專利名稱：涉及編碼pae以及pae樣多肽的基因并具有改變的貯藏化合物水平的植物種子、相關(guān)的構(gòu) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及在植物和種子中編碼果膠乙酰酯酶(PAE)和果膠乙酰酯酶樣(PAE樣)蛋白質(zhì)的分離的核酸片段以及此類片段用于調(diào)節(jié)編碼PAE或PAE樣活性的基因的表達(dá)的用途。
背景技術(shù)：
在成熟期，大豆種子干重的約40%是蛋白質(zhì)，并且20%是可提取的油。這些組成了大豆作物的有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物。例如，植物油是可得自植物的最富含能量的生物質(zhì)；它們具有碳水化合物兩倍的能含量。另外，只需要很少的能量來提取植物油并將其轉(zhuǎn)化成燃料。在種子重量的剩余40%中，約10%是可溶性碳水化合物?？扇苄蕴妓衔锊糠謱?duì)大豆種子的經(jīng)濟(jì)價(jià)值沒有多少貢獻(xiàn)，并且可溶性碳水化合物級(jí)分的主要組分棉籽糖對(duì)加工過程和對(duì)大豆粉在單腹動(dòng)物中的食物價(jià)值都是有害的(Coon等人(1988) Proceedings SoybeanUtilization Alternatives, Univ.0f Minnesota,第 203-211 頁X因?yàn)楦玫睦斫饬朔N子中貯藏化合物生物合成途徑，很顯然，有可能通過改變油、淀粉和可溶性碳水化合物生物合成途徑中的特定酶的催化活性來調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中貯藏化合物庫的大小(Taiz L.等人 ，PlantPhysiology ;The Benjamin/Cummings PublishingCompany:New York, 1991)。例如，調(diào)查L(zhǎng)PAT和DAGAT的過表達(dá)的研究顯示出，使甘油主鏈?；淖罱K步驟在種子中對(duì)于向著脂質(zhì)的流量發(fā)揮了重要的控制作用。通過過表達(dá)酵母甘油3-磷酸脫氫酶也可在油籽油菜中提高種子油含量，而在質(zhì)粒中的脂肪酸從頭合成所涉及的各個(gè)基因(例如乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合酶)的過表達(dá)基本上沒有改變所積累的脂質(zhì)的量(Vigeolas H.等人，Plant BiotechnologyJ.5,431-441 (2007))。在擬南芥中已鑒定了低種子油突變體wrinkledl。該突變明顯產(chǎn)生了碳水化合物代謝的種子特異性調(diào)控中的缺陷(Focks,Nicole 等人,Plant Physiol.(1998), 118 (I) , 91-101 )。持續(xù)關(guān)注鑒定編碼可在植物中調(diào)節(jié)貯藏化合物諸如油、蛋白質(zhì)、淀粉和可溶性碳水化合物的合成的蛋白質(zhì)的基因。絲氨酸水解酶類是自然界中富含的，并且在例如蛋白酶、脂肪酶、酯酶和轉(zhuǎn)移酶的酶中發(fā)揮不同的生物化學(xué)作用。全部這些相異的酶類在活性位點(diǎn)均有絲氨酸殘基，其在親核攻擊中作為底物從而形成共價(jià)中間體。已從植物和微生物中純化了果膠乙酰酯酶(PAE) (EC3.1.1.6)。PAE特異性地使乙酰化碳水化合物聚合物如木聚糖和果膠去乙?；AE已顯示例如在半乳糖醛酸殘基的C2和/或C3位置從甜菜果膠除去乙酰酯基團(tuán)(Nielsen, John E.；Christensen, Tove M.1.E.Distribution of pectin methylesterase and acetylesterase in thegenus Citrus visualized by tissue prints andchromatography.Plant Science (Shannon，Ireland) (2002)，162 (5)，799-807)。編碼來自植物的PAE的基因已被克隆和測(cè)序(Christensen等人，Protein and cDNA sequences oforange fruit pectin acetylesterase, and uses thereof0 PCT 國(guó)際申請(qǐng)(2000)，第 88頁C0DEN:PIXXD2W02000017368A120000330)。在接受了深度基因組或EST (表達(dá)序列標(biāo)記)測(cè)序的每種植物中，已鑒定了編碼與PAE具有相似性的蛋白質(zhì)的大基因家族。就PAE基因家族而言，不同的序列性質(zhì)和所觀察到的表達(dá)模式表明，基因家族成員有多糖的去乙?；獾纳锘瘜W(xué)功能。對(duì)于這些與具有PAE相似性的蛋白質(zhì)的可能的作用，進(jìn)行的研究很少。根據(jù)編碼PAE樣蛋白質(zhì)的基因在植物中普遍存在的性質(zhì)，對(duì)它們?cè)谥参锷L(zhǎng)和發(fā)育中，特別是在貯藏化合物在種子中含量的調(diào)控中的作用的深入研究是極為受關(guān)注的。

發(fā)明內(nèi)容
在第一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于 Clustal V 比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中來自所述轉(zhuǎn)基因植物的種子在與來自不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物的種子進(jìn)行比較時(shí)具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第二實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于 Clustal V 比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、
58、60、62、64、66、68或85進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列 ，并且其中所述轉(zhuǎn)基因種子在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照種子進(jìn)行比較時(shí)具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第三實(shí)施例中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子包含:重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(a)可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ IDNO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(b)包含至少一種調(diào)控元件的抑制DNA構(gòu)建體，所述調(diào)控元件可操作地連接到:(i)以下序列的全部或部分:(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽基于 Clustal V 比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列來源于受關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域基于Clustal V比對(duì)方法在與所述區(qū)域所源自的有義鏈或反義鏈的所述全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受關(guān)注的靶基因編碼PAE樣蛋白質(zhì)，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第四實(shí)施例中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子在與非轉(zhuǎn)基因的種子的油含量進(jìn)行比較時(shí)，基于干重計(jì)具有提高了至少4%的油含量，其中所述轉(zhuǎn)基因種子包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(a)如SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所不的核苷酸序列的全部或部分；或(b) (a)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列:其中(a)或(b)具有足以抑制內(nèi)源性活性在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度，并且進(jìn)一步地其中所述種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的種子相比，基于干重計(jì)具有至少4%的油含量的提聞。
在第五實(shí)施例中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(a) SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或(b)(a)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列:其中(a)或
(b)具有足以抑制內(nèi)源性PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度，并且進(jìn)一步地其中所述種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的種子相比，基于干重計(jì)具有至少4%的油含量的提聞。在第六實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括:Ca)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ IDNO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或 84 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；和(b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及(c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第七實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括:(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(i)如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或
(ii)⑴的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；其中⑴或(ii)具有足以抑制內(nèi)源性PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度；(b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及(c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第八實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括:(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(i)如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或
(ii)⑴的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；其中⑴或(ii)具有足以抑制內(nèi)源性PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度；(b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及(c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比，基于干重計(jì)具有至少4%的油含量的提高。在第九實(shí)施例中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子包含:重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(a)可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ IDN0:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；或(b)包含至少一種調(diào)控元件的抑制DNA構(gòu)建體，所述調(diào)控元件可操作地連接到:(i)以下序列的全部或部分:(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽基于 Clustal V 比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、
64、66、68或85進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B)(b) (i) (A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列來源于受關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域基于Clu stal V比對(duì)方法在與所述區(qū)域所源自的有義鏈或反義鏈的所述全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受關(guān)注的靶基因編碼PAE樣蛋白質(zhì)，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)具有改變的、提高的或降低的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第十實(shí)施例中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含:(a)編碼改變即提高或降低油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量所需的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽在與SEQ ID N0:36或48進(jìn)行比較時(shí)具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，或(b)所述核苷酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，其中所述全長(zhǎng)互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且 是100%互補(bǔ)的。所述多肽可包含SEQ ID N0:36或48的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含SEQ ID NO:35或47的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何分離的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接到至少一種調(diào)控序列，并且本發(fā)明涉及包含所述重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物和種子。所述細(xì)胞可為真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或者為原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。從單子葉植物和雙子葉植物(例如，分別如玉米和大豆)獲得的包含本發(fā)明的重組構(gòu)建體的種子在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。驅(qū)動(dòng)表達(dá)本發(fā)明核酸序列的種子特異性或種子優(yōu)選的啟動(dòng)子也被包括在內(nèi)。驅(qū)動(dòng)表達(dá)本發(fā)明核酸序列的胚或胚乳特異性的啟動(dòng)子也被包括在內(nèi)。此外，本發(fā)明的方法對(duì)于從單子葉植物(例如玉米和稻)和雙子葉植物(例如大豆和卡諾拉)獲得轉(zhuǎn)基因種子是有用的。也在本發(fā)明范圍之內(nèi)的是從轉(zhuǎn)基因種子獲得的產(chǎn)物和/或副產(chǎn)物，所述轉(zhuǎn)基因種子從單子葉植物或雙子葉植物(分別例如玉米和大豆)獲得。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于在植物中抑制編碼具有PAE樣蛋白質(zhì)活性的多肽的基因的表達(dá)水平的方法，其中所述方法包括用本發(fā)明的任何核酸片段轉(zhuǎn)化單子葉植物或雙子葉植物。


和序列表根據(jù)以下的形成本專利申請(qǐng)的一部分的具體實(shí)施方式
和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明。圖1A-1D顯示了由來源于以下的核苷酸序列編碼的PAE和PAE樣蛋白質(zhì)的氨基酸序列的比對(duì):完菁(Brassica rapa) (SEQ ID NO: 36);向日葵(Helianthus annuus)(SEQ ID NO:38);蓖麻(Ricinus communis) (SEQ ID NO:40);大豆(Glycine max) (SEQ IDN0:42、44、46 和 48);玉米(Zea mays) (SEQ ID N0:50、52 和 54);水稻(Oryzasativa) (SEQID N0:56、58 和 60);高粱(Sorghumbicolor) (SEQ ID N0:62、64 和 66);小麥(Triticumaestivum) (SEQ ID NO:68);擬南芥(Arabidopsisthaliana) (SEQ ID N0:85,At2g46930)；SEQ ID勵(lì):86，對(duì)應(yīng)于來自美國(guó)專利申請(qǐng)”20100083407的5￡0 ID NO:53381 (大豆)；和SEQ ID N0:87，對(duì)應(yīng)于美國(guó)專利申請(qǐng)US20090094717的SEQ ID NO: 13822 (擬南芥)。就比對(duì)而言，將在全部序列之間在給定位置處保守的氨基酸劃框表示。該程序用短劃線來使序列間最大程度的對(duì)齊。圖2顯示了圖1A-1D中顯示的每對(duì)氨基酸序列的百分比序列同一性的圖表。序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所示的關(guān)于專利申請(qǐng)中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。
SEQIDNO:1對(duì)應(yīng)于載體PHSbarENDS2的核苷酸序列。SEQIDN0:2對(duì)應(yīng)于多接頭的核苷酸序列。SEQIDN0:3對(duì)應(yīng)于載體pKR85的核苷酸序列。SEQIDN0:4對(duì)應(yīng)于載體pKR278的核苷酸序列。SEQIDN0:5對(duì)應(yīng)于載體pKR407的核苷酸序列。SEQIDN0:6對(duì)應(yīng)于載體pKR1468的核苷酸序列。SEQIDN0:7對(duì)應(yīng)于載體pKR1475的核苷酸序列。SEQIDN0:8對(duì)應(yīng)于載體pKR92的核苷酸序列。SEQIDN0:9對(duì)應(yīng)于載體pKR1478的核苷酸序列。SEQIDNO: 10 對(duì)應(yīng)于 SAIFF 和 lo22730 的基因組 DNA。SEQIDNO: 11 對(duì)應(yīng)于正向引物 PAE ORF FffD0SEQIDNO: 12 對(duì)應(yīng)于反向引物 PAE ORF REV。SEQIDNO: 13對(duì)應(yīng)于包含PAE的載體pENTR的核苷酸序列。SEQID勵(lì):14對(duì)應(yīng)于載體口10 1478^^￡的核苷酸序列。SEQID勵(lì):15對(duì)應(yīng)于？10 1481的核苷酸序列。SEQIDNO: 16 對(duì)應(yīng)于 AthLcc In 正向引物。SEQIDNO: 17 對(duì)應(yīng)于 AthLcc In 反向引物。SEQIDNO: 18對(duì)應(yīng)于含有漆酶內(nèi)含子的PCR (聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物。SEQIDNO: 19對(duì)應(yīng)于PSM1318的核苷酸序列。SEQIDN0:20 對(duì)應(yīng)于 pMBL18AITR12INT 的核苷酸序列。SEQIDNO:21對(duì)應(yīng)于PSM1789的核苷酸序列。SEQIDN0:22 對(duì)應(yīng)于 pMBL18AITR12INT ATTR21 的核苷酸序列。SEQIDNO:23 對(duì)應(yīng)于 SuSy-5’ 引物。SEQIDNO: 24 對(duì)應(yīng)于 SuSy-3’ 引物。SEQIDN0:25對(duì)應(yīng)于pLF122的核苷酸序列。SEQIDN0:26對(duì)應(yīng)于pKR1142的核苷酸序列。SEQIDN0:27對(duì)應(yīng)于pKR1155的核苷酸序列。SEQIDN0:28對(duì)應(yīng)于KS294的核苷酸序列。SEQIDN0:29對(duì)應(yīng)于pKR627的核苷酸序列。SEQIDN0:30對(duì)應(yīng)于pKR132的核苷酸序列。SEQIDNO:31對(duì)應(yīng)于pKR278的核苷酸序列。SEQIDN0:32對(duì)應(yīng)于pKR1157的核苷酸序列。SEQIDN0:33對(duì)應(yīng)于pKR1479的核苷酸序列。SEQIDN0:34 對(duì)應(yīng)于 pKR1481-PAE 的核苷酸序列。 表I列出了本文所述的多肽、包含編碼這些多肽全部或其主要部分的核酸片段的克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO:)。表I還標(biāo)示了作為單獨(dú)的EST (“EST”)的cDNA克隆、包含標(biāo)明的cDNA克隆的整個(gè)cDNA插入物的序列(“FIS”)、由兩個(gè)或更多個(gè)EST組裝而成的重疊群(“Contig”)、由FIS和一個(gè)或多個(gè)EST組裝而成的重疊群(“Contig*”)或編碼源自FIS、重疊群、EST和PCR或FIS和PCR的完整或功能性蛋白質(zhì)的序列(“ CGS ”)。表IPAE樣蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
1.包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中從所述轉(zhuǎn)基因植物獲得的種子在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)具有改變的即提高的或降低的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
2.從權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述轉(zhuǎn)基因種子在與來自不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物的種子進(jìn)行比較時(shí)具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
3.轉(zhuǎn)基因種子，包含: 重組DNA構(gòu)建體，其包含: (a)可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于 Clustal V 比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或 (b)抑制DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接到: (i)以下序列的全部或部分:(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽基于ClustalV比對(duì)方法在與 SEQ ID N0:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或 (ii)來源于受關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域基于Clustal V比對(duì)方法在與所述區(qū)域所源自的有義鏈或反義鏈的所述全部或部分進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受關(guān)注的靶基因編碼PAE或PAE樣蛋白質(zhì)， 并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)具有改變的、提高的或降低的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述油含量在與非轉(zhuǎn)基因的植物的油含量進(jìn)行比較時(shí)提高了至少4%。
5.包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子，包含:(a)如 SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分； 或(b) (a)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列: 其中(a)或(b)具有足以抑制內(nèi) 源性PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度，并且進(jìn)一步地其中所述種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的種子相比，基于干重計(jì)具有至少4%的油含量的提高。
6.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括:(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物。
7.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括: (a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述 重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及 (b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及 (c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
8.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括: (a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽基于Clustal V比對(duì)方法在與 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 進(jìn)行比較時(shí)具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及 (b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及 (c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比具有至少0.5%的提高的淀粉含量。
9.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括: (a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(i)如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分；或 (ii)(i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列； 其中(i)或(ii)具有足以抑制內(nèi)源性PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度； (b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及 (c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比具有改變的油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
10.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括: (a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含:(i)如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分；或 (ii)(i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列； 其中(i)或(ii)具有足以抑制內(nèi)源性PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性 在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的長(zhǎng)度； (b)由(a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及 (c)選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因種子與從非轉(zhuǎn)基因的植物獲得的轉(zhuǎn)基因種子相比，基于干重計(jì)具有至少4%的油含量的提高。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述轉(zhuǎn)基因種子從單子葉植物或雙子葉植物獲得。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述轉(zhuǎn)基因種子從玉米植物或大豆植物獲得。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述至少一種調(diào)控元件是種子特異性或種子優(yōu)選的啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述至少一種調(diào)控元件是胚乳或胚特異性啟動(dòng)子。
15.根據(jù)權(quán)利要求6、7、8、9或10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因種子從轉(zhuǎn)基因雙子葉植物獲得，所述轉(zhuǎn)基因雙子葉植物在其基因組中包含所述重組構(gòu)建體。
16.根據(jù)權(quán)利要求6、7、8、9或10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆。
17.通過權(quán)利要求6、7、8、9或10中任一項(xiàng)所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因種子。
18.從權(quán)利要求6、7、8、9或10中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因種子獲得的產(chǎn)物和/或副產(chǎn)物。
19.通過權(quán)利要求6、7、8、9、10或11中任一項(xiàng)所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述轉(zhuǎn)基因種子從單子葉植物或雙子葉植物獲得。
20.來自權(quán)利要求2所 述的轉(zhuǎn)基因種子的產(chǎn)物和/或副產(chǎn)物，其中所述植物是玉米或大豆。
21.來自權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因種子的產(chǎn)物和/或副產(chǎn)物，其中所述植物是玉米或大豆。
22.來自權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因種子的產(chǎn)物和/或副產(chǎn)物，其中所述植物是玉米或大豆。
23.來自權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因種子的產(chǎn)物和/或副產(chǎn)物，其中所述植物是玉米或大豆。
24.分離的多核苷酸，包括: (a)編碼在植物中改變，即提高或降低油、蛋白質(zhì)、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量所必需的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對(duì)方法，使用逐對(duì)比對(duì)默認(rèn)參數(shù)KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5 和 DIAGONALS SAVED=5，，在與 SEQ ID NO: 36 或 48 進(jìn)行比較時(shí)，所述多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；或 (b)(a)的核苷酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO: 36或48。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO: 35或47。
27.包含重組DNA構(gòu)建體的植物或種子，其中所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及在植物和種子中編碼PAE或PAE樣蛋白質(zhì)的分離的核酸片段以及此類片段用于調(diào)節(jié)編碼PAE或PAE樣蛋白質(zhì)活性的基因在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的表達(dá)的用途。
文檔編號(hào)C12N15/55GK103080320SQ201180042448
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月1日
發(fā)明者K·邁爾, B·麥戈尼格爾, K·L·斯特卡 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司