專利名稱：透明質(zhì)酸的脫乙酰基水解酶、由脫乙?；饷该撘阴；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸的脫乙酰基水解酶，以及使用該脫乙?；饷钢苽涞拿撘阴；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸屬于糖胺聚糖(GAGs)，如硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素及肝素，并且透明質(zhì)酸是重復(fù)單元的多陰離子天然線型聚合物，每個重復(fù)單元由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸組成。透明質(zhì)酸存在于眼睛、胎盤、關(guān)節(jié)的滑液潤滑劑、皮膚，以及雞冠中。根據(jù)體內(nèi)存在的位置，其分子量的范圍為在IO3至IO7道爾頓的內(nèi)。此外，透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并作為支架在包括表皮和真皮的皮膚的所有層中起重要作用。透明質(zhì)酸還存在于滑液、臍帶，以及所有高等動物的血液中，并且?guī)缀?0%的身體體內(nèi)的透明質(zhì)酸位于皮膚、呼吸道，以及腸道中。透明質(zhì)酸是糖胺聚糖中唯一的非硫酸化的。由于透明質(zhì)酸的充足的負(fù)電荷，其可結(jié)合陽離子，并吸收大量的水，在天然細(xì)胞外基質(zhì)中充當(dāng)滲透性緩沖液并形成水凝膠。因此，透明質(zhì)酸可作為細(xì)胞外基質(zhì)中的其它成分的極好的替代物，并且由于其極好的保水性，透明質(zhì)酸為組織和關(guān)節(jié)提供細(xì)胞外基質(zhì)水合的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，且通過物理力負(fù)責(zé)抵抗壓縮。此外，透明質(zhì)酸參與組織之間的滲透性調(diào)節(jié)，并在關(guān)節(jié)摩擦中誘導(dǎo)潤滑作用，且作為載體給關(guān)節(jié)的無血管區(qū)域提供營養(yǎng)物，或從關(guān)節(jié)的無血管區(qū)域中去除廢物。因此，利用透明質(zhì)酸的高吸水性和高粘度，天然存在的透明質(zhì)酸自身或其衍生物(Glenn D.Prestwich, Jing-wen Kuo,Chemically-Modified HA for Therapy andRegenerative Medicine, Current Pharmaceutical Biotechnology, 9(4), 242-245(2008))已被應(yīng)用于化妝品中或醫(yī)學(xué)上中用于眼睛(E. A. Balazs, Μ.1. Freeman, R. Kloti, G.Meyer-Schwickerathj F. Regnaultj and D. B. Sweeney, ^Hyaluronic acid and replacementof vitreous and aqueous humor"，Mod. Probl. Ophthalmol.，10，3 21 (1972) ) 另外，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸應(yīng)用于不同的組織再生和組織工程領(lǐng)域，包括軟骨和骨骼的再生(A. H.1sdaleiLD.Hordonj H.A.Bird,和 V.Wright,〃Intra_articular hyaluronate (Healon) : Adose-ranging study in rheumatoid arthritis and osteoarthritis' J.Drug Dev.，4，93 99 (1991) · M. Kawabataj M.1garashij R. Mikamij S. Ninomiyaj 和H. Oda，"Clinical evaluations of SLM-1O(sodium hyaluronate injection) in patientswith osteoarthritis of the knee"，Yakuri to Chiryo，21，257 283 (1993))、皮膚和軟組織的再生，以及壓抑組織的換膚術(shù)和整形手術(shù)，例如直接向體內(nèi)注射透明質(zhì)酸。盡管作為醫(yī)學(xué)生物材料，透明質(zhì)酸十分適用，但是由于其在體內(nèi)的半衰期短，所以在許多使用上受到限制。實(shí)際上，透明質(zhì)酸在體內(nèi)很容易降解，半衰期比膠原更短。在不分泌淋巴液的骨骼和軟骨中，透明質(zhì)酸很可能通過同時與膠原和蛋白聚糖原位代謝性降解來發(fā)生降解。在皮膚和關(guān)節(jié)中，2(Γ30%的透明質(zhì)酸很可能通過局部新陳代謝降解，且其余的透明質(zhì)酸通過淋巴途徑去除。透明質(zhì)酸的組織半衰期為半天到2天或3天(J. R. Ε. Fraser, Τ.C. Laurent,和 IL B. G. Laurent, Hyaluronan:1ts nature, distribution, functions, andturnover, J.1ntern. Med.，242 (I)，27-33 (1997))。特別地，當(dāng)將透明質(zhì)酸植入到正常關(guān)節(jié)時，據(jù)報道透明質(zhì)酸的半衰期少于I天(T. C. Laurentj和J. R. E. Fraser, Hyaluronanj FASEBJ.，6，2397-2404(1992))。在眼睛中，透明質(zhì)酸的半衰期延伸至70天，在眼睛中透明質(zhì)酸不與其它糖胺聚糖結(jié)合(U. B. G. Laurent，和 R. K. Reed，Turnover of hyaluronan in thetissue, Adv. Drug Delivery Rev.，7，237-56 (1991))。盡管透明質(zhì)酸作為醫(yī)學(xué)生物材料具有極高的潛能，但是由于在體內(nèi)的迅速降解并且半衰期短，以及天然聚合物自身的機(jī)械性能低，目前透明質(zhì)酸的使用受到限制。用于整形手術(shù)時，透明質(zhì)酸凝膠必須在體內(nèi)長時間保持需要的機(jī)械強(qiáng)度，并且由于其半衰期短，通常需要由具有2，00(T3，OOOkDa的超高分子量的透明質(zhì)酸制備。此外，需要對透明質(zhì)酸進(jìn)行化學(xué)改性，并將其開發(fā)成保持透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)，但在體內(nèi)不會迅速降解的衍生物，從而使透明質(zhì)酸適用于各種臨床目的的生物材料。已經(jīng)嘗試對透明質(zhì)酸進(jìn)行許多化學(xué)改性。例如，交聯(lián)透明質(zhì)酸，制備成烷基和芐基酯衍生物，或使用偶聯(lián)劑改性?；仡櫟侥壳盀橹沟难芯繄蟾嬉炎C明，通過化學(xué)改性開發(fā)的透明質(zhì)酸衍生物適合作為醫(yī)學(xué)用聚合物，該聚合物具有適用于靶組織、器官以及藥物遞送系統(tǒng)中的機(jī)械和化學(xué)性能。根據(jù)制藥學(xué)功能，其中一些衍生物顯示保持透明質(zhì)酸固有的生物學(xué)功能。然而，通過化學(xué)改性很難合成具有1. 5Χ106道爾頓分子量或更高分子量的透明質(zhì)酸衍生物，因?yàn)檫@樣的高分子量聚合物有可能經(jīng)受分子間纏結(jié)(Y. S. Soh，"Hyaluronic acid:properties and application'Polymer (Korea)，12，(1988))。針對上述問題，已經(jīng)提出各種解決方案。例如，可以制備低分子量的透明質(zhì)酸，或使用肼脫乙酰化N-乙酰-D-葡萄糖胺部分后，將獲得的具有有機(jī)胺基的透明質(zhì)酸進(jìn)行化學(xué)改性(V. Crescenzij A. FrancescangelijD. RenierjD. Bellini，New cross-linkedand sulfated derivatives of partially deacetylated hyaluronan:Synthesis andpreliminary characterization, Biopolymers, Vol. 64，86-94 (2002). S.OertherjA-CMaurinjE. Payanj P. Hubert, F. LapicquejN. PreslejJ. Dexheimerj P.Netterj 和F. Lapicquej High Interaction alginate-hyaluronate associations by hyaluronatedeacetylation for the preparation of efficient biomaterials, Biopolymer, 54,273-281 (2000))。另外，將位于β-葡萄糖醛酸的第6位的被認(rèn)為是透明質(zhì)酸酶的靶位點(diǎn)的羧基進(jìn)行化學(xué)性替換從而制備不溶于水的透明質(zhì)酸凝膠(Oh EJj Kang SWj Kim BSj Jiang Gj ChoIH，Hahn SK. , Control of the molecular degradation of hyaluronic acid hydrogelsfor tissue augmentation. J Biomed Mater Res A.，86(3):685-93(2008)Hahn SKj ParkJK，Tomimatsu T，Shimoboji T., Synthesis and degradation test of hyaluronic acidhydrogels.1nt J Biol Macromol.，40 (4)，374-80 (2007) · ) 進(jìn)一步地，據(jù)報道，不僅可以對重復(fù)單元的乙醇基(-0H)進(jìn)行化學(xué)改性，而且還可以通過破壞糖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)改性，并且使用羧酸基上的負(fù)電荷進(jìn)行物理改性(V. Crescenzij A. Francescangelij D. Renierj D.Bellini，New hyaluronan chemical derivatives. Regioselectively C(6)oxidized products, Macromolecules, 34，6367 6372 (2001))。然而，化學(xué)脫乙?；约笆褂门悸?lián)劑的化學(xué)改性產(chǎn)生具有顯著減小的分子量的透明質(zhì)酸，其導(dǎo)致透明質(zhì)酸固有的機(jī)械性能弱化(S. Oertherj A-C Maurinj E. Payanj P. Hubert, F. Lapicquej N. Preslej J. Dexheimerj P.Netterj 和 F. Lapicque，High Interaction alginate-hyaluronate associations byhyaluronate deacetylation for the preparation of efficient biomaterials, Biopolymer, 54，273-281 (2000))。此外,脫乙?；蚋男钥赡芤鹩糜陔x子交聯(lián)的多價金屬的分離以及引入的官能團(tuán)的解離，并且連同降解的透明質(zhì)酸一起非常易于產(chǎn)生細(xì)胞毒性。另外，降低機(jī)械強(qiáng)度的透明質(zhì)酸大大地限制了其在醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域中作為生物材料的應(yīng)用，并且不能制備成各種類型的生物材料。特別地，當(dāng)水凝膠、片材、薄膜、小珠、或納米纖維作為組織工程支架應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)時，一定要保持它們的強(qiáng)度和形態(tài)直到引入周圍的細(xì)胞到支架為止，從而迅速地構(gòu)建組織。否則，它們的形態(tài)將容易瓦解，同時功效及周圍組織的移植率顯著下降。因此，為了保持透明質(zhì)酸的必要的骨架，以用作組織工程支架以及作為細(xì)胞、蛋白質(zhì)、金屬和藥物的載體，以及作為涂層劑，透明質(zhì)酸的生物降解性和分子量必須是可調(diào)節(jié)的。另一方面，對N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的脫乙?；饷高M(jìn)行研究，主要研究了殼多糖脫乙?；饷?CDA:E，C，3. 5.1. 41)，其催化殼多糖至殼聚糖的轉(zhuǎn)化。在1936年，Watanabe報告指出動物組織中存在N-乙酰-D-葡萄糖胺的可能性，并且在1957年· S.Roseman首先從大腸桿菌菌株K-12的提取物中分離出該酶。隨后，成功地從魯氏毛霉的提取物，以及蠟狀芽孢桿菌的提取物；真菌，諸如菜豆炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌及葡枝根霉；昆蟲物種；甲殼動物；以及原生動物兔腦炎原蟲中分離出殼多糖脫乙?；饷?。另外，已報告出從魯氏毛霉、藍(lán)色犁頭霉，及構(gòu)巢曲霉中分離并純化殼多糖脫乙?；饷傅难芯拷Y(jié)果。從卵形孢球托霉和釀酒酵母中成功地分離出鈷-活化的殼多糖脫乙?；饷?Cda2P)，并且從兔腦炎原蟲、金龜子綠僵菌、及大腸桿菌和米根霉的培養(yǎng)基中成功地分離出殼多糖脫乙?；饷浮＝陙?，已報告從短帚霉、被孢霉屬真菌DY-52、卷柄根霉，以及霍亂弧菌中分離出殼多糖脫乙?；饷?，但是其純化結(jié)果尚未確定。另外，自從發(fā)現(xiàn)真菌的殼多糖脫乙酰酶和根瘤菌結(jié)瘤蛋白質(zhì)(NodB蛋白質(zhì))之間存在結(jié)構(gòu)相似性，分析了來自真菌，諸如魯氏毛霉、菜豆炭疽病菌、釀酒酵母、卵形孢球托霉以及黑根霉中的殼多糖脫乙酰酶的序列，但尚未公布。如前所述，對多糖的脫乙?；饷傅难芯渴菄@殼多糖脫乙酰基水解酶進(jìn)行的，其能夠?qū)σ幌盗羞B續(xù)的N-乙酰-D-葡萄糖胺殘留物具有催化作用，但不能與單糖N-乙酰-D-葡萄糖胺反應(yīng)。這樣的殼多糖脫乙?；饷覆粫﹄木厶荖-乙?；嗡睾蚇-乙酸基半乳糖胺顯不酶活性(Araki, Y. &Ito, E. (1975) · A pathway of chitosan formationin Mucor rouxii, Eur. J. Biochem. , 55, 71-78 (1975)),并且也不會催化透明質(zhì)酸的 N-乙酸-D-葡萄糖胺部分的脫乙酸化(Martinou A, Kafetzopoulos D, Bouriotis V. , Chitindeacetylation by enzymatic means:monitoring of deacetylation process, Carbohyd.Res.，273，235-242 (1995))。如此，已報告指出除了對殼多糖和殼聚糖的N-乙?；?D-葡萄糖胺具有酶活性以外，殼多糖脫乙?；饷覆痪哂忻富钚?。也就是說，沒有在以前的任何文件中報道過對透明質(zhì)酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的乙?；哂羞x擇性的脫乙酰酶。
因此，需要研究和開發(fā)能夠選擇性地脫乙?；该髻|(zhì)酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的脫乙?；饷?br/>發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明人研究了對透明質(zhì)酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺的こ?；哂羞x擇性的脫こ酰基水解酶，成功地從微生物中分離并純化了透明質(zhì)酸脫こ酰酶，并發(fā)現(xiàn)脫こ酰酶在制備脫こ?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物中是有用的，并且脫こ酰化的透明質(zhì)酸及其衍生物在體內(nèi)降解速度緩慢，最小限度的減少分子量和粘度，具有低膠凝點(diǎn)從而促進(jìn)凝膠化，并且對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性沒有影響，由此完成本發(fā)明。技術(shù)方案本發(fā)明的ー個目的在于提供從微生物中分離并純化的透明質(zhì)酸的脫こ酰基水解酶，其能夠催化透明質(zhì)酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺部分上的こ酰基的選擇性水解。本發(fā)明的另ー個目的在于提供脫こ?；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物，該透明質(zhì)酸或其衍生物通過使用本發(fā)明的透明質(zhì)酸的脫こ?；饷钢苽洹Ｓ幸嫘Ч鶕?jù)本發(fā)明的脫こ?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物移植到體內(nèi)后在初始時期不容易降解，并顯示出顯著地降低分子量和粘度，膠凝點(diǎn)低于未脫こ?；耐该髻|(zhì)酸，從而促進(jìn)凝膠化。此外，脫乙?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物甚至在高濃度下幾乎不對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性產(chǎn)生任何負(fù)面影響。因此，根據(jù)本發(fā)明的脫こ酰化的透明質(zhì)酸及其衍生物能夠用作生物材料，諸如細(xì)胞、基因和藥物的載體，以及組織工程支架。


圖1是從構(gòu)巢曲霉中分離并純化的透明質(zhì)酸脫こ酰酶對殼多糖低聚物五-N-こ酰殼六糖的活性的色譜圖。圖2示出了通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析透明質(zhì)酸脫こ酰酶的分離及純化的圖示[泳道1:標(biāo)志物(標(biāo)準(zhǔn)分子量)，泳道2 :30%硫酸銨組分，泳道3 :Q-瓊脂糖組分(未結(jié)合)，泳道4 :苯基-瓊脂糖組分，泳道5 :聚丙烯酰胺葡聚糖組分]。圖3示出了從短帚霉中分離并純化的脫こ酰酶的水性HPLC色譜圖。圖4示出了通過SDS-PAGE分析的從短帚霉中分離的脫こ酰酶的圖示。圖5示出了通過雙向電泳系統(tǒng)分析的從短帚霉中分離并純化的脫こ酰酶的Pl值。圖6示出了未脫こ?；暮屯ㄟ^透明質(zhì)酸酶脫こ酰化的透明質(zhì)酸的降解率的圖
/Jn o圖7是表示通過凝膠電泳測量的以酶法和化學(xué)方法脫こ?；耐该髻|(zhì)酸的分子量的圖示。圖8是表示以酶法和化學(xué)方法脫こ?；耐该髻|(zhì)酸的粘度的流變圖。圖9是表示根據(jù)與P -磷酸縮水甘油酯相互作用的以酶法和化學(xué)方法脫こ?；耐该髻|(zhì)酸的粘弾性圖。圖10示出了脫乙?；耐该髻|(zhì)酸對殼聚糖/ P -磷酸縮水甘油酯的凝膠化的影響[(a)不存在脫乙酰化的透明質(zhì)酸，(b)存在脫乙酰化的透明質(zhì)酸]。圖11示出了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的顯微圖像，該人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞示出了隨著未脫乙?；耐该髻|(zhì)酸和脫こ酰化的透明質(zhì)酸的濃度變化的形態(tài)變化。圖12示出了隨著未脫乙酰化的和脫乙酰化的透明質(zhì)酸的濃度以及培養(yǎng)時間改變的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性的圖示。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了透明質(zhì)酸的脫こ酰基水解酶，其能夠催化透明質(zhì)酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺上的こ?；倪x擇性水解。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了通過脫こ?；饷该摛初；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物。以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的脫こ?；饷笍奈⑸镏蟹蛛x并純化，且對透明質(zhì)酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺部分上的こ?；M(jìn)行選擇性地水解。微生物的例子包括構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、短帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)、魯氏毛霉(Mucor rouxii)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、黃瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerulea)、卵形抱球托霉(Gongronella butleri)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、兔腦炎原蟲(Encephalitozoon cuniculi )、金龜子綠僵菌(Metarhiziumani sop Iiae)、肺炎鏈球菌(Streptococus pneumoniae)、被抱霉屬真菌 DY_52( Morti ere I Iasp. DY-52)、卷柄根霉(Rhizopus circinans),以及霍亂弧菌(Vibrio cholerae),但并不限制于此。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫こ?；饷笍臉?gòu)巢曲霉和短帚霉中分離并純化，并分析了從構(gòu)巢曲霉中分離并純化的脫こ酰基水解酶的核苷酸序列，并表示為SEQ ID NO:1o另 外，本發(fā)明涉及使用透明質(zhì)酸的脫こ?；饷钢苽涿摛初；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物。詳細(xì)地，將透明質(zhì)酸或其衍生物溶于PH3. (T9. 0的緩沖液或蒸餾水，并在1(T70°C，優(yōu)選在30 60° C與透明質(zhì)酸的脫こ酰基水解酶一起培養(yǎng)0. 001 24小時，更優(yōu)選培養(yǎng)1 10小時，最優(yōu)選培養(yǎng)3飛小時，接著，向反應(yīng)混合物中加入こ醇以沉淀脫こ酰化的透明質(zhì)酸或其衍生物。關(guān)于這點(diǎn)，こ醇的量為反應(yīng)混合物重量的疒10倍，且優(yōu)選為約4 7倍。隨后，使用こ醇洗滌脫こ?；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物的沉淀物，將其溶于蒸餾水，并在冷凍干燥前使用蒸餾水透析。通過酶法脫こ?；耐该髻|(zhì)酸比化學(xué)法脫こ?；耐该髻|(zhì)酸具有更高的脫こ?；潭茸C明了與化學(xué)方法相比，本發(fā)明的脫こ?；饷改軌蚋行У貜耐该髻|(zhì)酸中去除
こ?；?。發(fā)現(xiàn)通過透明質(zhì)酸酶本發(fā)明的脫こ?；耐该髻|(zhì)酸在體內(nèi)的初始降解速度延遲，并且最小限度的減小分子量和粘度，從而能制備具有高分子量和高粘度的脫こ酰化的透明質(zhì)酸。另外，本發(fā)明的脫こ酰化的透明質(zhì)酸的膠凝點(diǎn)低于未脫こ?；耐该髻|(zhì)酸，即完整的透明質(zhì)酸，這表明通過陰離子的￠-磷酸縮水甘油酯和脫こ?；耐该髻|(zhì)酸的陽離子的游離胺基之間的相互靜電作用促進(jìn)脫こ?；耐该髻|(zhì)酸的凝膠化。根據(jù)本發(fā)明的脫こ?；耐该髻|(zhì)酸的濃度，觀察到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)沒有顯著地變化，并且人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性基本上沒有受培養(yǎng)基中脫こ?；耐该髻|(zhì)酸濃度的增長的影響。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的脫こ?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物在體內(nèi)初始降解速度延遲，最小限度的減小分子量和粘度，且具有低于未脫こ酰化的透明質(zhì)酸的膠凝點(diǎn)以易于膠凝化，并且盡管其在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度增加但對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性幾乎沒有影響。因此，根據(jù)本發(fā)明的脫こ?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物能夠用作生物材料，適用于細(xì)胞、基因和藥物的載體，或組織工程支架。通過以下實(shí)施例更好地理解本發(fā)明，該實(shí)施例僅在于說明，并不限制本發(fā)明。實(shí)施例1 :從構(gòu)巢曲霉中分離并純化透明質(zhì)酸脫こ酰酶1、構(gòu)巢曲霉的培養(yǎng)首先，將構(gòu)巢曲霉在液體培養(yǎng)基[(葡萄糖5g,酵母提取物2g,蛋白胨5g,NaC15g)或(1%葡萄糖，0. 15%酵母提取物，0. 15%酪蛋白水解產(chǎn)物，Ix維生素溶液，Ix最低鹽溶液，0. 5%殼多糖)，總體積為1L]或在平板培養(yǎng)基[3%蔗糖，0. 2%NaN03,1%K2HP04, 0 . 05%KC1, 0. 05% MgSO4]中在5 40° C下培養(yǎng)4 2，400小時。然后在液體培養(yǎng)基[(NaNO3 2g，K2HPO4 lg, KC10. 5g, MgSO4 0. 5g，蛋白胨 lg，殼多糖(TlOg)或(1% 葡萄糖，0. 15%酵母提取物，0. 15%酪蛋白水解產(chǎn)物，Ix維生素溶液，Ix最低鹽溶液，0. 5%殼多糖)]或在平板培養(yǎng)基[3% 蔗糖，0. 2%NaN03,1%K2HP04,0 . 05%KC1,0. 05%MgS04]中在 5 40° C下，以I 1，OOOrpm震蕩培養(yǎng)4 200小時。所述維生素溶液包含15. 2%NaN03，2. 6%MgS04，15. 2%K2HP04, 2. 6%KC1，0. 04%ZnCl2，0. 4% (NH4) 2Mo7024，0. 001%MnCl2，0. 03%CuS04,以及
0.001%FeS04,并且姆5OOmL的所述最低鹽溶液中包含核黃素50mg、對氨基苯甲酸250mg、鹽酸批卩多醇250mg、生物素2mg、抗壞血酸250mg、葉酸250mg、硫胺素250mg以及煙酸50mg。對于細(xì)胞內(nèi)酶蛋白，通過超聲波處理破壞真菌菌絲，然后以1，00(T100，OOOxg離心分離廣500分鐘。使用(Tl00%梯度的硫酸銨處理上清液0. 1 48小吋。以
1,000^100, OOOxg離心分離(T500分鐘后，使用0 100%梯度的硫酸銨處理上清液0.1 48小吋。以1，000^50, OOOxg離心分離1飛00分鐘，獲得作為沉淀物的酶。對于細(xì)胞外酶蛋白，使用0 100%硫酸銨(Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO，USA)使6L的細(xì)胞培養(yǎng)液飽和。以1，000^100, OOOxg離心分離(T500分鐘之后，使用(Tl00%硫酸銨使上清液飽和。然后，以1，000^100, OOOxg離心分離(T500分鐘，獲得作為沉淀物的酶。收集獲得的構(gòu)巢曲霉沉淀物，并懸浮在Tris-HCl緩沖液中(pH7. 5)，使用(Tl00%硫酸銨(50mM Tris-HCl，pH7. 5)過夜透析懸浮液。2、根據(jù)硫酸銨濃度的來自構(gòu)巢曲霉培養(yǎng)物的沉淀物的酶的脫こ?；钚酝ㄟ^測定由五-N-こ酰殼六糖的酶解產(chǎn)生的醋酸根離子水平分析根據(jù)硫酸銨濃度的來自構(gòu)巢曲霉培養(yǎng)物的沉淀物的酶的脫こ酰化活性。關(guān)于這點(diǎn)，使用酶偶聯(lián)法，通過測量從糖中分離的游離醋酸鹽離子的水平來檢測脫こ?；某潭取Ｔ诖姿嵩噭┖?ENZYTEC )中，如以下反應(yīng)流程所示，通過脫こ酰酶的酶促作用釋放醋酸根離子，并且在ACS、CS和MDH的存在條件下與共存的化學(xué)計(jì)量的NADH的產(chǎn)物連續(xù)反應(yīng)。在吸光度340nm下用消光系數(shù)e34(l=6. 31mM^cm^對NADH進(jìn)行定量分析。醋酸鹽 +ATP+CoAACS —こ酰基-CoA+AMP+PPiこ酸基-CoA+草酸こ酸鹽+H2O---CS —朽1樣酸鹽+CoAL-蘋果酸鹽 +NAD+ — L-MDH —草酰こ酸鹽 +NADH+H+作為對照，將包含在醋酸試劑盒中的330 ii L的TEA (三こ醇胺)緩沖液，67 ii L的ATP/CoA/NAD溶液，4 y L的MDH/CS溶液，7 y L的ACS溶液按順序連續(xù)地加入到1. 5mL e_管中，并且使用蒸餾水填充該管使其總體積達(dá)到lmL。在25° C下培養(yǎng)30分鐘后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到 96-孔板中，并利用酶標(biāo)儀(SpecUtiiVIax '' M2, Molecular Devices, USA)在 340nm 下測量吸光度。當(dāng)使用五-こ酰殼六糖作為基質(zhì)進(jìn)行測量時，根據(jù)硫酸銨濃度的來自構(gòu)巢曲霉培養(yǎng)物的沉淀物的脫こ?；钚钥偨Y(jié)在以下表I中。表I
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸的脫乙?；饷福鐾该髻|(zhì)酸的脫乙?；饷笍奈⑸镏蟹蛛x并純化，其能夠催化存在于透明質(zhì)酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺上的乙?；倪x擇性水解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸的脫乙?；饷?，其中所述微生物選自由構(gòu)巢曲霉、短帝霉、魯氏毛霉、臘狀牙抱桿囷、黃瓜炭痕病囷、葡枝根霉、監(jiān)色舉頭霉、卵形抱球托霉、釀酒酵母、兔腦炎原蟲、金龜子綠僵菌、肺炎鏈球菌、被孢霉屬真菌DY-52、卷柄根霉、霍亂弧菌，以及其組合構(gòu)成的組中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸的脫乙?；饷?，所述透明質(zhì)酸的脫乙酰基水解酶由具有SEQ ID N01的核苷酸序列的基因編碼，所述基因從構(gòu)巢曲霉中分離。
4.一種脫乙?；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物，所述脫乙?；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物使用權(quán)利要求I所述的透明質(zhì)酸的脫乙酰基水解酶制備。
5.一種權(quán)利要求4所述的脫乙?；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物的制備方法，所述方法包括將透明質(zhì)酸或其衍生物溶解于pH 3. (T9. O的緩沖液或蒸餾水中，并且在權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸的脫乙?；饷复嬖诘臈l件下，將溶液在10 70°(培養(yǎng)0.00廣24小時。
6.一種包含權(quán)利要求4所述的脫乙酰化的透明質(zhì)酸或其衍生物的用于細(xì)胞、基因或藥物的載體。
7.一種包含權(quán)利要求4所述的脫乙?；耐该髻|(zhì)酸或其衍生物的組織工程支架。
全文摘要
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸的脫乙?；饷福稍撁该撘阴；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物。本發(fā)明的脫乙?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物具有如下特征在活體中延遲初始分解率；最小限度地減小分子量和粘度；由于具有比未脫乙?；耐该髻|(zhì)酸的凝膠化溫度低的凝膠化溫度從而促進(jìn)凝膠化；以及幾乎不受培養(yǎng)基中脫乙?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物的濃度的增長影響的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率。因此，本發(fā)明的脫乙?；耐该髻|(zhì)酸及其衍生物作為生物成分是有用的，諸如細(xì)胞、基因、藥物等的傳遞系統(tǒng)，或組織工程的支架等。
文檔編號C12P19/04GK103038339SQ201180038352
公開日2013年4月10日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者金千皓, 金鍾一 申請人:韓國原子力醫(yī)學(xué)院