專利名稱：原伊魯烯合酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新鑒別的多核苷酸以及由這種多核苷酸編碼的多肽，并且涉及它們的生產和應用，以及它們的變異體和變異體的應用。此外，本發(fā)明涉及一種通過使用所述新鑒別的多核苷酸/多肽用于生產蜜環(huán)菌戊素(melleolide)和相關真菌倍半萜芳香酯的方法。
背景技術：
蜜環(huán)菌戍素是由蜜環(huán)菌屬(genus Armillaria)的同擔子菌(homobasidiomyceste)產生的特有的次級代謝產物,所述蜜環(huán)菌屬的同擔子菌的種類不僅被認為是可食用的蘑菇，并且許多種類也是眾所周知的森林寄生物，反映了它們形成使得它們能夠在營養(yǎng)貧乏地區(qū)生長的根狀菌束的能力。蜜環(huán)菌戊素是原伊魯烯(protoilludene)型倍半萜并且具有有效的抗微生物和細胞毒素活性。至今為止，大約有50種已知的蜜環(huán)菌戊素并且它們幾乎全部由這種真菌菌屬產生。每個分子包含通過酯鍵連接至類苔色酸聚酮側鏈上的三環(huán)的倍半萜骨架。原伊魯烯的生物合成被認為包括使常見的倍半萜前體二磷酸法呢基酯環(huán)化成原伊魯烯，隨后由細胞色素P450單氧酶進一步修飾，隨后連接聚酮側鏈。雖然在過去已經廣泛研究了一些萜烯，特別是來自植物的萜烯，例如薄荷醇、青蒿素(artemisinin)或紫杉醇(taxol) 的生物合成,關于絕大多數(shù)職烯,特別是由真菌產生的萜烯的合成還知之甚少。所有萜烯的生物合成都以三種常見前體之一的環(huán)化和重排起始(二磷酸香葉基酯(geranyl diphophate, 二磷酸物牛兒基酯),二磷酸法呢基酯(farnesyl diphosphate)或二磷酸香葉基香葉基酯(geranylgeranyl diphosphate, 二磷酸物牛兒基物牛兒基酯),從而分別產生單萜，倍半萜或雙萜。這些由萜烯合酶催化的環(huán)化反應，是自然界中已知的最復雜的化學反應。通常，植物和真菌的萜烯合酶僅顯示較低水平的序列一致性，并且盡管已經從植物中分離了數(shù)種萜烯合酶，僅報道了來自微生物的少數(shù)的萜烯合酶。并且，僅非常有限數(shù)量的真菌倍半萜合酶已被克隆以及功能性表征，包括，例如，單端孢霉烯(木霉二烯，trichodiene)合酶、馬5 鈴烯(aristolochene)合酶、以及 presilphiperfolan_8b-醇合酶。此外，近來已經表征了來源于灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea， Coprinus cinereus)的六種倍半胳合酶，產生了大根香葉烯A (germacrene Α)、α -衣蘭油烯(a-muurolene)、δ-杜松烯(δ-cadinene)、以及α-叩卜任烯(α-cuprenene)作為主要產物。認為原伊魯烯型倍半萜(也稱為蜜環(huán)菌戊素，參見上文)的生物合成包括使常見的倍半萜前體二磷酸法呢基酯環(huán)化成原伊魯烯，隨后由細胞色素P450單氧酶進一步修飾，隨后連接聚酮側鏈。因為在藥學中，特定的蜜環(huán)菌戊素由于它們的抗微生物和細胞毒性活性引起了人們的高度關注，因此，將期望以可控制的方式來特異性地生產和富集它們。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種新工具，通過該工具可以實現(xiàn)同源或異源的靶向生產。根據(jù)本發(fā)明，這個目的和其他目的通過提供一種分離的或合成的或重組的編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽并且包括選自由以下各項所組成的組中的序列的多核苷酸來實現(xiàn)a)隨附的序列表中的 SEQ ID No:l 或 SEQ ID No:14 ；b)與 SEQ ID No:1 或 SEQ ID No: 14 互補的核酸序列；c)在嚴格條件下與a)和b)中定義的核酸序列或它們的互補鏈雜交的核酸序列。這些目的進一步通過使用所述多核苷酸或由所述多核苷酸編碼的用于生產蜜環(huán)菌戊素的多肽，以及通過用于生產蜜環(huán)菌戊素的各自方法來實現(xiàn)。以這種方式完全實現(xiàn)了這些目的。上述多核苷酸編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽，根據(jù)發(fā)明人的知識，這是首次鑒別、純化以及酶學表征的。這種 新鑒別的多核苷酸催化二磷酸法呢基酯環(huán)化成原伊魯烯，該步驟是蜜環(huán)菌戊素生產合成中的關鍵步驟。因此，通過鑒別編碼原伊魯烯合酶的基因，已經發(fā)現(xiàn)并產生了有價值且有效的工具以影響蜜環(huán)菌戊素的生產，例如，通過過表達這種新鑒別的基因以產生多拷貝的原伊魯烯合酶，通過這種方法提高了蜜環(huán)菌戊素合成的環(huán)化速率，并且因此，增加蜜環(huán)菌戊素的產量。以此方式，可以獲得高度富集的蜜環(huán)菌戊素，它們是有效的抗微生物劑和細胞毒性物質，并且可以用作治療和藥學的所有不同領域中的治療工具。根據(jù)本發(fā)明，術語“一種或多種多核苷酸”通常指任何一種多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA?！耙环N或多種多核苷酸”包括，但不局限于，單鏈和雙鏈DNA ;單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)或單鏈區(qū)、雙鏈區(qū)和三鏈區(qū)的混合物的DNA ;單鏈和雙鏈RNA ;單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物的RNA ;包括DNA和RNA的雜交分子，所述DNA和RNA可以是單鏈區(qū)或，更典型地，雙鏈區(qū)或三鏈區(qū)，或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。此夕卜，在本文中使用的“多核苷酸”是指包含DNA或RNA或DNA和RNA兩者的三鏈區(qū)。在這些區(qū)中的鏈可以來自同一分子或來自不同分子。這些區(qū)可以包括所有的一種或多種的分子，但是更典型地涉及一些分子中的僅一個區(qū)域。三螺旋區(qū)的分子中的一種通常是寡核苷酸。在本文中使用的，術語“一種或多種多核苷酸”還包括上述的包含一種或多種修飾的堿基的DNA或RNA。因此具有針對穩(wěn)定性或其他原因而修飾的主鏈的DNA或RNA是該術語在本文中所希望的“一種或多種多核苷酸”。此外，包含不常見堿(如次黃嘌呤核苷)，或修飾的堿基(如三苯甲基化的堿基)(此處僅是給出兩個實例)的DNA或RNA，是如在本文中使用的術語的“多核苷酸”。應當理解的是為了本領域技術人員已知的多種有用的目的，已對DNA及RNA做出很多種修飾。如在本文中使用的，術語“一種或多種多核苷酸”包含這些多核苷酸的化學修飾、酶修飾或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞(包括例如，簡單細胞和復雜細胞)特有的DNA和RNA的化學形式。同樣，“一種或多種多核苷酸”還包括通常稱為一種或多種寡核苷酸的短多核苷酸?！耙环N或多種多肽”是指包含通過肽鍵或修飾的肽鍵連接彼此的兩個以上氨基酸的任何肽或蛋白質?！耙环N或多種多肽”是指通常稱為肽、低聚肽和低聚物的短鏈以及通常稱為蛋白質的長鏈兩者。多肽可以含有除了 20種基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！耙环N或多種多肽”包括通過天然過程，例如處理(processing)和其他翻譯后修飾,或通過化學修飾技術來修飾的那些。這些修飾在基礎課本中，并且在更詳細說明的專著中，以及在大量的研究文獻中進行了充分地說明，并且它們是本領域技術人員熟知的。應當理解的是在給定多肽中的數(shù)個位點上可以相同或不同程度地存在同一種類型的修飾。同樣，給定的多肽可以包含多種類型的修飾。修飾可以發(fā)生在多肽中的任何位置，包括肽主鏈、氨基酸側鏈、以及氨基或羧基端。修飾包括，例如，乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷或核苷衍生物的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲?；?、Y-羧基化、糖基化、GPI錨定(anchor)的形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蘧?；?、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、糖基化、脂質連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y -羧基化、羥基化和ADP-核糖基化、硒基化、硫酸化、轉運RNA介導的氨基酸添加到蛋白上如精氨酸化和泛素化。多肽可以是支鏈的或含有或不含有支鏈的環(huán)狀的。環(huán)狀的、支鏈的和具有支鏈的環(huán)狀多肽可以由翻譯后的天然過程產生，也可以完全由合成方法制造?！胺蛛x的”是指“通過人工”從其天然狀態(tài)改變，S卩，如果它在自然界中發(fā)生，則將其改變或從其原始環(huán)境中移開，或兩者。例如，天然存在于生命有機體中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，然而從其天然狀態(tài)的共存物中分離的相同的多核苷酸或多肽是“分離的”(如在本文中使用的術語)。類似地，如在本文中使用的術語“合成的”序列，是指合成產生的以及未與天然來源直接分離的任何序列?！爸亟M體”是指通過將來自一個物種的基因移植或剪接到不同物種的宿主有機體的細胞中而制備的基因工程化的DNA。這種DNA成為宿主基因結構的一部分并被復制。如在本文中使用的術語“編碼多肽的多核苷酸”包括含有編碼本發(fā)明的多肽的序列的多核苷酸，具體地是具有如在SEQ ID No:2中給出的氨基酸序列的高盧蜜環(huán)菌的原伊魯烯合酶。該術語還包括含有編碼多肽的單個連續(xù)區(qū)或不連續(xù)區(qū)(例如，被結合的噬菌體或插入序列中斷或編輯)連同也可以包含編碼和/或非編碼序列的另外的區(qū)的多核苷酸。如在本文中使 用的術語“一種或多種變異體”是分別地與參照多核苷酸或多肽不同的，但保留了基本性質的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型變異體在核酸序列上與另一種參照多核苷酸不同。變異體的核苷酸序列的改變可以或不可以改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改變可以導致由參照序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添力口、缺失、融合、和截短(如下討論的)。多肽的典型變異體在氨基酸序列上與另一種參照多肽不同。通常地，差異是有限的使得參照多肽和變異體的序列整體上非常相似，并且在許多區(qū)域上完全相同。變異體與參照多肽在氨基酸序列上能夠以任意組合形式相差一個或多個取代、添加、缺失。取代的或插入的氨基酸殘基可以或不可以是由遺傳密碼編碼的。多核苷酸或多肽的變異體是可以天然發(fā)生的，如等位基因變異體，或它可以是未知天然發(fā)生的變異體。多核苷酸和多肽的非天然發(fā)生的變異體可以通過誘變技術、通過直接合成以及通過本領域技術人員已知的其他重組方法來制備。此外，目前將術語“宿主細胞”定義為已被轉化或轉染的細胞，或能夠被外源性多核苷酸序列轉化或轉染的細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，分離的多核苷酸由SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14組成并且編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽。SEQ ID No:1表示基因組序列，而SEQ ID No:14表示 cDNA。如隨附的序列表中公開的SEQ ID No:1和SEQ ID No: 14分別是由高盧蜜環(huán)菌鑒別和表征的原伊魯烯合酶的基因組序列和cDNA。應當理解的是具有至少90%的序列一致性，以及甚至在其他蜜環(huán)菌種類中可以發(fā)現(xiàn)的它們的變異體，也是適宜的并且是本發(fā)明的一部分，因為使用這種新鑒別的原伊魯烯合酶，通過類似的原伊魯烯合酶提供了有價值的工具，即通過序列比較和隨后的酶學測試可以鑒別與SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14稍有區(qū)別的原伊魯烯合酶。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體基因工程化的宿主細胞以及通過重組技術生產本發(fā)明的多肽。還可以使用來源于本發(fā)明的DNA構建體(construct)的RNA序列,使用無細胞翻譯系統(tǒng)來生產這類多肽。因此并且另外地，本發(fā)明還涉及包含編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽的如上文定義的核酸序列的載體，該核酸序列可操作地連接至由載體轉化的宿主細胞識別的調控序列上。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，載體是表達載體，并且根據(jù)另一個方面,載體能夠以質粒、粘粒(cosmid)、噬菌體、脂質體、或病毒的形式存在。對于重組體生產而言，宿主細胞可以被基因工程化以結合本發(fā)明的表達系統(tǒng)或它們的部分或多核苷酸。將多核苷酸引入宿主細胞中可以通過在許多標準實驗手冊中描述的方法實現(xiàn)，例如 Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology, (1986),和 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。因此，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，可以例如包含在將穩(wěn)定地轉化/轉染到宿主細胞中的載體中。在該載體中，本發(fā)明的多核苷酸在誘導性啟動子的調控下，使得該基因/多核苷酸的表達可以是特異性靶向的，并且，如果希望的話，該基因能夠以這種方式過表達。很多種表達系統(tǒng)可 以用于生產本發(fā)明的多肽。這些載體，除了別的之外，還包括染色體載體、游離型載體、以及源于病毒的載體，例如，來源于細菌質粒、噬菌體、轉座子、酵母游離基因(yeast episome)、插入元件(616!116111:)、酵母染色體元件、病毒的載體，以及來源于它們的組合的載體，如來源于質粒和噬菌體基因元件的載體，如粘粒和噬菌粒。表達系統(tǒng)構造物可以包含調控以及引起表達的調控區(qū)。通常地，適宜在宿主中保持、增殖、或表達多核苷酸和/或表達多肽的任何系統(tǒng)或載體可以用于這個方面的表達。適當?shù)腄NA序列可以通過多種已知的和常規(guī)的技術中任何一種插入表達系統(tǒng)中,像例如,在Sambrook等人中提出的那些(參見上文)。由以上可見，本發(fā)明還涉及由選自由以下各項組成的組中的氨基酸序列組成的分離的肽a)在SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列；b)在SEQ ID N0:2中示出的氨基酸序列的等位基因變異體的氨基酸序列，其中，所述等位基因變異體由在嚴格條件下與SEQ ID No:l或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反鏈雜交的核酸分子編碼；c)在SEQ ID N0:2中示出的氨基酸序列的直系同源體(ortholog)的氨基酸序列，其中所述直系同源體由在嚴格條件下與在SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反鏈雜交的核酸分子編碼；以及d)在SEQ ID NO: 2中示出的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括至少10個連續(xù)
的氨基酸。同樣，本發(fā)明涉及包含如上文定義的載體的宿主細胞，具體地為選自由以下組成的組中的宿主細胞包括酵母的真菌、細菌、昆蟲、動物、和植物細胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，使用了宿主細胞，其中編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽的核酸適合各宿主細胞的密碼子使用。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，宿主細胞是同擔子菌(homobasidiomyceste),具體地是蜜環(huán)菌屬的同擔子菌，具體地是高盧蜜環(huán)菌(Armillaria gallica)、蜜環(huán)菌(Armillaria mellea)、奧氏蜜環(huán)菌(Armillaira ostoyae)、和蜜環(huán)菌屬中的其他成員。本發(fā)明的又一個方面涉及用于生產蜜環(huán)菌戊素的方法，包括以下步驟a、在允許生產蜜環(huán)菌戊素的適宜營養(yǎng)條件下使如上文定義的宿主細胞生長；以及b、從宿主細胞或其生長的培養(yǎng)基中分離所述蜜環(huán)菌戊素。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，蜜環(huán)菌戊素選自蜜環(huán)菌戊素1、蜜環(huán)菌乙素(亮菌甲素，armillaridine)、蜜環(huán)菌戊素A、蜜環(huán)菌戊素F、蜜環(huán)菌戊素B、蜜環(huán)菌戊素K、扁枝衣酸蜜環(huán)基酯(armillyl evernitate)、蜜環(huán)菌甲素(31'111；[1131'；[11)、蜜環(huán)菌醇(31'的111；
從實施方式和附圖的說明中得到另外的優(yōu)點。不言而喻地，在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，上述特征和以下還將解釋的特征不僅能夠以各自特定的組合使用，而且也能夠以其他組合或它們自身地使用。


在附圖中示出了并在以下描述中更詳細地解釋了本發(fā)明的一些實施方式。在附圖中圖1示出了蜜環(huán)菌戊素I生物合成的方案，包括二磷酸法呢基酯環(huán)化成6-原伊魯烯、氧化反應、以及側鏈連接；圖2是浸在培養(yǎng)物有機提取物中的高盧蜜環(huán)菌菌株FU02472的HPLC分析。使用可用的標準，將觀測到的化合物峰中的兩個鑒別為蜜環(huán)菌戊素I和蜜環(huán)菌乙素；圖3是用于證實在大腸桿菌中表達的Prol克隆具有原伊魯烯合酶活性的非放射性和放射性測試。Α/B)氣相色譜示出了在保留時間8. 77分鐘下具有特征質譜的峰。A)表達Prol的大腸桿菌克隆的提 取物。B)高盧蜜環(huán)菌菌絲體的提取物。C-F)放射性TLC (薄層色譜)測定虛線/點線是起始，虛線是溶劑前沿。C)大腸桿菌pUC19陰性對照。D)用[1-3HJ-GGPP (二萜烯合酶的底物)溫育的大腸桿菌Prol克隆。E)用[1」H]-FPP溫育的大腸桿菌Prol克隆。F)高盧蜜環(huán)菌，陽性對照；圖4是真菌倍半萜合酶的推測的氨基酸序列比對。對比了高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合酶(克隆 Prol;SEQ ID No:2)、灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea)衣蘭油烯合酶(Cop3 ;SEQID如12〃(0 3〃)和(0 5 (具有尚未知曉產物的倍半萜合酶；SEQ ID No: 13〃Cop5〃)的序列。黑框表示三種序列中相同的殘基；灰框表示三種序列中兩種序列相同的殘基。B)示意性地示出了具有顯示為黑框的外顯子和保守的DEXXD和NDxxSxxxE基序的高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合酶的基因組序列。圖5是通過DNA印跡雜交確定高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合酶的基因拷貝數(shù)。在BamHI和EcoRI泳道中可觀察到一條明顯的條帶(這兩種酶在基因組克隆中都沒有靶向部位)，然而在HindIII泳道中可觀察到二條條帶(在克隆中存在二個靶向部位，相距85bp)。在圖1中，示出了蜜環(huán)菌戊素I生物合成的似乎合理的方案，包括將二磷酸法呢基酯環(huán)化成6-原伊魯烯、氧化反應、和側鏈連接。
具體實施例方式實施例1 :蛋白提取物的產牛高盧蜜環(huán)菌菌株FU02472是由在奧地利的Traunsee附近收集的擔子果建立的，并在23° C下以及在140rpm的攪拌下，在浸在多個批次的包含200mL的YMG培養(yǎng)基500mL的Erlenmeyer搖瓶中的培養(yǎng)物中增殖。通過過濾從培養(yǎng)肉湯中獲得菌絲體，用液氮快速冷凍并存儲在-80° C下。連同Gateway 相容載體pDEST14 (Invitrogen) 一起，大腸桿菌菌株 TOPlO (Invitrogen, Karlsruhe,德國)用于克隆，大腸桿菌菌株 BL21 (DE3) CodonPlus(Agilent, Karlsruhe,德國)用于異源蛋白表達。為了生產來自蜜環(huán)菌的蛋白提取物，將高盧蜜環(huán)菌細胞培養(yǎng)物在用液氮冷凍的研缽中磨碎。將五倍體積的提取緩沖液(50mM的MES、20mM的MgCl2、5mM的2-巰基乙醇、10%(v/v)丙三醇和O. lg/g的菌絲體PVPP,pH6. 5)加入粉末中。在用Ultraturrax (12，OOOrmp持續(xù)I分鐘)另外地處理后，通過離心凈化蛋白提取物(在4° C下5，OOOrmp持續(xù)10分鐘)。通過Quick Start Bradford Protein Assay (Biorad)來測定蛋白質的濃度。所有蛋白質
定量測定進行三次。通過將培養(yǎng)的細胞顆粒再溶解于所述的提取緩沖液中來制備大腸桿菌蛋白提取物，并且在持續(xù)冷卻下通過兩輪微流化器處理將細胞溶解。使用處于測定緩沖液(50mM的M0PS、20mM的MgCl2、5mM的2-巰基乙醇，pH7. 2)中的[1- ]-二磷酸法尼基脂(FPP) (20Ci/mmol) (Biotend)來測定原伊魯烯合酶的活性。用500nM的[1-3H] -FPP持續(xù)2分鐘隨后用乙酸乙酯冷激來進行標準原伊魯烯合酶活性的測定。然后在放射性TLC讀取器(Raytest, Straubenhardt)中分析之前,將部分有機提取物點樣到硅膠TLC板上，并使用9:1的環(huán)己烷乙酸乙酯作為溶劑進行分離。為了確定Km值，通過用IOOmM的EDTA (最終濃度)冷激來中止反應，隨后用正戊烷萃取，通過硅膠柱色譜(層析,chromatography)純化以及通過液體閃爍計數(shù)定量。所有動力學活性測定均進行三次。溶劑提取物的質譜分析在安裝有Rxi -5ms (O. 25mm ID,長30m)柱(Restek)的QP2010S四級桿質譜儀(Shimadzu)上進行，使用以下溫度程序80° C持續(xù)20分鐘，隨后以15° C/min的速率將柱加熱至300° C，將300° C的最終恒定溫度保持4分鐘。在IkeV下通過電離完成碎片化。實施例2 cDNA庫的構律和測序根據(jù)生產商的方案，使用氯化銫密度梯度以及通過Oligotex (Qiagen, Hilden)純化的高盧蜜環(huán)菌菌株FU02472的mRNA，來構建高盧蜜環(huán)菌CloneMiner cDNA庫(Invitrogen)0在含有50 μ g/mL卡那霉素的2YT-瓊脂平板上選擇重組大腸桿菌，將2800個隨機挑取的克隆轉移至包含200 μ L的2ΥΤ培養(yǎng)基/孔的96-孔微量滴定板中，使用50 μ g/mL卡那霉素進行選擇。在37° C下在160rpm持續(xù)搖動下溫育這些板約12小時。使用正向引物 5’-CTC GCG TTA ACG CTA GCA TGG ATG-3’ (SEQ ID No:3)和反向引物 5’-GTGAGT CGT ATT ACA TGG TCA TAG CTG-3’ (SEQ ID No:4)直接從培養(yǎng)物中擴增高盧蜜環(huán)菌cDNAo 清洗 PCR 產物并在 Applied Biosystems3730DNA 分析儀上使用引物 5’-CGA CGG CCAGTC TTAAGC TCG GGC-3，(SEQ ID No:5)測序(Fraunhofer IME Aachen, Functional andApplied Genomics Group)。使用 CLC Combined Workbench3 軟件(CLC bio)、LasergenePackage (DNASTAR) NCBI BLASTx、和 Local BLAST 來分析序列數(shù)據(jù)。.實施例3 :大腸桿菌中異源表達高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合酶當cDNA測序鑒別潛在的萜烯合酶克隆時，在包含pDESTl目標載體的LR重組反應中使用相應的PENTRY載體。然后將得到的表達構建體引入大腸桿菌BL21(DE3)Codon plus細胞(Stratagene)中用于異源表達。在 Ferenbach 擋板燒瓶(Ferenbach-baffled flask)中培養(yǎng)重組細菌并且當OD6tltl達到0. 5時用ImM的IPTG誘變。在28° C下在160rpm下持續(xù)振蕩下保持誘變的細菌持續(xù)8小時。然后通過離心收集細胞，重懸在原伊魯烯測定緩沖液中，并使用微流化器(microfIuidizer)溶解。實施例4 :基因組DNA的分離和DNA印跡雜交使用溴化十六烷基三甲基銨(CT AB)法來分離高盧蜜環(huán)菌基因組DNA，并且適當時用50單位的BamH1、EcoRI或HindIII (NEB Biolabs)來消化120 μ g持續(xù)8小時。在恒定的50V下通過O. 7%瓊脂糖凝膠電泳來將消化的DNA分級過夜，將其轉移至帶有正電荷的尼龍膜(Roche)上并與含有單鏈的鮭魚精子DNA的Roti -Hybr1-Quiek(Roth)預雜交。使用針對探針 I 的正向引物 5’-CCT TCC TGA TAC TCT TGC CAA CTG-3’(SEQID No:6)和反向引物 5’-CCT CCT CCG TCG AGA CGT CCG AGT AC-3’ (SEQ ID No:7)，以及針對探針 2 的正向引物 5’-GTC ATC AAT CAT CCGGTT ATC AAA G_3’ (SEQ ID No:8)和反向引物 5’-CTT GGGCAT CAGCGT TAT CCA CCT C_3，(SEQ ID No:9)，通過PCR合成兩個核酸探針(約 400bp)。根據(jù)生產商的建議，使用DecaLabel DNA標記試劑盒(Fermentas),用a -32P-dATP(HartmannAnalytic)來標記這些產物。 實施例5 :高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合酶基因組克隆的分離在50-1 的反應中，使用正向引物 5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAAAAA AGC AGG CTTCGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC TCA ACG CATCTT CCT TCC TG-3’ (SEQ ID No: 10)，反向引物 5’-GGG GAC CAC TTTGTA CAA GAA AGC TGG GTT TAG AGA TGA MT CCG TCA ACA ATTTGAGG-3’ (SEQ ID No: 11)以及Hei’culase II Fusion DNA 聚合酶(Stratagene),通過擴增IOOng的高盧蜜環(huán)菌基因組DNA來分離包含高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合酶基因的基因組克隆。如上所述，純化PCR產物并測序。實施例6 :結果和討論:通過由奧地利的·Traunsee附近收集的蘑菇種類建立細胞培養(yǎng)物(FU02472)，來分離并且表征推測的蜜蘑菇(honey mushroom)(高盧蜜環(huán)菌)原伊魯烯合酶。在允許生產蜜環(huán)菌戊素的液體YM6. 3培養(yǎng)基中培養(yǎng)該培養(yǎng)物。在約500小時的發(fā)酵后，收獲培養(yǎng)物并使用適當?shù)膮⒄瘴锿ㄟ^LC-UV-MS來測定蜜環(huán)菌戊素產物的曲線。由FU02472生產的主要蜜環(huán)菌戊素被鑒定為蜜環(huán)菌戊素I和蜜環(huán)菌乙素(參見圖2)。通過在不同的時間點對培養(yǎng)物取樣，隨時間對蜜環(huán)菌戊素的積累曲線和原伊魯烯合酶活性進行研究。通過將來自培養(yǎng)物中可溶性酶提取物與放射性標記的二磷酸法呢基酯共同溫育來測試酶活性。然后通過放射性TLC來分析來自這些反應的有機提取物(參見圖3)。在我們測試的全部粗蛋白提取物中觀察到可變水平的原伊魯烯合酶活性，產生了 Rf值為O. 7 (暫時鑒定為6-原伊魯烯)的強非極性產物，以及Rf值為O.1的產物(暫時鑒定為法呢醇)。隨后通過GC-MS來證實這兩種產物的身份(參見下文)。熱不能活化的對照部分不能將二磷酸法呢基酯轉化為非極性產物。在185小時后在培養(yǎng)物中觀察到最高的原伊魯烯合酶活性，因此選擇該時間點用于酶純化。接下來，確定在可溶性蛋白部分中推測的原伊魯烯合酶活性是否確實是由于在真菌提取物中存在的原伊魯烯合酶活性。因此，用氚標記物標記(spike )冰冷的二磷酸法呢基酯并且使其與來自FU02472的可溶性蛋白提取物一起溫育12小時。然后，通過放射性TLC和GC-MS分析放射性物質部分以證實Rf值以及產物的身份(identity)。提取產物的質譜產生 m/zl75 (100%)、119 (91%)、105 (59%)、133 (35%)、91 (40%)、189 (17%)、161 (15%)、和 147(14%)的離子，分子母體離子為m/z204 (24%)。觀察到的碎片圖譜與之前針對倍半萜6-原伊魯烯的報道相匹配(參見圖2)。出乎意料地，GC-MS分析沒有顯示7-原伊魯烯的存在，表明如在最終的蜜環(huán)菌戊素最終產物中觀察到的，發(fā)生了從6(7)至7(8)位置的烯丙基重排。類似的烯丙基重排已在用于將紫杉-4 (5),11 (12) - 二烯轉化為紫杉-4 (20)，11 (12) - 二烯轉化為紫杉-4 (5)，11 (12) - 二烯-5-醇的紫杉醇合成中進行了描述，該反應是由細胞色素P450依賴的單氧酶催化的(Jennewein et al.,2004)。因此，申請人提出，在蜜環(huán)菌戍素的生物合成期間，包括催化烯丙基重排和羥基化反應兩者的類似的細胞色素P450依賴的單氧酶步驟。使用部分純化的高盧蜜環(huán)菌原伊魯烯合成酶、氚標記的二磷酸法呢基酯以及放射性TLC分析進行酶的進一步表征。這些實驗顯示二磷酸法呢基酯的Km為O. 53M。如預期的，發(fā)現(xiàn)酶活性完全取決于二價金屬離子。當用MnCl2替換時5mM的MgCl2下降了 75%，則達到了最高的原伊魯烯合酶的活性。最適宜的溫度是22° C，且在>35° C時幾乎完全失去活性。在50mM下測試了數(shù)個緩沖系統(tǒng)，在pH7. 2 (MOPS緩沖液)下具有最佳活性。在pH5. 8(MES緩沖液)和pH8. 5 (Tris緩沖液)下活性下降了 50%。該酶也對乙醇的存在非常敏感，當乙醇濃度低至5%時引起活性顯著地降低。證實了將從真菌菌絲體中純化高盧蜜環(huán)菌的原伊魯烯合酶蛋白至均質性并通過Edman測序法測定N-端氨基酸序列的嘗試不成功，但顯示該酶可能是45kDa的單體。由FU02472菌絲體培養(yǎng)物構建cDNA庫，并且對2592個隨機選擇的克隆的序列分析導致鑒別了與真菌萜烯合酶具有同源性的六種部分序列，例如，來源于灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea)。這些序列中的五種(兩種全長cDNA、一種部分cDNA、以及兩種包含內含子的克隆)示出了單個推測的原伊魯烯合酶基因，稱為Prol。剩余的序列，即約600bp長度的部分cDNA，表示獨特的基因，稱為Pro2。在可用于比較的約200個殘基上，這兩種推測的酶在氨基酸水平上顯示了大約55%的一致性。對Prol的進一步分析顯示了 1042bp長度的開放讀碼框，其編碼具有347個氨基酸殘基并且預測分子量為40kDa的蛋白。Prol多肽包含在適當方向上的DEXXD和NDxxSxxxE基序(如對于其他職烯合酶是特征性的)。使用Prol的氨基酸序列來搜索GenBank,顯示與來自灰蓋鬼傘屬擔子菌(basidiomycete Coprinopsiscinerea)的Cop3和Cop5倍半萜合酶具有緊密聯(lián)系(分別為32. 6%和33%的一致性)。Cop3是衣蘭油烯合酶，而Cop5的準確功能仍待確定。在來自子囊菌(ascomyceta)或植物的Prol與萜烯合酶之間沒有觀察到顯著的同源性。在大腸桿菌中Prol 的異源表達導致具有足夠的倍半萜合酶活性的粗制可溶性蛋白提取物在5分鐘內將80%的O. 5M的氚標記的二磷酸法呢基酯底物轉化成與6-原伊魯烯(Rf = O. 7)的性質相匹配的產物。將相同的溶菌液與二磷酸香葉基香葉基酯一起溫育沒有產生大量的更低極性的產物(<1%)，并且當使用來源于空載體對照的大腸桿菌溶菌液時，二磷酸法呢基酯和二磷酸香葉基香葉基酯都沒有轉化為較低極性的產物(參見圖3)。使用冰冷的二磷酸法呢基酯對異源萜烯合酶進行表征，用戊烷萃取并且通過GC-MS分析有機萃取物，顯示形成了具有與天然原伊魯烯合酶相同的保留時間和質譜的產物。使用1270全長的Prol cDNA克隆來設計可以擴增相應的基因組DNA序列的引物(圖4)。對1645bp產物的分析顯示存在八個內含子和九個外顯子，一些短至50bp。之前對植物萜烯合酶基因的分析已顯示很少的內含子。使用分別表示Prol克隆的5’和3’端的兩種寡核苷酸探針的DNA印跡，顯示在高盧蜜環(huán)菌基因組中僅存在一個拷貝的Prol基因(圖5)。
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽并且包括選自由以下各項所組成的組中的序列 a)隨附的序列表中SEQID No:1或SEQ ID No: 14 ; b)與SEQID No:1或SEQ ID No: 14互補的核酸序列； c)在嚴格條件下與a)和b)中定義的核酸序列或它們的互補鏈雜交的核酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的分離的多核苷酸，由編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽的所述 SEQ ID No:1 或 SEQ ID No: 14 組成。
3.一種載體，包含根據(jù)權利要求1或2所述的編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地連接至可被用所述載體轉化的宿主細胞識別的調控序列。
4.根據(jù)權利要求2所述的載體，其特征在于所述載體是表達載體。
5.根據(jù)權利要求2或3所述的載體，其特征在于所述載體以質粒、粘粒、噬菌體、脂質體、或病毒的形式存在。
6.一種分離的肽，由選自由以下各項所組成的組中的氨基酸序列組成 Ca)在SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列； (b)在SEQID NO:2中示出的氨基酸序列的等位基因變異體的氨基酸序列，其中所述等位基因變異體由在嚴格條件下與SEQ IDNckI或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反鏈雜交的核酸分子編碼； (c)在SEQID N0:2中示出的氨基酸序列的直系同源體的氨基酸序列，其中所述直系同源體由在嚴格條件下與SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反鏈雜交的核酸分子編碼；以及 (d)在SEQID No:2中示出的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括至少10個連續(xù)的氨基酸。
7.—種宿主細胞，包含根據(jù)權利要求2至4中任一項所述的載體。
8.根據(jù)權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞選自由包括酵母的真菌、細菌、昆蟲、動物、和植物細胞組成的組。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞是大腸桿菌細胞。
10.根據(jù)權利要求7至9之一所述的宿主細胞，其特征在于編碼具有原伊魯烯合酶活性的多肽的所述核酸適合各細胞的密碼子使用。
11.根據(jù)權利要求7、8和9所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞是同擔子菌。
12.根據(jù)權利要求11所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞是蜜環(huán)菌(Armillaria)屬的同擔子菌，具體地是高盧蜜環(huán)菌(Armillaria galIica),和蜜環(huán)菌(Armillaria mellea)。
13.一種用于生產蜜環(huán)菌戊素的方法，包括以下步驟 a、在允許生產蜜環(huán)菌戊素的適宜營養(yǎng)條件下，使根據(jù)權利要求5至10中任一項所述的宿主細胞生長；以及 b、從所述宿主細胞或其生長培養(yǎng)基中分離所述蜜環(huán)菌戊素。
14.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述蜜環(huán)菌戊素選自蜜環(huán)菌戊素1、蜜環(huán)菌乙素、蜜環(huán)菌戊素A、蜜環(huán)菌戊素F、蜜環(huán)菌戊素B、蜜環(huán)菌戊素K、扁枝衣酸蜜環(huán)基酯、蜜環(huán)菌甲素、蜜環(huán)菌醇、蜜環(huán)菌戊素J、蜜環(huán)菌寅素、10- α -羥基-蜜環(huán)菌戊素、苔色酸蜜環(huán)基酯、蜜環(huán)菌戊素Ε、1-0-三氟乙?；?蜜環(huán)菌戊素E、蜜環(huán)菌戊素H、5’ -O-甲基-melledonal、melledonal、arnamial、蜜環(huán)菌戍素 C、蜜環(huán)菌戍素 D、melledonal A、melledonal C、melIedonol ο
15.根據(jù)權利要求9或10所述的方法，其特征在于步驟a)和b)由以下步驟組成1、在適合的營養(yǎng)條件下使轉化或轉染的宿主細胞生長，以包含選自以下各項中的核酸序列a)來自隨附序列表中的SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14，b)與SEQ-1D No:1或SEQ IDNo: 14互補的核酸序列，以及c)在嚴格條件下與a)和b)中定義的核酸序列或它們的互補鏈雜交的核酸序列； i1、過表達所述核酸序列； ii1、從而在所述宿主細胞中增強蜜環(huán)菌戊素的生產，以及 iv、從所述宿主細胞或其生長培養(yǎng)基中分離所述蜜環(huán)菌戊素。
16.通過權利要求12至16中的一項所述的方法獲得的蜜環(huán)菌戊素。
17.根據(jù)權利要求1或2中的任一項所述的多核苷酸、或根據(jù)權利要求3至5中的任一項所述的載體、或根據(jù)權利要求6所述的多肽用于生產蜜環(huán)菌戊素的用途。
18.根據(jù)權利要求17所述的用途，其特征在于通過編碼原伊魯烯合酶的多核苷酸的異源或同源過表達來生產蜜環(huán)菌戊素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有原伊魯烯合酶(protoilludene synthase)活性并且包含選自由以下各項組成的組中的序列的多肽a)隨附序列表中的SEQ ID No:1或SEQ ID No:14；b)與SEQ ID No:1或SEQ ID No:14互補的核酸序列；c)在嚴格條件下與a)和b)中定義的核酸序列或它們的互補鏈雜交的核酸序列，并且涉及由所述分離的多核苷酸編碼的多肽，以及它們用于生產蜜環(huán)菌戊素(melleolide)的應用。
文檔編號C12N9/88GK103052709SQ201180037837
公開日2013年4月17日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權日2010年8月2日
發(fā)明者斯特凡·延內魏因, 貝內迪克特·恩格斯, 托爾斯滕·格羅特, 馬克·施塔德勒 申請人:弗蘭霍菲爾運輸應用研究公司