專(zhuān)利名稱(chēng)：用于登革熱檢測(cè)的探針和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)涉及通過(guò)使用“寡核苷酸”探針用于檢測(cè)和定量來(lái)自血液、血漿或血清樣品的登革熱病毒的方法。
背景技術(shù)：
近幾十年來(lái)，世界各地的登革熱發(fā)病率急劇增長(zhǎng)。約25億人一世界人口的五分之二一現(xiàn)在處于來(lái)自于登革熱的風(fēng)險(xiǎn)中。世界衛(wèi)生組織(WHO)目前估計(jì)全球每年可能有50萬(wàn)登革熱感染病例。僅在2007年，在美洲有超過(guò)890，000例報(bào)告的登革熱病例，其中26000病例為登革出血熱(DHF)。目前該病是在非洲、美洲、東地中海、東南亞和西太平洋地區(qū)的超過(guò)100個(gè)國(guó)家的地方病。東南亞和西太平洋地區(qū)受影響最嚴(yán)重。1970年之前，只有九個(gè)國(guó)家發(fā)生過(guò)登革出血熱流行，到1995年這個(gè)數(shù)字增加了超過(guò)4倍。登革熱是由蚊子傳播的感染，近幾十年來(lái)已成為主要的國(guó)際公共衛(wèi)生關(guān)注點(diǎn)。登革熱發(fā)生在世界各地的熱帶和亞 熱帶地區(qū)，主要集中在城市化和半城市化地區(qū)。登革出血熱(DHF)，一種潛在的致命并發(fā)癥，于20世紀(jì)50年代在菲律賓和泰國(guó)登革熱流行期間被首次確認(rèn)。現(xiàn)在，DHF影響到大多數(shù)亞洲國(guó)家并且已成為該地區(qū)兒童住院和死亡的首要原因。登革熱病毒(DENV)是黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬的單鏈RNA(ssRNA)正鏈病毒。它也被稱(chēng)為登革熱發(fā)燒(骨痛熱，breakbone fever)。有四種不同、但卻緊密相關(guān)的引起登革熱的病毒。登革出血熱(DHF)是一種潛在致命的并發(fā)癥，其特征是高熱，經(jīng)常伴隨肝臟腫大，并且嚴(yán)重的情況下發(fā)生循環(huán)衰竭。發(fā)病通常以突然發(fā)熱并伴有臉部潮紅以及其他流感樣癥狀開(kāi)始。高熱通常持續(xù)兩到七天并可高達(dá)41°C，可能伴隨驚厥和其他并發(fā)癥。沒(méi)有針對(duì)登革熱的特殊治療。目前使用的用于登革熱診斷的方法是基于通過(guò)ELISA對(duì)血清中的抗登革熱IgM和IgG的血清學(xué)檢測(cè)。這些血清學(xué)方法無(wú)法在疾病的早期階段檢出感染。因此需要快速、靈敏的方法用于在感染過(guò)程中的早期對(duì)登革熱感染進(jìn)行檢測(cè)以進(jìn)行更好的病人管理。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本公開(kāi)涉及具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列的探針，可選地與可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合；具有如SEQ ID No. 3或SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列的引物；用于檢測(cè)登革熱感染的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含核酸擴(kuò)增試劑、具有選自包含SEQID No.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合、以及具有如SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物；檢測(cè)和可選地量化登革熱感染的方法,所述方法包括以下操作一(a)獲得包含核酸擴(kuò)增試劑、選自包含SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的組中的探針、和具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物的PCR反應(yīng)混合物，(b)將檢測(cè)樣品引入至PCR反應(yīng)混合物用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得目標(biāo)序列的拷貝，接著通過(guò)測(cè)量產(chǎn)生的熒光信號(hào)以檢測(cè)登革熱感染和(c)可選地，由所檢測(cè)的信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線用于量化登革熱感染；用于檢測(cè)登革熱感染的試劑盒，所述試劑盒包括具有選自包含SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合，可選地在5’和3’端進(jìn)行標(biāo)記，具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物，和擴(kuò)增試劑，可選地連同說(shuō)明書(shū)；以及用于檢測(cè)登革熱感染的試劑盒的組裝方法，所述方法包括將具有選自包含SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合、具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物、和擴(kuò)增試劑，可選地連同說(shuō)明書(shū)進(jìn)行組合的步驟。


為了容易地理解本公開(kāi)并獲得實(shí)際效果，現(xiàn)在對(duì)示例性實(shí)施方式作出參考，如參考附圖所進(jìn)行的圖解說(shuō)明。附圖連同下面的詳細(xì)說(shuō)明，被并入并構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，并用于進(jìn)一步圖解說(shuō)明實(shí)施方式和解釋各種原理和優(yōu)勢(shì)，根據(jù)本公開(kāi)，其中
圖1示出使用SEQ ID No.1通過(guò)即時(shí)PCR針對(duì)登革熱血清型的擴(kuò)增曲線。圖2示出使用SEQ ID No. 2通過(guò)即時(shí)PCR針對(duì)登革熱血清型的擴(kuò)增曲線。圖3不出使用國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室引物和探針(National reference laboratoryprimers&probe)通過(guò)即時(shí)PCR針對(duì)登革熱血清型的擴(kuò)增曲線。圖4示出對(duì)數(shù)稀釋曲線。
具體實(shí)施例方式本公開(kāi)涉及具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列的探針,可選地與可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式中，探針用于檢測(cè)登革熱感染；并且其中可檢測(cè)標(biāo)簽為在5’端的突光團(tuán)(flurophore)和在3’端的粹滅劑(粹滅物，淬滅劑，quencher)。在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式中，突光團(tuán)選自包括以下的組中突光素，由6-羧基熒光素[FAM]、VIC、J0E、5-(2’_氨基乙基)氨基萘_1_磺酸、香豆素香豆素衍生物、熒光黃、得克薩斯紅、四甲基羅丹明、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料組成的熒光素衍生物，優(yōu)選6-羧基熒光素[FAM];并且猝滅劑選自包括以下的組中四甲基羅丹明(tetra methyl rhodamine)、4’-(4_ 二甲基氛基苯偶?xì)饣?苯甲酸、4_ 二甲基氛基苯基偶氮苯基-4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、羧基四甲基羅丹明和黑洞淬滅劑I (black hole quencherl) [BHQ]染料,優(yōu)選黑洞淬滅劑I (BHQl)0本公開(kāi)涉及具有如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式中，具有SEQ ID No. 3的引物是正義引物而具有SEQ IDNo. 4的引物是反義引物。在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式中，引物與具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo. 2的探針相對(duì)應(yīng)；并且其中引物與任一具有SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2的探針組合使用。本公開(kāi)涉及用于檢測(cè)登革熱感染的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含核酸擴(kuò)增試齊U、具有選自包含SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合；以及具有如SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列的引物。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式中，具有SEQ ID No. 3的引物是正義引物而具有SEQ IDNo. 4的引物是反義引物；并且探針與在5’端具有熒光團(tuán)并在3’端具有猝滅劑的可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合。
在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式中，引物與具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo. 2的探針相對(duì)應(yīng)；并且其中，引物與任一具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo. 2的探針組合使用。在本公開(kāi)的又一個(gè)實(shí)施方式中，從選自包含血液、血漿和血清或它們的任意組合的組中的樣品中檢出登革熱感染；并且擴(kuò)增試劑選自包含氯化鎂、Taq聚合酶和緩沖液或任何它們的組合的組中。本公開(kāi)涉及檢測(cè)以及可選地量化登革熱感染的方法，所述方法包括以下操作(a)獲得包含核酸擴(kuò)增試劑、選自包含SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2的組中的探針和具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物； (b )將檢測(cè)樣品引入至PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得目標(biāo)序列的拷貝，接著通過(guò)測(cè)量產(chǎn)生的熒光信號(hào)用于檢測(cè)登革熱感染；以及 (c)可選地，由所檢測(cè)信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量登革熱感染。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式中，具有SEQ ID No. 3的引物是正義引物而具有SEQ IDNo. 4的引物是反義引物。在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式中，引物與具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo. 2的探針相對(duì)應(yīng)；并且其中引物與任一具有SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2的探針組合使用。在本公開(kāi)的又一實(shí)施方式中，檢測(cè)樣品選自包含血液、血漿和血清或它們的任意組合的組中；并且擴(kuò)增試劑選自包含氯化鎂、Taq聚合酶和緩沖液或它們的任意組合的組中。在本公開(kāi)的再一實(shí)施方式中，探針與在5’端具有熒光團(tuán)且在3’端具有猝滅劑的檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合；并且熒光信號(hào)由在5’端具有熒光團(tuán)且在3’端具有猝滅劑的探針產(chǎn)生。在本公開(kāi)的另一實(shí)施方式中，突光團(tuán)選自包含以下的組中突光素，由6-羧基突光素[FAM]、VIC、J0E、5-(2’_氨基乙基)氨基萘_1_磺酸酸、香豆素和香豆素衍生物、熒光黃、得克薩斯紅、四甲基羅丹明、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料構(gòu)成的熒光素衍生物，優(yōu)選6-羧基熒光素[FAM];并且猝滅劑選自包含以下的組中四甲基羅丹明(tetra methyl rhodamine)、4’-(4_ 二甲基氛基苯偶?xì)饣?苯甲酸、4_ 二甲基氛基苯基偶氮苯基-4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、羧基四甲基羅丹明和黑洞淬滅劑1[BHQ]染料，優(yōu)選黑洞淬滅劑I (BHQ1)。本公開(kāi)涉及用于檢測(cè)登革熱感染的試劑盒，所述試劑盒包括具有選自包含SEQ IDNo.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合，可選地在5’和3’端進(jìn)行標(biāo)記，具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的探針；以及擴(kuò)增試劑，可選地連同說(shuō)明書(shū)。在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式中，探針與在5’端具有熒光團(tuán)且在3’端具有猝滅劑的可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合；并且擴(kuò)增試劑選自包含氯化鎂、Taq聚合酶和緩沖液或它們的任意組合的組中。本公開(kāi)涉及用于檢測(cè)登革熱感染的試劑盒的組裝方法，所述方法包括將以下進(jìn)行組合的步驟具有選自包括SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合；具有如SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列的引物；以及擴(kuò)增試劑，可選地連同說(shuō)明書(shū)。詵擇用于引物和探針設(shè)計(jì)的區(qū)域
在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)在所有四種血清型中保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針。具有SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2的探針連同具有SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4的引物可以檢測(cè)所有4種登革熱病毒的血清型。本公開(kāi)的目標(biāo)是通過(guò)從感染的人的感染的血液、血清或血漿中分離的RNA檢測(cè)由登革熱病毒引起的登革熱病毒感染。檢測(cè)的模式是使用以熒光團(tuán)和猝滅劑標(biāo)記的“寡核苷酸”探針由即時(shí)PCR監(jiān)測(cè)熒光的增加。本公開(kāi)是關(guān)于使用寡核苷酸探針和它們各自的引物采用即時(shí)PCR方法對(duì)登革熱病毒感染的檢測(cè)。上述提到的“寡核苷酸”探針與在5’端的熒光團(tuán)和在3’端的猝滅劑結(jié)合。本發(fā)明中所使用的熒光團(tuán)是FAM (6-羧基熒光素)。除了 6-羧基熒光素，其他選自包括熒光素和熒光素衍生物FAM、VIC、J0E、5- (2’ -氨基乙基)氨基萘_1_磺酸、香豆素和香豆素衍生物、熒光黃、得克薩斯紅、四甲基羅丹明、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組中的熒光團(tuán)也可以用于標(biāo)記。
本發(fā)明中所使用的猝滅劑是BHQl (黑洞淬滅劑I)。除了 BHQl外其他選自包含四甲基羅丹明(Tetra Methyl Rhodamine)、4’-(4_ 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4_ 二甲氨基苯基偶氮苯基_4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、羧基四甲基羅丹明和BHQ染料的組中的猝滅劑也可以用于標(biāo)記。在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式中所述熒光團(tuán)是6-羧基熒光素[FAM]且當(dāng)猝滅劑出現(xiàn)于3’端時(shí)其是黑洞淬滅劑I [BHQ1]。根據(jù)本公開(kāi)，由SEQ ID NO.1或SEQ ID No. 2設(shè)計(jì)的探針連同如SEQ ID No. 3及SEQ ID No. 4設(shè)計(jì)的引物被設(shè)計(jì)用于登革熱病毒感染的檢測(cè)。本公開(kāi)涉及用于檢測(cè)登革熱病毒感染的方法，其中，所述PCR混合物包含核酸擴(kuò)增試劑、如SEQ ID NO.1或SEQ ID No. 2設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針連同與它們相應(yīng)的引物和提供的登革熱RNA樣品用于使用即時(shí)PCR擴(kuò)增以獲得目標(biāo)序列的拷貝。根據(jù)熒光信號(hào)增加測(cè)量擴(kuò)增并且將產(chǎn)生的信號(hào)的量與未感染的樣品進(jìn)行比較。登革熱感染的檢測(cè)隨后通過(guò)可選的由檢測(cè)的信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以獲得用于量化登革熱感染的拷貝數(shù)。根據(jù)本公開(kāi)，寡核苷酸探針具有范圍從24至25個(gè)核苷酸的尺寸。設(shè)計(jì)的探針在5’端具有熒光團(tuán)且在3’端具有猝滅劑。在5’端的熒光團(tuán)是FAM (6-羧基熒光素)且當(dāng)出現(xiàn)在3’端時(shí)猝滅劑是黑洞淬滅劑 I [BHQlJ0本公開(kāi)用于使用從血液、血清或血漿樣品中分離的RNA對(duì)由登革熱病毒引起的登革熱病毒感染的檢測(cè)。用于檢測(cè)的方法是使用即時(shí)PCR。根據(jù)本公開(kāi)，“寡核苷酸探針”涉及脫氧核糖核酸(DNA)的短序列。寡核苷酸探針可以與目標(biāo)DNA特異性地雜交而不表現(xiàn)出與未受感染的DNA的非特異性雜交。此處使用的探針遵循Taqman化學(xué)原理。TaqMan探針也被稱(chēng)為雙染料寡核苷酸或雙標(biāo)記探針，是最廣泛使用的探針類(lèi)型。根據(jù)本公開(kāi)的寡核苷酸探針進(jìn)一步配備有各自的正義和反義引物，其可用于通過(guò)即時(shí)PCR特異性擴(kuò)增和檢測(cè)由登革熱病毒引起的登革熱病毒感染。如上述要求保護(hù)的引物具有從18至19個(gè)核苷酸的尺寸范圍。用于檢測(cè)登革熱病毒感染的相應(yīng)的探針和引物序列如表I中所示。表I
權(quán)利要求
1.具有如SEQID No.1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列的探針，可選地與可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中，所述探針用于檢測(cè)登革熱感染；并且其中，所述可檢測(cè)標(biāo)簽是在5’端的熒光團(tuán)和在3’端的猝滅劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其中，所述熒光團(tuán)選自包含以下的組中熒光素，由 6_羧基熒光素[FAM]、VIC、J0E、5-(2’_氨基乙基)氨基萘_1_磺酸、香豆素和香豆素衍生物、熒光黃、得克薩斯紅、四甲基羅丹明、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料組成的熒光素衍生物，優(yōu)選6-羧基熒光素[FAM];并且所述猝滅劑選自包含以下的組中四甲基羅丹明、4’ -(4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4- 二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明和黑洞猝滅劑1[BHQ]染料，優(yōu)選黑洞猝滅劑I (國(guó)1)。
4.具有如SEQID No. 3或SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物，其中，具有SEQID No. 3的所述引物是正義引物而具有 SEQ ID No. 4的所述引物是反義引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物，其中，所述引物與具有SEQID No.1或SEQ ID No. 2的探針相對(duì)應(yīng)；并且其中，所述引物與任一具有SEQID No.1或SEQ ID No. 2的所述探針組合使用。
7.一種用于檢測(cè)登革熱感染的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含核酸擴(kuò)增試劑、具有選自包含SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合；以及具有如SEQ ID No. 3和SEQID No. 4所示的核苷酸序列的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反應(yīng)混合物，其中，具有SEQID No. 3的所述引物是正義引物而具有SEQ ID No. 4的所述引物是反義引物；并且所述探針與在5’端具有熒光團(tuán)和在3’ 端具有猝滅劑的可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反應(yīng)混合物，其中，所述引物與具有SEQIDNo.1或SEQ ID No. 2的探針相對(duì)應(yīng)；并且其中所述引物與任一具有SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2的所述探針組合使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反應(yīng)混合物，其中，所述登革熱感染是從選自包含血液、血漿和血清或它們的任何組合的組中的樣品中檢出的；并且所述擴(kuò)增試劑選自包含氯化鎂、 Taq聚合酶和緩沖液或它們的任何組合的組中。
11.一種檢測(cè)和可選地量化登革熱感染的方法，所述方法包括以下操作(a)獲得包含核酸擴(kuò)增試劑、選自包含SEQ ID No.1和SEQ IDNo. 2的組中的探針、和具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物的PCR反應(yīng)混合物；(b )將檢測(cè)樣品弓I入至所述PCR反應(yīng)混合物用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得目標(biāo)序列的拷貝， 接著檢測(cè)產(chǎn)生的熒光信號(hào)以檢測(cè)所述登革熱感染；以及(c)可選地，由所檢測(cè)信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量所述登革熱感染。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，具有SEQID No. 3的所述引物是正義引物而具有SEQ ID No. 4的所述引物是反義引物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述引物與具有SEQID No.1或SEQ ID No. 2 的探針相對(duì)應(yīng)；并且其中所述引物與任一具有SEQID No.1或SEQ ID No. 2的所述探針組合使用。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述檢測(cè)樣品選自包含血液、血漿和血清或它們的任何組合的組中；并且所述擴(kuò)增試劑選自包含氯化鎂、Taq聚合酶和緩沖液或它們的任何組合的組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述探針與在5’端具有熒光團(tuán)和在3’端具有猝滅劑的可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合；并且所述熒光信號(hào)由在5’端具有熒光團(tuán)和在3’端具有猝滅劑的所述探針產(chǎn)生。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述熒光團(tuán)選自包含以下的組中熒光素，由 6-羧基熒光素[FAM]、VIC, J0E、5-(2’ -氨基乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素和香豆素衍生物、熒光黃、得克薩斯紅、四甲基羅丹明、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料組成的熒光素衍生物，優(yōu)選6-羧基熒光素[FAM];并且所述猝滅劑選自包含以下的組中四甲基羅丹明、4’ -(4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4- 二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’ -馬來(lái)酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明和黑洞猝滅劑1[BHQ]染料，優(yōu)選黑洞猝滅劑I (國(guó)1)。
17.一種用于檢測(cè)登革熱感染的試劑盒，所述試劑盒包括具有選自包含SEQ ID No.1和 SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合，可選地在5’端和3’端標(biāo)記；具有如SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列的引物；以及擴(kuò)增試劑，可選地連同說(shuō)明書(shū)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述探針與在5’端具有熒光團(tuán)和在3’端具有猝滅劑的可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合；并且所述擴(kuò)增試劑選自包含氯化鎂、Taq聚合酶和緩沖液或它們的任何組合的組中。
19.一種用于檢測(cè)登革熱感染的試劑盒的組裝方法，所述方法包括將以下進(jìn)行組合的步驟具有選自包含SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2的組中的核苷酸序列的探針或其探針的組合；具有如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的引物；以及擴(kuò)增試劑，可選地連同說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本公開(kāi)提供了通過(guò)使用寡核苷酸探針，利用從血液、血漿或血清樣品中分離的核酸，用于檢測(cè)和量化由登革病毒引起的登革熱病毒感染的方法的描述。此處采用的用于檢測(cè)的方法是通過(guò)即時(shí)PCR。本公開(kāi)還提供了引物、探針、PCR反應(yīng)混合物和它們的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103025893SQ201180036713
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者曼尤拉·賈甘納特, 馬諾杰·穆拉克卡普斯·納拉亞南, 錢(qián)德拉塞克哈爾·布哈斯卡拉恩·奈爾, 皮拉里塞蒂·文卡塔·蘇巴拉奧 申請(qǐng)人:彼格泰格私人有限公司