專利名稱：Fdp測定用試劑及試劑盒、以及測定方法
FDP測定用試劑及試劑盒、以及測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定作為纖維蛋白及纖維蛋白原的分解產(chǎn)物的FDP的試劑及試劑盒、以及測定FDP的方法。
背景技木由止血或某種病的因素，如果血管內(nèi)或組織中發(fā)生血栓(穩(wěn)定化纖維蛋白)，為了將其除去，在活體內(nèi)發(fā)生纖溶反應(yīng)。溶解此血栓的纖溶反應(yīng)被稱為二次纖溶，血栓中的纖維蛋白由纖溶酶等的酶的作用而分解而在血中生成纖維蛋白分解產(chǎn)物(FbnDP ;二次纖溶物)。另ー方面，在活體內(nèi)，也發(fā)生不伴隨血栓的形成而發(fā)生的被稱為一次纖溶的纖溶反應(yīng)。在一次纖溶中，纖維蛋白原由纖溶酶等的酶的作用而分解而在血中生成纖維蛋白原分解產(chǎn)物(FbgDP ;一次纖溶物)。這些纖維蛋白及纖維蛋白原的分解產(chǎn)物被總稱為FDP (fibrinogenand fibrin degradation products)。 在血中的FDP的存在成為推測活體的纖溶亢進(jìn)的指標(biāo)。所以，現(xiàn)在，血中的FDP的測定在涉及血栓、循環(huán)器障礙、纖溶亢進(jìn)、異常出血等的疾病或彌散性血管內(nèi)凝血綜合征(DIC)等的診斷中利用。特別是，為了分類DIC的病態(tài)，要求無關(guān)于FDP的種類而測定總FDP量。在血中的FDP的測定用試劑中，一直以來適用免疫學(xué)方法，例如有利用免疫比濁法的試劑在市售。作為那樣的FDP測定用試劑，有使用抗人纖維蛋白原抗體等的多克隆抗體的試劑。但是，在使用此試劑的FDP測定中，如果作為待測樣品，不使用血清等，除去纖維蛋白原的活體樣品，則FDP測定值擬似性地變成高值。但是，制備血清的作業(yè)是煩瑣的。另夕卜,在如PT (凝血酶原時(shí)間)、APTT (活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間)、Fbg (纖維蛋白原濃度)一祥的血液凝固檢查中，由于作為待測樣品而使用血漿，所以在臨床現(xiàn)場中，優(yōu)選使用可使用血漿的單克隆抗體的血漿FDP測定用試劑(參照專利文獻(xiàn)I 5)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:特公平5-38906號公報(bào)專利文獻(xiàn)2:特公平7-46104號公報(bào)專利文獻(xiàn)3:專利第3472138號公報(bào)專利文獻(xiàn)4:特開2001-354700號公報(bào)專利文獻(xiàn)5:特開2002-372536號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題使用血清的FDP測定用試劑對一次纖溶物及二次纖溶物均等地反應(yīng)。但是，在以往的血漿FDP測定用試劑中，在使用的單克隆抗體的，對一次纖溶物的反應(yīng)性和對二次纖溶物的反應(yīng)性之間確認(rèn)差異。即，在以往的血漿FDP測定用試劑中，相比對一次纖溶物的反應(yīng)性，對二次纖溶物的反應(yīng)性有更高的傾向。一般而言，在生理性的條件下不發(fā)生纖維蛋白原的分解。從而，由于在FDP中二次纖溶物占大部分，所以上述的反應(yīng)性的差在通常的測定中不成問題。但是，在DIC、急性全骨髓性白血病等的患者中，血中的纖溶酶的活性變得過量，一次纖溶成為亢進(jìn)的狀態(tài)。即，在從那樣的狀態(tài)的受試者得到的活體樣品中含一次纖溶物。從而，在對一次纖溶物的反應(yīng)性低的以往的血漿FDP測定用試劑中有無法正確地測定在纖溶亢進(jìn)狀態(tài)的受試者的總FDP量的擔(dān)憂。本發(fā)明g在提供通過與一次纖溶物及二次纖溶物的兩方均一地反應(yīng)，可正確地測定在纖溶亢進(jìn)狀態(tài)的受試者的FDP的試劑及試劑盒。再者，本發(fā)明g在提供使用該試劑及試劑盒的FDP的測定方法。解決課題的技術(shù)方案
本發(fā)明人在進(jìn)行銳意研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用含致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液的試劑，該載體粒子與活體樣品中的一次纖溶物及二次纖溶物均一地反應(yīng)，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明提供FDP測定用試劑，其含致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體，其選自不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)的第I單克隆抗體、不與X級分及D級分反應(yīng),但與XDP級分、DD/E級分、DD級分及Y級分反應(yīng)的第2單克隆抗體、及不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)，對于FDP的反應(yīng)性與第I單克隆抗體不同的第3單克隆抗體。另外，本發(fā)明提供FDP測定用試劑盒，其含含緩沖液的第I試劑、及上述的含致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體的第2試劑。再者，本發(fā)明提供FDP測定方法，其包括上述的將致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液和活體樣品混合的步驟，以及測定由抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的，上述載體粒子的凝集的程度的步驟。發(fā)明效果本發(fā)明的FDP測定用試劑及試劑盒、以及測定方法對于用以往的FDP測定用試劑正確的測定是困難的含一次纖溶物的活體樣品，也可高精度測定FDP。另外，本發(fā)明的FDP測定用試劑及試劑盒、以及測定方法，由于對一次纖溶物及ニ次纖溶物均等反應(yīng)，所以作為待測樣品而可使用血清及血漿二者。

圖1是示本發(fā)明的FDP測定試劑的對一次纖溶物及二次纖溶物的反應(yīng)性的坐標(biāo)圖。圖2是示本發(fā)明的FDP測定試劑的對一次纖溶物和二次纖溶物的反應(yīng)比率的坐標(biāo)圖。圖3是示在本發(fā)明的FDP測定試劑及他公司制品中，對一次纖溶物和二次纖溶物的反應(yīng)比率的差異的坐標(biāo)圖。實(shí)施方式在本說明書中，“ FDP”是指纖維蛋白分解產(chǎn)物及纖維蛋白原分解產(chǎn)物二者。在本說明書中，“纖維蛋白分解產(chǎn)物”也被稱為二次纖溶物，是作為由凝血酶等的酶的作用而血液中的纖維蛋白原凝固而形成的聚合物的穩(wěn)定化纖維蛋白被纖溶酶等的酶分解而發(fā)生的蛋白質(zhì)組。作為纖維蛋白分解產(chǎn)物，可舉出DD級分、DD/E級分、XDP級分等。作為XDP級分，可舉出DD/E級分的多聚體、例如作為DD/E級分的3聚體的DXD/YY級分、作為DD/E級分的5聚體的YXY/DXXD級分、作為DD/E級分的7聚體的DXXD/YXXY級分等。另夕卜，在所述技術(shù)中，XDP級分也被總稱為D ニ聚體。在本說明書中，“纖維蛋白原分解產(chǎn)物”也被稱為一次纖溶物，是血液中存在的纖維蛋白原被纖溶酶等的酶分解而發(fā)生的蛋白質(zhì)組。作為纖維蛋白原分解產(chǎn)物可舉出X級分、Y級分、D級分及E級分。在本說明書中，“對于FDP的反應(yīng)性”由抗FDP單克隆抗體特異性地反應(yīng)的FDP的種類而規(guī)定，或者，由致敏抗FDP單克隆抗體的載體和FDP的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的凝集的程度規(guī)定。從而，在可在某抗FDP單克隆抗體和別的抗FDP單克隆抗體之間特異性地反應(yīng)的FDP的種類互相不同之時(shí)，這些的抗體的對于FDP的反應(yīng)性被確定為互相不同。另外，與互相相同的種類的FDP反應(yīng)時(shí)，在各自使用致敏某抗FDP單克隆抗體的載體和致敏別的抗FDP單克隆抗體的載體的FDP測定中，在凝集的程度互相顯著地不同之時(shí)，這些的抗體的對于FDP的反應(yīng)性被確定為互相不同。本發(fā)明的FDP測定用試劑(以下，也被稱為本發(fā)明的試劑)中使用的單克隆抗體是對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體。作為那樣的單克隆抗體，從以下的第I單克隆抗體、第2單克隆抗體及第3單克隆選擇至少2種是優(yōu)選的。第I單克隆抗體是不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)的抗體。第2單克隆抗體是不與X級分及D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分及Y級分反應(yīng)的抗體。第3單克隆抗體是不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)，對于FDP的反應(yīng)性與第I單克隆抗體不同的抗體。作為本發(fā)明的試劑中含的單克隆抗體的組合，可舉出例如“第I單克隆抗體和第2單克隆抗體”、“第I單克隆抗體和第3單克隆抗體”、“第2單克隆抗體和第3單克隆抗體”及“第I單克隆抗體和第2單克隆抗體和第3單克隆抗體”。上述的第1、第2及第3單克隆抗體是來源于小鼠、大鼠、倉鼠、兔、山羊、馬等之任何的哺乳動物的抗體也可，但在它們之中小鼠也是優(yōu)選的。另外，抗體的同種型是IgG、IgM、IgE、IgA等之任何也可。在抗體中含抗體的片段及其衍生物。作為具體例，可舉出Fab片段、F (ab’)2片段等。上述的第1、第2及第3單克隆抗體可由所述技術(shù)中公知的免疫學(xué)方法得到。即，通過作為抗原將FDP (—次纖溶物及/或二次纖溶物)和佐劑任意地混合而免疫動物，將從該動物取得的B淋巴細(xì)胞和適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合而制備雜交瘤，純化該雜交瘤的培養(yǎng)上清，可得到單克隆抗體。
具體而言，由以下的方法可得到本發(fā)明的試劑中使用的第1、第2及第3單克隆抗體。
抗原的取得
作為抗原使用的FDP可通過使如纖溶酶一樣的可分解纖維蛋白及纖維蛋白原的酶作用于纖維蛋白及纖維蛋白原而得到。再有，成為FDP的原料的纖維蛋白及纖維蛋白原有市售。另外，纖維蛋白可通過向纖維蛋白原作用凝血酶、第XIII因子及鈣鹽而得到。
免疫方法
可用將如上述一樣得到的抗原與佐劑任意地混合，在適當(dāng)?shù)木彌_液中溶解或懸浮而得到的抗原液免疫動物。該抗原液中的抗原的濃度是50 500 μ g/ml左右是優(yōu)選的?？乖拿庖咴缘蜁r(shí)，也可將如白蛋白、鑰孔青貝血藍(lán)蛋白一樣的載體蛋白質(zhì)任意地與抗原彡口口
作為佐劑，可使用在所述技術(shù)中公知的佐劑。作為那樣的佐劑，可舉出例如弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、Ribi (MPL),Ribi (TDM),Ribi (MPL+TDM)、百日咳疫苗(Bordetella pertussis vaccine)、胞壁酰二肽(MPD)、招佐劑(ALUM)及這些的組合。在初次免疫時(shí)使用FCA，在追加免疫時(shí)使用FIA或Ribi佐劑的組合是特別優(yōu)選的。
待免疫的動物是小鼠、大鼠、倉鼠、馬、山羊、兔等之任何均可，優(yōu)選為小鼠、更優(yōu)選是BALB/c小鼠。
免疫法可根據(jù)使用的抗原的種類或佐劑的有無而適宜選擇。例如使用小鼠時(shí)，將佐劑混合抗原液O. 05 Iml (抗原10 200 μ g)注射到腹腔內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或尾靜脈內(nèi)， 從初次免疫每約4 21天進(jìn)行I 4次追加免疫，再者約I 4周后，進(jìn)行最終免疫。通過使抗原量變多而進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，不向抗原液使用佐劑而進(jìn)行免疫也可。追加免疫的約 5 10天后，采集血液而測定抗體價(jià)?？贵w價(jià)可根據(jù)如后述的抗體價(jià)測定一樣的本技術(shù)中公知的方法測定。從最終免疫約3 5天后，從被免疫的動物摘出脾臟，分離脾臟細(xì)胞而可得到產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
單克隆抗體的制備
單克隆抗體可根據(jù)所述技術(shù)中公知的方法、例如Kohler及Milstein, Nature, 256，495-497 (1975)所述的方法制備。
使用的骨髓瘤細(xì)胞是小鼠、大鼠、人等任何的哺乳動物來源的細(xì)胞均可，可舉出例如小鼠骨髓瘤 P3 X 63-Ag8、P3 X 63_Ag8_Ul、P3NSl-Ag4、SP2/o_Agl4、P3 X 63_Ag8 ·653 等的株化骨髓瘤細(xì)胞。在骨髓瘤細(xì)胞之中有產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈的種類的骨髓瘤細(xì)胞，將其作為融合對象使用，則產(chǎn)生抗體的細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白重鏈和此輕鏈隨機(jī)地結(jié)合。從而，使用不產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈的骨髓瘤細(xì)胞、例如P3X63-Ag8 · 653、SP2/o_Agl4等是優(yōu)選的。 產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞是同種動物、特別是同系統(tǒng)的動物來源的細(xì)胞是優(yōu)選的。
作為將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合而制備雜交瘤的方法，可舉出使用聚乙二醇(PEG)的方法、使用仙臺病毒的方法、使用電融合裝置的方法等。使用PEG時(shí)，在含約 30 60%的PEG (平均分子量1000 6000)的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或緩沖液中將脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以I 10:1、優(yōu)選為5 10:1的混合比懸浮，在溫度約25 37°C、pH6 8的條件下反應(yīng)約30秒鐘 3分鐘左右即可。反應(yīng)結(jié)束后，清洗細(xì)胞，除去含有PEG的溶液而再懸浮于培養(yǎng)基中，接種到微滴定板上培養(yǎng)。
將如上述一樣融合的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可進(jìn)行雜交瘤的選擇。作為選擇 培養(yǎng)基，只要是僅融合細(xì)胞可增殖的培養(yǎng)基即可，可使用例如次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧 啶(HAT)培養(yǎng)基。雜交瘤的選擇，通常、可在細(xì)胞融合的I 7天后，與培養(yǎng)基之一部分、優(yōu) 選為約半量的選擇培養(yǎng)基交換，再每2 3天同樣重復(fù)培養(yǎng)基交換而培養(yǎng),在培養(yǎng)結(jié)束后， 通過顯微鏡觀察選擇雜交瘤的集落生長的孔來進(jìn)行。
如此得到的雜交瘤是否產(chǎn)生所望的抗體，可通過采集該雜交瘤的培養(yǎng)上清，進(jìn)行 抗體價(jià)分析來確認(rèn)?？贵w價(jià)分析可通過所述技術(shù)中公知的方法進(jìn)行。例如，可通過向固定化 到固相的抗原蛋白質(zhì)添加階段稀釋的培養(yǎng)上清，再與用熒光物質(zhì)、酶或放射性同位素(RI) 標(biāo)記的第二抗體(抗球蛋白抗體、抗IgG抗體、抗IgM抗體等)反應(yīng)而檢測抗體。
由上述的抗體價(jià)測定確認(rèn)產(chǎn)生所望的抗體的雜交瘤，可由有限稀釋法、軟瓊脂法、 使用熒光激發(fā)細(xì)胞分選儀的方法等，分離單一克隆。例如在有限稀釋法的情況中，通過在培 養(yǎng)基中階段稀釋而培養(yǎng)至雜交瘤的集落成I細(xì)胞/孔左右，可單離產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤。
從雜交瘤的單克隆抗體的取得方法可根據(jù)單克隆抗體的必要量或雜交瘤的性狀 適宜選擇?？膳e出例如，從移植該雜交瘤的小鼠的腹水取得的方法、由細(xì)胞培養(yǎng)從培養(yǎng)上清 取得的方法等。只要是可在小鼠的腹腔內(nèi)增殖的雜交瘤，從腹水可得到數(shù)mg/ml的高濃度 的單克隆抗體。在體內(nèi)無法增殖的雜交瘤的情況中，可從細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清取得單克隆 抗體。此時(shí)，盡管產(chǎn)生抗體的量低，但免疫球蛋白或其他雜質(zhì)的混入少而容易純化。
從移植雜交瘤的小鼠腹腔內(nèi)取得抗體時(shí)，向預(yù)先施用例如如姥鮫烷 (2，6，10，14-四甲基十五烷)一樣的有免疫抑制作用的物質(zhì)的BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)移植雜 交瘤(約IXlO6個(gè)以上)，約I 3周后，采集貯留的腹水。在移植異種雜交瘤時(shí)，使用裸鼠、 放射線處理小鼠等是優(yōu)選的。
從細(xì)胞培養(yǎng)上清取得抗體時(shí)，例如除了細(xì)胞維持使用的靜置培養(yǎng)之外，由高密度 培養(yǎng)法或旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法等培養(yǎng)雜交瘤，可得到含有抗體的培養(yǎng)上清。如果向培養(yǎng)基添加血 清，則含其他抗體或白蛋白等的雜質(zhì)，抗體的純化多會變得煩瑣，所以使向培養(yǎng)基的血清的 添加量盡可能少是優(yōu)選的。將雜交瘤由慣用的方法在無血清培養(yǎng)基中馴化，在無血清培養(yǎng) 基中培養(yǎng)是更優(yōu)選的。由此，抗體純化變得容易。
從腹水或培養(yǎng)上清的單克隆抗體的純化可通過公知的方法進(jìn)行，可舉出例如通過 使用硫酸銨、硫酸鈉等的鹽的鹽析的分級分離法、聚乙二醇分級分離法、乙醇分級分離法、 DEAE離子交換層析法、基于凝膠過濾層析法等的方法。
目的的抗體是小鼠IgG時(shí)，可利用使用蛋白A結(jié)合載體或抗小鼠免疫球蛋白結(jié)合 載體的親和層析法來純化抗體。
作為本發(fā)明的試劑中使用的第I單克隆抗體，可舉出例如由以保藏號NITE BP-950在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(郵政編碼292-0818、 日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，于2010年6月I日保藏的雜交瘤“FDP3-797”產(chǎn) 生的抗體(以下，也被稱為“FDP3-797抗體”)。
作為本發(fā)明的試劑中使用的第2單克隆抗體，可舉出例如由以保藏號NITE BP-951在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(郵政編碼292-0818、 日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，于2010年6月I日保藏的雜交瘤“FDP3-2935”產(chǎn)生的抗體(以下，也被稱為“FDP3-2935抗體”)。
作為本發(fā)明的試劑中使用的第3單克隆抗體，可舉出例如由以保藏號NITE BP-952在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(郵政編碼292-0818、 日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，于2010年6月I日保藏的雜交瘤“DD-M1051”產(chǎn)生的抗體(以下，也被稱為“DD-M1051抗體”)。
在本發(fā)明的試劑中，各單克隆抗體之間的濃度比不特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適宜決定。
本發(fā)明的試劑含選自上述的第1、第2及第3單克隆抗體的，致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體。作為那樣的載體，可舉出有機(jī)高分子化合物、無機(jī)化合物、紅細(xì)胞等。作為有機(jī)高分子化合物，可舉出不溶性瓊脂糖、不溶性葡聚糖、纖維素、乳膠、聚苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-縮水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作為無機(jī)化合物，可舉出氧化硅、氧化鋁等。
上述的載體的形狀不特別限定，是球狀、平面狀等任何的形狀也可。是球狀時(shí)，載體粒子的平均徑可根據(jù)測定機(jī)器等適宜選擇，但通常是O. 05 O. 5 μ m為適當(dāng)?shù)?。作為粒子的材質(zhì)，乳膠是特別優(yōu)選的。
作為用第1、第2及第3單克隆抗體致敏載體的方法，所述技術(shù)中公知的物理的吸附法及化學(xué)結(jié)合法之任何也可，但由于操作簡便，而物理吸附法是優(yōu)選的。
上述的載體是粒子的情況中，該載體粒子是致敏上述的2種或3種單克隆抗體的載體粒子也可，是各單克隆抗體各自個(gè)別地致敏的載體粒子的混合物也可。第1、第2及第 3單克隆抗體之間向載體粒子的致敏條件互相不同時(shí)，用各抗體個(gè)別地致敏 載體粒子是優(yōu)選的。
上述的載體粒子是乳膠粒子時(shí)，將致敏上述的單克隆抗體的載體粒子在適當(dāng)?shù)木彌_液中懸浮。懸浮液中的乳膠粒子的濃度優(yōu)選為O. 5 10mg/ml、更優(yōu)選是O. 75 5mg/ml。 另外，該懸浮液中的單克隆抗體的總濃度優(yōu)選為10 100 μ g/ml、更優(yōu)選是20 50 μ g/ ml ο
作為上述的緩沖液，可舉出在pH5 10、優(yōu)選為pH6 9有緩沖作用的緩沖液。具體而言，可舉出例如磷酸緩沖液、咪唑緩沖液、三乙醇胺-鹽酸、Good緩沖液等。作為Good緩沖液，可舉出 MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS, M0PS0, BES, TES, HEPES, HEPPS, Tricine、Tris、Bicine、TAPS 等的緩沖液。它們之中 M0PS0 也是優(yōu)選的。
上述的緩沖液可再含蛋白質(zhì)穩(wěn)定化劑(例如BSA等)、防腐劑(例如疊氮化鈉、苯基甲磺酰氟等)、PH調(diào)節(jié)劑、增感劑(例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚陰離子、聚乙二醇、多糖類等)、 無機(jī)鹽(例如氯化鈉、氯化鈣等)、背景抑制劑(例如人抗小鼠抗體(HAMA)吸收劑等)等的添加物。
作為本發(fā)明的試劑之一實(shí)施方式，可舉出FDP測定用試劑盒(以下，也被稱為本發(fā)明的試劑盒)。本發(fā)明的試劑盒含含緩沖液的第I試劑，和含致敏選自上述的第1、第2及第3單克隆抗體的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液的第2試劑。
本發(fā)明的試劑盒是用于由免疫測定、例如使致敏上述的至少2種單克隆抗體的乳膠粒子和活體樣品中的FDP反應(yīng)的測定(乳膠凝集法)等，檢測該樣品中的FDP的試劑盒。
作為本發(fā)明的試劑盒中使用的第1、第2及第3單克隆抗體之一例，各自可舉出 FDP3-797 抗體、FDP3-2935 抗體及 DD-M1051 抗體。
本發(fā)明的試劑盒的形態(tài)是如上所述含第I試劑和第2試劑的2試劑型的形態(tài)，但是含I個(gè)試劑的I試劑型的形態(tài)也可。從測定精度的觀點(diǎn)等，作為試劑盒的形態(tài)，含第I試劑和第2試劑的2試劑型是優(yōu)選的。更優(yōu)選為，本發(fā)明的試劑盒是含含緩沖液的第I試劑，和含上述的本發(fā)明的FDP測定用試劑的第2試劑的形態(tài)。
作為可在構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒的第I試劑中使用的緩沖液，可舉出與在本發(fā)明的試劑中可在載體粒子的懸浮中使用的緩沖液相同的緩沖液。第I試劑含上述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化劑、防腐劑、PH調(diào)節(jié)劑、增感劑、無機(jī)鹽等的添加物也可。
本發(fā)明的FDP測定方法可使用本發(fā)明的FDP測定用試劑或試劑盒實(shí)施。作為本發(fā)明的FDP測定方法之一實(shí)施方式，對于使用本發(fā)明的FDP測定用試劑盒測定活體樣品中的 FDP的方法，接下來具體說明。
首先，將含緩沖液的第I試劑和活體樣品混合而溫育。其中，作為活體樣品，可舉出從受試者得到的血清、血漿、尿等。將第I試劑和活體樣品混合之時(shí)的容量比是5:1 50:1左右即可。另外，溫育時(shí)間是I 10分鐘左右即可。
接下來，向第I試劑和活體樣品的混合物添加含致敏選自上述的第1、第2及第3 單克隆抗體的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液的第2試劑。將該混合物和第2試劑混合之時(shí)的容量比是1:0. 05 1:1. 5左右即可。
如果添加第2試劑而混合，則由抗原抗體反應(yīng),發(fā)生FDP和第2試劑中的載體粒子的凝集。將此凝集的程度作為每I分鐘的吸光度的變化量測定。此測定用可測定散射光強(qiáng)度、吸光度或透射光強(qiáng)度的光學(xué)機(jī)器進(jìn)行是優(yōu)選的。另外，測定波長可選擇300 2400nm、 優(yōu)選為300 lOOOnm、更優(yōu)選為從500 IOOOnm的范圍適宜的波長。
活體樣品中的FDP的濃度及/或量可使用由濃度已知的FDP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從測定的吸光度的變化量算出。
在本發(fā)明的試劑盒中，將第I試劑和第2試劑混合之后，向兩試劑的混合物添加活體樣品而可將載體粒子的凝集的程度也在以光學(xué)方法測定的方法中利用。
再有，作為本發(fā)明的FDP測定方法中使用的第1、第2及第3單克隆抗體之一例，各自可舉出FDP3-797抗體、FDP3-2935抗體及DD-M1051抗體。
接下來對實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例
試驗(yàn)例1:各單克隆抗體的反應(yīng)性的檢查
作為第1、第2及第3單克隆抗體，各自使用FDP3-797抗體、FDP3-2935抗體及 DD-M1051抗體，將對各抗體的纖維蛋白及纖維蛋白原分解產(chǎn)物的反應(yīng)性的差異通過如以下一樣的ELISA法檢查。
(I) FDP 的制備
(7-1)纖維蛋白原分解產(chǎn)物(FbgDP)的制備
向纖維蛋白原(Sigma公司)241mg (39. 7mg/ml)添加纖溶酶(Sigma公司)至終濃度達(dá)60mU/ml，于37°C反應(yīng)8小時(shí)。其后，加抑肽酶至終濃度達(dá)lU/ml，停止分解反應(yīng)。將得到的反應(yīng)液用12000 Xg離心20分鐘，將得到的上清填充到用50mM Tris緩沖液(pH7. 4) 平衡化的賴氨酸-瓊脂糖4B柱(硼8ml)而進(jìn)行層析之后，用旋柱除瓊脂糖，制備FbgDP溶液。使用蛋白質(zhì)定量試劑(Bio-Rad公司)測定得到的FbgDP溶液的蛋白質(zhì)濃度。另外，F(xiàn)b 將gDP溶液之一部分在后述的本發(fā)明的FDP測定用試劑的向FDP的反應(yīng)性的確認(rèn)中使用。
將得到的FbgDP溶液由超濾用離心管(Amiconl550K ；Millipore公司)用樣品緩沖液(62. 5mM Tris、192mM甘氨酸、l%SDS(pH6. 8))取代2次。將得到的溶液填充到S^hacryl S-300 (GE Healthcare公司)，使用蠕動泵使以流速70 80 μ I/分流動而每10分鐘回收級分。對于得到的各級分，通過使用分子量標(biāo)志物的SDS-PAGE解析，各自回收含X級分、Y 級分及D級分的級分。將其由Amiconl550K (Millipore公司)用磷酸緩沖液(PBS)取代2 次，作為FbgDP抗原。
(1-2)纖維蛋白分解產(chǎn)物(FbnDP)的制備
向纖維蛋白原(Sigma公司)92mg (23mg/ml)加氯化I丐、人凝血酶(三菱Pharma公司)及第XIII因子(NIPRO公司)至終濃度分別達(dá)25mM、4U/ml及O. 05U/ml，于37°C反應(yīng)一晚，將纖維蛋白原變換為纖維蛋白。將反應(yīng)液中產(chǎn)生的纖維蛋白凝膠用Tris緩沖液(TBS (pH7. 4)) 50ml清洗，在4°C、3000Xg離心10分鐘而回收纖維蛋白凝膠。將此操作重復(fù)2 次之后，使用50ml注射器將纖維蛋白凝膠弄碎。將纖維蛋白凝膠再懸浮于TBS (pH7.4) 4. 6ml。向懸浮液添加纖溶酶至終濃度達(dá)75mU/ml，于37°C反應(yīng)6小時(shí)。其后，加抑肽酶至終濃度達(dá)lU/ml，停止分解反應(yīng)。將得到的反應(yīng)液用12000 X g離心20分鐘，將得到的上清填充到用50mM Tris緩沖液(pH7. 4)平衡化的賴氨酸-瓊脂糖4B柱(硼3. 5ml)而進(jìn)行層析之后，用旋柱除瓊脂糖，制備FbnDP溶液。使用蛋白質(zhì)定量試劑(Bio-Rad公司)測定得到的FbnDP溶液的蛋白質(zhì)濃度。另外，將FbnDP溶液之一部分在后述的本發(fā)明的FDP測定用試劑的向FDP的反應(yīng)性的確認(rèn)中使用。
將得到的FbnDP溶液由超濾用離心管(Amiconl550K ；Millipore公司)用樣品緩沖液(62. 5mM Tris、192mM甘氨酸、l%SDS(pH6. 8))取代3次。將得到的溶液填充到S^hacryl S-300CGE Healthcare公司)，使用蠕動泵使以流速2ml/分流動而每30秒鐘回收級分。對于得到的各級分，通過使用分子量標(biāo)志物的SDS-PAGE解析，各自回收含XDP級分、DD/E級分、DD級分的級分。將其由Amiconl550K (Millipore公司)用磷酸緩沖液(PBS)取代2次， 作為FbnDP抗原。
將各抗FDP單克隆抗體溶液用PBS稀釋為O. 5 μ g/ml，各自將各100 μ I分注于96 孔微滴定板的孔，于4°C靜置18小時(shí)。其后，用含O. 05%Tween20的IOmM磷酸緩沖液(pH7. O) (以下，被稱為清洗液)將孔清洗3次。接下來，向孔填充含1%BSA的IOmM磷酸緩沖液(以下，被稱為封閉緩沖液)，得到抗FDP單克隆抗體的抗體固相。
將孔用清洗液清洗3次之后，向該抗體固相的各孔各加100 μ I上述制備的FbgDP 各抗原及FbnDP各抗原，于室溫反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將孔用清洗液清洗3次之后，向各孔各加1001過氧化物酶標(biāo)記抗纖維蛋白原抗體(DAK0公司)，于室溫反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將孔用清洗液清洗3次之后，向各孔各加100μ I ODP底物液(國際試劑株式會社)，于室溫反應(yīng)15分鐘。接下來，向各孔各加100μ 12Ν硫酸，停止反應(yīng)，測定在490nm的吸光度。
結(jié)果不于表I。
表I
權(quán)利要求
1.FDP測定用試劑，其含致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體，其選自 不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)的第I單克隆抗體、 不與X級分及D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分及Y級分反應(yīng)的第2單克隆抗體、及 不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)，對于FDP的反應(yīng)性與上述第I單克隆抗體不同的第3單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1所述的FDP測定用試劑，其中上述載體是粒子。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的FDP測定用試劑，其中上述載體粒子是個(gè)別地致敏各單克隆抗體的載體粒子的混合物。
4.權(quán)利要求1 3之任一項(xiàng)所述的抗FDP單克隆抗體，其中上述第I單克隆抗體是由以保藏號NITE BP-950在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心，于2010年6月I日保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
5.權(quán)利要求1 4之任一項(xiàng)所述的抗FDP單克隆抗體，其中上述第2單克隆抗體是由以保藏號NITE BP-951在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心，于2010年6月I日保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
6.權(quán)利要求1 5之任一項(xiàng)所述的抗FDP單克隆抗體，其中上述第3單克隆抗體是由以保藏號NITE BP-952在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心，于2010年6月I日保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
7.FDP測定用試劑盒，其含 第I試劑，其含緩沖液；以及 第2試劑，其含致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液，其選自 不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)的第I單克隆抗體、 不與X級分及D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分及Y級分反應(yīng)的第2單克隆抗體、及 不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)，對于FDP的反應(yīng)性與上述第I單克隆抗體不同的第3單克隆抗體。
8.FDP測定方法，其包括 將致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液和活體樣品混合的步驟，所述致敏對于FDP的反應(yīng)性互相不同的至少2種單克隆抗體的載體粒子的懸浮液選自 不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)的第I單克隆抗體、 不與X級分及D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分及Y級分反應(yīng)的第2單克隆抗體、及 不與D級分反應(yīng)，但與XDP級分、DD/E級分、DD級分、X級分及Y級分反應(yīng)，對于FDP的反應(yīng)性與上述第I單克隆抗體不同的第3單克隆抗體，以及 測定由抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的，上述載體粒子的凝集的程度的步驟。
9.權(quán)利要求8所述的FDP測定方法，其中上述凝集的程度的測定是吸光度的變化的測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及含致敏選自對于FDP的反應(yīng)性互相不同的3種單克隆抗體的至少2種單克隆抗體的載體的FDP測定用試劑。另外，本發(fā)明涉及含該試劑的試劑盒、及利用該試劑或試劑盒的FDP測定方法。
文檔編號C12P21/08GK103026231SQ20118003645
公開日2013年4月3日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者小林克史, 村上真澄, 杉本真由美 申請人:希森美康株式會社