鏈核酸的另一條鏈的至少一個(gè)堿基附著至可移動(dòng)的表面。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中通過移開支持物使得雙鏈核酸在步驟a)中變性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過移開支持物來向雙鏈分子施加高于或等于15pN，優(yōu)選高于或等于17pN，更優(yōu)選高于或等于ISpN的物理力。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中通過將支持物帶到一起使得變性的雙鏈核酸在步驟c )中復(fù)性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中通過將支持物帶到一起使得向雙鏈分子施加的力降低至小于或等于12pN，優(yōu)選小于或等于I ΙρΝ，更優(yōu)選小于或等于ΙΟρΝ。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中未附著至支持物的雙鏈核酸的末端共價(jià)或非共價(jià)地彼此連接。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)至d)重復(fù)數(shù)次(從而積累測(cè)量并增加信號(hào)/噪音比)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟d)的檢測(cè)包括測(cè)量附著至支持物的雙鏈核酸分子兩端之間的距離(Z)0
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其包括當(dāng)所述雙鏈核酸分子變性時(shí)，測(cè)量附著至支持物的雙鏈核酸分子兩端之間的距離(Zs)的另一步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其還包括步驟 比較z和Zsi,以及 確定阻斷的位置。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其包括測(cè)量阻斷的持續(xù)時(shí)間的另一步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其包括阻斷的持續(xù)時(shí)間與參考值進(jìn)行比較的另一步驟。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中單鏈核酸分子選自η聚單鏈核酸分子的文庫(kù)，所述文庫(kù)由連接有所有可能的η-2或η-3核苷酸組合的所有可能的二核苷酸或三核苷酸的組合組成，分別地η優(yōu)選為小于或等于30的整數(shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法,其中二核苷酸或三核苷酸位于單鏈核酸分子的中心。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法,其中二核苷酸或三核苷酸位于偏離單鏈核酸分子中心的位置。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其中在雙鏈核酸中四種堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、和胸腺嘧啶中的至少一種的發(fā)生被特異性擴(kuò)增標(biāo)簽替換，所述擴(kuò)增標(biāo)簽是寡核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中單鏈核酸是互補(bǔ)于擴(kuò)增標(biāo)簽之一的寡核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19任一項(xiàng)所述的方法，其包括確定所述單鏈核酸在雙鏈核酸分子上的每一個(gè)阻斷位置的另一步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)所述的方法，其中用互補(bǔ)于擴(kuò)增標(biāo)簽的每一個(gè)寡核苷酸接連重復(fù)步驟a)至d)以及確定單鏈核酸在雙鏈核酸分子上的每一個(gè)阻斷位置的另一步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其包括進(jìn)一步的步驟 i)將相鄰的雜交單鏈核酸連接至上游的單鏈核酸引物，以及 ii)通過如下步驟監(jiān)測(cè)所述引物的延伸 α在所述連接的引物存在時(shí)，使得所述雙鏈核酸變性和復(fù)性，以及 β檢測(cè)復(fù)性中的阻斷。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中用不同單鏈核酸重復(fù)步驟i)至ii)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22和23任一項(xiàng)所述的方法，其中單鏈核酸分子選自η聚單鏈核酸分子的文庫(kù)，所述文庫(kù)由所有可能的二核苷酸的組合組成，所述二核苷酸3’端連接至所有可能的η-2核苷酸組合，η優(yōu)選為小于或等于20的整數(shù)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)所述的方法，其中去除或分解新合成的鏈。
26.一種用于測(cè)定核酸序列的方法，其中用引物重復(fù)權(quán)利要求22-25所述的步驟，所述引物相對(duì)于權(quán)利要求22所述的引物向上游或下游移動(dòng)一個(gè)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過物理操作測(cè)定核酸序列的方法。尤其是，所述方法包括步驟通過向?qū)?yīng)于所述核酸序列的雙鏈核酸分子施加物理力，使所述分子變性；以及檢測(cè)雙鏈核酸分子復(fù)性的阻斷。更具體地，所述方法包括步驟通過向?qū)?yīng)于所述核酸序列的雙鏈核酸分子施加物理力，使所述分子變性；提供單鏈核酸分子；在所述單鏈核酸分子存在下，使所述雙鏈核酸分子復(fù)性；以及檢測(cè)雙鏈核酸復(fù)性的阻斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103052718SQ201180034601
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者D·邦西蒙, J-F·阿勒芒, M·馬諾薩斯, 丁方圓, V·克羅凱特 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 巴黎高等師范學(xué)院