專利名稱：使用切口酶的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域，特別是屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增核酸的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增被廣泛用在研究、診斷學(xué)、法醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食物科學(xué)和農(nóng)業(yè)中?！艾F(xiàn)場(chǎng)即時(shí)測(cè)試(Point of Care Testing)”(POCT)是指在患者醫(yī)療點(diǎn)處或附近進(jìn)行的診斷性測(cè)試，即去集中化的檢查，例如可以在私人醫(yī)療實(shí)踐、小醫(yī)院、藥店中或者甚至在事故或其它醫(yī)療緊急事件的現(xiàn)場(chǎng)或位點(diǎn)處或者在救護(hù)車內(nèi)執(zhí)行所述檢查。現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷需要快速且簡(jiǎn)單的測(cè)試。因此，在基于核酸的檢測(cè)方法的情況下，與已建立的但較慢的基于PCR的方法相比，快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)最近已變得越來越重要。PCR需要熱循環(huán)，以便將雙鏈核酸例如DNA的兩條鏈分離開。相反，例如等溫?cái)U(kuò)增方法不需要熱循環(huán)儀。最杰出的等溫?cái)U(kuò)增方法之一是所謂的解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)(例如被描述在Vincent 等.(2004)，EMBO re ports 5(8):795-800 Jeong 等.(2009)，Cell.Mol.Life Sci66:3325-3336 ；W0-A2 2004/027025 ；W0-A2 2006/074334 中，所有均通過參考結(jié)合于此)。HDA是基于解旋酶將雙鏈核酸特別是DNA解旋的能力，而不需要加熱或甚至熱循環(huán)。在HDA中，使用DNA聚合酶和合適的寡核苷酸引物來復(fù)制分離的DNA鏈。因此，HDA模擬天然的復(fù)制叉機(jī)制。HDA需要存在ATP、二價(jià)鎂離子和dNTP。某些基于HDA的方法還采用單鏈結(jié)合蛋白(SSB)來包被置換的DNA鏈。事實(shí)上，取決于所使用的酶，可以在熱不穩(wěn)定或熱穩(wěn)定的反應(yīng)中執(zhí)行HDA方法。典型地，在25°C和50°C之間、優(yōu)選在37°C和42°C之間的溫度下執(zhí)行熱不穩(wěn)定的HDA反應(yīng)。相反，在超過50°C、典型地在60°C和70°C之間的溫度下執(zhí)行熱穩(wěn)定的HDA或嗜熱的HDA (tHDA)反應(yīng)。HDA反應(yīng)選擇性地?cái)U(kuò)增由兩個(gè)引物限定的靶序列。HDA使用解旋酶而不是像PCR中那樣使用熱來將雙鏈核酸的兩條鏈分離開。因此，可以在單個(gè)溫度下執(zhí)行HDA，而不需要熱循環(huán)。常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)HDA反應(yīng)的步驟示于圖1中:在第一個(gè)步驟中，通過解旋酶將雙鏈核酸解旋，產(chǎn)生(部分)單鏈的序列。然后，引物與單鏈區(qū)結(jié)合。在步驟2中，聚合酶合成互補(bǔ)鏈。最后，解旋酶和聚合酶共同起作用，導(dǎo)致模板的擴(kuò)增(步驟3)。其它等溫?cái)U(kuò)增包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)，鏈置換擴(kuò)增是基于使用限制性酶在DNA的未修飾鏈上造成切口并通過核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶的作用來延伸切口處的3’末端以置換下游的DNA鏈。另一種等溫?cái)U(kuò)增是滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，其中線性ssDNA被退火到環(huán)狀ssDNA模板上，所述環(huán)狀ssDNA模板是通過使用DNA連接酶連接模板DNA的兩個(gè)末端而生成的。接著，使用DNA聚合酶延伸退火的引物，并生成互補(bǔ)模板序列的串聯(lián)連接的拷貝。RCA和SDA兩者都需要初始的熱變性步驟。其它等溫?cái)U(kuò)增包括例如切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)和相關(guān)的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)，兩者都采用切口酶和聚合酶來擴(kuò)增短的雙鏈模板序列(例如被描述在van Ness等.(2003)，Proc.Natl.Acad.Sc1.100(8):4504-4509 ;US-A1 2003/0082590 ；W0-A22004/022701 ；W0-A22009/012246 ；W0-A2 2004/067726 中，所有均通過參考結(jié)合于此)。然而，所有上述等溫?cái)U(kuò)增方法均需要復(fù)雜的反應(yīng)方案，是相對(duì)慢的和/或僅限于相對(duì)短的模板序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增核酸、優(yōu)選雙鏈核酸的改進(jìn)的方法，所述方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的這些限制。本發(fā)明的方法基于改良的HDA方法。所提供的方法比常規(guī)的tHDA快，同時(shí)具有可靠的特異性。與類似于NEAR和EXPAR的方法相比，本發(fā)明的方法可以擴(kuò)增更長(zhǎng)的模板核酸。本發(fā)明涉及在切口核酸內(nèi)切酶存在下執(zhí)行的HDA擴(kuò)增方法。因此，在本發(fā)明的情形下，在解旋酶、合適的聚合酶、和切口核酸內(nèi)切酶存在下擴(kuò)增模板核酸。具體地，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增模板核酸、特別是DNA的方法，其中所述方法包括在切口核酸內(nèi)切酶存在下使用解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)反應(yīng)、特別是嗜熱的HDA (tHDA)擴(kuò)增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列，或者在HDA反應(yīng)期間由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列被弓I入到模板核酸中?？梢允褂冒汕锌诤怂醿?nèi)切酶識(shí)別的序列的寡核苷酸引物將由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列引入到模板核酸中。這樣的引物可以包含不與模板核酸雜交但是包含由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列或其部分的5’標(biāo)簽序列。本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增核酸的試劑盒，所述試劑盒包含-切口核酸內(nèi)切酶，-解旋酶，和`-DNA 聚合酶。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于擴(kuò)增核酸，也可用于檢測(cè)核酸和/或?qū)怂徇M(jìn)行定量。


圖1示出了現(xiàn)有技術(shù)的且可商購(gòu)的例如來自于biohelix/ New England Biolabs的標(biāo)準(zhǔn)tHDA反應(yīng)、即在切口核酸內(nèi)切酶不存在下的tHDA反應(yīng)的方案。圖2示出了本發(fā)明的使用帶標(biāo)簽引物的切口 tHDA的具體實(shí)施方案的反應(yīng)方案。圖3示出了本發(fā)明的使用不帶標(biāo)簽引物的切口 tHDA的具體實(shí)施方案的反應(yīng)方案。圖4示出了在管掃描器中來自于實(shí)施例1的不同的實(shí)時(shí)(切口)tHDA反應(yīng)的結(jié)果(擴(kuò)增曲線)。圖中所示的是隨時(shí)間推移的原始熒光強(qiáng)度。圖5示出了實(shí)施例1的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔融曲線。A)標(biāo)準(zhǔn)tHDA，B)無Nb.BsmI的切口 tHDA，C)有 Nb.BsmI 的切口 tHDA。圖6示出了具有擴(kuò)增和電泳后的實(shí)施例1的各個(gè)反應(yīng)混合物的聚丙烯酰胺凝膠。A)染色前的凝膠，B)用EtBr染色后的凝膠。C)凝膠上各個(gè)條帶BI至B5的內(nèi)含物還被圖示在圖6B1至6B5中。圖7示出了實(shí)施例2的靶DNA連同所使用的引物的序列。
圖8示出了反應(yīng)速率對(duì)切口核酸內(nèi)切酶的濃度的依賴性。圖中示出的是在可以檢測(cè)到顯著高于背景信號(hào)的擴(kuò)增子信號(hào)之前的以分鐘(min)為單位的時(shí)間。在存在較低濃度的切口核酸內(nèi)切酶時(shí)，比無切口核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)早約5min檢測(cè)到信號(hào)，表示反應(yīng)更快。
圖9示出了標(biāo)準(zhǔn)tHDA即無任何切口核酸內(nèi)切酶的tHDA的擴(kuò)增曲線(隨時(shí)間推移的熒光)。在cDNA模板存在下測(cè)得三條曲線，在cDNA模板不存在下測(cè)得兩條曲線。圖10示出了在0.1U切口核酸內(nèi)切酶Nt.BstNBI存在下tHDA的擴(kuò)增曲線。在cDNA模板存在下測(cè)得三條曲線，在cDNA模板不存在下測(cè)得兩條曲線。圖11示出了在無切口核酸內(nèi)切酶Nt.BstNBI的標(biāo)準(zhǔn)tHDA之后的熔融曲線分析。對(duì)圖9中示出的反應(yīng)進(jìn)行熔融曲線分析。在cDNA模板存在下測(cè)得三條曲線，在cDNA模板不存在下測(cè)得兩條曲線。圖12示出了在0.1U切口核酸內(nèi)切酶Nt.BstNBI存在下標(biāo)準(zhǔn)tHDA之后的熔融曲線分析。對(duì)圖10中示出的反應(yīng)進(jìn)行熔融曲線分析。在CDNA模板存在下測(cè)得三條曲線，在cDNA模板不存在下測(cè)得兩條曲線。圖13示出了反應(yīng)速率對(duì)切口核酸內(nèi)切酶的存在的依賴性。圖中示出的是在可以檢測(cè)到顯著高于背景信號(hào)的擴(kuò)增子信號(hào)之前的以分鐘(min)為單位的時(shí)間。在切口核酸內(nèi)切酶存在下，比無切口核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)早約6min檢測(cè)到信號(hào)，表示反應(yīng)更快。圖14示出了實(shí)施例1的擴(kuò)增子的一條鏈的序列，實(shí)施例1的擴(kuò)增子是指淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)基因組的孔蛋白基因的一部分。指出了引物和探針的雜交區(qū)。(A):標(biāo)準(zhǔn)tHDA ; (B):本發(fā)明的方法的使用帶標(biāo)簽引物的切口 tHDA，帶下劃線的是Nb.BsmI的識(shí)別序列，由帶標(biāo)簽引物引入的序列是斜體的。詳細(xì)描述本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增并任選地檢測(cè)核酸、特別是DNA的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法基于解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)反應(yīng)。然而，不同于現(xiàn)有技術(shù)的HDA反應(yīng)，在本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)中存在切口核酸內(nèi)切酶。因此，本發(fā)明的試劑盒也包含切口核酸內(nèi)切酶。本發(fā)明的方法在本文中可以被稱為“切口 HDA”。具體地，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于擴(kuò)增和檢測(cè)短DNA序列，優(yōu)選小于400bp的序列，更優(yōu)選小于200bp的序列，甚至更優(yōu)選150bp以下的序列,最優(yōu)選在70bp和120bp之間的序列。典型地，用本發(fā)明的方法和試劑盒，擴(kuò)增或檢測(cè)雙鏈核酸。然而，也可以擴(kuò)增和檢測(cè)單鏈核酸，只要在實(shí)際的基于HDA的擴(kuò)增開始之前用聚合酶將它們轉(zhuǎn)錄成核酸雙鏈即雙鏈模板即可。具體地，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增模板核酸的方法，其中所述方法包括在切口核酸內(nèi)切酶存在下使用解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)反應(yīng)擴(kuò)增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列，或者在HDA反應(yīng)期間由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列被弓I入到模板核酸中?？梢圆捎枚喾N模板核酸、優(yōu)選采用雙鏈核酸來使用所述方法和試劑盒。典型地，用本發(fā)明的試劑盒和方法擴(kuò)增和/或檢測(cè)DNA。因此，在本發(fā)明的情形下，模板核酸優(yōu)選為雙鏈核酸，更優(yōu)選為DNA。例如，待擴(kuò)增或檢測(cè)的序列可以是線性DNA或環(huán)狀DNA。DNA例如可以選自基因組DNA,例如微生物基因組DNA、病毒DNA、質(zhì)粒DNA和cDNA。模板可以反轉(zhuǎn)錄自RNA，特別是mRNAo在本發(fā)明的情形下，“dsDNA”和“DNA”雙鏈?zhǔn)侵鸽p鏈DNA，“ssDNA”是指單鏈DNA，“dsRNA”是指雙鏈RNA，“ssRNA”是指單鏈RNA。還可以用本發(fā)明的試劑盒和方法擴(kuò)增其它核酸，例如dsRNA或DNA/RNA雜交體。可以在HDA之前執(zhí)行其它的酶促步驟例如反轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄，以形成可用的核酸。本發(fā)明要求待擴(kuò)增的模板核酸中存在由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列。由于不是每個(gè)待擴(kuò)增的靶序列都包含這樣的切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，因此，可以通過合適的引物來引入這樣的序列。因此，在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用包含由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列的寡核苷酸弓I物將由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列弓I入到模板核酸中。在某些實(shí)施方案中，包含由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列的弓丨物包含不與模板核酸雜交的5 ’標(biāo)簽序列，并且由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列處于所述標(biāo)簽序列中。這樣的引物在本文中被稱為“帶標(biāo)簽引物”，圖2中示意性示出了對(duì)應(yīng)的實(shí)施方案。還可以采用誘變引物，S卩，與原始模板序列不是100%互補(bǔ)的引物，由此引入合適的切口核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。本發(fā)明的HDA反應(yīng)優(yōu)選為嗜熱的HDA(tHDA)，即，所使用的酶在所述方法的溫度下是熱穩(wěn)定的。熱穩(wěn)定的酶典型地為源自于熱穩(wěn)定的生物的酶。因此，優(yōu)選地，在超過60°C、更優(yōu)選在60°C和70°C之間、甚至更優(yōu)選在60°C和65°C之間、最優(yōu)選在約64°C至65°C的溫度下執(zhí)行本發(fā)明的方法。例如可以使用水浴、加熱模塊、溫箱或熱循環(huán)儀來維持溫度。本發(fā)明的方法通常為等溫方法，這意味著，該方法是在單個(gè)溫度下執(zhí)行的，而不像例如在PCR中那 樣 需要溫度循環(huán)。然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在恒定的實(shí)際反應(yīng)溫度下執(zhí)行反應(yīng)之前，可以包括在典型地超過90°C、優(yōu)選約95°C的高溫下的熱變性步驟。于是，與在單個(gè)溫度下執(zhí)行的“一步法”方案不同，這被稱為“兩步法”反應(yīng)。在某些情況下，兩步法方案可以產(chǎn)生更高的靈敏度。因此，在本發(fā)明的情形下，兩步法方案是優(yōu)選的。事實(shí)上，在本發(fā)明的切口 HDA方法中，在解旋酶、聚合酶、切口酶以及合適的正向和反向寡核苷酸引物存在下溫育模板核酸。另外，需要存在用于擴(kuò)增反應(yīng)的其它試劑，例如dNTP、ATP或dATP以及鎂離子。反應(yīng)混合物優(yōu)選地還包含緩沖劑和鹽例如NaCl和/KCl。各個(gè)酶和試劑可以在開始擴(kuò)增之前被一起加入或者可以被順次加入。在某些具體實(shí)施方案中，在其它組分之后加入切口核酸內(nèi)切酶。在兩步法方案的優(yōu)選實(shí)施方案中，在初始的熱變性步驟之后加入酶。術(shù)語“引物”是指能夠與靶核酸上的單鏈區(qū)結(jié)合以促進(jìn)靶核酸的聚合酶依賴性復(fù)制的單鏈核酸。在本發(fā)明的情形下，向模板核酸添加一個(gè)或多個(gè)引物。使用一個(gè)引物引起線性擴(kuò)增，而使用兩個(gè)或甚至更多個(gè)引物引起指數(shù)擴(kuò)增。術(shù)語“解旋酶”在本文中是指能夠?qū)㈦p鏈核酸酶促解旋的任何酶。例如，解旋酶是可見于所有生物以及所有涉及核酸的過程例如復(fù)制、重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯和RNA剪接的酶。(Kornberg 和 Baker,《DNA 復(fù)制》(DNA Replication), W.H.Freeman andCompany (第2版(1992))，特別是第11章)。任何沿著DNA或RNA以5’至3’方向或以相反的3’至5’方向易位的解旋酶均可用于本發(fā)明的實(shí)施方案。這包括從原核生物、病毒、古生菌和真核生物獲得的解旋酶或天然存在的酶的重組形式，以及具有指定的活性的類似物或衍生物。由Kornberg和Baker在他們的書《DNA復(fù)制》，W.H.Freeman andCompany (第2版(1992))的第11章中描述的天然存在的DNA解旋酶的實(shí)例包括大腸桿菌(E.coli)解旋酶 1、I1、III 和 IV，Rep, DnaB, PriA, PcrA, T4 Gp41 解旋酶，T4 Dda 解旋酶，T7 Gp4解旋酶，SV40大T抗原，酵母RAD?？捎糜贖DA的其它解旋酶包括RecQ解旋酶(Harmon 和 Kowalczykowski, J.Biol, Chem.276:232-243 (2001))、來自于騰沖嗜熱菌(T.tengcongensis)和極端嗜熱菌(T.thermophilus)的熱穩(wěn)定的UvrD解旋酶(Collins和McCarthy, Extremophiles.7:35-41.(2003))、來自于水生嗜熱菌(T.aquaticus)的熱穩(wěn)定的 DnaB 解旋酶(Kaplan 和 Steitz, J.Biol.Chem.274:6889-6897 (1999))、以及來自于古生菌和真核生物的 MCM 解旋酶(Grainge 等，Nucleic Acids Res.31:4888-4898 (2003))。通常以5’至3’方向復(fù)制的解旋酶的實(shí)例是T7 Gp4解旋酶、DnaB解旋酶和Rho解旋酶，而以3’ -5’方向復(fù)制的解旋酶的實(shí)例包括UvrD解旋酶、PcrA、Rep、HCV的NS3 RNA解旋酶。解旋酶可能需要輔因子，即，解旋酶的解旋活性所需要的小分子劑。解旋酶的輔因子包括三磷酸核苷(NTP)和脫氧核苷三磷酸(dNTP濃度)和鎂(或其它二價(jià)陽離子)。例如，濃度在0.1-1OOmM范圍內(nèi)、優(yōu)選在1-1OmM范圍內(nèi)(例如3mM)的ATP (三磷酸腺苷)可以用作UvrD解旋酶的輔因子。類似地，在1-1OmM范圍內(nèi)(例如3mM)的dTTP (脫氧胸苷三磷酸)可以用作T7 Gp4B解旋酶的輔因子。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，特別是對(duì)于非嗜熱的HDA來說，反應(yīng)中可以存在其它蛋白例如拓?fù)洚悩?gòu)酶或輔助蛋白例如單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)，以便促進(jìn)解旋酶活性。在單鏈結(jié)合蛋白(SSB)存在下，解旋酶顯示出改進(jìn)的活性。在這些情況下，SSB的選擇通常不限于特定的蛋白。 單鏈結(jié)合蛋白的實(shí)例是T4基因32蛋白、大腸桿菌SSB、T7gp2.5 SSB、噬菌體phi29 SSB (Kornberg和Baker,同上(1992))和前述蛋白的截短形式。在使用熱穩(wěn)定的解旋酶的情況下，一種或多種SSB或其它輔助蛋白的存在是任選的。在EP-Bl I 539 979中，特別是在
至
章節(jié)中更詳細(xì)地描述了用于HDA和tHDA中的解旋酶和包含解旋酶的制劑。優(yōu)選地，在超過50 V、優(yōu)選在50 V和70 V之間、更優(yōu)選在60 °C和65 °C之間的溫度下執(zhí)行本發(fā)明的切口 HDA擴(kuò)增反應(yīng)。在本發(fā)明的情形下，解旋酶可以來自于不同的解旋酶家族。解旋酶優(yōu)選選自超家族I解旋酶、超家族II解旋酶、超家族III解旋酶、來自于dnaB樣超家族的解旋酶或者來自于rho樣超家族的解旋酶。解旋酶可以源自于嗜中溫或耐熱的生物。解旋酶可以是遺傳或化學(xué)修飾的。超家族I解旋酶例如包括dda、pcrA、F質(zhì)粒tral蛋白解旋酶和UvrD。超家族II解旋酶例如包括recQ和NS3解旋酶。超家族III解旋酶例如包括AAV rep解旋酶。來自于dnaB樣超家族的解旋酶例如包括T7噬菌體解旋酶。在本發(fā)明的方法和試劑盒的情形下，優(yōu)選的是，解旋酶是熱穩(wěn)定的解旋酶。熱穩(wěn)定的Tte-UvrD解旋酶是優(yōu)選的。拓?fù)洚悩?gòu)酶可用于長(zhǎng)HDA反應(yīng)，以提高HDA擴(kuò)增長(zhǎng)的靶擴(kuò)增子的能力。當(dāng)解旋酶將非常長(zhǎng)的線性DNA雙鏈分離開時(shí)，拓?fù)洚悩?gòu)酶的旋轉(zhuǎn)(松弛)功能消除纏繞并防止過旋(Kornberg 和 Baker,同上(1992))。例如，大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (Fermentas, Vilnius,Lithuania)可通過在一條DNA鏈中引入切口而用于松弛負(fù)超螺旋DNA。相反，大腸桿菌DNA促旋酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶II)在DNA中引入瞬時(shí)的雙鏈斷裂，從而允許DNA鏈相互穿過(Kornberg 和 Baker,同上(1992))。原則上，可以選擇在所需的反應(yīng)溫度下有活性、即能夠延長(zhǎng)游離3’ -OH末端的所有聚合酶。具有附加功能例如校對(duì)功能、核酸內(nèi)切酶活性、鏈置換活性和/或反轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶也可用于本發(fā)明的情形?；诔掷m(xù)性和鏈置換活性，選擇用于HDA的聚合酶。在熔融并與引物雜交之后，使核酸經(jīng)受聚合步驟。如果待擴(kuò)增的核酸是DNA，則選擇DNA聚合酶。當(dāng)初始IE標(biāo)是RNA時(shí),則首先使用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA祀標(biāo)復(fù)制成cDNA分子,然后通過所選擇的DNA聚合酶在HDA中進(jìn)一步擴(kuò)增cDNA。DNA聚合酶作用于靶核酸，以在4種dNTP存在下延伸與核酸模板雜交的引物，從而形成與核酸模板上的核苷酸序列互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。DNA聚合酶選自缺乏5’至3’核酸外切酶活性的聚合酶，并且所述聚合酶還可以任選地缺乏3’ -5’核酸外切酶活性。合適的DNA聚合酶的實(shí)例包括大腸桿菌DNA聚合酶I的核酸外切酶缺陷的Klenow片段(New England Biolabs, Inc.(Beverly,MA))、核酸外切酶缺陷的T7 DNA聚合酶(測(cè)序酶；USB (Cleveland, 0H))、大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段(New England Biolabs,Inc.(Beverly, MA))、Bst DNA 聚合酶的大片段(New England Biolabs, Inc.(Beverly,MA))、KlenTaq DNA 聚合酶(AB Peptides (St Louis，MO))、T5 DNA 聚合酶(美國(guó)專利N0.5，716，819)、和Pol III DNA聚合酶(美國(guó)專利N0.6，555，349)。在本發(fā)明的情形下，優(yōu)選的是具有鏈置換活性的DNA聚合酶，例如大腸桿菌DNA聚合酶I的核酸外切酶缺陷的Klenow片段、Bst DNA聚合酶的大片段和測(cè)序酶。T7聚合酶是高保真的聚合酶，出錯(cuò)率為 3.5x10s,顯著低于 Tag 聚合酶(Keohavong 和 Thilly, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86,9253-9257(1989))。然而，T7聚合酶不是熱穩(wěn)定的，因此，對(duì)于在需要熱循環(huán)的擴(kuò)增系統(tǒng)中的使用而言，T7聚合酶不是最佳的。在可以等溫執(zhí)行的HDA中，T7測(cè)序酶是用于擴(kuò)增DNA的優(yōu)選聚合酶之一。在本發(fā)明的方法和試劑盒的情形下，聚合酶優(yōu)選為熱穩(wěn)定的聚合酶。優(yōu)選地，聚合酶選自Bst DNA聚合酶、PyroPhage`聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent (exo_)聚合酶。沒有顯著的核酸外切酶活性的聚合酶是優(yōu)選的。一般來說，適合用于HDA和切口 HDA的引物是短的合成寡核苷酸，例如具有大于10個(gè)核苷酸且小于50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)涉及多種參數(shù)，例如基于鏈的比對(duì)得分(string-based alignment score)、熔融溫度、弓I物長(zhǎng)度和GC含量(Kampke等，Bioinformatics 17:214-225 (2003))。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，重要的因素之一是選擇的序列在待擴(kuò)增的核酸分子特有的靶片段內(nèi)。另一個(gè)重要因素是確定用于HDA反應(yīng)的引物的熔融溫度。引物的熔融溫度由寡核苷酸的長(zhǎng)度和GC含量決定。優(yōu)選地，引物的熔融溫度在會(huì)發(fā)生雜交和擴(kuò)增的溫度范圍內(nèi)。例如，如果當(dāng)使用大腸桿菌UvrD解旋酶制劑時(shí)，雜交和擴(kuò)增的溫度被設(shè)定在37°C，則被設(shè)計(jì)用于該反應(yīng)的引物對(duì)的熔融溫度應(yīng)在約30°C至50°C范圍內(nèi)。如果雜交和擴(kuò)增的溫度是60°C，則被設(shè)計(jì)用于該反應(yīng)的引物對(duì)的熔融溫度應(yīng)在55°C和70°C之間、優(yōu)選在55°C和65°C之間的范圍內(nèi)。熔融溫度顯著高于反應(yīng)溫度的引物可能引起非特異性副反應(yīng)，因此是不太優(yōu)選的。為了選擇用于HDA反應(yīng)的最佳引物，可以在平行分析中測(cè)試一組具有各種不同的熔融溫度的引物。Kampke等，Bioinformatics 17:214-225(2003)描述了關(guān)于引物設(shè)計(jì)的更多信息。各引物與靶核酸的每一末端雜交，并可以由聚合酶使用靶核苷酸序列作為模板以3’至5’方向延伸。雜交條件是如《分子克隆和實(shí)驗(yàn)指南》(“Molecular Cloning and Laboratory Manual，，)第二版，Sambrook、Rich 和 Maniatis 出版,Cold Spring Harbor (2003)中描述的標(biāo)準(zhǔn)條件。為了實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，同源或完全匹配的引物是優(yōu)選的。然而，引物可以在5’末端包含不與靶核苷酸序列互補(bǔ)的序列?；蛘?，整個(gè)引物中都可以含有不與靶核酸精確互補(bǔ)的核苷酸或序列。引物可以表示類似的引物，或者可以是用于HDA的非特異性引物或通用引物，只要可以在預(yù)定溫度下通過引物-模板結(jié)合實(shí)現(xiàn)特異性雜交即可。引物可以包含脫氧核糖核苷酸堿基A、T、G或C中的任一種和/或一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸堿基A、C、U、G和/或一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，其中修飾不會(huì)阻止引物與核酸的雜交或者引物的延長(zhǎng)或者雙鏈分子的變性。可以用化學(xué)基團(tuán)例如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或者用非核苷酸接頭修飾引物，以提高它們的性能或促進(jìn)擴(kuò)增產(chǎn)物的表征。為了檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，可以使引物經(jīng)受修飾，例如熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和生物素化。其它標(biāo)記方法包括放射性同位素、發(fā)色團(tuán)和配體例如生物素或半抗原，所述配體盡管不能被直接檢測(cè)到，但可以通過與其特異性結(jié)合伙伴例如分別為抗生物素蛋白和抗體的標(biāo)記形式反應(yīng)而被容易地檢測(cè)到?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法制備如本文所述的引物。(參見，例如美國(guó)專利N0.6，214，587)。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用一對(duì)的兩個(gè)序列特異性引物來實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)擴(kuò)增，其中一個(gè)引物與靶序列的5’邊界雜交，另一個(gè)引物與靶序列的3’邊界雜交。該方法可以容易地與Lee等(J.Mol.Biol.316:19-34(2002))區(qū)分開。在單個(gè)HDA反應(yīng)中可以利用多對(duì)引物以擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，同時(shí)在多重反應(yīng)中使用不同的檢測(cè)標(biāo)簽。多重反應(yīng)常用于SNP分析以及病原體檢測(cè)(Jessing等，J.Clin.Microbiol.41:4095-4100 (2003))。例如可以使用PrimerQuest 程序(http://www.1dtdna.com/ScitooIs/Applications/Primerquest/Advanced.aspx)或 Primer3 程序(http://frod0.w1.mit.edu/cg1-bin/primer3/primer3_www.cgi)來設(shè)計(jì) tHDA 引物。在本文中使用時(shí)，“切`口 ”是指在相對(duì)于由執(zhí)行切口的酶識(shí)別的核苷酸序列而言的特定位置處只對(duì)完全雙鏈的核酸分子或部分雙鏈的核酸分子的雙鏈部分的一條鏈進(jìn)行的切割。其中核酸被切口的特定位置被稱為“切口位點(diǎn)”。“切口核酸內(nèi)切酶”是識(shí)別完全或部分雙鏈的核酸分子的特定核苷酸序列并在相對(duì)于識(shí)別序列而言的特定位置處只切割核酸分子的一條鏈的酶。在本文中使用時(shí)，“切口核酸內(nèi)切酶”是指識(shí)別完全或部分雙鏈的核酸分子的核苷酸序列并在相對(duì)于識(shí)別序列而言的特定位置處只切割核酸分子的一條鏈的核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶典型地識(shí)別只由天然核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，并只切割含有核苷酸序列的完全或部分雙鏈的核酸分子的一條鏈。在本發(fā)明的方法和試劑盒的情形下，切口核酸內(nèi)切酶優(yōu)選為熱穩(wěn)定的切口核酸內(nèi)切酶。切口核酸內(nèi)切酶是可商購(gòu)的，例如購(gòu)自New England Biolabs (NEB)。優(yōu)選地，切口核酸內(nèi)切酶選自 Nb.BsmI,Nt.BstNBI,Nt.CviPII,Nb.BbvC1、Nb.BsrDI,Nb.BtsI,Nt.BsmA1、Nt.BbvCI,Nt.BspQI和Nt.Alw10 Nb.BsmI和Nt.BstNBI是特別優(yōu)選的切口核酸內(nèi)切酶。例如通過遺傳工程改造標(biāo)準(zhǔn)的限制性核酸內(nèi)切酶而獲得的切口核酸內(nèi)切酶也可用于本發(fā)明的情形。Nb.BsmI是只切割雙鏈DNA底物上的一條DNA鏈的切口核酸內(nèi)切酶；它識(shí)別序列5’-GAATGC-3’并在互補(bǔ)鏈上如斜線所指示的進(jìn)行切割:5’-G/CATTC_3’。Nt.BstNBI是位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶，其只切割雙鏈DNA底物上的一條DNA鏈；它在其識(shí)別序列5’-GAGTC-3’的3’側(cè)之外4個(gè)堿基處催化單鏈斷裂。根據(jù)本發(fā)明所使用的反應(yīng)溫度，選擇在該溫度下有活性的合適的切口核酸內(nèi)切酶。在“包含標(biāo)簽序列的引物”(“帶標(biāo)簽引物”)的情況下，“由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列”(“切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列”)可以完全或部分處于所述標(biāo)簽序列中。切割位點(diǎn)也可以處于所述標(biāo)簽序列中，或者它可以在上游或下游的一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)(bp)處。切割位點(diǎn)(“切口位點(diǎn)”)可以在與所指示的識(shí)別序列相同的鏈上，或者在另一條鏈上。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以被描述為包括以下步驟: ( i )提供雙鏈模板核酸，(ii)使模板核酸與用于使雙鏈模板核酸解旋的解旋酶接觸，以形成至少部分單鏈的模板核酸，(iii)加入用于與步驟(ii)的單鏈模板雜交的寡核苷酸引物，其中至少一個(gè)寡核苷酸弓I物包含由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列，(iv)用聚合酶合成與單鏈模板核酸互補(bǔ)的寡核苷酸引物的延伸產(chǎn)物，以形成雙鏈模板核酸，(V)使在步驟(iv)中合成的雙鏈模板核酸與用于在模板核酸中引入切口的切口核酸內(nèi)切酶接觸，(vi)使步驟(V)的模板核酸與使雙鏈模板核酸解旋的解旋酶接觸，以形成至少部分單鏈的模板核酸，(vii)加入用于與步驟(vi )的單鏈模板雜交的寡核苷酸引物，(Viii)用聚合酶合成與單鏈模板核酸互補(bǔ)的寡核苷酸引物的延伸產(chǎn)物，以形成雙鏈模板核酸，(ix)根據(jù)需要重復(fù)步驟(V)至(Viii)，以擴(kuò)增模板核酸。在擴(kuò)增單鏈模板核酸的情況下，必須通過例如反轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄將單鏈模板核酸轉(zhuǎn)錄成雙鏈核酸。 在本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案中，寡核苷酸引物的由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列處于不與模板核酸雜交的5’標(biāo)簽序列中，并且所述方法在步驟(iv)和(V)之間還包括以下步驟:(a)使步驟(iv)的模板核酸與用于使雙鏈模板核酸解旋的解旋酶接觸，以形成至少部分單鏈的模板核酸，(b)加入用于與步驟(a)的單鏈模板雜交的寡核苷酸引物，(c)用聚合酶合成與單鏈模板核酸互補(bǔ)的寡核苷酸引物的延伸產(chǎn)物，以形成雙鏈模板核酸。在圖2中示意性地示出了在DNA上使用帶標(biāo)簽引物的切口 tHDA反應(yīng)的過程:步驟A:通過解旋酶將dsDNA (“靶DNA”，“模板DNA”)解旋，并且引物對(duì)與單鏈DNA結(jié)合。一個(gè)引物具有不與模板DNA雜交的5’標(biāo)簽序列。DNA聚合酶開始合成從引物開始的互補(bǔ)鏈。步驟B:形成兩條雙鏈產(chǎn)物DNA:基于不帶標(biāo)簽引物的產(chǎn)物I對(duì)應(yīng)于模板DNA并再次進(jìn)入步驟A中的反應(yīng)；產(chǎn)物I’包含標(biāo)簽序列并被解旋酶解旋。步驟C:通過DNA聚合酶合成產(chǎn)物I’的互補(bǔ)鏈。步驟D:—條鏈產(chǎn)生產(chǎn)物I’并再次進(jìn)入步驟C中的反應(yīng)，另一條鏈產(chǎn)生產(chǎn)物2，產(chǎn)物2包含具有功能性切口位點(diǎn)和切口酶識(shí)別序列的標(biāo)簽序列。步驟E:產(chǎn)物2的一條鏈在切口位點(diǎn)處被切割，并被解旋酶從另一末端開始解旋。DNA聚合酶延長(zhǎng)切割位點(diǎn)處的3’末端并置換鏈(“鏈置換擴(kuò)增”(SDA))。引物結(jié)合在另一條鏈上并被DNA聚合酶延長(zhǎng)。步驟F:引物延長(zhǎng)產(chǎn)生了兩種產(chǎn)物，產(chǎn)物3包含標(biāo)簽序列，產(chǎn)物3’不包含標(biāo)簽序列。產(chǎn)物3在切口位點(diǎn)處被再次切割，并合成了互補(bǔ)鏈。產(chǎn)物3’被解旋酶解旋。步驟Gl:產(chǎn)物3的擴(kuò)增產(chǎn)生了再次進(jìn)入步驟Gl的產(chǎn)物3和進(jìn)入步驟G2的產(chǎn)物3’。步驟G2:合成兩條ssDNA鏈的互補(bǔ)鏈，產(chǎn)生了再次進(jìn)入步驟E和G2中的反應(yīng)的產(chǎn)物2和3’。總反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)物3的積累?？梢杂秒s交探針例如與擴(kuò)增子的反向鏈互補(bǔ)的雜交探針檢測(cè)該產(chǎn)物。在圖3中示意性地示出了在DNA上使用不帶標(biāo)簽引物的切口 tHDA反應(yīng)的過程。步驟A:向dsDNA添加包含至少一個(gè)引物、DNA聚合酶、解旋酶和切口核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)混合物。引物包含切口核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。dsDNA被解旋酶解旋，引物與單鏈雜交并被延長(zhǎng)。在一條鏈中引入了切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。步驟B:所產(chǎn)生的dsDNA被切口核酸內(nèi)切酶切割。步驟C:解旋酶將dsDNA解旋，舊的引物或新結(jié)合的引物在3’末端處被DNA聚合酶延長(zhǎng)。在下文中，總結(jié)了 DNA的一步法和兩步法切口 tHDA反應(yīng)的典型的但僅僅是示例性的并且是非限制性的方案:兩步法tHDA方案1.向包含dNTP、dATP或ATP，鎂離子(例如硫酸鎂MgSO4),緩沖劑例如Tris HCl，以及鹽例如NaCl和/或KCl的合適的水性反應(yīng)緩沖液中加入模板DNA以及正向和反向引物。例如微量離心管類型可以被用作反應(yīng)容器。2.將反應(yīng)混 合物加熱至變性溫度(例如95°C，持續(xù)例如2min)，任選地在4°C下冷卻或置于冰上，然后在實(shí)際反應(yīng)溫度下持續(xù)短時(shí)間(例如64°C或65°C，持續(xù)例如I至3min)。然后，任選地將反應(yīng)混合物置于冰上或4°C。3.向反應(yīng)混合物中加入酶，即解旋酶、DNA聚合酶和切口酶。例如可以通過短暫的渦旋或通過移液管吹打輕輕地混合反應(yīng)混合物?？梢詫⒚割A(yù)先混合在合適的緩沖液中。4.在合適的溫度下例如在64°C或65°C下將反應(yīng)混合物溫育合適的時(shí)間，例如60至90min,優(yōu)選為60至75min。一步法tHDA方案對(duì)于一步法方案而言，略過了兩步法方案的步驟2。在步驟I之后，直接進(jìn)行到步驟3。用于本發(fā)明的方法的典型緩沖條件如下:-Tris:5 至 IOOmM,優(yōu)選為 IOmM-ρΗ7.5 至 9.5，優(yōu)選為 ρΗ8.8-KCl:0 至 50mM，優(yōu)選為 5mM-MgSO4: I 至 6mM，優(yōu)選為 3.5mM-NaCl:0 至 IOOmM,優(yōu)選為 40mM
-dNTP:0.1 至 ImM，優(yōu)選為 0.4mM-(d) ATP (即 dATP 和 / 或 ATP):1 至 7mM，優(yōu)選為 3mM-引物(正向):0.02 至 1.5 μ Μ，優(yōu)選為 0.1 μ M-引物(反向):0.02 至 1.5 μ Μ，優(yōu)選為 0.1 μ M-切口核酸內(nèi)切酶:0.01-10U/反應(yīng)，優(yōu)選為0.5至3U/反應(yīng)(25 μ I/反應(yīng))-聚合酶:0.3至 3U/μ 1，優(yōu)選為 0.6 至 2U/μ I-解旋酶:1至 IOOng/ μ I,優(yōu)選為 3 至 20ng/ μ I任選地可以加入甜菜堿，優(yōu)選其濃度為100至2000mM，優(yōu)選為700至1200mM。然而，這些只是示例性的條件，可以根據(jù)其它參數(shù)例如所使用的具體的酶、模板和/或引物序列或者溫度對(duì)所述條件進(jìn)行調(diào)整。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。例如可以使用凝膠電泳、嵌入染料或特異性寡核苷酸探針來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物?？赏ㄟ^多種方法來檢測(cè)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物，所述方法包括溴化乙錠染色以及用選自以下的標(biāo)簽檢測(cè)擴(kuò)增的序列:放射性標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽和酶。例如可以使用熒光標(biāo)記的LUX 引物(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)實(shí)時(shí)檢測(cè)HDA擴(kuò)增產(chǎn)物,所述引物是在3’末端附近設(shè)計(jì)有熒光團(tuán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。該構(gòu)型固有地賦予了熒光猝滅能力，而無需單獨(dú)的淬滅基團(tuán)。當(dāng)引物變成被摻入到雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物中時(shí)，熒光團(tuán)被去淬滅化，導(dǎo)致熒光信號(hào)顯著增加 。寡核苷酸探針優(yōu)選包含熒光標(biāo)簽，即典型地為共價(jià)連接的熒光染料。具體地，熒光標(biāo)記的探針可以標(biāo)記有選自以下的染料:FAM、VIC、NED、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET, TAMRA, JOE、ROX, BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅、亞基馬黃、Alexa Fluor和PET。合適的雜交探針包括LightCycler探針(Roche)、TaqMan探針(Roche)、分子信標(biāo)、Scorpion引物、Sunrise引物、LUX引物和Amplifluor引物。在本發(fā)明的情形下，TaqMn探針是優(yōu)選的。本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增核酸的試劑盒，所述試劑盒包含-切口核酸內(nèi)切酶，-解旋酶，和-DNA 聚合酶。對(duì)于本發(fā)明的方法而言，試劑盒的解旋酶優(yōu)選選自:超家族I解旋酶，例如dda、pcrA、F質(zhì)粒tral蛋白解旋酶和UvrD ;超家族II解旋酶，例如recQ和NS3解旋酶；超家族III解旋酶，例如AAV rep解旋酶；來自于dnaB樣超家族的解旋酶，例如T7噬菌體解旋酶；以及來自于rho樣超家族的解旋酶。優(yōu)選的是，解旋酶是熱穩(wěn)定的解旋酶。熱穩(wěn)定的Tte-UvrD解旋酶是特別優(yōu)選的。試劑盒的聚合酶優(yōu)選自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。試劑盒的切口核酸內(nèi)切酶優(yōu)選自 Nb.Bsm1、Nt.BstNB1、Nt.CviPI1、Nb.BbvC1、Nb.BsrD1、Nb.Bts1、Nt.BsmA1、Nt.BbvC1、Nt.BspQI 和 Nt.AlwI。本發(fā)明的試劑盒還可以包含
-緩沖劑，例如Tris，和/或-dNTP，和 / 或-(d)ATP，和 / 或-鎂鹽，例如磷酸鎂,和/或-NaCl，和 / 或-KCl。本發(fā)明的試劑盒還可以包含拓?fù)洚悩?gòu)酶和/或SSB。試劑盒的各個(gè)組分可以在一個(gè)或多個(gè)容器中。兩個(gè)或更多個(gè)組分可以例如共同在一個(gè)容器例如反應(yīng)管或小瓶中。優(yōu)選地，緩沖劑、鹽、dNTP以及如果存在的話還有(d)ATP在預(yù)先混合的溶液中。所述試劑盒還可以包含手冊(cè)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的方法和試劑盒在擴(kuò)增和/或檢測(cè)核酸中的應(yīng)用。所述方法和試劑盒例如可以用于檢測(cè)微生物、病毒、病原體、人類的基因組DNA和cDNA等。對(duì)其中的核酸進(jìn)行檢測(cè)的樣品例如可以是臨床樣品例如體液，例如血液、血漿、血清和尿液；或者可以是來自于環(huán)境、植物、動(dòng)物、牲畜、食品的樣品或來自于犯罪現(xiàn)場(chǎng)的樣品。所述方法和試劑盒例如可以用于專用的實(shí)驗(yàn)室、護(hù)理點(diǎn)或現(xiàn)場(chǎng)。核酸可以在擴(kuò)增之前從樣品中被純化和/或分離，或者它們可以在樣品中被直接擴(kuò)增和/或檢測(cè)。下面的實(shí)施例示出了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但所述實(shí)施例不是限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例1:俥用帶標(biāo)簽引`物的切口 tHDA在該實(shí)施例中，使用標(biāo)準(zhǔn)tHDA和本發(fā)明的切口 tHDA方法分別擴(kuò)增和檢測(cè)了來自于淋病奈瑟氏菌基因組的孔蛋白基因的序列(SEQ ID NO:1):5，-ATTTGTTCCGAGTCAAAACAGCAAGTCCGCCTATACGCCTGCTACTTTCACGCTGGAAAGTAATCAGATGAAACCAGTTCCG-3，a)材料:表1:用于擴(kuò)增和檢測(cè)SEQ ID NO:1的引物和探針
權(quán)利要求
1.用于擴(kuò)增模板核酸的方法， 其中所述方法包括在切口核酸內(nèi)切酶存在下使用解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)反應(yīng)擴(kuò)增所述模板核酸，并且 其中所述模板核酸包含由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列，或者在HDA反應(yīng)期間由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列被引入到模板核酸中，其中HDA反應(yīng)是嗜熱的HDA(tHDA)，其中使用包含由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列的寡核苷酸引物將由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列引入到模板核酸中，并且其中擴(kuò)增的序列短于400bp。
2.權(quán)利要求1的方法，其中包含由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列的所述引物包含不與模板核酸雜交的5’標(biāo)簽序列，并且由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列處于所述標(biāo)簽序列中。
3.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中模板核酸是雙鏈模板核酸，優(yōu)選為DNA。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中解旋酶選自:超家族I解旋酶,例如dda、pcrA、F質(zhì)粒tral蛋白解旋酶和UvrD ;超家族II解旋酶，例如recQ和NS3解旋酶；超家族III解旋酶，例如AAV rep解旋酶；來自于dnaB樣超家族的解旋酶，例如T7噬菌體解旋酶；以及來自于rho樣超家族的解旋酶。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中聚合酶選自BstDNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce 聚合酶和 Vent (exo_)聚合酶。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中切口核酸內(nèi)切酶選自Nb.Bsm1、Nt.BstNBI,Nt.CviPI1、Nb.BbvC1、Nb.BsrD1、Nb.Bts1、Nt.BsmA1、Nt.BbvC1、Nt.BspQI 和 Nt.AlwI。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在超過50°C、優(yōu)選在50°C和70°C之間、更優(yōu)選在60°C和65°C之間的溫度下執(zhí)行HDA擴(kuò)增反應(yīng)。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括初始的熱變性步驟。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。
10.權(quán)利要求9的方法，其中使用凝膠電泳、嵌入染料或特異性寡核苷酸探針來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
11.用于擴(kuò)增核酸的試劑盒，其包含 -切口核酸內(nèi)切酶， -解旋酶，和 -DNA聚合酶。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其還包含 -緩沖劑，例如Tris，和/或 -dNTP，和 / 或 -(d)ATP，和 / 或 -鎂鹽，例如磷酸鎂，和/或 -NaCl，和 / 或 -KCl。
13.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求11或12任一項(xiàng)的試劑盒在擴(kuò)增并任選檢測(cè)核酸序列中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增模板核酸的方法，其中所述方法包括在切口核酸內(nèi)切酶存在下使用解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)反應(yīng)擴(kuò)增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列，或者在HDA反應(yīng)期間由所述切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列被引入到模板核酸中。本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增核酸的試劑盒，所述試劑盒包含切口核酸內(nèi)切酶、解旋酶和DNA聚合酶。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103108961SQ201180039588
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者克里斯蒂安·科夫哈格, 戈?duì)柕隆じ衤搴郎? 托馬斯·羅特曼, 拉爾夫·希默爾賴希 申請(qǐng)人:凱杰有限公司