專利名稱：用于核酸合成和擴增的組合物、方法和試劑盒的制作方法
用于核酸合成和擴增的組合物、方法和試劑盒相關(guān)申請的交叉參考本申請根據(jù)35U. S. C. § 119(e)要求2010年6月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/357，021和2011年3月25日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/467，852的優(yōu)先權(quán)的利益，將所述美國臨時專利申請通過引用整體并入本文。領(lǐng)域本公開內(nèi)容涉及用于合成核酸的組合物、方法和試劑盒。更具體地，提供了用于在單步RT-PCR法中擴增核酸分子的組合物、方法和試劑盒，其包括一種或多種用于增強對PCR抑制劑的耐受性的試劑。

背景核酸的檢測、分析、轉(zhuǎn)錄和擴增是現(xiàn)代分子生物學中最重要的方法中的一些方法。此類方法用于核酸分析的應(yīng)用在基因表達的研究、感染性試劑或遺傳疾病的診斷、cDNA的產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)錄病毒的分析等等應(yīng)用中特別重要。逆轉(zhuǎn)錄RNA，隨后通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行cDNA擴增，通常稱為RT-PCR或RNA-PCR，已被廣泛用于檢測和定量核酸靶并且對于病毒基因分析特別重要。致癌病毒及其在癌癥的病理發(fā)生中的作用的研究可在癌癥的診斷和治療中具有重要意義。然而，致癌病毒的檢測中的可變性可使這些研究成為挑戰(zhàn)性的。檢測法的靈敏性和特異性是關(guān)鍵問題。早期檢測可通過使用分子生物學技術(shù)檢測還未經(jīng)歷血清轉(zhuǎn)換的樣品中的致癌病毒核酸來實現(xiàn)，此類技術(shù)適用于不能在組織培養(yǎng)中繁殖的病毒。常規(guī)地，免疫檢測法已被用于檢測致癌病毒的存在，但此類方法具有幾個缺點。在人乳頭瘤病毒(HPV)(其可引起宮頸癌)的情況下，檢測因早期病毒蛋白質(zhì)的低表達和可區(qū)分HPV類型的的靈敏且特異的高質(zhì)量抗體的缺乏而十分困難(Villa and Denny, International Journal ofGynecology and Obstetrics, 94 (Suppl.1) : S71-S80 (2006))。當樣品因可以在樣品收集之前已發(fā)生數(shù)目或數(shù)年的感染(如在愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)的情況下)而顯示殘余的抗體水平時，結(jié)果還可引起誤導或不能得出結(jié)論，所述愛潑斯坦-巴爾病毒與何杰金淋巴瘤及其它癌相關(guān)(國家傳染病中心(NationalCenter for Infectious Diseases)。“愛潑斯坦-巴爾病毒和傳染性單核細胞增多癥”，⑶C. http://www. cdc. gov/ncidod/diseases/ebv. htm(2010年11月))。病毒核酸的基于PCR的檢測不僅因序列特異性引物結(jié)合而具有高度特異性的有利方面，而且其還因為其擴增更短的核酸片段的能力而比其它雜交技術(shù)例如Northern和Southern印跡那樣麻煩比它們更靈敏。序列特異性探針結(jié)合給實時PCR添加了額外層的特異性并且具有提供病毒載量信息的額外有利方面。RT-PCR通常包括兩個單獨的分子合成⑴cDNA從RNA模板的合成；和(ii)新合成的cDNA通過PCR擴增的復制?？墒褂脙煞N或更多種酶，通過單步(或偶聯(lián))RT-PCR法進行RT-PCR，其中將至少兩種單獨的酶(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶)分別用于初始cDNA合成和隨后的擴增。在單步RT-PCR中，將逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增組合至單個反應(yīng)混合物中，這提供了優(yōu)于兩步驟RT-PCR(其中使用兩個不同的或單獨的反應(yīng)進行合成和擴增步驟)的眾多有利方面。單步驟RT-PCR需要比二步驟RT-PCR更少的對于反應(yīng)混合物和核酸產(chǎn)物的操作(例如，兩個反應(yīng)步驟之間為了添加組分或酶而進行的反應(yīng)管的打開)，從而是勞動密集度較低并且耗時較少的方法。必要時，單步驟RT-PCR還允許使用更少的樣品，以及減小污染的風險(Sellner 和 Turbett, Biotechniques25:234-238(1998))。然而，單步驟RT-PCR法的使用具有一些缺點。例如，逆轉(zhuǎn)錄酶對DNA聚合酶的比率的個體優(yōu)化對于用于單步驟RT-PCR的即可使用的組合物或試劑盒通常是不可行的。幾篇報道也已證明當在單管RT-PCR反應(yīng)中組合使用時逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶之間的干擾導致低靈敏性或結(jié)果的缺乏(Sellner，L. N.，等人，Nucl. Acids Res. 20:1487-1490 (1992))。此外，從其提取病毒核酸的樣品通常包含抑制PCR的額外化合物。土壤和糞便中的腐殖酸、血液中的血色素、血清中的免疫球蛋白G以及各種血液抗凝劑如肝素和檸檬酸鹽全都是此類抑制劑的實例。此類抑制劑在核酸提取和純化過程中不可能被完全去除，從而負面影響下游PCR擴增，如通過當利用實時PCR測定時Ct ( S卩，循環(huán)閾值)的增加和dRn(即，標準化報道分子信號的差異)的減小所反映的。與低dRn偶聯(lián)的高Ct通常表示定量PCR (qPCR)和逆轉(zhuǎn)錄酶-qPCR (RT-qPCR)應(yīng)用中的反應(yīng)中的低靶核酸濃度。顯示減小的擴增或無擴增的反應(yīng)表示靶核酸不存在或以少至不可被檢測的量存在。包含可檢測量的靶但因PCR抑制劑的存在而被抑制的反應(yīng)可顯示假的高Ct和低dRn，這可導致用戶相信靶核酸的量少于實際存在的量。如果抑制的水平足夠嚴重，則反應(yīng)可能不能完全擴增，從而導致假陰性結(jié)果。由于核酸合成應(yīng)用對分子生物學和細胞生物學領(lǐng)域的重要性，因此以一般化的即可使用的組合物的形 式存在的顯示高靈敏性的、不受樣品的量限制、減少醫(yī)生操作的量、使污染的風險降至最低、使試劑的費用減少至最少、以及使核酸終產(chǎn)物的量最大化的單步驟RT-PCR系統(tǒng)，是本領(lǐng)域所需要的。此外，減少或消除PCR抑制劑的負面影響的方法，特別地當分析其中樣品來源通常包含此類抑制劑的病毒靶時，是確保準確結(jié)果所必需的。概述本發(fā)明總地說來涉及用于合成核酸的組合物、方法和試劑盒。更具體地，提供了用于在單步驟RT-PCR法中使用與一種或多種DNA聚合酶例如來自水生棲熱菌(Thermophi Iusaquaticus) (Taq)的DNA聚合酶組合的一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶的擴增核酸分子的組合物、方法和試劑盒。優(yōu)選地，所述組合物還包含一種或多種用于增強對通常在從其提取核酸，特別地病毒核酸的樣品(例如，糞便、血液、土壤等)中發(fā)現(xiàn)的多種化合物的耐受性(即，阻斷或減緩PCR抑制)的試劑。此類PCR抑制劑阻斷劑可包括例如牛血清白蛋白(BSA)和魚膠(fish gelatin)。本教導從而有利于核酸分子的快速和高效的擴增和靶序列的檢測和定量(這可用于多種工業(yè)、醫(yī)學、法醫(yī)和診斷目的)。本文中公開的實施方案對于病毒基因包括RNA和DNA靶的快速擴增和檢測是特別有用的。具體地,本教導涉及包含至少一種活性DNA聚合酶和至少一種活性逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的組合物。在一些實施方案中，此類組合物還包含至少一種PCR抑制劑阻斷劑，其中所述PCR抑制劑阻斷劑增強對一種或多種PCR抑制劑(如果存在的話)的耐受性。在一些實施方案中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶為逆轉(zhuǎn)錄酶。在一些優(yōu)選實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶是熱穩(wěn)定性的。例如，熱穩(wěn)定性逆轉(zhuǎn)錄酶可以是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、其突變體、變體或衍生物。在一些實施方案中，M-MLV RT可包含一個或多個突變。此類突變可包括例如Y64、R116、D124、Η126、Υ133、Κ152、Q190、Τ197、Η204、V223、Μ289、Τ306 或 F309。在一些實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為約O. 5U/ μ L至約5U/ μ L。在一些實施方案中，本發(fā)明的聚合酶為DNA聚合酶。在一些優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。例如，熱穩(wěn)定性DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶、其突變體、變體或衍生物。在一些實施方案中，DNA聚合酶的濃度為約O. 005υ/μ L至約O. 5U/y L。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物的PCR抑制劑阻斷劑為蛋白質(zhì)、多肽或其肽衍生物。在一些優(yōu)選實施方案中，PCR抑制劑阻斷劑可以是明膠、白蛋白或其組合。這些可以包括例如魚膠或牛血清白蛋白(BSA)。在一些更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明組合物可包含至少魚膠和BSA。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物中BSA的濃度可以為約500ng/u L至約5000ng/u L。在其它實施方案中，本發(fā)明組合物中魚膠的終濃度可以為約0.4%至約4%。在一些實施方案中，PCR抑制劑，如果存在于組合物中，可以是血色素、腐殖酸、肝素、EDTA、檸檬酸鈉或免疫球蛋白G(IgG)。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物在-20° C可以是液體或凝膠。在其它實施方案中，組合物在約-20° C可以不是固體。在其它實施方案中，組合物在約-20° C可以不凍結(jié)。在一些優(yōu)選實施方案中，組合物在使用前不需要解凍。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物還可包含一種或多種核苷酸(dNTP)。此類核苷酸可以是例如dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。在一些實施方案中，組合物中每一種核苷酸的濃度為約O. 5mM至約5mM。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物還可包含甘油。在一些實施方案中，甘油的濃度為約5%至約50%。在本發(fā)明組合物的一些實施方案中，組合物還可包含RNA酶抑制蛋白(RIP)。在一些實施方案中，RIP的濃度為約O.1U/μ L至約l.OU/yL。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物還可包含一種或多種去垢劑。在一些實施方案中，一種或多種去垢劑的濃度為約O. 005%至約O. 05%。在一些實施方案中，一種或多種去垢劑可以是陽離子、兩性離子、陰離子或非離子型的。在一些實施方案中，非離子型去后劑可以是例如Nonidet P-40 (NP-40)去垢劑或TWEEN20去垢劑。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物還可包含一種或多種被動參考對照(passivereference control)。在一些實施方案中，一種或多種被動參考對照可以是例如ROX染料。在一些實施方案中，可將本發(fā)明組合物配制為濃縮原液。在一些實施方案中，此類濃縮原液可以為約2X至約6X原液。在一些實施方案中，此類原液可被稀釋用于隨后用于例如核酸合成法中。在一些優(yōu)選實施方案中，可將組合物配制為至少4X原液。本教導還涉及用于進行核酸樣品的RT-PCR的方法。在一些實施方案中，本方法可包括步驟(i)將包含至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶、至少一種DNA聚合酶或至少一種PCR抑制劑阻斷劑的組合物與(a)核酸樣品；(b) —種或多種標記的探針；和(c) 一種或多種引物混合，其中所述PCR抑制劑阻斷劑增強對一種或多種PCR抑制劑(當存在時)的耐受性；和(ii)對所述核酸樣品進行RT-PCR。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，可從來源例如血液、汗、眼淚、土壤、唾液、尿或糞便提取核酸樣品。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，可在單個容器(例如，管、室、孔)或單個反應(yīng)混合物中進行RT-PCR。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，將包含至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶、至少一種DNA聚合酶和至少一種PCR抑制劑阻斷劑的組合物與(a)核酸樣品；(b) —種或多種標記的探針；或(C) 一種或多種引物混合。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，一種或多種標記的探針可以是
權(quán)利要求
1.包含至少一種DNA聚合酶、至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和至少一種PCR抑制劑阻斷劑的組合物，其中所述PCR抑制劑阻斷劑增強對一種或多種PCR抑制劑的耐受性。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶為熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶或其突變體、 變體或衍生物。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述MMLVRT包含選自Y64、R116、D124、H126、Y133、K152、 Q190、T197、H204、V223、M289、T306 或 F309 的一個或多個突變。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述熱穩(wěn)定性DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶或其突變體、 變體或衍生物。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PCR抑制劑阻斷劑為蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述蛋白質(zhì)為明膠。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述明膠為魚膠。
10.權(quán)利要求7的組合物，其中所述蛋白質(zhì)為白蛋白。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述白蛋白為牛血清白蛋白(BSA)。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包含至少魚膠和BSA。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中BSA的濃度是約500ng/ μ L至5000ng/ μ L。
14.權(quán)利要求12的組合物,其中所述魚膠的濃度是約O. 4%至4%。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物在-20° C為液體或凝膠。
16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物在-20° C不為固體。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物在-20° C不凍結(jié)。
18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物在使用之前不需要解凍。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PCR抑制劑選自血色素、腐殖酸、肝素或EDTA。
20.權(quán)利要求1的組合物，還包含一種或多種核苷酸(dNTP)。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述核苷酸選自dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。
22.權(quán)利要求20的組合物，其中所述核苷酸的每一種的濃度為約O.5mM至5mM。
23.權(quán)利要求1的組合物,還包含甘油。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述甘油的濃度為5%-50%。
25.權(quán)利要求1的組合物，還包含RNA酶抑制蛋白(RIP)。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述RIP的濃度為O.1U/ μ L至1. OU/ μ L。
27.權(quán)利要求1的組合物,還包含去垢劑。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述去垢劑為ΝΡ-40或TWEEN20。
29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述去垢劑的濃度為O.005%至O. 05%。
30.權(quán)利要求1的組合物，還包含被動參考對照。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述被動參考對照為ROX染料。
32.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為濃縮原液。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述濃縮原液為2Χ至5Χ原液。
34.權(quán)利要求1或32的組合物，其中所述組合物用于核酸合成、核酸擴增或RT-PCR法。
35.進行核酸樣品的RT-PCR的方法，包括將組合物與 a)核酸樣品; b)一種或多種標記的探針； c)一種或多種引物混合， 所述組合物包含 至少一種活性逆轉(zhuǎn)錄酶； 至少一種活性DNA聚合酶；和 至少一種PCR抑制劑阻斷劑，其中所述PCR抑制劑阻斷劑增強對一種或多種PCR抑制劑的耐受性；和 對所述核酸樣品進行RT-PCR。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述核酸樣品獲自包含PCR抑制劑的來源。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述核酸來源選自血液、汗、眼淚、土壤、唾液、尿和糞便。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述標記的探針為
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述一種或多種PCR抑制劑選自血色素、腐殖酸和肝素。
40.權(quán)利要求35的方法，其中所述PCR抑制劑阻斷劑的至少一種為魚膠。
41.權(quán)利要求35的方法，其中所述PCR抑制劑阻斷劑的至少一種為BSA。
42.權(quán)利要求35的方法，其中在單個管或反應(yīng)中進行所述RT-PCR。
43.權(quán)利要求35的方法，其中在所述與a、b或c混合之前不解凍所述組合物。
44.權(quán)利要求34的方法，其中所述增強的耐受性通過Ct的減小來表示。
45.權(quán)利要求34的方法，其中所述增強的耐受性是當與使用不含PCR抑制劑阻斷劑的組合物的方法比較時增強至少10%。
46.權(quán)利要求44的方法，其中Ct減小至少ICto
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述BSA的濃度為至少500ng/μ L。
48.權(quán)利要求46的方法，其中當至少40μ M血色素存在于所述組合物中時觀察到至少為8的Ct的減小，當至少IOng/ μ L腐殖酸存在于所述組合物中時，觀察到至少為7的Ct的減小。
49.權(quán)利要求40的方法，其中魚膠的所述濃度為至少1%。
50.權(quán)利要求46的方法，其中當至少IOng/μL腐殖酸存在于所述組合物中時觀察到至少為3的Ct的減小，或當至少O. 06U的肝素存在于所述組合物中時觀察到至少為6的Ct的減小。
51.用于擴增核酸分子的方法，所述方法包括 將核酸模板與包含一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種DNA聚合酶以及一種或多種PCR抑制劑阻斷劑的組合物混合以形成反應(yīng)混合物；和 在足以擴增與所述核酸模板的全部或部分互補的核酸分子的條件下溫育所述反應(yīng)混合物。
52.權(quán)利要求51的方法,其中所述核酸模板為RNA。
53.權(quán)利要求51的方法,其中所述核酸模板為DNA。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述PCR抑制劑阻斷劑的至少一種為魚膠。
55.權(quán)利要求51的方法，其中所述PCR抑制劑阻斷劑的至少一種為BSA。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述PCR抑制劑阻斷劑增強對一種或多種PCR抑制劑的耐受性。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述PCR抑制劑的至少一種選自血色素、腐殖酸或肝素。
58.權(quán)利要求56的方法，其中所述耐受性的增加由Ct的減小來表示。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述Ct的減小是減小至少lCt。
60.用于核酸合成的方法，所述方法包括將一種或多種第一核酸分子與一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種聚合酶和一種或多種 PCR抑制劑阻斷劑混合；和在足以產(chǎn)生與所述一種或多種第一核酸分子的全部或部分互補的一種或多種第二核酸分子的條件下溫育所述混合物。
61.權(quán)利要求60的方法,其中所述第一核酸分子為RNA。
62.權(quán)利要求60的方法,其中所述第一或第二核酸分子為DNA。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述PCR抑制劑阻斷劑為魚膠或BSA。
64.反應(yīng)混合物，其包含至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶；至少一種聚合酶；至少一種PCR抑制劑阻斷劑；和至少一種核苷酸。
65.權(quán)利要求64的反應(yīng)混合物，還包含標記的探針。
66.權(quán)利要求65的反應(yīng)混合物，其中所述探針為TaqMan :探針。
67.權(quán)利要求64的反應(yīng)混合物，還包含至少一種引物。
68.權(quán)利要求64的反應(yīng)混合物，還包含核酸模板。
69.權(quán)利要求68的反應(yīng)混合物，其中所述核酸模板為RNA。
70.權(quán)利要求68的反應(yīng)混合物，其中所述核酸模板為DNA。
71.試劑盒，其在單個容器中包含含有至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶、至少一種DNA聚合酶和至少一種PCR抑制劑阻斷劑的組合物。
72.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物在-20°C為凝膠。
73.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物在-20°C不是固體。
74.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物在-20°C不凍結(jié)。
75.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物為4X濃縮原液。
76.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物用于RT-PCR法。
77.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物用于核酸合成方法。
78.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物用于核酸擴增方法。
79.權(quán)利要求71的試劑盒，還在至少一個其它容器中包含含有至少一種探針和/或至少一種引物的組合物。
80.權(quán)利要求79的試劑盒，其中所述探針為TaqMan 探針。
81.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物還包括至少一種核苷酸。
82.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述組合物還包含緩沖劑或鹽溶液。
83.權(quán)利要求76-78的任一項的試劑盒，其中所述方法包括熱循環(huán)。
84.權(quán)利要求83的試劑盒，其中所述熱循環(huán)為快速熱循環(huán)。
85.權(quán)利要求76-78的任一項的試劑盒，其中所述方法包括多路。
86.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV或其具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的任何突變體、變體或衍生物。
87.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述聚合酶為TaqDNA聚合酶或其具有DNA聚合酶活性的任何突變體、變體或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于合成核酸分子的組合物、方法和試劑盒。更具體地，提供了用以在單步驟RT-PCR法中擴增核酸分子的組合物、方法和試劑盒，其包括用于增強對PCR抑制劑的耐受性的一種或多種試劑。
文檔編號C12Q1/68GK103038366SQ201180037898
公開日2013年4月10日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者C·胡, J·伯克曼, P·嚴 申請人:生命技術(shù)公司