專利名稱：通用樣品制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外診斷學(xué)領(lǐng)域。具體而言，在此領(lǐng)域內(nèi)，其關(guān)注用于診斷目的的核酸的樣品制備。更精確地，本發(fā)明提供了一種用于自多種不同類型的流體樣品至少同時(shí)分離第一和第二靶核酸的方法。
背景技術(shù)：
自復(fù)雜的生物學(xué)混合物諸如例如臨床樣品分離生物學(xué)材料諸如核酸或蛋白質(zhì)具有相當(dāng)大的意義，尤其對(duì)于診斷目的。核酸樣品制備的診斷性應(yīng)用的例子包含病毒諸如人乳頭狀瘤病毒(HPV)、西尼羅病毒(WNV)的制備及隨后的檢測(cè)或針對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)的存在的獻(xiàn)血常規(guī)篩選。此外，所述擴(kuò)增技術(shù)適用于細(xì)菌性靶物諸如分枝桿菌 或沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae),或?qū)δ[瘤標(biāo)志物的分析。本領(lǐng)域中已經(jīng)開(kāi)發(fā)出眾多不同方法，例如，將樣品中不期望的組分變性、沉淀并除去，隨后沉淀并分離所討論的分析物(例如基于醇的核酸沉淀)。另一種辦法是將相應(yīng)的生物學(xué)材料結(jié)合至固體支持材料，所述固體支持材料可以例如以層析柱形式提供。出于診斷目的，且尤其為了自動(dòng)化分離隨后進(jìn)行中或高通量分析的生物學(xué)材料，經(jīng)常使用結(jié)合顆粒。這類顆?？梢跃哂泄δ芑砻?，即它們經(jīng)常用抗體、核酸捕捉探針等包被以結(jié)合期望的分析物。或者，它們可以具有未修飾的表面諸如特別用于核酸分離的玻璃表面。然而，出于診斷目的而有待分析的靶核酸可以存在于多種不同來(lái)源中。實(shí)際上，通常使用于不同來(lái)源中核酸的樣品制備規(guī)程適合于1.流體樣品的類型2.核酸的類型。在從不同來(lái)源分離不同核酸時(shí)，也可能不得不考慮其它標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)通過(guò)對(duì)所述不同類型的樣品提供不同制備方法解決了此多樣性。本發(fā)明提供了用于從多種不同類型的流體樣品至少分離第一和第二靶核酸的改良方法。發(fā)明描述本發(fā)明提供了一種用于從多種不同類型的流體樣品至少同時(shí)分離第一和第二靶核酸的方法。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于從多種不同類型的流體樣品至少同時(shí)分離第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自動(dòng)化步驟a.在與流體樣品數(shù)目對(duì)應(yīng)的數(shù)目的容器中將固體支持材料和所述多種不同類型的流體樣品在一定條件下組合在一起達(dá)一段時(shí)間，該條件和時(shí)間段足以允許包含所述靶核酸的核酸在所述固體支持材料上固定化，b.在分離站中將所述固體支持材料自存在于所述流體樣品中的其它物質(zhì)分離，c.在分離站中純化所述核酸，其通過(guò)將所述流體樣品與所述固體支持材料分開(kāi)，并將所述固體支持材料用清洗緩沖液清洗一次或多次進(jìn)行，其中物理?xiàng)l件和所述時(shí)間段對(duì)于所述多種不同類型的流體樣品的成員是相同的。特別但不僅對(duì)于具有高樣品通量的臨床實(shí)驗(yàn)室，高度有利的是提供用于從多種不同類型的流體樣品快速、簡(jiǎn)便且可靠地同時(shí)分離多種靶核酸的這類改良方法。包括上文提及的自動(dòng)化步驟的方法展示出多種優(yōu)點(diǎn)。首先，將依照本發(fā)明的樣品制備規(guī)程與例如RNA逆轉(zhuǎn)錄和靶核酸擴(kuò)增以自動(dòng)化方式組合顯著降低對(duì)手動(dòng)干預(yù)的需要以及由此潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)?！ご送?，提供其中有多種不同樣品，即不同核酸來(lái)源的單一方法的可能性顯著促成降低核酸診斷的總體復(fù)雜性。如果例如不得不對(duì)每種類型的流體樣品應(yīng)用不同方法，就像現(xiàn)有技術(shù)中的情況那樣，那么樣品制備是復(fù)雜、耗時(shí)且資源密集得多的。通常，必須采用不同試劑，這導(dǎo)致成本增加，并且阻礙快速且不復(fù)雜的自動(dòng)化解決辦法的開(kāi)發(fā)。依照本發(fā)明的樣品制備展現(xiàn)出適合于處理含有不同類型核酸諸如例如DNA和RNA的多種不同樣品類型的靈活性和工作流。不同來(lái)源，即樣品類型包含所有種類的人體液,諸如例如血液、痰、鼻拭樣、尿液、汗液或其它，等等。依照本發(fā)明的方法需要相當(dāng)少的動(dòng)手實(shí)踐時(shí)間，并且測(cè)試的實(shí)施比現(xiàn)有技術(shù)中使用的樣品制備方法簡(jiǎn)單得多。依照本發(fā)明的方法在例如臨床病毒學(xué)領(lǐng)域中提供一項(xiàng)主要的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠湓试S平行實(shí)驗(yàn)中數(shù)種病毒的平行樣品制備和優(yōu)選地下游擴(kuò)增。該方法特別可用于管理需要頻繁的病毒監(jiān)測(cè)的移植后患者。由此，依照本發(fā)明的方法促進(jìn)節(jié)省成本的診斷學(xué)，并且促成抗病毒劑的使用和病毒性并發(fā)癥以及住院的降低。這同樣適用于臨床微生物學(xué)領(lǐng)域。一般而言，效率會(huì)在更快的周轉(zhuǎn)時(shí)間和改善的測(cè)試靈活性方面增加。因此，這導(dǎo)致做出診斷對(duì)患者要求的測(cè)試運(yùn)行數(shù)目的降低和潛在更短的住院期(例如如果可以更快地提供診斷，那么需要抗微生物療法的患者會(huì)更快地接受它，并且因此更早恢復(fù))。另外，患者顯示更小的發(fā)病率，并且因此引起更少的支持療法(例如敗血癥診斷延遲相關(guān)的加強(qiáng)監(jiān)護(hù))相關(guān)成本。更快地提供陰性結(jié)果對(duì)于抗生素的開(kāi)藥過(guò)量可以具有重要的含意。例如，如果使用依照本發(fā)明的方法獲得的測(cè)試結(jié)果能夠比用標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方法，接著用例如實(shí)時(shí)PCR更快地排除病原體，那么就不會(huì)迫使臨床醫(yī)師使用經(jīng)驗(yàn)抗生素?；蛘?，如果使用經(jīng)驗(yàn)抗生素，那么可以縮短相應(yīng)治療的持續(xù)時(shí)間。就設(shè)計(jì)一種包括用依照本發(fā)明的方法的樣品制備的測(cè)定法而言，熟練技術(shù)人員會(huì)特別但不僅僅受益于下列優(yōu)點(diǎn) 軟件復(fù)雜性的降低(導(dǎo)致編程錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)降低) 將測(cè)定法開(kāi)發(fā)努力聚焦于化學(xué)優(yōu)化而非化學(xué)以及儀器控制參數(shù) 可靠得多的系統(tǒng)，因?yàn)榭偸鞘褂脝我环椒?，并且可以最佳地設(shè)計(jì)硬件來(lái)實(shí)施此方案 給實(shí)施依照本發(fā)明方法的熟練技術(shù)人員提供作為同一過(guò)程的部分平行運(yùn)行多種不同分離的靈活性籲成本降低。 在本發(fā)明的意義中，核酸的“純化”、“分離”或“提取”指如下的情況可以在診斷測(cè)定法中例如通過(guò)擴(kuò)增分析核酸前，通常必須從含有不同組分的復(fù)雜混合物的生物學(xué)樣品中將它們純化、分離或提取。對(duì)于第一步，可以使用允許核酸富集的方法。經(jīng)常，要分析的核酸在所討論的流體樣品內(nèi)的溶液中不是游離的，而是位于閉合結(jié)構(gòu)諸如例如細(xì)胞或病毒內(nèi)。在診斷用測(cè)定法中，目的經(jīng)常是特別是鑒定流體樣品諸如臨床樣品中病原性細(xì)胞或病毒。這類病原體可以例如包含RNA病毒如例如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙肝病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、日本腦炎病毒(JEV)、圣路易斯(St. Louis)腦炎病毒(SLEV)和其它，或DNA病毒如例如乙肝病毒(HBC)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和其它，或細(xì)菌如例如沙眼衣原體(CT)、淋病奈瑟氏球菌(NG)和其它。依照本發(fā)明的方法對(duì)于從上文提及的以及其它的生物體中提取核酸是有用的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文描述的方法，其中步驟a.進(jìn)一步包括將核酸從其細(xì)胞和/或病毒環(huán)境中釋放，其通過(guò)裂解多種不同流體樣品中潛在存在的細(xì)胞和/或病毒殼體進(jìn)行。 為了釋放細(xì)胞或病毒顆粒的內(nèi)容物，可以將它們用酶或化學(xué)藥品處理以將細(xì)胞壁或病毒顆粒溶解、降解或變性。此過(guò)程通常被稱為裂解。所得的含有這類裂解材料的溶液被稱為溶胞物。適合于裂解細(xì)胞和/或病毒殼體或類似結(jié)構(gòu)的試劑通常在裂解緩沖液內(nèi)提供。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文所描述的方法在步驟a.中進(jìn)一步包括向多種不同流體樣品添加裂解緩沖液。由于依照本發(fā)明的方法對(duì)于高通量、效率和并行化是特別有利的，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述裂解緩沖液對(duì)于所述多種不同類型的流體樣品的成員是相同的。那樣，樣品制備規(guī)程的復(fù)雜性得到進(jìn)一步降低，因?yàn)椴槐貙?duì)要處理的不同樣品單個(gè)提供不同裂解試劑。此外，該規(guī)程在用單一裂解緩沖液工作時(shí)可以更容易地控制?？梢岳缬枚嗦芬埔汗軓膯蝹€(gè)容器中取出裂解緩沖液，隨后同時(shí)分配到不同樣品中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文所描述的方法中的裂解緩沖液包含一種或多種選自下組的組分籲離液劑籲緩沖物質(zhì) 醇籲還原劑。離液劑(其通常擾亂溶液中水分子的有序結(jié)構(gòu)以及分子之中和之間的非共價(jià)結(jié)合力)可以對(duì)樣品制備規(guī)程做出數(shù)種貢獻(xiàn)。具體但不僅僅，它們可以通過(guò)擾亂核酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)作為RNA酶抑制劑應(yīng)用。通常，不必對(duì)裂解緩沖液應(yīng)用另外的RNA酶抑制劑。除此之外，離液劑還促成對(duì)生物膜，諸如質(zhì)膜或細(xì)胞器膜(若存在的話)的破壞。還有，它們可以在核酸對(duì)表面如玻璃的粘著結(jié)合中起重要的作用(見(jiàn)下文)。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的離液劑是胍鹽如硫氰酸胍或鹽酸胍或氯化胍或異硫氰酸胍、尿素、過(guò)氯酸鹽諸如例如過(guò)氯酸鉀、其它硫氰酸鹽或碘化鉀。特別優(yōu)選的是硫氰酸胍。然而，在本發(fā)明的范圍內(nèi)也可以使用其它離液劑?！愕兀彌_物質(zhì)對(duì)于維持溶液中某個(gè)pH值或pH范圍是重要的。這是大多數(shù)生物學(xué)系統(tǒng)的先決條件，并且通常對(duì)于體外反應(yīng)也是期望的。它對(duì)于本發(fā)明的方法也可以是有利的。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的緩沖液是檸檬酸鹽緩沖液諸如檸檬酸鈉，而且還有Tris (三-(羥甲基)-氨基甲烷)緩沖液諸如TrisHCl、磷酸鹽、N-(2-羥乙基)-哌嗪-N’ -(2-乙磺酸)(HEPES)、乙酸鹽緩沖液，而且也可以在本發(fā)明上下文中使用其它緩沖液。在用于核酸制備的裂解緩沖液中使用醇也可以是有利的，如本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明上下文中特別優(yōu)選的是使用聚多卡醇(polidocanol)，而其它醇也可以在上文所描述的裂解緩沖液中使用。聚多卡醇用于制備核酸的用途已經(jīng)例如記載于EP1932913中。還原劑也可以促成不期望的組分諸如上文提及的RNA酶A的變性。具體地，如本領(lǐng)域中公知的還原劑切割對(duì)于許多蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)特別重要的分子間和分子內(nèi)二硫鍵。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的是還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)， 但是也可以在本發(fā)明的上下文中有利地采用本領(lǐng)域中已知的其它還原劑諸如例如2-巰基乙醇。由上述內(nèi)容看來(lái)，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面是上文所描述的方法，其中所述裂解緩沖液包含下列組分籲硫氰酸胍，籲檸檬酸鈉， 聚多卡醇，· DTT0在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文提及的裂解緩沖液組分的濃度如下籲硫氰酸胍4M 檸檬酸鈉50mM 聚多卡醇5%w/v# DTT :2%w/v。上文所描述的裂解緩沖液的pH并不限于特定pH值。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述裂解緩沖液具有酸性pH，更優(yōu)選地5. 5-6. 5，最優(yōu)選地約5. 8的pH。在裂解過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題是降解感興趣組分的其它酶，例如降解核酸的脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶諸如上文提及的RNA酶在裂解規(guī)程過(guò)程中與感興趣的組分接觸。這些降解酶也可以存在于細(xì)胞外部或在裂解前可能已經(jīng)在不同細(xì)胞區(qū)室中空間分隔。當(dāng)裂解發(fā)生時(shí)，感興趣的組分變得暴露于所述降解酶。在此過(guò)程期間釋放的其它組分可以例如是屬于對(duì)細(xì)胞有毒的脂多糖類家族的內(nèi)毒素，并且可以對(duì)意圖用在人或動(dòng)物療法中的產(chǎn)品引起問(wèn)題。有多種手段來(lái)處理上文提及的問(wèn)題。當(dāng)意圖釋放核酸時(shí)，通常使用離液劑(如上文所描述)或陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子或非離子型去污劑。使用快速降解先前描述的酶或不期望的蛋白質(zhì)的蛋白酶也是一種優(yōu)點(diǎn)。然而，這可能產(chǎn)生另一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗鑫镔|(zhì)或酶能在隨后步驟中干擾試劑或組分。在上文提及的這類裂解或樣品制備過(guò)程中優(yōu)選使用的酶是如下的酶，其切割蛋白質(zhì)底物中的酰胺連接，并且分類為蛋白酶，或(互換地)肽酶(參見(jiàn)Walsh, 1979, EnzymaticReaction Mechanisms, ff. H. Freeman and Company, San Francisco,第 3 章)。現(xiàn)有技術(shù)中使用的蛋白酶包含堿性蛋白酶(W098/04730)或酸性蛋白酶(US5，386，024)。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)在核酸分離中廣泛用于樣品制備的蛋白酶是來(lái)自白色念球菌(Tritirachiumalbum)的蛋白酶 K(參見(jiàn)例如 Sambrook J.等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989),其在中性pH左右是有活性的，并且屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶家族。在上文提及的裂解或樣品制備方法中特別優(yōu)選使用的是酶Esperase，即一種在高堿度和于高溫兩者都保留其活性的強(qiáng)力的蛋白酶(EP1201753)。在裂解步驟后的樣品制備步驟中，進(jìn)一步富集感興趣的組分。如果感興趣的非蛋白質(zhì)性組分是例如核酸，那么通常在將它們?cè)诨谔结樀臏y(cè)定法中使用前從復(fù)雜的裂解混合物提取它們。有數(shù)種用于核酸純化的方法序列依賴性的或生物特異性的方法如例如 親和層析 與固定化的探針雜交不依賴于序列的或物理化學(xué)的方法如例如 用例如酚-氯仿進(jìn)行的液體-液體萃取 用例如純乙醇進(jìn)行的沉淀 用濾紙進(jìn)行的提取 用微團(tuán)形成劑如鯨蠟基三甲基溴化銨進(jìn)行的提取 結(jié)合固定化的嵌合染料，例如吖啶衍生物 吸附至娃膠或娃藻土(diatomic earth) 在離液序列高的(chaotropic)條件下吸附至磁性玻璃顆粒(MGP)或有機(jī)娃燒顆粒。對(duì)于純化目的特別感興趣的是將核酸吸附至玻璃表面，盡管其它表面也是有可能的。近年來(lái)已經(jīng)提出了許多通過(guò)利用核酸對(duì)玻璃表面的結(jié)合行為用于將其從其天然環(huán)境中分離出來(lái)的規(guī)程。如果未修飾的核酸是靶物，那么優(yōu)選將核酸直接結(jié)合至硅土表面的材料，因?yàn)楹怂岵槐剡M(jìn)行修飾，而且甚至可以結(jié)合天然核酸，等等。這些方法由多份文件詳細(xì)地描述。例如，在 VogelsteinB.等,Proc. Natl. Acad. USA76 (1979) 615-9 中，提出了一種用于將來(lái)自瓊脂糖凝膠的核酸在存在碘化鈉的情況下結(jié)合到磨砂火石玻璃的規(guī)程。在存在過(guò)氯酸鈉的情況下在玻璃粉上自細(xì)菌純化質(zhì)粒DNA記載于Marko Μ. A.等，Anal.Biochem. 121 (1982)382-387。在DE-A3734442中，描述了在玻璃纖維濾器上分離單鏈M13噬菌體DNA，其通過(guò)使用乙酸將噬菌體顆粒沉淀,并用高氯酸鹽裂解噬菌體顆粒來(lái)進(jìn)行。清洗結(jié)合到玻璃纖維濾器的核酸，然后用含有甲醇的Tris/EDTA緩沖液洗脫。一種用于從λ噬菌體純化DNA的類似規(guī)程記載于Jakobi R.等，Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201。該規(guī)程需要使核酸在離液鹽溶液中選擇性結(jié)合玻璃表面以及將核酸與污染物諸如瓊脂糖、蛋白質(zhì)或細(xì)胞殘留物分開(kāi)。為了將玻璃顆粒與污染物分開(kāi)，可以將該顆粒離心或者將流體抽過(guò)玻璃纖維濾器。然而，這是一個(gè)限制步驟，其阻止該規(guī)程用于加工大量樣品。在通過(guò)添加鹽和乙醇進(jìn)行沉淀后使用磁性顆粒來(lái)固定化核酸是更有利的，并且記載于例如AldertonR. P.等，S·，Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 和 PCT GB91/00212 中。在此規(guī)程中，將核酸與磁性顆粒一起凝集。通過(guò)應(yīng)用磁場(chǎng)并實(shí)施清洗步驟將凝集物與初始溶劑分開(kāi)。在一個(gè)清洗步驟后，將核酸溶解于Tris緩沖液中。然而，此規(guī)程具有的缺點(diǎn)在于沉淀對(duì)于核酸不是選擇性的。更確切地，也將多種固體和溶解的物質(zhì)凝集。因此，不可以使用此規(guī)程來(lái)除去可能存在的、特定酶促反應(yīng)的大量的任何抑制劑。磁性多孔玻璃也是商品化的，其在多孔特殊玻璃基質(zhì)中含有磁性顆粒，并且用含有鏈霉親合素的層覆蓋。如果生物學(xué)材料例如蛋白質(zhì)或核酸在復(fù)雜的制備步驟中修飾，從而它們共價(jià)結(jié)合生物素，那么可以使用此產(chǎn)品來(lái)分離它們?？纱呕奶厥馕絼┳C明為對(duì)于自動(dòng)樣品制備是非常有效且合適的。出于此目的，使用亞鐵磁性和鐵磁性以及超順磁性(superparamagnetic)色素。最優(yōu)選的磁性玻璃顆粒和使用它們的方法是那些記載于W001/37291中的。依照R. Boom等(JClinMicrobiol. 28(1990),495-503)的方法特別可用于本發(fā)明上下文中的核酸分離。可以通過(guò)改編所述方法中使用的相應(yīng)流體樣品的體積來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)依照本發(fā)明的方法的靈活性。此實(shí)施方案聚焦于不同類型的流體樣品和可能地生物體及其內(nèi)存在的核酸類型的多樣性。例如，全血樣品中的某些病毒可能比其它樣品需要更多的起始材料(若已知在這些特定情況中通常僅存在低拷貝數(shù))。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述多種不同流體樣 品中的至少一種流體樣品與其它流體樣品具有不同的體積?；蛘?另外，還優(yōu)選的是，向所述多種不同流體樣品添加不同體積的裂解緩沖液。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述多種不同流體樣品中的至少一種流體樣品與其它流體樣品具有不同體積時(shí)，向樣品添加裂解緩沖液，使得所有樣品在添加后具有相同體積。在此實(shí)施方案中，對(duì)不同樣品同時(shí)實(shí)施自動(dòng)化方法甚至是更方便的。在此辦法中組合如下的優(yōu)點(diǎn)，即能夠根據(jù)樣品類型來(lái)選擇適當(dāng)?shù)钠鹗俭w積及對(duì)于實(shí)施分離和任選地，例如擴(kuò)增和檢測(cè)具有相同體積。術(shù)語(yǔ)“固體支持材料”包含就核酸固定化而言的、上文提及的任何固體材料，例如磁性玻璃顆粒、玻璃纖維、玻璃纖維濾器、濾紙等，盡管固體支持材料并不限于這些材料。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述固體支持材料包含核酸結(jié)合顆粒和核酸，所述核酸結(jié)合顆粒優(yōu)選是一種或多種選自下組的材料硅土、金屬、金屬氧化物、塑料、聚合物。在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述固體支持材料是磁性玻璃顆粒?！肮潭ɑ痹诒景l(fā)明的上下文中意指以可逆或不可逆的方式捕捉對(duì)象諸如例如核酸。具體地，“在固體支持材料上固定化”意指出于將其與任何周圍介質(zhì)分開(kāi)的目的，使一種或多種對(duì)象與固體支持材料結(jié)合，并且可以例如通過(guò)在后來(lái)的點(diǎn)時(shí)與固體支持材料分開(kāi)來(lái)回收。在此上下文中，“固定化”可以例如包括將核酸吸附至玻璃或固體材料的其它合適的表面，如上文所描述的。此外，可以通過(guò)結(jié)合捕捉探針來(lái)特異性“固定化”核酸，其中核酸通過(guò)堿基配對(duì)而結(jié)合附著于固體支持物的、基本上互補(bǔ)的核酸。在后一種情況中，這類特異性固定化導(dǎo)致靶核酸的優(yōu)勢(shì)結(jié)合。“同時(shí)”在本發(fā)明的意義中意味著同時(shí)且在相同物理?xiàng)l件下實(shí)施兩種行為，諸如擴(kuò)增第一和第二或更多種核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)容器中實(shí)施至少第一和第二革巴核酸的同時(shí)擴(kuò)增。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)容器中用至少一種核酸而在第二容器中用至少第二種核酸同時(shí)且在相同物理?xiàng)l件(特別就溫度和溫育時(shí)間而言)下實(shí)施同時(shí)擴(kuò)增。
“第一靶核酸”和“第二靶核酸”是不同的核酸?！傲黧w樣品”是可以進(jìn)行靶向核酸的診斷用測(cè)定法的任何流體材料，并且優(yōu)選地，自生物學(xué)來(lái)源衍生。還優(yōu)選地，流體樣品自人衍生，并且是體液。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，流體樣品是人血液、尿液、痰、汗液、拭樣、可移液的糞、或脊髓液。最優(yōu)選地，流體樣品是人血液。術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)容器”包含但不限于，管或板諸如微孔、深孔或其它類型多孔板的孔，其中發(fā)生用于分析流體樣品的反應(yīng)諸如例如逆轉(zhuǎn)錄或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這類容器的外部界限或壁是化學(xué)惰性的，使得它們不干擾之內(nèi)發(fā)生的分析反應(yīng)。優(yōu)選地，如上文所描述的核酸分離也在多孔板中實(shí)施。在此背景中，分析系統(tǒng)中的多孔板允許多種樣品的平行分離和分析或貯存?？梢詫?duì)多孔板優(yōu)化最大液體攝取，或得到最大熱轉(zhuǎn)移。用于本發(fā)明上下文中的優(yōu)選的多孔板是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，以在自動(dòng)化分析儀中溫育或分離分析物。優(yōu)選地，多孔板構(gòu)建并排列為接觸磁 性裝置和/或加熱裝置。所述優(yōu)選的多孔板(可互換地，其在本發(fā)明的上下文中稱作“加工板”)，包含-包含成行排列的、頂部有開(kāi)口的多個(gè)容器的頂部表面。容器包含上部部分、中心部分和底部部分。上部部分與多孔板的頂部表面連接，并且包含兩個(gè)較長(zhǎng)側(cè)和兩個(gè)較短側(cè)。中心部分具有實(shí)質(zhì)上矩形的橫截面，其具有兩個(gè)較長(zhǎng)側(cè)和兩個(gè)較短側(cè)；-兩個(gè)相向的較短的和兩個(gè)相向的較長(zhǎng)的側(cè)壁，和-基部，其中所述基部包含開(kāi)口，該開(kāi)口構(gòu)建并排列為將多孔板置于與所述磁性裝置和/或加熱裝置的接觸中。在多孔板的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一行內(nèi)相鄰的容器在所述幾乎矩形形狀的較長(zhǎng)側(cè)上連接。優(yōu)選地，多孔板包含位于容器的相鄰行間的連續(xù)空間。所述連續(xù)空間構(gòu)建并排列為容納板形狀的磁性裝置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器的底部部分包含球形底部。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器的底部部分包含位于所述中心部分和所述球形底部之間的圓錐部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述頂部表面包含圓拱(rib)，其中所述圓拱圍繞所述容器的開(kāi)口。優(yōu)選地，容器的所述上部部分的一個(gè)較短側(cè)包含凹口(recess)，所述凹口包含從圓拱延伸到該容器內(nèi)側(cè)的彎曲表面。此外，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述容器包含圓形內(nèi)側(cè)形狀。為了固定到加工或溫育站，優(yōu)選地，基部包含含有凹口的邊緣。分析儀站上的閂鎖夾(latch clip)可以銜接所述凹口以將板固定在站上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述容器包含基本上恒定的壁厚度。在本發(fā)明上下文中優(yōu)選的加工板(101)是I組件板。其頂部表面(110)包含多個(gè)容器(103)(圖5、圖6)。每個(gè)容器在頂部具有開(kāi)口(108)，并且在底部端(112)是閉合的。頂部表面(110)包含圓拱(104)，優(yōu)選地，其相對(duì)于頂部表面(110)是升高的，并且圍繞容器
(103)的開(kāi)口(108)。這防止可能落到板(101)的頂部表面(110)上的液滴污染容器(103)的內(nèi)容物。在圖3至8中顯示了優(yōu)選的加工板的視圖。優(yōu)選地，加工板(101)的足跡包含對(duì)應(yīng)于ANSI SBS足跡形式的基部長(zhǎng)度和寬度。更優(yōu)選地，長(zhǎng)度為127. 76mm+/-0. 25mm，而寬度為85. 48mm+/-0. 25mm。因此，該板(101)具有兩個(gè)相向的較短的側(cè)壁(109)和兩個(gè)相向的較長(zhǎng)的側(cè)壁(118)。加工板(101)包含用于與輸送裝置(handler) (500，

圖12)相互作用的形式鎖定元件(106)。可以將加工板(101)在維持正確取向和位置的情況中以高速快速且安全地夾緊、轉(zhuǎn)運(yùn)并定位。優(yōu)選地，用于夾緊的形式鎖定元件(106)位于加工板(101)的上部中心部分，優(yōu)選地，上部中心的三分之一內(nèi)。這具有的優(yōu)點(diǎn)在于加工板(101)的潛在扭曲對(duì)形式鎖定元件(106)只具有較小的影響，而且板(101)的操作更強(qiáng)力。 優(yōu)選地，加工板(101)包含硬件標(biāo)識(shí)符(102)和(115)。硬件標(biāo)識(shí)符(102)和(115)是加工板(101)獨(dú)特的，并且不同于同一系統(tǒng)中使用的其它消耗品的硬件標(biāo)識(shí)符。優(yōu)選地，硬件標(biāo)識(shí)符(102,115)在該消耗品側(cè)壁上包含隆起部(ridge) (119)和/或凹口(125)，其中所述隆起部(119)和/或凹口(125)的模式對(duì)于特定的消耗品類型，優(yōu)選地加工板(101)是獨(dú)特的。此獨(dú)特模式在本文中也稱為獨(dú)特的“表面幾何學(xué)”。硬件標(biāo)識(shí)符(102、115)確保用戶僅可以將加工板(101)以正確的取向加載到分析用儀器的適當(dāng)堆垛機(jī)(stacker)位置中。在加工板(101)的側(cè)面，包含導(dǎo)向元件(116)和(117)(圖3、圖4)。它們防止加工板 [101]傾斜。導(dǎo)向元件(116,117)允許用戶將具有導(dǎo)向元件(116,117)的加工板(101)作為堆垛(stack)加載到分析用儀器中，然后將其在不使板傾斜的情況中在堆垛機(jī)中在該儀器內(nèi)垂直轉(zhuǎn)移。容器(103)的中心部分(120)具有幾乎為矩形的橫截面(圖6、圖7)。它們沿著幾乎為矩形形狀的較長(zhǎng)側(cè)(118)以共用壁(113)分隔(圖3)。由此形成的容器(103)行具有的優(yōu)點(diǎn)在于盡管可用的空間有限，但是它們具有大體積，優(yōu)選地為4ml的體積。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于由于基本上恒定的壁厚度，生產(chǎn)是非常經(jīng)濟(jì)的。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)在于容器(103)彼此加強(qiáng)，并且因此可以獲得形狀的高穩(wěn)定性。連續(xù)空間(121)位于容器(103)行之間(圖6、圖7)。該空間(121)可以容納磁體(202,203)或加熱裝置(128)(圖11)。優(yōu)選地，這些磁體(202,203)和加熱裝置(128)是固體裝置。因此，可以將容器(103)中可容納的液體(215)中包含的磁性顆粒(216)從該液體(215)分離，其通過(guò)在使磁體(202、203)接近容器(103)時(shí)對(duì)容器(103)施加磁場(chǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘撸趯⒓庸ぐ?101)置于加熱裝置(128)上時(shí)，可以以升高的、受控的溫度溫育容器(103)的內(nèi)容物。由于磁體(202、203)或加熱裝置(128)可以是固體，因此可以實(shí)現(xiàn)高能量密度。容器(103)的中心部分(120)的幾乎矩形的形狀(圖10)還通過(guò)優(yōu)化容器(103)和磁體(202)或加熱裝置(128)之間的接觸表面，并且因此增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移入容器中來(lái)優(yōu)化容器壁(109)和扁平形狀的磁體(202)或加熱裝置(128)之間的接觸。在容器的圓錐底部(111)的區(qū)域中，空間(121)甚至更為明顯，并且可以容納更多磁體(203)。容器的上部區(qū)域中大磁體(202)和圓錐區(qū)域中較小磁體(203)的組合允許較大或小體積液體(215)中磁性顆粒(216)的分離。因此，小磁體(203)使得在洗脫物移液過(guò)程中扣留磁性顆粒(216)更簡(jiǎn)單。這使得通過(guò)減少磁性顆粒(216)沉淀物的死體積來(lái)以最小的損失移液洗脫物成為可能。此外，使轉(zhuǎn)移的洗脫物中磁性顆粒(216)的存在最小化。在容器(103)的上部端，容器(103)的較短側(cè)壁(109)之一包含延伸至圓周圓拱
(104)的試劑入口通道(105)(圖3、4、7)。將試劑移液至試劑入口通道(105)上，并且從通道(105)排入容器(103)中。因此，防止移液管針或尖端(3、4)和容器中含有的液體之間的接觸。此外，防止源自將液體直接分配入容器(103)中含有的另一種液體(215)中的噴濺，其可能引起移液管針或尖端(3、4)或相鄰容器(103)的污染。將小體積試劑，隨后為最大體積的另一種試劑連續(xù)移液入試劑入口通道(105)上確保將僅以少量添加的試劑完全排入容器(103)中。因此，移液小體積的試劑在不損失要實(shí)施的測(cè)試的準(zhǔn)確度的情況中是可能的。在內(nèi)側(cè)，在容器底部(111、112)，形狀變成圓錐形(111)，并且以球形底部(112)為末端(圖6、圖7)。容器的內(nèi)側(cè)形狀(114)(包括矩形中心部分(120))是圓形的。球形底部(112)、圓形內(nèi)側(cè)形狀(114)、圓錐形部分(111)和容器(103)的精細(xì)表面的組合產(chǎn)生有利的流體學(xué)，其促進(jìn)加工板(101)中分析物的有效分離和純化。球形底部(112)允許分離洗脫物的基本上完全使用和死體積的降低，這減少試劑遺留物或樣品交叉污染。
加工板(101)的基部(129)上的邊緣包含用于銜接加工站(201)或加熱裝置
(128)或分析用儀器(126)上的閂鎖夾(124)的凹口 (107)(圖5、圖9)。閂鎖夾(124)與凹口(107)的銜接允許加工板(101)在加工站(201)上的定位和固定。凹口(107)的存在允許閂鎖力幾乎與基部(129)垂直地對(duì)加工板(101)起作用。因此，僅可以發(fā)生橫向起作用的小力。這降低應(yīng)變的發(fā)生以及如此加工板(101)的變形。垂直閂鎖力也可以中和加工板(101)的任何變形，從而導(dǎo)致加工站(201)內(nèi)球形底部(111)的更精確定位。一般地，加工板(101)和分析儀內(nèi)加工站(201)或加熱裝置(128)之間的精確界面減少死體積，而且還降低樣品交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。“分離站”是分析用系統(tǒng)中允許固體支持材料自流體樣品中存在的其它材料分離的一種裝置或組件。這類分離站可以例如包括但不限于離心機(jī)、過(guò)濾管架、磁體、或其它合適的組件。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離站包含一個(gè)或多個(gè)磁體。優(yōu)選地，使用一個(gè)或多個(gè)磁體來(lái)分離作為固體支持物的磁性顆粒，優(yōu)選地，磁性玻璃顆粒。如果例如流體樣品和固體支持材料在多孔板的孔中組合在一起，那么分離站包含的一個(gè)或多個(gè)磁體可以例如通過(guò)將磁體引入孔中來(lái)與流體樣品自身接觸，或者可以使所述一個(gè)或多個(gè)磁體靠近孔的外壁以吸引磁性顆粒，隨后將它們與周圍液體分開(kāi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離站是包含多孔板的裝置，所述多孔板包含具有多孔板頂部表面處開(kāi)口和閉合底部的容器。該容器包含上部部分、中心部分和底部部分，其中所述上部部分與多孔板的頂部表面連接，并且優(yōu)選地，包含兩個(gè)較長(zhǎng)側(cè)和兩個(gè)較短側(cè)。中心部分具有含兩個(gè)較長(zhǎng)側(cè)的實(shí)質(zhì)上矩形的橫截面，其中所述容器成行排列。連續(xù)空間位于兩個(gè)相鄰行間以使夾具(fixture)上安放的至少一個(gè)磁體與處于至少兩個(gè)Z位置的側(cè)壁選擇性接觸。該裝置進(jìn)一步包含磁性分離站，該磁性分離站包含至少一個(gè)夾具。夾具包含至少一個(gè)產(chǎn)生磁場(chǎng)的磁體。存在移動(dòng)機(jī)械，其相對(duì)于多孔板的容器至少在第一和第二位置之間垂直移動(dòng)包含至少一個(gè)磁體的所述至少一個(gè)夾具。優(yōu)選地，容器的所述至少兩個(gè)Z位置包含所述容器的側(cè)壁和底部部分。優(yōu)選地，所述至少一個(gè)磁體的磁場(chǎng)在所述至少一個(gè)磁體處于所述第一位置時(shí)將磁性顆粒拉到容器與所述至少一個(gè)磁體相鄰的內(nèi)表面。所述磁場(chǎng)的效應(yīng)在所述至少一個(gè)磁體處于所述第二位置時(shí)小于在所述至少一個(gè)磁體處于所述第一位置時(shí)。優(yōu)選地，包含所述至少一個(gè)磁體的夾具包含框。容器具有優(yōu)選的特征，如上文在多孔板/加工板的背景中描述的。一種這類優(yōu)選特征是所述容器的至少一部分具有與所述容器的軸成直角的實(shí)質(zhì)上矩形的橫截面。
在所述第一位置中，所述至少一個(gè)磁體與所述容器的所述部分相鄰。相鄰理解為意指極其接近從而對(duì)容器的內(nèi)容物施加磁場(chǎng)，或者與容器有物理接觸。分離站包含接受多孔板的框和附著多孔板的閂鎖夾。優(yōu)選地，分離站包含兩類磁體。下文進(jìn)一步描述了此優(yōu)選的實(shí)施方案。下文描述了第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其包含對(duì)包含磁體的框施加壓力，使得磁體相對(duì)于多孔板的容器擠壓的彈簧。優(yōu)選地，第一磁體構(gòu)建并排列為與多孔板的容器相互作用以對(duì)所述容器中容納的包含磁性顆粒的大體積液體施加磁場(chǎng)。優(yōu)選地，所述第二磁體構(gòu)建并排列為與多孔板的容器相互作用以對(duì)所述容器中容納的包含磁性顆粒的小體積液體施加磁場(chǎng)。所述第一和第二磁體可以移動(dòng)到不同的Z位置。 此外，分離和純化核酸的方法在本發(fā)明的上下文和所述分離站中是有用的。該方法包括使核酸在多孔板的容器中與磁性顆粒結(jié)合的步驟。所述容器包含上部開(kāi)口、中心部分和底部部分。然后，當(dāng)液體的主要部分位于容器中圓錐部分以具有矩形形狀的中心部分替換的截面之上時(shí)，如下將結(jié)合的材料與液體中含有的未結(jié)合的材料分開(kāi)，即將磁體從第二位置移動(dòng)到第一位置，并且在所述第一位置中，對(duì)中心部分應(yīng)用磁場(chǎng)，以及任選地，對(duì)所述容器的底部部分另外應(yīng)用磁場(chǎng)。任選地，可以用清洗溶液清洗磁性顆粒。通過(guò)對(duì)所述容器的底部部分選擇性應(yīng)用磁場(chǎng)自所述磁性顆粒分離小體積的液體，其中液體的主要部分位于容器中圓錐部分以具有矩形形狀的中心部分替換的截面之下。用于分離與磁性顆粒結(jié)合的核酸的磁性分離站在本發(fā)明的上下文中也是有用的，所述分離站包含第一磁體和第二磁體，所述第一磁體構(gòu)建并排列為與多孔板的容器相互作用以對(duì)所述容器中容納的包含磁性顆粒的大體積液體施加磁場(chǎng)，所述第二種磁體構(gòu)建并排列為與多孔板的容器相互作用以對(duì)所述容器中容納的包含磁性顆粒的小體積液體施加磁場(chǎng)，且其中所述第一和第二磁體可以移動(dòng)到不同的Z位置。在本文中描述了磁性分離站的優(yōu)選實(shí)施方案。下文描述了對(duì)本發(fā)明有用的分離站(201)的第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。所述分離站(201)的第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含至少兩類磁體(202、203)。第一長(zhǎng)型磁體(202)構(gòu)建并排列為適合于加工板(101)的空間(121)。如此，磁體(202)對(duì)容器(103)中的液體(215)施加磁場(chǎng)以扣留容器壁內(nèi)側(cè)的磁性顆粒(216)。當(dāng)存在大體積液體(215)時(shí)，這允許磁性顆粒(216)和任何與其結(jié)合的材料與容器(103)內(nèi)側(cè)的液體(215)分離。磁體(202)具有伸長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)，并且構(gòu)建并排列為與容器的基本上矩形的中心部分(120)相互作用。因此，當(dāng)液體(215)的主要部分位于容器(103)中圓錐部分(111)以具有矩形形狀的中心部分(120)替換的截面之上時(shí)使用磁體(202)。如圖40中顯示的，磁體(202)的優(yōu)選構(gòu)造包含夾具(204、204a)，該夾具包含適合于加工板(101)中容器(103)行之間的空間(121)的磁體(202)。磁體(202)的另一種優(yōu)選的實(shí)施方案包含排列在夾具(204、204a)上的磁體
(202)。優(yōu)選的分離站(201)的磁體(203)較小，并且可以與容器(103)的圓錐部分(111)相互作用。這在圖10中顯示。優(yōu)選地，磁體(203)在基部(205)上排列，所述基部可以移動(dòng)到加工板(101)的空間(121)中。優(yōu)選地，每個(gè)磁體(202、203)構(gòu)建為與兩個(gè)相鄰行中的兩個(gè)容器(103)相互作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述加工板(101)具有每行8個(gè)容器(103)的6行?？梢耘c優(yōu)選的加工板(101)相互作用的分離站(201)具有3個(gè)包含磁體(202)的夾具(204、204a)和4個(gè)包含磁體(203)的基部(205)。還包括一種如下的實(shí)施方案，其中所述分離站具有4個(gè)包含磁體(202)的磁性?shī)A具(204、204a)和3個(gè)包含磁體
(203)的磁性基部(205)。所述磁體(202、203)是可移動(dòng)的。所述分離站(201)包含移動(dòng)夾具(204、204a)和基部(205)的機(jī)械。所有夾具(204、204a)通過(guò)基部(217)相互連接，并且因此協(xié)調(diào)移動(dòng)。所有磁體(203)與一個(gè)基部(218)連接，并且因此協(xié)調(diào)移動(dòng)。用于移動(dòng)磁性板(202)和(203)的機(jī)械構(gòu)建并排列為將兩類磁性板(202、203)移動(dòng)至總共4個(gè)末端位置在圖40a_c中，所述磁體(203)位于加工板(101)的容器(103)的圓錐部分附近。這是磁體(203)的最高位置，并且是分離位置。在此圖中，所述磁體(202)位于最低位置。當(dāng)它們?cè)诖宋恢脮r(shí)它們不牽涉分離。在圖10中顯示的優(yōu)選實(shí)施方案中，磁體(202)的基部(217)與定位輪(206)連接。該基部(217)包含通過(guò)移動(dòng)元件(209)與連接元件(208)柔性接觸的底部末端(207)。所述移動(dòng)元件構(gòu)建并排列為將連接元件(208)沿著軌道(212)從一側(cè)移動(dòng)到另一側(cè)。所述移動(dòng)元件(209)用銷(220)固定到連接元件(208)。所述連接元件(208)通過(guò)螺釘(210)固定到定位輪(206)。連接元件(208)也與軸(211)連接。優(yōu)選地，所述連接元件(208)是矩形板。當(dāng)定位輪(206)繞著軸(211)偏心移動(dòng)，使得螺釘(210)從高于偏心軸的點(diǎn)移動(dòng)到低于偏心軸的點(diǎn)時(shí)，使移動(dòng)元件(209)和附著有磁體(202)的基部(204)的底部末端(207)從最高位置移動(dòng)到最低位置?；?218)在底部部分(219)上安放，并且在其較低末端用銷(213)與移動(dòng)元件(214)連接，優(yōu)選地，所述移動(dòng)元件是輪，其與定位輪(206)相互作用。當(dāng)定位輪(206)繞軸(211)旋轉(zhuǎn)時(shí)，輪(214)沿著定位輪(206)移動(dòng)。如果輪(214)位于定位輪(206)中離軸(211)的距離較短的截面上，那么磁體(203)處于其最低位置。如果輪(214)位于定位輪(206)中離軸(211)的距離最大的截面上時(shí)，磁體(203)處于其最高位置。因此，在分離站的第一個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)選實(shí)施方案中，磁體(203)的位置受定位輪
(206)形狀控制。當(dāng)移動(dòng)元件(209)沿著軌道(212)的中心、圓形的上部或下部部分(212a)移動(dòng)時(shí)，小型磁體(203)上下移動(dòng)。當(dāng)移動(dòng)元件(209)位于底部末端(207)的側(cè)面(212b) 并且向上或向下移動(dòng)時(shí)，磁體(202)向上或向下移動(dòng)。定位輪可以由任何電動(dòng)機(jī)(224)旋轉(zhuǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，彈簧(225)附著于分離站的基部(222)和磁體(203)的基部(218)以確保磁體(203)在其向下移動(dòng)時(shí)移動(dòng)到最低位置中。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“銷”指任何固定元件，包括螺釘或銷。在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分離站(230)包含至少一個(gè)夾具(231)，該夾具包含至少一個(gè)磁體(232)，優(yōu)選地，與行(123)中的容器(103)數(shù)目相等數(shù)目的磁體。優(yōu)選地，所述分離站(230)包含與上文中描述的多孔板(101)的行(123)數(shù)目相等數(shù)目的夾具
(231)。更優(yōu)選地，6個(gè)夾具(231)在分離站(230)上安放。至少一個(gè)磁體(232)在一個(gè)夾具(231)上安放。優(yōu)選地，磁體(232)數(shù)目等于一行(123)中容器(103)的數(shù)目。最優(yōu)選地，8個(gè)磁體(232)在一個(gè)夾具上(231)安放。優(yōu)選地，在所述夾具(231)上包含一類磁體
(232)。更優(yōu)選地，磁體(232)在朝向與磁體相互作用的容器取向的一側(cè)安放。夾具(231)在基部(233)上安放。優(yōu)選地，所述安放是柔性的。基部(233)包含安放于其上的彈簧(234)。彈簧(234)的數(shù)目是所述基部(233)上安放的每個(gè)夾具(231)至少一個(gè)彈簧。該基部進(jìn)一步包含斜面(236)，其限制彈簧及因此包含磁體(232)的夾具
(231)的移動(dòng)。優(yōu)選地，任一個(gè)所述彈簧(234)構(gòu)建并排列為與夾具(231)相互作用。更優(yōu)選地，所述彈簧(234)是軛式彈簧(yokespring)。所述相互作用控制夾具(231)的水平移動(dòng)。此外，分離站(230)包含框(235)。具有夾具(231)的基部(233)通過(guò)移動(dòng)機(jī)械與框
(235)連接，如在上文中對(duì)第一個(gè)實(shí)施方案的磁體(232)描述的。優(yōu)選地，所述基部(233)和夾具(231)構(gòu)建并排列為(以Z方向)垂直移動(dòng)。將上文中描述的多孔板(101)插入在分離站(230)中。垂直移動(dòng)包含磁體(232)的夾具(231)。如此，將任一個(gè)夾具(232)移動(dòng)到容器(103)的兩行(123)之間的空間(121)中。垂直移動(dòng)使安放在夾具(231)上的磁體(232)與容器(103)接觸。根據(jù)容器(103)內(nèi)側(cè)的液體(215)體積選擇Z位置。對(duì)于大體積，磁體(232)在中心位置(120)中接觸容器(103)，在那里容器(103)具有近似矩形形狀。對(duì)于小體積液體(215)(其中液體(215)的 主要部分位于容器(103)的中心部分(120)下)，優(yōu)選地，磁體(232)接觸容器(103)的圓錐部分(111)。彈簧附著于任一個(gè)框(231)的基部(233)(圖9a)、b))。該彈簧使磁體(232)擠壓容器(103)。這確保在磁性分離過(guò)程中磁體(232)和容器(103)之間的接觸。優(yōu)選地，磁體(232)在位于入口(105)下面的側(cè)壁(109)上接觸容器(103)。這具有的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)移液添加的液體流過(guò)扣留的磁性顆粒，并且確保將顆粒重懸浮，而且相同處理所有容器中的所有樣品。此實(shí)施方案特別適合于在所述多孔板(101)的容器(103)中含有不同水平的液體
(215)時(shí)將如上文中描述的多孔板(101)中包含的液體(215)與磁性顆粒(216)分開(kāi)?！扒逑淳彌_液”是設(shè)計(jì)為除去不期望的組分(尤其在純化規(guī)程中)的流體。這類緩沖液是本領(lǐng)域中公知的。在核酸純化背景中，清洗緩沖液適于清洗固體支持材料以將固定化的核酸與任何不期望的組分分開(kāi)。所述清洗緩沖液可以例如在如上文所描述的具有酸性PH且沒(méi)有乙醇和/或離液劑的一種或多種緩沖溶液中含有乙醇和/或離液劑。清洗溶液或其它溶液經(jīng)常以儲(chǔ)備溶液提供，所述儲(chǔ)備溶液在使用前必須稀釋。依照本發(fā)明的方法中的清洗需要將固體支持材料及其上固定化的核酸與清洗緩沖液進(jìn)行程度不同的強(qiáng)烈接觸。不同方法有可能實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，例如在相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)容器中或與相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)容器一起搖動(dòng)清洗緩沖液及固體支持材料。另一種有利的方法是將包含清洗緩沖液和固體支持材料的懸浮液抽吸并分配一次或多次。優(yōu)選地，使用移液管實(shí)施此方法，其中優(yōu)選地，所述移液管包含抽吸所述懸浮液并將其再次分配的一次性移液管尖端。這類移液管尖端在棄去和替換前可以使用數(shù)次。優(yōu)選地，對(duì)本發(fā)明有用的一次性移液管尖端具有至少 ο μ 1，更優(yōu)選地，至少15 μ 1，更優(yōu)選地，至少100 μ 1，更優(yōu)選地，至少500 μ 1，更優(yōu)選地，至少1ml，甚至更優(yōu)選地，約Iml的體積。在本發(fā)明的上下文中使用的移液管也可以是移液針。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟c.中的所述清洗包含抽吸和分配包含固體支持材料的清洗緩沖液。為了易于操作并促進(jìn)自動(dòng)化，優(yōu)選的是將上文提及的容器在整體排列中組合，因此可以一起操作它們。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述容器在整體排列中組合。整體排列可以例如是可逆或不可逆地彼此附著或排列在架中的管形瓶或管。優(yōu)選地，所述整體排列是多孔板。更優(yōu)選地，所述多孔板是深孔板。依照本發(fā)明的方法在要制備不同類型的核酸時(shí)是特別有用的，因?yàn)樘峁﹩我还ぷ髁骱拖嗤噭┫捎谄洳煌匦远詥为?dú)方式分離不同類型的核酸，如DNA和RNA的需要。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一靶核酸包含RNA,而所述第二靶核酸包含DNA。
此外，多種不同流體樣品可以包含不同生物體或者自不同生物體衍生。然后，用相同工作流和試劑同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的核酸也是有利的。例如，本發(fā)明允許細(xì)菌、DNA病毒和RNA病毒核酸的這類同時(shí)制備，盡管它們有不同的結(jié)構(gòu)和特性。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一靶核酸和第二靶核酸來(lái)自不同生物體。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一和/或第二核酸是非病毒性核酸。還有，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一和/或第二靶核酸是細(xì)菌核酸。如本文中使用的，“生物體”意指任何活的單細(xì)胞或多細(xì)胞生命形態(tài)。在本發(fā)明的上下文中，病毒是一種生物體。本發(fā)明在不同核酸要來(lái)自多種不同類型的流體樣品時(shí)也是有用的。如此，可以在相同物理?xiàng)l件下在平行同時(shí)提取中分離不同核酸，然后，可以例如在不同容器中進(jìn)一步分析性加工。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一核酸存在于第一流體樣品中，而所述第二核酸存在于第二流體樣品中。此類實(shí)施方案在所述不同核酸彼此不接觸并且可以分開(kāi)加工時(shí)是特別有用的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第二靶核酸不存在于第一流體樣品中。然而，不同核酸也可以存在于相同樣品內(nèi)，但是不必必須將它們都在分離后進(jìn)一步加工。本發(fā)明在這些情況中也是有用的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第二核酸也存在于第一流體樣品中。在下游加工的情況中(特別在使用診斷技術(shù)諸如核酸擴(kuò)增方法時(shí))，經(jīng)常期望或甚至需要包括一種或多種對(duì)照核酸。這樣，可以在將對(duì)照添加至純化的核酸時(shí)控制分析反應(yīng)，或者也可以在核酸提取前或期間添加對(duì)照時(shí)監(jiān)測(cè)樣品制備。包括兩類對(duì)照也是常見(jiàn)且優(yōu)選的。在此方面，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中在任何步驟對(duì)流體樣品和/或純化的核酸添加對(duì)照核酸。對(duì)于將核酸結(jié)合至固體支持材料，以及裂解細(xì)胞和病毒(若可應(yīng)用的話)，證明了于高至50°C的溫度溫育是有利的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟a.于高至50°C的溫度，優(yōu)選地，350C -450C的溫度，更優(yōu)選地，于40°C的溫度實(shí)施。對(duì)于分離的核酸的下游加工，例如將它們進(jìn)行擴(kuò)增前將它們與固體支持材料分開(kāi)可以是有利的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述方法在步驟c.后進(jìn)一步包括下列步驟d.用洗脫緩沖液將核酸自固體支持材料洗脫。在本發(fā)明的上下文中“洗脫緩沖液”是適合于將核酸與固體支持物分開(kāi)的液體。這類液體可以是例如蒸餾水或水性鹽溶液，諸如例如Tris緩沖液如Tris HC1、或HEPES、或熟練技術(shù)人員已知的其它合適的緩沖液。優(yōu)選地，這類洗脫緩沖液的PH值是堿性或中性的。 所述洗脫緩沖液可以進(jìn)一步含有組分諸如例如螯合劑如EDTA，其通過(guò)使降解酶失活來(lái)穩(wěn)定化分離的核酸。優(yōu)選地，于升高的溫度實(shí)施洗脫，使得本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是上文所描述的方法，其中于70°C -90°C的溫度，更優(yōu)選地，于80°C的溫度實(shí)施步驟d.。如上文提及的，經(jīng)常期望分析通過(guò)上文所描述的方法分離的核酸。為此，增加用于分析的起始材料的量可以是有利的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述方法在步驟c.后或步驟d.后進(jìn)一步包括下列步驟e.將純化的核酸和任選地所述固體支持材料轉(zhuǎn)移到多個(gè)反應(yīng)容器，f.擴(kuò)增靶核酸。在此背景中，特別有利的是，采用允許在相同物理?xiàng)l件下并使用相同試劑在兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)多種不同核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)方法。這類技術(shù)與上文公開(kāi)的快速且有效的樣品制備的組合對(duì)于提供例如整合自動(dòng)化解決辦法(其中對(duì)含有不同核酸的多種不同類型的樣品實(shí)施相同工作流)可以是非常有利的?？梢云叫屑庸み@些樣品以同時(shí)分離它們含有的不同核酸，然后，也可以以同時(shí)方式實(shí)施對(duì)所述分離的不同核酸的分析。這類辦法的組合顯著降低這類實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和獲得結(jié)果的時(shí)間，這具有相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)于臨床背景中的診斷實(shí)驗(yàn)室而言。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟f.包括下列步驟1.在至少兩個(gè)反應(yīng)容器中使純化的核酸與包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶的一種或多種擴(kuò)增試劑接觸，其中至少第一反應(yīng)容器至少包含所述第一靶核酸，而至少第二反應(yīng)容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述第二靶核酸不存在于所述第一反應(yīng)容器中；i1.在所述反應(yīng)容器中將所述純化的核酸與所述一種或多種擴(kuò)增試劑在一定的條件下一起溫育一段時(shí)間，該條件和時(shí)間段適合于通過(guò)所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶發(fā)生RNA轉(zhuǎn)錄；ii1.在所述反應(yīng)容器中將所述純化的核酸和所述一種或多種擴(kuò)增試劑在一定的條件下一起溫育一段時(shí)間，該條件和時(shí)間段足以發(fā)生指示所述第一和第二靶核酸的存在或缺乏的擴(kuò)增反應(yīng)，其中在步驟1.至ii1.中用于轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的條件至少對(duì)于第一和第二靶核酸是相同的。對(duì)于擴(kuò)增規(guī)程，在現(xiàn)有技術(shù)中的一項(xiàng)挑戰(zhàn)是，在單個(gè)反應(yīng)容器中實(shí)施的多重測(cè)定法中的不同靶核酸數(shù)目受限于合適標(biāo)記物的數(shù)目。例如在實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法中，熒光染料光譜的潛在重疊對(duì)于測(cè)定法性能(假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)、較低的精確性，等等)具有很大的影響。因此，相應(yīng)的熒光團(tuán)必須經(jīng)過(guò)仔細(xì)選擇，并且在光譜上良好地分開(kāi)，從而確保診斷測(cè)試的期望性能。典型地，不同可用熒光團(tuán)的數(shù)目對(duì)應(yīng)于PCR儀熒光通道的單數(shù)位數(shù)目。相比之下，在上文所描述的方法中，在至少兩個(gè)不同的反應(yīng)容器中發(fā)生至少第一和第二靶核酸的擴(kuò)增，從而允許較高數(shù)目的不同靶核酸的同時(shí)擴(kuò)增，因?yàn)椴煌磻?yīng)容器中的信號(hào)可以彼此獨(dú)立地檢出。如下的實(shí)施方案仍然在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中在多個(gè)反應(yīng)容器的一個(gè)或多個(gè)中實(shí)施多重反應(yīng)，從而成倍增加可以同時(shí)且在相同條件下擴(kuò)增的靶物數(shù)目。在本發(fā)明的上下文中，“擴(kuò)增試劑”是使核酸能夠擴(kuò)增的化學(xué)或生物化學(xué)成分。這 類試劑包含但不限于核酸聚合酶、緩沖液、單核苷酸諸如三磷酸核苷、寡核苷酸例如如寡核苷酸引物、鹽及其相應(yīng)的溶液、檢測(cè)探針、染料，等等。如本領(lǐng)域中已知的，“核苷”是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。兩類最常見(jiàn)的這類雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶。“核苷酸”是進(jìn)一步包含與核苷的糖部分共價(jià)連接的磷酸根基團(tuán)的核苷。對(duì)于那些包含呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸根基團(tuán)可以與糖的2’ _、3’ -或5’ -羥基模塊連接。核苷酸是“寡核苷酸”(其可以更一般地稱為“寡聚化合物”)，或“多核苷酸”(更一般稱為“多聚化合物”)的單體單元。前述物質(zhì)的另一種一般表述是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。依照本發(fā)明，“寡聚化合物”是由“單體單元”組成的化合物，所述“單體單元”可以是單獨(dú)的核苷酸或單獨(dú)的非天然化合物(見(jiàn)下文)，更特別地是經(jīng)修飾的核苷酸(或核苷酸類似物)或非核苷酸化合物，或其組合?！肮押塑账帷焙汀敖?jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)是寡聚化合物的亞組。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指自多個(gè)作為其單體單元的核苷酸形成的組分。磷酸根基團(tuán)通常稱為形成寡核苷酸的核苷間主鏈。RNA和DNA的正常連接或主鏈?zhǔn)?’至5’磷酸二酯連接。可以合成對(duì)本發(fā)明有用的寡核苷酸和經(jīng)修飾的寡核苷酸(見(jiàn)下文)，如主要在本領(lǐng)域中描述的且本領(lǐng)域中熟練人員已知的。用于制備特定序列的寡聚化合物的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如合適序列的克隆和限制以及直接化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成方法可以包括例如由Narang S. A.等，Methods in Enzymology68 (1979) 90-98描述的憐酸三酯方法、由 Brown E. L.等，Methods in Enzymology68 (1979) 109-151 披露的磷酸二酯方法、在 Beaucage 等，Tetrahedron Letters22 (1981) 1859 中披露的亞磷酰胺方法、在Garegg等，Chem. Scr. 25(1985)280-282中披露的H-膦酸鹽方法以及在US4, 458，066中披露的固體支持物方法。在依照本發(fā)明的方法中，寡核苷酸可以經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸?！敖?jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)與天然核苷酸相差一些修飾，但是仍然由堿基、呋喃戊糖基糖、磷酸根部分、堿基樣、呋喃戊糖基糖樣和磷酸根樣部分或其組合組成。例如，可以將標(biāo)記物附著于核苷酸的堿基部分，由此獲得經(jīng)修飾的核苷酸。核苷酸中的天然堿基也可以用例如7-脫氮嘌呤替換，由此也獲得經(jīng)修飾的核苷酸?！敖?jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)，屬于另一特定亞組的寡聚化合物，擁有一種或多種核苷酸和一種或多種經(jīng)修飾的核苷酸作為單體單元。因此，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)指以與寡核苷酸基本上相似的方式發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)，并且在本發(fā)明的背景中可以互換使用。從合成觀點(diǎn)來(lái)看，可以例如通過(guò)對(duì)磷酸根主鏈、核糖單元或核苷酸堿基的適當(dāng)修飾通過(guò)化學(xué)修飾寡核苷酸來(lái)生成經(jīng)修飾的寡核苷酸(或寡核苷酸類似物)(Uhlmann 和 Peyman, Chemical Reviews90 (1990) 543; Verma S.和 EcksteinF. , Annu. Rev. Biochem. 67 (1998)99-134)。代表性修飾包括用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷間連接替換磷酸二酯核苷間連接；用脫氮或氮雜嘌呤和嘧啶替換天然的嘌呤和嘧啶堿基，在第5位或第6位具有取代基基團(tuán)的嘧啶堿基；在第2位、第6位或第8位或第7位(如7-脫氮嘌呤)具有改變的取代基基團(tuán)的嘌呤堿基；攜帶烴基、烯基、炔基或芳基模塊，例如低級(jí)烴基基團(tuán)諸如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，或芳基基團(tuán)如苯基、芐基、萘基的堿基；在例如其2’位置具有 取代基基團(tuán)的糖；或碳環(huán)或無(wú)環(huán)糖類似物。與本發(fā)明的精神一致的其它修飾是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這類經(jīng)修飾的寡核苷酸(或寡核苷酸類似物)最好描述為與天然寡核苷酸在功能上可互換，但在結(jié)構(gòu)上不同。更為詳細(xì)的，例示性修飾披露于Verma S.和Eckstein
F.，Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134 或 W002/12263 中。另外，可以做出如下的修飾，其中核苷單元經(jīng)由取代核苷間磷酸酯或糖磷酸酯連接的基團(tuán)連接。這類連接包括那些披露于Verma S.和 Eckstein F.，Annu. Rev. Biochem. 67(1998)99-134 中的。當(dāng)利用憐酸酯以外的連接來(lái)連接核苷單元時(shí)，這類結(jié)構(gòu)也描述為“寡核苷”?！昂怂帷币约啊鞍泻怂帷笔侨绫绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的核苷酸的多聚化合物?！鞍泻怂帷痹诒疚闹杏糜谥笜悠分袘?yīng)該分析，即應(yīng)該測(cè)定樣品中其存在、不存在和/或量的核酸。術(shù)語(yǔ)“引物”在本文中如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的那樣使用，指能夠通過(guò)模板依賴性DNA聚合酶引發(fā)DNA合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但也指經(jīng)修飾的寡核苷酸，即例如引物的3’端提供游離的3’ -OH基團(tuán)，可以通過(guò)建立3’至5’磷酸二酯連接的模板依賴性DNA聚合酶對(duì)所述游離的3’ -OH基團(tuán)附著其它核苷酸，其中使用三磷酸脫氧核苷且其中釋放焦磷酸?！疤结槨币仓柑烊坏幕蚪?jīng)修飾的寡核苷酸。如本領(lǐng)域中已知的，探針滿足檢測(cè)分析物或擴(kuò)增物的目的。在依照本發(fā)明的方法的情況中，可以使用探針來(lái)檢測(cè)靶核酸的擴(kuò)增物。出于此目的，探針通常攜帶標(biāo)記物。“標(biāo)記物”，經(jīng)常稱為“報(bào)告基團(tuán)”，一般是使與其結(jié)合的核酸，特別是寡核苷酸或經(jīng)修飾的寡核苷酸，以及任何核酸與樣品的剩余部分可區(qū)別的基團(tuán)(具有附著的標(biāo)記物的核酸也可以稱作經(jīng)標(biāo)記的核酸結(jié)合化合物、經(jīng)標(biāo)記的探針或僅探針)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，其是例如熒光染料諸如熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料和香豆素染料。依照本發(fā)明的優(yōu)選的熒光染料是FAM、HEX、JA270、CAL635、香豆素343、Quasar705、Cyan500、CY5. 5、LC-紅 640、LC-紅 705。在本發(fā)明的上下文中，任何引物和/或探針都可以是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸。
核酸擴(kuò)增的優(yōu)選方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其披露于美國(guó)專利No. 4，683，202、4，683，195,4, 800, 159和4，965，188，等等。PCR通常采用兩種或更多種結(jié)合選擇的核酸模板(例如DNA或RNA)的寡核苷酸引物。對(duì)核酸分析有用的引物包括能夠在靶核酸的核酸序列內(nèi)充當(dāng)核酸合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)方法從限制性消化物純化引物，或者其可以合成生成。優(yōu)選地，引物是單鏈以在擴(kuò)增中實(shí)現(xiàn)最大效率，但是引物可以是雙鏈。首先，將雙鏈引物變性，即處理以將鏈分開(kāi)。將雙鏈核酸變性的一種方法通過(guò)加熱進(jìn)行?！盁岱€(wěn)定性聚合酶”是熱穩(wěn)定的酶聚合酶，即其是催化形成與模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物，并且在受到升高的溫度處理達(dá)實(shí)現(xiàn)雙鏈模板核酸變性必需的時(shí)間時(shí)沒(méi)有不可逆地變性的酶。一般地，合成在每條引物的3’端起始，并且沿著模板鏈以5’到3’方向進(jìn)行。熱穩(wěn)定性聚合酶已經(jīng)例如自黃色棲熱菌(Thermus fIavus)、紅色棲熱菌(T. rubber)、嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)、水生棲熱菌(T. aquaticus)、乳棲熱菌(T.1acteus)、紅色棲熱菌(T. rubens)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)和熾熱甲燒嗜熱菌(Methanothermusfervidus)分離。不過(guò),非熱穩(wěn)定性聚合酶也可以在PCR測(cè)定法中采用，只要該酶得到補(bǔ)充。如果模板核酸是雙鏈的，那么有必要在可以使用其作為PCR中的模板前將兩條鏈 分開(kāi)?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的變性方法，包括物理、化學(xué)或酶手段來(lái)實(shí)現(xiàn)鏈分開(kāi)。一種分開(kāi)核酸鏈的方法牽涉加熱核酸，直至其變性占優(yōu)勢(shì)(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%變性)。使模板核酸變性必需的加熱條件會(huì)取決于例如緩沖鹽濃度和變性的核酸的長(zhǎng)度和核苷酸組成，但是范圍通常為約90°C至約105°C達(dá)某個(gè)時(shí)間，該時(shí)間取決于反應(yīng)特征諸如溫度和核酸長(zhǎng)度。變性通常實(shí)施約5秒至9分鐘。為了不使相應(yīng)的聚合酶如例如ZOOTNA聚合酶暴露于這類高溫太長(zhǎng)及如此有損失功能性酶的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選使用較短的變性步驟。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，變性步驟長(zhǎng)至30秒，進(jìn)一步優(yōu)選地，長(zhǎng)至20秒，進(jìn)一步優(yōu)選地，長(zhǎng)至10秒，進(jìn)一步優(yōu)選地，長(zhǎng)至5秒，最優(yōu)選地，約5秒。如果通過(guò)加熱來(lái)使雙鏈模板核酸變性，那么允許反應(yīng)混合物冷卻至如下的溫度，該溫度促進(jìn)每條引物在靶核酸上與其靶序列退火。優(yōu)選地，用于退火的溫度是約35°C至約70°C，進(jìn)一步優(yōu)選地，約45°C至約65°C;進(jìn)一步優(yōu)選地，約50°C至約60°C，進(jìn)一步優(yōu)選地，約55°C至約58°C。退火時(shí)間可以是約10秒至約I分鐘(例如約20秒至約50秒；約30秒至約40秒)。在此背景中，可以有利的是使用不同的退火溫度來(lái)增加相應(yīng)測(cè)定法的包容性(inclusivity)。簡(jiǎn)言之，這意味著于相對(duì)較低的退火溫度，引物也可以結(jié)合具有單一錯(cuò)配的靶物，因此也可以擴(kuò)增特定序列的變體。如果例如某種生物體具有已知或未知的也應(yīng)該檢出的遺傳變體，那么這可以是期望的。在另一方面，相對(duì)較高的退火溫度具有提供較高特異性的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槌蚋叩臏囟龋锝Y(jié)合不完全匹配的靶序列的可能性不斷降低。為了受益于這兩種現(xiàn)象，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，上文所描述的方法包括于不同溫度，優(yōu)選地，首先于較低溫度，然后于較高溫度退火。如果例如第一溫育于55°C發(fā)生約5個(gè)循環(huán)，那么可以(預(yù))擴(kuò)增不完全匹配的靶序列。這接著可以是例如于58°C約45個(gè)循環(huán)，從而提供貫穿實(shí)驗(yàn)的主要部分的較高特異性。這樣，在特異性保持相對(duì)較高的情況中不遺漏潛在重要的遺傳變體。然后，將反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)至促進(jìn)或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即足以自退火引物發(fā)生延伸以生成與要分析的核酸互補(bǔ)的產(chǎn)物的溫度。溫度應(yīng)該足以從與核酸模板退火的每條引物合成延伸產(chǎn)物，但是不應(yīng)高得以致于延伸產(chǎn)物從其互補(bǔ)模板變性(例如，一般地，用于延伸的溫度范圍為約40°C至約80°C;例如約50°C至約70°C;約60°C )。延伸時(shí)間可以是約10秒至約5分鐘，優(yōu)選地，約15秒至2分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選地，約20秒至約I分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選地，約25秒至約35秒。新合成的鏈形成雙鏈分子，其可以在反應(yīng)的隨后步驟中使用?？梢愿鶕?jù)需要經(jīng)常重復(fù)鏈分開(kāi)、退火、和延伸步驟以產(chǎn)生期望量的與靶核酸對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)中的限制因素是反應(yīng)中存在的引物、熱穩(wěn)定性酶、和三磷酸核苷的量。優(yōu)選地，將循環(huán)步驟(即變性、退火、和延伸)至少重復(fù)一次。為了在檢測(cè)中使用，循環(huán)步驟數(shù)目會(huì)取決于例如樣品的性質(zhì)。如果樣品是核酸的復(fù)雜混合物，那么將需要更多的循環(huán)步驟來(lái)擴(kuò)增足以檢出的靶序列。一般地，將循環(huán)步驟至少重復(fù)約20次，但是可以重復(fù)多達(dá)40、60或甚至100次。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以實(shí)施如下的PCR，其中退火和延伸步驟在同一步驟中(一步PCR)或者如上文所描述的，在分開(kāi)的步驟中(兩步PCR)實(shí)施。將退火和延伸一起及如此在相同物理和化學(xué)條件下，用合適的酶諸如例如ZOOTNA聚合酶實(shí)施具有的優(yōu)點(diǎn)在于節(jié)省每個(gè)循環(huán)中用于額外步驟的時(shí)間，并且還消除對(duì)退火和延伸之間額外的溫度調(diào)節(jié)的需要。因此，一步PCR降低相應(yīng)測(cè)定法的總體復(fù)雜性。 一般地，總體擴(kuò)增的時(shí)間較短是優(yōu)選的(因?yàn)榭s短獲得結(jié)果時(shí)間)，而且導(dǎo)致可能更早的診斷。在本發(fā)明的上下文中要使用的其它優(yōu)選的核酸擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR;Wu D. Y.和 Wallace R. B. , Genomics4 (1989) 560-69 ；及 Barany F. ,Proc.Natl. Acad. Sc1. USA88 (1991) 189-193);聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(BaranyF. , PCRMethods and Applic. 1(1991)5-16)；缺口 -LCR(TO9OA)IO69);修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Repair Chain Reaction) (EP0439182A2)、3SR(Kwoh D. Y.等，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA86(1989) 1173-1177;Guatelli J. C.等,Proc. Natl. Acad. Sc1. USA87(1990) 1874-1878;W092/08808)、以及NASBA(US5, 130，238)。此外，有鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)和 Qb 擴(kuò)增(關(guān)于綜述，參見(jiàn)例如 Whelen A. C.和 Persing D. H. , Annu. Rev. Microbiol.50 (1996)349-373;Abramson R. D.和Myers T. ff. , Curr Opin Biotechnol4(1993)41-47)?！熬哂心孓D(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶”是能夠基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。它也能夠在RNA已經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA后形成雙鏈DNA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是熱穩(wěn)定的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的方法包括將含有RNA模板的樣品與寡核苷酸引物和優(yōu)選地?zé)岱€(wěn)定性DNA聚合酶在存在至少所有4種天然的或經(jīng)修飾的三磷酸脫氧核糖核苷的情況中在合適的緩沖液中一起溫育，所述寡核苷酸引物與所述RNA模板充分互補(bǔ)以與后者雜交，所述合適的緩沖液包含金屬離子緩沖液，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其緩沖PH和金屬離子濃度兩者。于某個(gè)溫度實(shí)施此溫育，所述溫度足以使所述引物與所述RNA模板雜交，并且所述DNA聚合酶催化所述三磷酸脫氧核糖核苷的聚合，以形成與所述RNA模板序列互補(bǔ)的cDNA序列。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“cDNA”指使用核糖核酸鏈(RNA)作為模板合成的互補(bǔ)DNA分子。RNA可以是例如mRNA、tRNA、rRNA、或另一種形式的RNA，諸如病毒RNA。cDNA可以是單鏈的、雙鏈的或者可以與互補(bǔ)RNA分子氫鍵鍵合，如在RNA/cDNA雜合物中的。
適合于與RNA模板退火的引物也可以適合于通過(guò)PCR擴(kuò)增。對(duì)于PCR，與逆轉(zhuǎn)錄cDNA鏈互補(bǔ)的第二條引物為延伸產(chǎn)物的合成提供起始位點(diǎn)。在通過(guò)DNA聚合酶來(lái)擴(kuò)增RNA分子中，第一延伸反應(yīng)是使用RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄，并且生成DNA鏈。使用DNA模板的第二延伸反應(yīng)生成雙鏈DNA分子。因此，通過(guò)DNA聚合酶從RNA模板合成互補(bǔ)DNA鏈為擴(kuò)增提供起始材料。熱穩(wěn)定性DNA聚合酶可以在偶聯(lián)的單酶逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)中使用。術(shù)語(yǔ)“同質(zhì)的”在此背景中指用于RNA靶物的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的兩步驟單一添加反應(yīng)。同質(zhì)的意指在逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟后，不需要在擴(kuò)增步驟前打開(kāi)反應(yīng)容器或以其它方式調(diào)節(jié)反應(yīng)組分。在非同質(zhì)性RT/PCR反應(yīng)中，在逆轉(zhuǎn)錄后且在擴(kuò)增前，例如調(diào)節(jié)、添加、或稀釋一種或多種反應(yīng)組分諸如擴(kuò)增試劑，為此不得不打開(kāi)反應(yīng)容器，或者至少不得不操作其內(nèi)容物。雖然本發(fā)明的范圍包括同質(zhì)性和非同質(zhì)性實(shí)施方案兩者，但是優(yōu)選RT/PCR的同質(zhì)形式。
逆轉(zhuǎn)錄是RT/PCR中的一個(gè)重要的步驟。例如，本領(lǐng)域中已知的是，RNA模板顯示形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)可以阻礙引物結(jié)合和/或相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)cDNA鏈的延伸。因此，RT反應(yīng)的相對(duì)較高的溫度就轉(zhuǎn)錄效率而言是有利的。在另一方面，提高溫育溫度也意味著更高的特異性，即RT引物不會(huì)與同預(yù)期的一種或多種序列顯示錯(cuò)配的序列退火。尤其在多種不同靶RNA的情況中，可能期望也轉(zhuǎn)錄，并且隨后擴(kuò)增并檢測(cè)具有單一錯(cuò)配的序列，例如在流體樣品中可能存在生物體的未知的或不常見(jiàn)的亞株或亞種的情況中。為了受益于上文所描述的兩種優(yōu)點(diǎn)，即減少二級(jí)結(jié)構(gòu)和具有錯(cuò)配的模板的逆轉(zhuǎn)錄，本發(fā)明的一個(gè)方面是于超過(guò)一種不同溫度實(shí)施RT溫育。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中在步驟i1.中，于30°C至75°C，優(yōu)選地45°C至70°C，進(jìn)一步優(yōu)選地55°C至65°C的不同溫度實(shí)施具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶的溫育。作為逆轉(zhuǎn)錄的又一個(gè)重要方面，較長(zhǎng)的RT步驟可以損傷可存在于流體樣品中的DNA模板。如果流體樣品含有RNA和DNA種類兩者，如此，有利的是將RT步驟的持續(xù)時(shí)間保持得盡可能短，但是同時(shí)確保合成的cDNA量足以用于隨后的擴(kuò)增和任選的擴(kuò)增物檢測(cè)。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中在步驟i1.中，時(shí)間段是長(zhǎng)至30分鐘、20分鐘、15分鐘、12. 5分鐘、10分鐘、5分鐘、或I分鐘。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性且包含突變的聚合酶選自下組a. CSOTNA 聚合酶b. CS6DNA 聚合酶c.海棲熱袍菌(Thermotoga maritime) DNA 聚合酶d.水生棲熱菌DNA聚合酶e.嗜熱棲熱菌DNA聚合酶f.黃色棲熱菌DNA聚合酶g.絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)DNA 聚合酶h.棲熱菌屬物種spsl7DNA聚合酶1.棲熱菌屬物種ZOOTNA聚合酶j.那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana) DNA 聚合酶
k.非洲棲熱腔菌(Termosipho africanus) DNA 聚合酶1. Thermus caldophilus DNA 聚合酶。特別適合于這些要求的是在聚合酶域中攜帶突變的酶，所述突變就較快的延伸速率而言增強(qiáng)其逆轉(zhuǎn)錄效率。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是相對(duì)于相應(yīng)的野生型聚合酶包含突變的聚合酶，所述突變賦予改善的核酸延伸速率和/或改善的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在上文所描述的方法中，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是相對(duì)于相應(yīng)的野生型聚合酶包含突變的聚合酶，所述突變賦予改善的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 攜帶使其特別可用于本發(fā)明背景的點(diǎn)突變的聚合酶披露于W02008/046612中。具體地，要在本發(fā)明背景中使用的優(yōu)選的聚合酶是在聚合酶域中至少包含下述基序的突變的DNA聚合酶=T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N ;其中Xb7是選自S或T的氨基酸，且其中Xb8是選自G、T、R、K或L的氨基酸，其中該聚合酶包含3’ -5’外切核酸酶活性，并且相對(duì)于野生型DNA聚合酶具有改善的核酸延伸速率和/或改善的逆轉(zhuǎn)錄效率，其中在所述野生型DNA聚合酶中，Xb8是選自D、E或N的氨基酸。一個(gè)特別優(yōu)選的例子是來(lái)自棲熱菌屬物種Z05的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶突變體(記載于例如US5，455，170)，如與相應(yīng)的野生型酶Z05相比，所述變異在聚合酶域中包含突變。對(duì)依照本發(fā)明的方法特別優(yōu)選的是突變體ZOOTNA聚合酶，其中第580位氨基酸選自下組
G、T、R、K 和 L0對(duì)于使用熱穩(wěn)定性聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄，Mn2+作為二價(jià)陽(yáng)離子是優(yōu)選的，并且通常以鹽形式，例如氯化錳(MnCl2)、乙酸錳(Mn(OAc)2)、或硫酸錳(MnSO4)包括在內(nèi)。如果例如在含有50mM Tricine緩沖液的反應(yīng)中包含MnCl2，那么MnCl2 —般以O(shè). 5-7. OmM的濃度存在；當(dāng)利用各 200mM dGTP、dATP、dUTP、和 dCTP 時(shí)優(yōu)選 O. 8-1. 4mM ;且 2. 5-3. 5mM MnCl2 是最優(yōu)選的。此外，使用Mg2+作為二價(jià)陽(yáng)離子用于逆轉(zhuǎn)錄在本發(fā)明的背景中也是優(yōu)選的。由于在保留DNA靶核酸的情況中將RNA靶核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此可以使用cDNA和DNA兩者進(jìn)行隨后的擴(kuò)增，依照本發(fā)明的方法特別可用于同時(shí)擴(kuò)增自具有RNA基因組的生物體或具有DNA基因組的生物體兩者衍生的靶核酸。此優(yōu)點(diǎn)相當(dāng)大地增加可以在相同物理?xiàng)l件下分析的一批不同生物體，特別是病原體。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中至少兩種靶核酸包含RNA 和 DNA。特別由于適當(dāng)?shù)淖钸m溫度，酶如Tth聚合酶或優(yōu)選地上文提及的突變體ZOOTNA聚合酶適合于實(shí)施隨后擴(kuò)增靶核酸的步驟。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增兩者采用同一種酶促成易于實(shí)施該方法，并且促進(jìn)了自動(dòng)化，因?yàn)椴槐卦赗T和擴(kuò)增步驟之間操作流體樣品。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在上文所描述的方法中，在步驟i1.和步驟iii中使用相同的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶。優(yōu)選地，所述酶是上文描述的突變體ZOOTNA聚合酶。為了不使本發(fā)明上下文中使用的反應(yīng)混合物的聚合酶或其它組分暴露于升高的溫度達(dá)長(zhǎng)于必要的時(shí)間，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，高于90°C的步驟長(zhǎng)多至20秒，優(yōu)選地多至15秒，更優(yōu)選地多至10秒，更優(yōu)選地多至5秒，且最優(yōu)選地5秒。這也縮短獲得結(jié)果時(shí)間，并且縮短測(cè)定法的總體需要時(shí)間。在這類同質(zhì)性設(shè)置中，可以具有相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)的是在啟動(dòng)RT和擴(kuò)增前將反應(yīng)容器密封，由此降低污染的風(fēng)險(xiǎn)?？梢岳缛缦聦?shí)現(xiàn)密封，即應(yīng)用優(yōu)選為透明的箔、蓋，或者通過(guò)對(duì)反應(yīng)容器添加油，并在流體頂部形成親脂相作為密封層。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文描述的方法，其在步驟1.和步驟i1.之間進(jìn)一步包括將至少兩個(gè)反應(yīng)容器密封的步驟。擴(kuò)增步驟的靶物可以是RNA/DNA雜合分子。靶物可以是單鏈或雙鏈核酸。雖然最廣泛使用的PCR規(guī)程使用雙鏈靶物，但是這并不是必須的。在單鏈DNA靶物的第一輪擴(kuò)增循環(huán)后，反應(yīng)混合物含有雙鏈DNA分子，其由單鏈靶物和新合成的互補(bǔ)鏈構(gòu)成。類似地，在RNA/cDNA靶物的第一輪擴(kuò)增循環(huán)后，反應(yīng)混合物含有雙鏈cDNA分子。在這點(diǎn)時(shí)，進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增循環(huán)，如上文所描述的。
由于核酸擴(kuò)增(特別但不僅僅是在PCR的情況中)在作為循環(huán)反應(yīng)實(shí)施時(shí)是非常有效的，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中步驟ii1.中的擴(kuò)增反應(yīng)由多個(gè)循環(huán)步驟組成。合適的核酸檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且記載于標(biāo)準(zhǔn)教科書如 Sambrook J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor, New York, 1989 及 AusubeIF.等CurrentProtocols in Molecular Biologyl987, J. Wiley and Sons, NY。在實(shí)施核酸檢測(cè)步驟前也可以有進(jìn)一步的純化步驟，如例如沉淀步驟。檢測(cè)方法可以包括但不限于結(jié)合或插入特定的染料如溴化乙啶，其插入雙鏈DNA中，此后改變其熒光。也可以任選地在限制性消化后通過(guò)電泳方法分離純化的核酸，此后將其顯現(xiàn)。還有基于探針的測(cè)定法，其采用寡核苷酸與特定序列的雜交和隨后對(duì)雜交物的檢測(cè)。優(yōu)選的是在擴(kuò)增反應(yīng)期間或之后檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸以評(píng)估分析結(jié)果。特別對(duì)于實(shí)時(shí)檢測(cè)，使用核酸探針是有利的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟和雜交步驟，所述雜交步驟包括使擴(kuò)增的核酸與探針雜交?？梢杂欣氖菍?shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)，即在擴(kuò)增自身期間檢測(cè)靶核酸和/或其擴(kuò)增物。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中用供體熒光模塊和相應(yīng)的接受熒光模塊標(biāo)記探針。優(yōu)選地，上文所列的方法基于供體熒光模塊和接受熒光模塊之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。代表性的供體熒光模塊是熒光素，而代表性的相應(yīng)接受熒光模塊包括LC-紅640,LC-紅705、Cy5、和Cy5. 5。通常，檢測(cè)包括以供體熒光模塊吸收的波長(zhǎng)激發(fā)樣品，并且顯現(xiàn)和/或測(cè)量由相應(yīng)的接受熒光模塊發(fā)射的波長(zhǎng)。在依照本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，檢測(cè)繼之以量化FRET。優(yōu)選地，在每個(gè)循環(huán)步驟后實(shí)施檢測(cè)。最優(yōu)選地，實(shí)時(shí)實(shí)施檢測(cè)。通過(guò)使用商品化實(shí)時(shí)PCR儀(例如LightCycler 或丨;小PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以以顯著縮短的循環(huán)時(shí)間在單個(gè)封閉的小杯中組合。由于檢測(cè)與擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生，因此實(shí)時(shí)PCR方法消除對(duì)操作擴(kuò)增產(chǎn)物的需要，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)PCR大大地縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間，并且是臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)PCR技術(shù)的一種有吸引力的備選。
下列專利申請(qǐng)描述了如在LightCycler 技術(shù)中使用的實(shí)時(shí)PCR :W097/46707、W097/46714和W097/46712。LightCycler 儀是一種與利用高質(zhì)量光學(xué)鏡的微體積熒光計(jì)組合的快速熱循環(huán)儀。此快速熱循環(huán)技術(shù)使用薄玻璃小杯作為反應(yīng)容器。反應(yīng)室的加熱和冷卻通過(guò)交替加熱的和周圍的空氣來(lái)控制。由于空氣的質(zhì)量低以及小杯的表面積與體積的比率高，可以在熱室內(nèi)實(shí)現(xiàn)非?？焖俚臏囟冉粨Q速率。TaqMan#技術(shù)利用用兩種熒光模塊標(biāo)記的單鏈雜交探針。當(dāng)?shù)谝粺晒饽K用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，吸收的能量依照FRET的原理轉(zhuǎn)移到第二熒光模塊。一般地，第二熒光模塊是猝滅劑分子。以此形式使用的典型熒光染料是例如FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan和CY5. 5，等等。在PCR反應(yīng)的退火步驟期間中，經(jīng)標(biāo)記的雜交探針結(jié)合靶核酸(即擴(kuò)增產(chǎn)物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到Taq或如熟練技術(shù)人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的突變體Z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。結(jié)果，激發(fā)的熒光模塊和猝滅劑模塊變成彼此空間分開(kāi)。因此，在沒(méi)有猝滅劑的情況中激發(fā)第一熒光模塊后，可以檢出來(lái)自第一突光模塊的突光發(fā)射。在上文描述的兩種檢測(cè)形式中，發(fā)射信號(hào)的強(qiáng)度可以與初始靶核酸分子數(shù)目相關(guān)聯(lián)。作為FRET的一種備選，可以使用雙鏈DNA結(jié)合染料諸如熒光DNA結(jié)合染料(例如SYBRGREliN 1貨成SYBRGOLL) (Molecular Probes))來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在與雙鏈核酸相互作用后，這類熒光DNA結(jié)合染料在用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)射出熒光信號(hào)。也可以使用雙鏈DNA結(jié)合染料諸如核酸嵌入染料。當(dāng)使用雙鏈DNA結(jié)合染料時(shí)，通常實(shí)施解鏈曲線分析以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。使用本發(fā)明的實(shí)時(shí)PCR方法，也可以使用與FRET結(jié)合的分子信標(biāo)來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。分子信標(biāo)技術(shù)使用用第一熒光模塊和第二熒光模塊標(biāo)記的雜交探針。第二熒光部分一般是猝滅劑，并且熒光標(biāo)記物通常位于探針的每個(gè)末端。分子信標(biāo)技術(shù)使用具有允許二級(jí)結(jié)構(gòu)形成(例如發(fā)夾)的序列的探針寡核苷酸。由于探針內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，兩種熒光 模塊在探針在溶液中時(shí)為空間接近。在與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后，探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)受到破壞，并且熒光模塊變得彼此分開(kāi)，使得在用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后，可以檢出第一熒光模塊的發(fā)射。因此，利用FRET的上文描述的方法在依照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，其中所述探針包含允許二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的核酸序列，其中所述二級(jí)結(jié)構(gòu)形成導(dǎo)致所述第一和第二熒光模塊之間的空間接近。僅可以在熒光模塊直接局部接近時(shí)，且在供體熒光模塊的發(fā)射光譜與接受熒光模塊的吸收光譜重疊時(shí)發(fā)生有效的FRET。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述供體和接受熒光模塊在所述探針上在彼此的不超過(guò)5個(gè)核苷酸內(nèi)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接受熒光模塊是猝滅劑。如上文描述的，在TaqMan形式中，在PCR反應(yīng)的退火步驟期間中，經(jīng)標(biāo)記的雜交探針結(jié)合靶核酸(即擴(kuò)增產(chǎn)物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到Taq或如熟練技術(shù)人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的突變體Z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在依照本發(fā)明的方法中，擴(kuò)增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。
進(jìn)一步有利的是注意選擇由上文所描述的方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子的長(zhǎng)度。一般地，相對(duì)較短的擴(kuò)增子提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文描述的方法，其中擴(kuò)增片段包含多至450個(gè)堿基，優(yōu)選地多至300個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選地多至200個(gè)堿基，且進(jìn)一步優(yōu)選地多至150個(gè)堿基。依照本發(fā)明，使用對(duì)照核酸可以進(jìn)一步具有優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域已知的是定性和定量對(duì)照兩者特別在診斷環(huán)境中具有相當(dāng)大的意義。在此背景中，充當(dāng)“定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的對(duì)照核酸傾向是參照，并且作為參照使用以量化靶核酸，即測(cè)定靶核酸的量。出于此目的，一種或多種定量標(biāo)準(zhǔn)核酸與靶核酸一起經(jīng)歷所有可能的樣品制備步驟。此外，貫穿整個(gè)方法在相同反應(yīng)混合物內(nèi)加工定量標(biāo)準(zhǔn)核酸。它必須在存在或沒(méi)有靶核酸的這兩種情況中都直接或間接地生成可檢測(cè)的信號(hào)。出于此目的，在每種測(cè)試中必須仔細(xì)優(yōu)化定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的濃度，以便不干擾靈敏度，而且例如在非常高的靶物濃度也生成可檢測(cè)的信號(hào)。就相應(yīng)測(cè)定法的檢測(cè)限(L0D，見(jiàn)下文)而言，優(yōu)選地，“定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的濃度范圍是20-5000倍L0D，更優(yōu)選地20-1000倍L0D，最優(yōu)選地20-5000 倍L0D。反應(yīng)混合物中定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的終濃度取決于實(shí)現(xiàn)的定量測(cè)量范圍。定量標(biāo)準(zhǔn)核酸可以是例如DNA、RNA或PNA、裝甲(armored)DNA或RNA及其經(jīng)修飾形式。“檢測(cè)限”或“L0D”意指樣品中可檢測(cè)的最低核酸量或濃度。低“L0D”對(duì)應(yīng)于高靈敏度，反之亦然?！癓0D”通常依靠單位“cp/ml” (特別是在核酸是病毒核酸時(shí))，或者以IU/ml表示?！癱p/ml”意指“每毫升的拷貝”，其中“拷貝”是相應(yīng)核酸的拷貝。IU/ml代表“國(guó)際單位/ml”，指WHO標(biāo)準(zhǔn)。一種用于計(jì)算LOD的廣泛使用的方法是“Probit (概率單位)分析”，其是一種分析刺激物(劑量)和可數(shù)性(quantal)(全有或全無(wú))響應(yīng)之間關(guān)系的方法。在典型的可數(shù)性響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)物組給予不同劑量的藥物。記錄每個(gè)劑量水平的百分比瀕死。然后，可以使用Probit分析來(lái)分析這些數(shù)據(jù)。Probit模型假定百分比響應(yīng)與對(duì)數(shù)劑量的關(guān)系呈累積正態(tài)分布。也就是說(shuō)，可以使用對(duì)數(shù)劑量作為變量來(lái)從累積法線(cumulative normal)中讀出百分比瀕死。使用正態(tài)分布而不是其它概率分布，影響在可能的劑量的高和低末端處的預(yù)測(cè)響應(yīng)率，但是接近中間具有很少的影響。Probit分析可以以獨(dú)特的“命中率”應(yīng)用。如本領(lǐng)域中已知的，“命中率”通常以百分比[%]表示，并且指示在特定濃度的分析物時(shí)陽(yáng)性結(jié)果的百分比。因此例如，LOD可以以95%命中率測(cè)定，這意味著對(duì)95%有效結(jié)果呈陽(yáng)性的背景計(jì)算L0D。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文所描述的方法提供l-100cp/ml或O. 5_50IU/ml,更優(yōu)選地 l_75cp/ml 或 O. 5_30IU/ml，更優(yōu)選地 l_25cp/ml 或 l_20IU/ml 的 L0D。就來(lái)自某些病毒的可能的靶核酸的一些例子而言，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的方法提供下列LOD # HIV :多至60cp/ml,更優(yōu)選地多至50cp/ml,更優(yōu)選地多至40cp/ml,更優(yōu)選地多至30cp/ml,更優(yōu)選地多至20cp/ml,更優(yōu)選地多至15cp/ml· HBV :多至10IU/ml，更優(yōu)選地多至7. 5IU/ml，更優(yōu)選地多至5IU/ml· HCV :多至10IU/ml，更優(yōu)選地多至7. 5IU/ml，更優(yōu)選地多至5IU/ml· WNV1:多至20cp/ml,更優(yōu)選地多至15cp/ml,更優(yōu)選地多至10cp/ml· WNV I1:多至20cp/ml,更優(yōu)選地多至15cp/ml,更優(yōu)選地多至10cp/ml,更優(yōu)選地多至5cp/ml· JEV :多至100cp/ml,更優(yōu)選地多至75cp/ml,更優(yōu)選地多至50cp/ml,更優(yōu)選地多至 30cp/ml# SLEV :多至100cp/ml,更優(yōu)選地多至75cp/ml,更優(yōu)選地多至50cp/ml,更優(yōu)選地多至25cp/ml,更優(yōu)選地多至10cp/ml。在下文中描述了如何基于定量標(biāo)準(zhǔn)核酸在TaqMan形式中實(shí)施定量結(jié)果計(jì)算的例子從來(lái)自整個(gè)PCR運(yùn)行的、經(jīng)儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)計(jì)算滴度。含有靶核酸和充當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的對(duì)照核酸的一組樣品在使用規(guī)定溫度概況的熱循環(huán)儀上經(jīng)歷PCR。在PCR概況期間的選定溫度和時(shí)間，通過(guò)過(guò)濾光照明樣品，并且對(duì)每份樣品針對(duì)靶核酸和定量標(biāo)準(zhǔn)核酸收集過(guò)濾熒光數(shù)據(jù)。在完成PCR運(yùn)行后， 處理熒光讀數(shù)以產(chǎn)生定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。在數(shù)次似真性檢查后，對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)核酸和靶核酸計(jì)算肘值(elbow value) (CT)。肘值定義為靶核酸或定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的熒光與預(yù)定閾值(熒光濃度)相交的點(diǎn)。滴度測(cè)定基于如下的假定，即靶核酸和定量標(biāo)準(zhǔn)核酸以相同的效率擴(kuò)增，且在計(jì)算的肘值，擴(kuò)增并檢測(cè)相等量的靶核酸和定量標(biāo)準(zhǔn)核酸擴(kuò)增子拷貝數(shù)。因此，(CTQS - CT靶物)對(duì)對(duì)數(shù)(靶物濃度/QS濃度)呈線性，其中“QS”代表內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸。然后，可以例如通過(guò)使用如下述等式中的多項(xiàng)式校正式計(jì)算滴度T T，=10 (a (CTQS - CT 革巴物)2+b (CTQS - CT 靶物)+c)已知多項(xiàng)式常數(shù)和定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的濃度，因此該等式中唯一的變量是差(CTQS -CT靶物)。在僅檢測(cè)流體樣品中靶核酸的存在或缺乏外，測(cè)定所述核酸的量也經(jīng)常是重要的。舉例而言，病毒性疾病的階段和嚴(yán)重性可以基于病毒載量評(píng)估。此外，任何療法的監(jiān)測(cè)需要關(guān)于個(gè)體中存在的病原體量的信息以估計(jì)療法的成功與否?？紤]上文提及的內(nèi)容，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其進(jìn)一步包括在步驟ii1.后測(cè)定靶核酸的量的步驟。此外，在本發(fā)明的意義中，一種或多種對(duì)照核酸可以充當(dāng)“定性內(nèi)部對(duì)照核酸”。生物學(xué)樣品中核酸的定性檢測(cè)對(duì)于例如識(shí)別個(gè)體感染是至關(guān)重要的。由此，用于檢測(cè)微生物性感染的測(cè)定法的一個(gè)重要的要求是避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，因?yàn)檫@類結(jié)果幾乎會(huì)不可避免地導(dǎo)致就相應(yīng)患者的治療而言的嚴(yán)重后果。因此，特別是在基于PCR的方法中，向檢測(cè)混合物添加定性內(nèi)部對(duì)照核酸。所述對(duì)照對(duì)于確定測(cè)試結(jié)果的有效性是特別重要的至少在就相應(yīng)的靶核酸而言陰性結(jié)果的情況中，定性內(nèi)部對(duì)照反應(yīng)在特定背景內(nèi)必須表現(xiàn)為反應(yīng)性的，即必須檢測(cè)出定性內(nèi)部對(duì)照，否則認(rèn)為該測(cè)試自身是無(wú)效的。然而，在定性設(shè)置中，在陽(yáng)性結(jié)果的情況中沒(méi)有必要必須檢出所述定性內(nèi)部對(duì)照。對(duì)于定性測(cè)試，特別重要的是，保證靈敏度，并且因此對(duì)其嚴(yán)格控制。因此，定性內(nèi)部對(duì)照的濃度必須相對(duì)較低，從而即使在例如略微抑制的情況中，沒(méi)有檢測(cè)出定性內(nèi)部對(duì)照，并且因此該測(cè)試是無(wú)效的。必須注意使其適應(yīng)相應(yīng)的測(cè)定法及其靈敏度。優(yōu)選地，定性內(nèi)部核酸，即第二對(duì)照核酸的濃度范圍會(huì)包含每個(gè)反應(yīng)I個(gè)拷貝至每個(gè)反應(yīng)1000個(gè)拷貝的范圍。就相應(yīng)測(cè)定法的檢測(cè)限(LOD)而言，優(yōu)選地，其濃度在測(cè)定法的LOD和LOD的25倍數(shù)值之間，更優(yōu)選地在LOD和10倍LOD之間。更優(yōu)選地，其在2倍和10倍LOD之間。甚至更優(yōu)選地，其在5倍和10倍LOD之間。最優(yōu)選地，其為5倍或10倍LOD。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在即使在缺乏一種或多種所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的情況中指示反應(yīng)混合物中發(fā)生擴(kuò)增。本發(fā)明特別可用于開(kāi)發(fā)對(duì)多種參數(shù)和/或核酸類型在對(duì)所述不同參數(shù)和/或核酸類型使用相同內(nèi)部對(duì)照核酸序列的情況中進(jìn)行的同時(shí)測(cè)定法。因此，它促成在多種水平上降低相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的總體復(fù)雜性例如,僅必須設(shè)計(jì)一種內(nèi)部對(duì)照核酸序列，并且添加至相應(yīng)的擴(kuò)增混合物，如此節(jié)省用于設(shè)計(jì)和合成或購(gòu)買多種對(duì)照核酸序列的時(shí)間和成本?？梢詫⒁环N或多種測(cè)定法流線化(streamline)，并且減少操作錯(cuò)誤。另外，在相同條件下同時(shí)實(shí)施的一個(gè)測(cè)定法或平行測(cè)定法中采用的不同對(duì)照核酸序列越多，可發(fā)生的相應(yīng)條件的調(diào)節(jié)越復(fù)雜。此外，憑借適合于多種核酸的單一對(duì)照，可以將所述對(duì)照從單一來(lái)源分配入例如含有所述不同靶核酸的不同容器中。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，單一對(duì)照核酸序列也可以充當(dāng)定性和定量對(duì)照。 因此,本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面是一種用于分離和同時(shí)擴(kuò)增可以存在于一種或多種流體樣品的至少第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自動(dòng)化步驟a.向每種所述流體樣品添加內(nèi)部對(duì)照核酸b.在一個(gè)或多個(gè)容器中將固體支持材料和所述一種或多種流體樣品于一定條件下組合在一起達(dá)一段時(shí)間，所述條件和時(shí)間段足以允許包含所述靶核酸和內(nèi)部對(duì)照核酸的核酸在所述固體支持材料上固定化c.在分離站中將所述固體支持材料自存在于所述流體樣品中的其它物質(zhì)分離d.在所述分離站中純化所述核酸，并將所述固體支持材料用清洗緩沖液清洗一次或多次e.在至少兩個(gè)反應(yīng)容器中使所述純化的靶核酸和所述純化的內(nèi)部對(duì)照核酸與一種或多種擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑包含針對(duì)每種所述靶核酸和所述內(nèi)部對(duì)照核酸的至少一組獨(dú)特引物，其中至少第一反應(yīng)容器至少包含所述第一靶核酸，而至少第二反應(yīng)容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述第二靶核酸不存在于第一反應(yīng)容器中f.在所述反應(yīng)容器中將所述純化的靶核酸和所述純化的內(nèi)部對(duì)照核酸與所述一種或多種擴(kuò)增試劑在一定的條件下一起溫育達(dá)到一段時(shí)間，所述條件和時(shí)間段足以發(fā)生指示所述靶核酸存在或缺乏的擴(kuò)增反應(yīng)，g.檢測(cè)并測(cè)量由所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物生成并與所述靶核酸濃度成比例的信號(hào)，以及檢測(cè)并測(cè)量由所述內(nèi)部對(duì)照核酸生成的信號(hào)，其中步驟d.至g.中用于擴(kuò)增和檢測(cè)的條件對(duì)于所述至少第一和第二純化的靶核酸和所述內(nèi)部對(duì)照核酸是等同的，且其中所述內(nèi)部對(duì)照核酸的序列對(duì)所述至少第一和第二純化的靶核酸是等同的。作為上文所描述的方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)，在可能的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定生物學(xué)樣品測(cè)試其它核酸不需要牽涉添加不同內(nèi)部對(duì)照核酸的另一個(gè)樣品制備規(guī)程，因?yàn)榭梢允褂帽景l(fā)明中使用的對(duì)照來(lái)檢驗(yàn)不同核酸的擴(kuò)增。因此，一旦已經(jīng)添加內(nèi)部對(duì)照核酸，可以在相同條件下在相同樣品中測(cè)試其它參數(shù)。內(nèi)部對(duì)照核酸可以是競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性或部分競(jìng)爭(zhēng)性的。
競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)部對(duì)照核酸攜帶與靶物基本相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，并且由此與靶物競(jìng)爭(zhēng)相同引物。雖然此原理允許對(duì)相應(yīng)靶核酸的良好模仿(由于其類似結(jié)構(gòu))，但是它可以降低就一種或多種靶核酸而言的擴(kuò)增效率，并且因此導(dǎo)致測(cè)定法不太靈敏。非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)部對(duì)照核酸具有不同于靶物的引物結(jié)合位點(diǎn)，并且如此結(jié)合不同引物。這類設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)包含如下的事實(shí)，即反應(yīng)混合物中不同核酸的單一擴(kuò)增事件可以在沒(méi)有任何競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)的情況中彼此獨(dú)立發(fā)生，等等。因此，對(duì)該測(cè)定法的檢測(cè)限沒(méi)有發(fā)生不利影響(如可以是在競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置中的情況)。最后，在使用部分競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置的擴(kuò)增中，相應(yīng)的對(duì)照核酸和至少一種靶核酸競(jìng)爭(zhēng)相同引物，而至少一種其它靶核酸結(jié)合不同引物。如下的事實(shí)使所述方法變得相當(dāng)靈活，即上文所描述的方法牽涉針對(duì)每種所述靶核酸和所述內(nèi)部對(duì)照核酸的一組獨(dú)特引物。在此非競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置中，沒(méi)有必要將靶物特異性結(jié)合位點(diǎn)引入對(duì)照核酸中(如在競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置的情況中)，并且避免如上文提及的競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置的缺點(diǎn)。在非競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置中，內(nèi)部對(duì)照核酸具有不同于任何靶序列的序列，從而不競(jìng)爭(zhēng)它們 的引物和/或探針。優(yōu)選地，內(nèi)部對(duì)照核酸的序列不同于流體樣品中的其它核酸序列。例如，如果流體樣品自人衍生，那么優(yōu)選地，內(nèi)部對(duì)照核酸沒(méi)有也內(nèi)源性存在于人內(nèi)的序列。如此，序列差異應(yīng)該至少足夠顯著，從而不容許引物和/或探針在嚴(yán)格條件下對(duì)相應(yīng)的一種或多種內(nèi)源核酸的結(jié)合，并且如此，使得設(shè)置變?yōu)楦?jìng)爭(zhēng)性的。為了避免這類干擾，優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的內(nèi)部對(duì)照核酸序列自與流體樣品起源不同的來(lái)源衍生。優(yōu)選地，其自天然存在的基因組，優(yōu)選地植物基因組，進(jìn)一步優(yōu)選地葡萄基因組衍生。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，自天然存在的基因組衍生的核酸是混雜的。如本領(lǐng)域中已知的，“混雜”意味著在序列中以某種程度引入堿基突變。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的內(nèi)部對(duì)照核酸的序列相對(duì)于衍生其的天然存在的基因是實(shí)質(zhì)性改變的。在本發(fā)明的上下文中，“序列”是核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即組成相應(yīng)核酸的單個(gè)核堿基的特定排列。應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語(yǔ)“序列”并非指特定類型的核酸諸如RNA或DNA，而是適用于這兩者以及其它類型的核酸諸如例如PNA或其它。在核堿基彼此對(duì)應(yīng)的情況中，特別是在尿嘧啶(存在于RNA中)和胸腺嘧啶(存在于DNA中)的情況中，可以認(rèn)為這些堿基在RNA和DNA序列之間是等同的，如相關(guān)領(lǐng)域中公知的。臨床相關(guān)核酸經(jīng)常是DNA,其可以自例如DNA病毒如例如乙肝病毒(HBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)等，或細(xì)菌如例如沙眼衣原體(CT)、淋病奈瑟氏球菌(NG)等衍生。在這類情況中，可以有利的是，使用由DNA組成的內(nèi)部對(duì)照核酸，以反映靶核酸特性。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照核酸是DNA。在另一方面，臨床診斷學(xué)相關(guān)的眾多核酸是核糖核酸，如例如來(lái)自RNA病毒諸如例如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙肝病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、日本腦炎病毒(JEV)、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)等的核酸。可以將本發(fā)明容易地應(yīng)用于這類核酸。在此情況中，可以有利的是使用由RNA組成的內(nèi)部對(duì)照核酸，以反映靶核酸特性。如果要在上文所描述的方法中分析RNA和DNA兩者，那么優(yōu)選的是內(nèi)部對(duì)照核酸是RNA，因?yàn)閮?yōu)選地，內(nèi)部對(duì)照核酸模擬牽涉多種靶物的測(cè)定法中最靈敏的靶物，并且RNA靶物通常必須更緊密地控制。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照核酸是RNA。由于RNA比DNA更易降解(由于諸如堿性pH、核糖核酸酶等影響所致)，優(yōu)選地，由RNA構(gòu)成的內(nèi)部對(duì)照核酸以裝甲顆粒提供。裝甲顆粒諸如特別是裝甲R(shí)NA記載于例如EP910643中。簡(jiǎn)言之，至少部分將RNA在病毒外殼蛋白中包囊，所述RNA可以用化學(xué)法或者優(yōu)選地，例如由細(xì)菌諸如例如大腸桿菌(E. coli)異源生成。后者賦予RNA對(duì)外部影響，特別是核糖核酸酶的抗性。必須理解的是，內(nèi)部對(duì)照DNA也可以以裝甲顆粒提供。裝甲R(shí)NA和DNA兩者在本發(fā)明上下文中可用作內(nèi)部對(duì)照核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在大腸桿菌中用MS2外殼蛋白裝甲R(shí)NA對(duì)照核酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用λ噬菌體GTll裝甲DNA對(duì)照核酸。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照核酸是 裝甲核酸。上文所描述的測(cè)定法的結(jié)果可以是摻雜的，并且例如包括假陽(yáng)性(在與來(lái)自與流體樣品不同的來(lái)源的核酸交叉污染的情況中)。特別地，前者實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增物可以促成這類不期望的效果。一種用于使核酸擴(kuò)增的交叉污染的效應(yīng)最小化的具體方法記載于美國(guó)專利號(hào)5，035，996中。該方法牽涉將非常規(guī)的核苷酸堿基諸如dUTP引入擴(kuò)增產(chǎn)物中，并將遺留產(chǎn)物暴露于酶和/或物理化學(xué)處理以使產(chǎn)物DNA不能充當(dāng)后續(xù)擴(kuò)增的模板。用于這類處理的酶是本領(lǐng)域中已知的。例如，尿嘧啶DNA糖基化酶(也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG)從含有所述堿基的PCR產(chǎn)物中除去尿嘧啶殘基。酶處理導(dǎo)致對(duì)污染性遺留PCR產(chǎn)物的降解，并且用來(lái)使擴(kuò)增反應(yīng)“絕育”。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其在步驟1.和步驟i1.之間進(jìn)一步包括下列步驟 在一定條件下用酶處理流體樣品，其中酶促降解來(lái)自自其它樣品擴(kuò)增交叉污染性核酸的產(chǎn)物； 將所述酶失活。優(yōu)選地，所述酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。在上文所描述的方法中，優(yōu)選的是所有步驟都是自動(dòng)化的。“自動(dòng)化”意味著方法的步驟適合于用儀器或機(jī)器實(shí)施，所述儀器或機(jī)器能夠在很少或沒(méi)有人為外部控制或影響的情況中運(yùn)行。僅可能必須手動(dòng)完成該方法的制備步驟，例如必須將貯存容器充滿并放好位置，樣品的選擇必須人為實(shí)施以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它步驟，例如控制計(jì)算機(jī)的操作。儀器或機(jī)器可以例如自動(dòng)添加液體，混合樣品或于特定溫度實(shí)施溫育步驟。典型地，這類機(jī)器或儀器是由計(jì)算機(jī)控制的機(jī)器人，該計(jì)算機(jī)實(shí)施規(guī)定單一步驟和命令的程序。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于分離和同時(shí)擴(kuò)增可以存在于流體樣品中的至少兩種靶核酸的分析系統(tǒng)(440)，所述分析系統(tǒng)包含下列模塊 包含固體支持材料的分離站(230)，所述分離站構(gòu)建并排列為分離并純化流體樣品中包含的靶核酸 包含至少兩個(gè)反應(yīng)容器的擴(kuò)增站(405)，所述反應(yīng)容器包含擴(kuò)增試劑、在至少第一反應(yīng)容器中的至少第一純化的靶核酸和在至少第二反應(yīng)容器中的至少第二純化的核酸(其中所述第二核酸不存在于所述第一反應(yīng)容器中)，以及具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，所述聚合酶相對(duì)于相應(yīng)的野生型聚合酶進(jìn)一步包含如下的突變，該突變賦予改善的核酸延伸速率和/或改善的逆轉(zhuǎn)錄酶活性?！胺治鱿到y(tǒng)”是以分析給定的樣品為最終目的，彼此相互作用的組件諸如儀器的排列。本發(fā)明的分析系統(tǒng)(440，圖11)是包含用于分離和/或純化分析物的模塊(401)的系統(tǒng)(440)。此外，系統(tǒng)(440)另外包含用于分析所述分析物以獲得可檢測(cè)信號(hào)的模塊(403)?？梢栽谙嗤K(401、402、403)中或者備選地在分開(kāi)模塊中檢測(cè)可檢測(cè)信號(hào)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“模塊”指分析儀(400)內(nèi)的任何空間限定位置。兩個(gè)模塊(401、403)可以以壁分開(kāi)，或者可以處于開(kāi)放關(guān)系。任一個(gè)模塊(401、402、403)可以自主控制，或者模塊(401,402,403)的控制可以與其它模塊共享。優(yōu)選地，中央控制所有模塊。模塊(401、402、403)間的轉(zhuǎn)移可以是手動(dòng)的，但是優(yōu)選是自動(dòng)的。因此，本發(fā)明涵蓋自動(dòng)化分析儀(400)的 許多不同實(shí)施方案。 “分離站”在上文有描述?！皵U(kuò)增站”包含用于溫育至少兩個(gè)反應(yīng)容器的內(nèi)容物的溫度受控型恒溫箱。其進(jìn)一步包含多個(gè)反應(yīng)容器如管或板，其中發(fā)生用于樣品分析的反應(yīng)諸如PCR。這類容器的外部界限或壁是化學(xué)惰性的，使得其不干擾之內(nèi)發(fā)生的擴(kuò)增反應(yīng)。為了易于操作并促進(jìn)自動(dòng)化，優(yōu)選的是，將至少兩個(gè)反應(yīng)容器在整體排列中組合，因此可以對(duì)它們一起操作。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上文描述的分析系統(tǒng)，其中所述至少兩個(gè)反應(yīng)容器在整體排列中組合。整體排列可以是例如可逆或不可逆地彼此附著或在架中排列的管形瓶或管。優(yōu)選地，所述整體排列是多孔板。優(yōu)選地，所述多孔板在固定站(holding station)中容納。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)輸送裝置將多孔容器從固定站運(yùn)輸?shù)綒怄i(air-lock) (460)，而第二輸送裝置將所述多孔板從所述氣鎖運(yùn)輸?shù)剿鰯U(kuò)增站，其中這兩個(gè)輸送裝置通過(guò)形式鎖定相互作用與所述多孔板相互作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析系統(tǒng)是全自動(dòng)化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在系統(tǒng)的各站間運(yùn)輸整體排列中組合的至少兩個(gè)反應(yīng)容器。在第二個(gè)實(shí)施方案中，將純化的靶核酸從所述分離站轉(zhuǎn)移到所述擴(kuò)增站。優(yōu)選地，用包含附著有移液管尖端的移液管的移液器轉(zhuǎn)移包含純化的核酸的液體。在第三個(gè)實(shí)施方案中，將純化的核酸從所述分離站轉(zhuǎn)移到固定站中容納的整體排列中的反應(yīng)容器。優(yōu)選地，然后，將整體排列中的所述反應(yīng)容器從所述固定站轉(zhuǎn)移到所述擴(kuò)增站。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進(jìn)一步包含移液?jiǎn)卧Ｋ鲆埔簡(jiǎn)卧辽僖粋€(gè)移液管，優(yōu)選地多個(gè)移液管。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多個(gè)移液管在一個(gè)或多個(gè)整體排列中組合，優(yōu)選地，在所述整體排列內(nèi)可以個(gè)別操作移液管。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中使用的移液管是包含移液管尖端的移液管，如上文描述的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述移液管是移液針。或者，可以將用于分離站中樣品制備并含有包含純化的靶核酸的流體的反應(yīng)容器或反應(yīng)容器排列從分離站轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增站。
為此目的，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)移單元，優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)移單元包含機(jī)器人裝置，優(yōu)選地，所述裝置包含輸送裝置。出于上文在依照本發(fā)明的方法的背景中提出的原因，以下是本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方面 上文描述的分析系統(tǒng)(440)，其中至少一個(gè)反應(yīng)容器包含RNA靶核酸和DNA靶核酸。 上文描述的分析系統(tǒng)(440)，其中至少一個(gè)反應(yīng)容器包含RNA靶核酸，而至少一個(gè)另一反應(yīng)容器包含DNA靶核酸。優(yōu)選地，上文描述的分析系統(tǒng)(440)進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的元件·
用于檢測(cè)由分析物引起的信號(hào)的檢測(cè)模塊(403) 密封器(410) 用于試劑和/或一次性用品的貯存模塊(1008)。 用于控制系統(tǒng)組件的控制單元(1006)?！皺z測(cè)模塊”(403)可以例如是用于檢測(cè)擴(kuò)增規(guī)程結(jié)果或效果的光學(xué)檢測(cè)單元。光學(xué)檢測(cè)單元可以包含光源，例如氙氣燈，用于引導(dǎo)和過(guò)濾光的光學(xué)鏡諸如鏡、透鏡、光學(xué)濾光片、纖維光學(xué)鏡，一個(gè)或多個(gè)參照通道，或CCD照相機(jī)或不同的照相機(jī)?！懊芊馄鳌?410)構(gòu)建并排列為密封與依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)結(jié)合使用的任何容器。這類密封器可以例如用合適的蓋密封管，或用箔或其它合適的密封材料密封多孔板?！百A存模塊”(1008)貯存對(duì)于引起對(duì)分析流體樣品重要的化學(xué)或生物學(xué)反應(yīng)必需的試劑。其還可以包含對(duì)本發(fā)明的方法有用的其它組分，例如一次性用品諸如移液管尖端或在分離站和/或擴(kuò)增站內(nèi)要用作反應(yīng)容器的容器。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進(jìn)一步包含用于控制系統(tǒng)組件的控制單元。這類“控制單元”(1006)可以包含用于確保所述分析系統(tǒng)的不同組件正確且以正確的時(shí)機(jī)工作并相互作用(例如以協(xié)調(diào)方式移動(dòng)并操作組件諸如移液管)的軟件?？刂茊卧€可以包含運(yùn)行實(shí)時(shí)操作系統(tǒng)(RTOS)(其是意圖用于實(shí)時(shí)應(yīng)用的多任務(wù)操作系統(tǒng))的處理器。換言之，該系統(tǒng)處理器能夠管理實(shí)時(shí)約束，即從事件到系統(tǒng)應(yīng)答的操作最后期限(與系統(tǒng)加載無(wú)關(guān))。其以實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)內(nèi)的不同單元依照給定的指令正確運(yùn)行并應(yīng)答。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于處理分析物的分析系統(tǒng)(440)，其包含a.第一位置，該第一位置包含以線性排列且包含流體樣品(1010)的第一接受器(receptacle) (1001)、包含以nxm排列且用于容納流體樣品(1011)的接受器(103)的加工板
(101)、包含線性排列的至少兩個(gè)移液?jiǎn)卧?702)的第一移液裝置(700)(其中所述移液?jiǎn)卧?702)與移液管尖端(3、4)偶聯(lián))、以及包含以ax(nxm)排列的移液管尖端(3,4)的尖端架(70)；b.第二位置，該第二位置包含用于所述加工板(101)的固定器(201、128)、用于多孔板的固定器(330)、用于所述尖端架(70)的固定器(470)和第二移液裝置(35)，所述第二移液裝置(35)包含以nxm排列且與移液尖端(3、4)偶聯(lián)的移液?jiǎn)卧?702)(圖12)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“固定器”指任何能夠接受架或加工板的排列。本發(fā)明的分析系統(tǒng)(440)的優(yōu)點(diǎn)如上文對(duì)本發(fā)明的方法所描述的。優(yōu)選地，第一移液裝置(700)的所述移液?jiǎn)卧?702)的位置是可變的。所述第一移液裝置(700)的優(yōu)選實(shí)施方案在下文中進(jìn)行描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述尖端架(70)包含以ax(nxm)排列的移液管尖端(3、4)。優(yōu)選地，尖端架(70)中包含第一類(4)和第二類(3)移液管尖端。在此實(shí)施方案中，第一類移液管尖端(4)以nxm排列形式排列,而第二類移液管尖端(3)以nxm排列形式排列。在此背景中，“η”指行數(shù)，而m指列數(shù)，其中優(yōu)選地，η是6，且優(yōu)選地，m是8。更優(yōu)選地，第一類移液管尖端(4)與第二類移液管尖端(3)具有不同體積，最優(yōu)選地，第一類移液管尖端(4)的體積超過(guò)500ul，而第二類移液管尖端(3)的體積小于500ul。在此實(shí)施方案中，a=2。然而，本發(fā)明中還包括具有超過(guò)兩類移液管尖端，并且因此a>2的本發(fā)明實(shí)施方案。在一個(gè)方面，本發(fā)明的分析系統(tǒng)(440)包含用于向所述加工板(101)各個(gè)位置分配樣品類型和各個(gè)測(cè)試的控制單元(1006)。優(yōu)選地，所述位置是分開(kāi)的室(401、402)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述系統(tǒng)另外包含轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(480)，其用于在所述第一(402)和第二 (401)位置之間轉(zhuǎn)移所述加工板(101)和所述架(70)。所述轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(480)的優(yōu)選實(shí)施方案是傳送帶，或更優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)輸送裝置。
此外，優(yōu)選地，所述第二移液裝置(35)的所述移液管單元與在第一位置(402)中使用的移液管尖端(3、4)銜接。另外，本發(fā)明的系統(tǒng)(440)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含第三站(403)，所述第三站包含溫度受控型溫育箱，其用于將所述分析物與獲得可檢測(cè)信號(hào)必需的試劑一起溫育。此系統(tǒng)的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案在下文中描述。用第一處理器(1004)和第二處理器(1005)對(duì)nxm排列實(shí)現(xiàn)樣品和測(cè)試定位的更加優(yōu)化控制，所述第一處理器(1004)包含在所述第一位置(402)中且所述控制單元(1006)對(duì)其轉(zhuǎn)移指令，該指令關(guān)于將樣品類型和各個(gè)測(cè)試分配到加工板(101)的nxm排列的容器
(103)中的特定位置，所述第二處理器(1005)包含在所述第二位置(401)中且所述控制單元(1006)對(duì)其轉(zhuǎn)移指令，該指令關(guān)于將樣品類型和各個(gè)測(cè)試分配到加工板的nxm排列的容器(103)中的特定位置。優(yōu)選地，另外，所述系統(tǒng)包含位于所述第一位置中的第一處理器，和位于所述第二位置中的第二處理器。更優(yōu)選地，所述第一處理器(1004)控制所述第一移液裝置(700)，而所述第二處理器(1005)控制所述第二移液裝置(35)。依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)的所有其它優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施方案的具體描述是那些對(duì)依照本發(fā)明的方法提述的。附圖簡(jiǎn)述圖1 :如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中使用的樣品制備工作流的示意圖。朝下的箭表示向上文提及的深孔板的每個(gè)相應(yīng)孔添加組分或試劑，朝上的箭表示其相應(yīng)的除去。這些動(dòng)作在步驟2、3、4、21和22中手動(dòng)實(shí)施，在步驟10、14、16、18和24中通過(guò)裝置的加工頭(process head)實(shí)施，以及在步驟5、6、7、11、15和19中通過(guò)裝置的試劑頭(reagent head)實(shí)施。必須理解的是，可以在本發(fā)明的精神內(nèi)靈活調(diào)節(jié)使用的體積，優(yōu)選地，至少約多至公開(kāi)值的30%。具體地，在步驟2的情況中，優(yōu)選地，樣品體積是可變的，從而考慮到不同類型的流體樣品，其可以需要或多或少的起始材料來(lái)獲得正確的結(jié)果，如技術(shù)人員已知的。優(yōu)選地，范圍是約IOOul至約850ul。更優(yōu)選地，其是約lOOul、約500ul或約850ul。優(yōu)選地，在步驟3中用稀釋劑將相應(yīng)容器中的體積調(diào)節(jié)至相同總體積。優(yōu)選地，如在圖1中顯示的方案中，總體積合計(jì)多至約850ul。圖2 如實(shí)施例1 中描述的，在 LightCycler480 (Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, DE)上實(shí)施擴(kuò)增自HIV、HBV和CT衍生的靶核酸的增長(zhǎng)曲線。y軸上標(biāo)示的“信號(hào)”是標(biāo)準(zhǔn)化的熒光信號(hào)。X軸顯示相應(yīng)PCR循環(huán)的數(shù)目。與相應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照核酸的增長(zhǎng)曲線一起顯示HIV和HBV的增長(zhǎng)曲線。相應(yīng)的靶核酸曲線以直線表示，對(duì)照核酸曲線以點(diǎn)線表示。圖2a :定性HIV測(cè)定法，其在用于檢測(cè)靶探針的通道中測(cè)量。
圖2b :定性HIV測(cè)定法，其在用于檢測(cè)對(duì)照探針的通道中測(cè)量。圖2c :定量HIV測(cè)定法，其在用于檢測(cè)靶探針的通道中測(cè)量。圖2d :定量HIV測(cè)定法，其在用于檢測(cè)對(duì)照探針的通道中測(cè)量。圖2e :定量HBV測(cè)定法，其在用于檢測(cè)靶探針的通道中測(cè)量。圖2f :定量HBV測(cè)定法，其在用于檢測(cè)對(duì)照探針的通道中測(cè)量。圖2g CT測(cè)定法，其在用于檢測(cè)靶探針的通道中測(cè)量。圖3 加工板的透視圖。圖 4 從對(duì)角看，加工板的透視圖。圖5 加工板的俯視圖。圖 6 沿加工板較長(zhǎng)側(cè)的橫截面視圖。圖7 橫截面視圖的局部視圖。圖8 加工板較長(zhǎng)側(cè)的透視圖。圖9 a)至d)顯示磁性分離站的第二個(gè)實(shí)施方案的不同視圖。圖 10 :(a)至(C)顯示容納加工板的磁性分離站的第一個(gè)實(shí)施方案的視圖，第一類磁體在最高的Z位置中，而第二類磁體在最低的Z位置中。圖 11 :包含不同站、模塊或室的分析儀的示意圖。圖 12 顯示本發(fā)明的分析系統(tǒng)。圖 13 依照實(shí)施例2中的數(shù)據(jù)，EDTA血漿中定量HBV測(cè)定法的線性。圖 14
依照實(shí)施例
圖15
依照實(shí)施例
圖16
依照實(shí)施例
圖17
依照實(shí)施例
2中的數(shù)據(jù),血清中定量HBV測(cè)定法的線性。
2中的數(shù)據(jù)，EDTA血漿中定量HCV測(cè)定法的線性。
2中的數(shù)據(jù),血清中定量HCV測(cè)定法的線性。
2中的數(shù)據(jù)，EDTA血漿中定量HIV測(cè)定法的線性。
實(shí)施例以下實(shí)施例描述了可以運(yùn)行本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，這些實(shí)施例并非限制性的，并且可以在不背離本發(fā)明的精神的情況中修改。實(shí)施例1 :本實(shí)施例描述了一種用于分離和同時(shí)擴(kuò)增至少第一和第二靶核酸的方法，其使用單一通用內(nèi)部對(duì)照核酸。簡(jiǎn)言之，在描述的實(shí)施方案中，對(duì)一組數(shù)種不同靶物同時(shí)且在相同條件下實(shí)施實(shí)時(shí)PCR，所述靶物包含細(xì)菌(沙眼衣原體，CT)以及DNA病毒(HBV)和RNA病毒(HIV)。所有樣品分別在相同實(shí)驗(yàn)內(nèi)，即在同一深孔板(用于樣品制備)或多孔板(用于擴(kuò)增和檢測(cè))上加工并分析。制備下列樣品，隨后分析
權(quán)利要求
1.一種用于自多種不同類型的流體樣品至少同時(shí)分離第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自動(dòng)化步驟a.在與流體樣品數(shù)目對(duì)應(yīng)的數(shù)目的容器中將固體支持材料和所述多種不同類型的流體樣品在一定條件下組合在一起達(dá)一段時(shí)間，該條件和時(shí)間段足以允許包含所述靶核酸的核酸在所述固體支持材料上固定化，b.在分離站中將所述固體支持材料自存在于所述流體樣品中的其它物質(zhì)分離，c.在分離站中純化所述核酸，其通過(guò)將所述流體樣品與所述固體支持材料分開(kāi)，并將所述固體支持材料用清洗緩沖液清洗一次或多次來(lái)進(jìn)行，其中物理?xiàng)l件和所述時(shí)間段對(duì)于所述多種不同類型的流體樣品的成員是相同的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a.進(jìn)一步包括將核酸從其細(xì)胞和/或病毒環(huán)境中釋放，其通過(guò)裂解所述多種不同流體樣品中潛在存在的細(xì)胞和/或病毒殼體來(lái)進(jìn)行。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟a.進(jìn)一步包括向所述多種不同流體樣品添加裂解緩沖液。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述裂解緩沖液對(duì)于所述多種不同類型的流體樣品的成員是相同的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述裂解緩沖液包含一種或多種選自下組的組分籲離液劑籲緩沖物質(zhì) 醇 還原劑。
6.權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述裂解緩沖液具有酸性pH。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多種不同流體樣品中的至少一種流體樣品與其它流體樣品具有不同體積。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述容器在同一整體排列中組合。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一靶核酸包含RNA，而所述第二靶核酸包含DNA。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸來(lái)自不同生物體。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中于高至50°c的溫度實(shí)施步驟a.。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在步驟c.后進(jìn)一步包括下列步驟d.用洗脫緩沖液從所述固體支持材料洗脫所述核酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中于介于70°C和90°C之間的溫度實(shí)施步驟d.。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在步驟c.后或在步驟d.后進(jìn)一步包括下列步驟e.將純化的核酸和任選地所述固體支持材料轉(zhuǎn)移至多種反應(yīng)容器，f.擴(kuò)增所述靶核酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中步驟f.包括下列步驟1.在至少兩個(gè)反應(yīng)容器中使純化的核酸與包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶的一種或多種擴(kuò)增試劑接觸，其中至少第一反應(yīng)容器至少包含所述第一靶核酸，而至少第二反應(yīng)容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述第二靶核酸不存在于所述第一反應(yīng)容器中；i1.在所述反應(yīng)容器中將所述純化的核酸與所述一種或多種擴(kuò)增試劑在一定的條件下一起溫育一段時(shí)間，該條件和時(shí)間段適合于通過(guò)所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶發(fā)生RNA 轉(zhuǎn)錄；ii1.在所述反應(yīng)容器中將所述純化的核酸與所述一種或多種擴(kuò)增試劑在一定的條件下一起溫育一段時(shí)間，該條件和時(shí)間段足以發(fā)生指示所述第一和第二靶核酸存在或缺乏的擴(kuò)增反應(yīng)，其中步驟1.至ii1.中用于轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的條件至少對(duì)于第一和第二靶核酸是相同的。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支持物包含核酸結(jié)合顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷目的的核酸的樣品制備。更精確地，本發(fā)明提供了一種用于自多種不同類型的流體樣品至少同時(shí)分離第一和第二靶核酸并任選地以同時(shí)方式擴(kuò)增所述分離的核酸的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103025891SQ201180035818
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
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