專利名稱：用于產(chǎn)生由單分子dna形成的環(huán)狀dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生僅由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA的方法、用于上述方法的新適配體和用于產(chǎn)生環(huán)狀DNA的包含新適配體的試劑盒。本發(fā)明還涉及使用通過上述方法產(chǎn)生的單分子環(huán)狀DNA來鑒定和/或檢測(cè)基因的方法。特別地，本發(fā)明涉及鑒定和/或檢測(cè)引起多種病理狀態(tài)的融合基因的方法。
背景技術(shù)：
載體方法是常規(guī)基因分析方法。在載體方法中，待分析的目標(biāo)基因被整合到載體中，然后利用測(cè)序儀確定擴(kuò)增后得到的基因的全長(zhǎng)序列。但是載體方法的問題在于其需要培養(yǎng)操作，問題還在于需要使用測(cè)序儀來分析基因的全長(zhǎng)。近年來，已經(jīng)開發(fā)出了用于基因分析的高速測(cè)序儀，并且由于這種測(cè)序儀的開發(fā)，作為基因分析手段的配對(duì)(メイ卜ペア)方法引起了注意。

圖1示意性示出了使用配對(duì)方法的基因分析的概況。在配對(duì)方法中，用于連接的核苷酸序列(限制性酶識(shí)別位點(diǎn))與待分析的目標(biāo)基因的兩端相連，然后使目標(biāo)基因環(huán)化。然后，通常使用II型限制性酶將限制性酶識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)的側(cè)翼包含15或更多個(gè)核苷酸、且優(yōu)選25個(gè)或更多個(gè)核苷酸至幾十個(gè)或更少個(gè)核苷酸的部分從所述環(huán)化的基因上切下。將該部分通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，然后確定所切下的部分基因的核苷酸序列。從而確定目標(biāo)基因兩端的序列，然后可利用已知的序列數(shù)據(jù)鑒定目標(biāo)基因。配對(duì)是指通過閱讀單個(gè)DNA片段的兩端得到的一對(duì)核苷酸序列的序列數(shù)據(jù)。從基因上切下給定數(shù)量的核苷酸的實(shí)際使用的方法包括:使用II型限制性酶切割遠(yuǎn)離識(shí)別位點(diǎn)之位點(diǎn)的方法以切割給定數(shù)量的核苷酸；和包括以下步驟的方法:利用超聲等對(duì)環(huán)狀DNA進(jìn)行物理切 割，利用附接在接頭上的生物素回收切割片段，然后通過PCR擴(kuò)增該片段，然后確定擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的序列。因此，通過閱讀特定長(zhǎng)度的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含通過連接DNA的兩端來環(huán)化的基因中連接位點(diǎn)兩側(cè)的側(cè)翼，配對(duì)方法可以鑒定已知基因?；旧?，如果閱讀了基因頭部和尾部的部分核苷酸序列，那么這些序列將允許在各個(gè)基因中作出可靠的區(qū)分。因此，配對(duì)方法已經(jīng)被用作可靠且簡(jiǎn)單的基因分析方法(非專利文獻(xiàn)I和2)。此外，配對(duì)方法已經(jīng)被用于下一代序列分析，因此隨著高速測(cè)序儀的出現(xiàn)，其變得更加重要。但是，當(dāng)根據(jù)配對(duì)方法環(huán)化DNA來進(jìn)行基因分析吋，除了單基因或單DNA(單個(gè)分子)的自環(huán)化外，還發(fā)生多DNA(多個(gè)分子)的環(huán)化和多個(gè)分子(兩個(gè)或更多個(gè)分子)的線性結(jié)合。通過隨后的操作，可以從環(huán)狀分子中分離和除去由多個(gè)分子組成的線性分子。另一方面，無法將由多個(gè)分子組成的環(huán)狀分子與由單個(gè)分子組成的環(huán)狀分子分離，由多個(gè)分子組成的環(huán)狀分子變成了污染物。由于以下原因，由多個(gè)分子組成的環(huán)狀產(chǎn)物抑制了単獨(dú)基因的分析并且顯著降低了分析的特異性。特別地，如圖2所示，當(dāng)三種類型的cDNA自環(huán)化時(shí)，如果如(B)所示僅單分子DNA環(huán)化，根據(jù)配對(duì)方法可使用確切的序列來指明基因。但是，除了如(B)所示單分子的環(huán)化外，如(C)所示可產(chǎn)生未環(huán)化的線性產(chǎn)物，或如(D)所示兩個(gè)或更多個(gè)cDNA可能發(fā)生環(huán)化。在(C)的情況下，可利用DNA外切酶除去線性產(chǎn)物。但是，在(D)的情況下，由多個(gè)cDNA組成的環(huán)化產(chǎn)物被識(shí)別為環(huán)狀分子，因此無法除去并且成為根據(jù)配對(duì)方法的基因分析中的污染物。根據(jù)配對(duì)方法的基因分析意在根據(jù)目標(biāo)基因兩端的核苷酸序列來鑒定目標(biāo)基因。具體地，將用于環(huán)化的連接適配體附接到單個(gè)基因的兩端，然后將兩個(gè)適配體位點(diǎn)彼此連接來使基因環(huán)化。然后，從所述基因上切除以適配體位點(diǎn)為中心在兩側(cè)包含特定數(shù)量的核苷酸的部分。由此，通過分析來源于原始基因每一端之部分的核苷酸序列，可以鑒定所述基因。因此，多個(gè)分子的環(huán)化產(chǎn)物具有多個(gè)適配體位點(diǎn)，與適配體附接的兩端是不同基因的兩端。因此，如上所述，根據(jù)上述兩種方法中的任ー種，因?yàn)橥ㄟ^切下以適配體為中心的附接于適配體兩端的包含給定數(shù)量核苷酸的核苷酸序列的部分來進(jìn)行基因分析，所以由多個(gè)分子的環(huán)化產(chǎn)物得到的用于分析的基因片段包含不同基因的末端。因此，不能夠進(jìn)行單基因的分析。 因此，在根據(jù)配對(duì)方法的基因分析中，多個(gè)分子的環(huán)化產(chǎn)物的存在抑制每個(gè)基因的分析。根據(jù)所采用的方法，多個(gè)DNA分子環(huán)化的可能性一般為極少量至百分之十幾。在已知基因的分析中，它們被識(shí)別為異常的核苷酸序列，因此，通?？梢詫⑵鋸拇治鲂蛄兄谐?。因此，盡管操作變得復(fù)雜，但是其僅造成精確度的稍微下降。但是，在使用配對(duì)方法檢測(cè)正?；虻慕M中異?；?如融合基因)存在的情況下，如果多個(gè)正常基因環(huán)化，就確定為存在異?；颉Ｒ虼?，就變得無法正確確定異常基因(如融合基因)的存在。融合基因是通過多個(gè)(兩個(gè))基因彼此結(jié)合而構(gòu)成的具有新功能的基因。例如，在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的染色體結(jié)構(gòu)畸形，如缺失、重疊、重組和易位。當(dāng)在DNA水平發(fā)生基因切割和連接并且在每個(gè)切割位點(diǎn)存在結(jié)構(gòu)基因時(shí)，就形成了融合基因。一般而言，融合基因?qū)τ诩?xì)胞是致死的或無意義的，其在很多情況下并不造成臨床問題。但是，當(dāng)由融合基因產(chǎn)生的融合蛋白抑制對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的控制從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)異常加速吋，就造成臨床問題，如形成腫瘤。過去認(rèn)為融合基因主要在造血系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)。但是，近年來，預(yù)期融合基因還與上皮實(shí)體腫瘤相關(guān)聯(lián)(非專利文獻(xiàn)3)。在這些實(shí)體癌中，從前列腺癌和肺癌中發(fā)現(xiàn)了典型的融合基因(非專利文獻(xiàn)4和5)。通過這些發(fā)現(xiàn)，融合基因的分析(融合基因的存在的確定)作為診斷腫瘤(癌癥)等的新方法引起了注意。特別地，通過檢測(cè)已知對(duì)應(yīng)于病理狀態(tài)的已知融合基因，能夠快速診斷病理狀態(tài)。此外，新融合基因的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)藥物之靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。另ー方面，在實(shí)體腫瘤上進(jìn)行的常規(guī)染色體分析具有一些缺點(diǎn)并且極其難于分析和/或確定融合基因。近年來，已經(jīng)開發(fā)出了新方法，例如Mano等人的cDNA功能化表達(dá)分析方法。但是，這些技術(shù)依然具有操作復(fù)雜、精確性方面的問題等不足(專利文獻(xiàn)I)。另外，最近開發(fā)了多種下一代高速基因測(cè)序儀。因此，基因的高速序列分析已經(jīng)顯著進(jìn)步，并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了短時(shí)間的基因分析。因此，根據(jù)腫瘤基因和/或基因的高速和/或大規(guī)模核苷酸序列分析的融合基因研究已經(jīng)開始(非專利文獻(xiàn)6)。為了通過使用配對(duì)方法的序列分析來鑒定融合基因，需要可靠地產(chǎn)生來自單cDNA分子的單環(huán)狀DNA。圖3示出了根據(jù)配對(duì)方法的融合基因分析的示意圖。但是，在一些情況下，如圖4所示，可能由多個(gè)cDNA分子形成單個(gè)環(huán)狀DNA。因此，在根據(jù)配對(duì)方法進(jìn)行序列分析時(shí)，可能獲得正常基因看上去是融合基因的結(jié)果。如果由于在常規(guī)基因序列中不存在此基因的原因而除去此基因的話，那么也除去了融合基因。因此，變得基本不可能確認(rèn)融合基因的存在。當(dāng)根據(jù)配對(duì)方法的序列分析檢測(cè)融合基因時(shí)，除去多個(gè)基因的環(huán)狀DNA是必需的。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本專利N0.4303303非專利文獻(xiàn):非專利文獻(xiàn)1:Tanpakushitsu Kakusan Koso, August2009, (1233-1247,1271-1275)非專利文獻(xiàn)2: " Shikkan Idenshi no Tansaku to ChokosokuSequence, " Jikken Igaku extra edition,Vol.27,N0.12 (2009,113 (1929)-143 (1959))非專利文獻(xiàn)3:Mitelman et al., 2004, Nature Genetics, Vol.36, N0.4，pp.331-334非專利文獻(xiàn)4:Chinnaiyan et al.,2005, Science, Vol.310, pp.644-648非專利文獻(xiàn)5:Soda et al.，2007，Nature, Vol.448，pp.56ト566
非專利文獻(xiàn)6:Bashir et al., April 2008, PLoS Computational Biology,Vol.4，Issue 4，el00005
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題期望發(fā)現(xiàn)可靠地產(chǎn)生僅由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA分子的方法。也就是說，本發(fā)明的目的是提供能夠由單個(gè)DNA產(chǎn)生單個(gè)環(huán)狀DNA的方法。解決方案本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過向單個(gè)DNA分子中引入具有包含特異性序列識(shí)別位點(diǎn)的特定結(jié)構(gòu)的適配體然后進(jìn)行兩步法連接，可形成僅由單分子組成的環(huán)化DNA。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了可靠地使僅僅單分子DNA環(huán)化的方法，其中不發(fā)生由多個(gè)DNA組成的多分子的環(huán)化。在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生環(huán)狀DNA的方法，所述環(huán)狀DNA僅由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA組成，不包含由多分子DNA形成的環(huán)狀DNA，所述方法包括以下步驟:I)使每個(gè)目標(biāo)DNA分子的一端與用于第一環(huán)化的適配體(A)結(jié)合并且使其另ー端與用于第二環(huán)化的包含適配體(b)和適配體(A)的適配體(B)結(jié)合的步驟，其中適配體(B)通過適配體(b)側(cè)與所述DNA分子結(jié)合，從而使得適配體(B)中的適配體(A)位于所述DNA分子與適配體(b)之鍵的外側(cè)，其中適配體(A)包含切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)產(chǎn)生與適配體(A)的全部切割末端非特異性結(jié)合的切割末端，和適配體(b)包含切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)產(chǎn)生僅與相同適配體(b)的切割末端特異性結(jié)合的切割末端；
2)在適配體(A)的切割位點(diǎn)切割在步驟I)中得到的DNA分子的第一切割步驟；3)使在步驟2)中得到的DNA分子的兩端結(jié)合以環(huán)化所述DNA分子的第一環(huán)化步驟；4)除去步驟3)中未環(huán)化的線性單分子和多分子結(jié)合的DNA的步驟；5)在適配體(b)的切割位點(diǎn)切割在步驟3)和步驟4)中得到的環(huán)狀DNA分子的第ニ切割步驟；和6)使在步驟5)中得到的DNA分子的兩端結(jié)合以環(huán)化所述DNA分子的第二環(huán)化步驟；在第二環(huán)化步驟中，因?yàn)檫m配體(b)與來自相同適配體(b)的切割末端特異性結(jié)合，所以基本上不發(fā)生多個(gè)DNA分子環(huán)化導(dǎo)致的線性化，并且待環(huán)化的DNA是單分子DNA。此時(shí)，如上所述，需要除去未環(huán)化的線性DNA分子。步驟6)中未環(huán)化的線性DNA由以下組成:痕量的單分子DNA，其未能與在步驟5)中切割的部分(b)再結(jié)合；和大量的單分子或多分子DNA，其與步驟3)中多個(gè)DNA分子環(huán)化并且在步驟5)切割適配體后未能與每個(gè)適配體(b)再結(jié)合。在本發(fā)明的第一實(shí)施方案中，適配體(A)優(yōu)選為包含限制性酶位點(diǎn)的雙鏈DNA，所述限制性酶位點(diǎn)識(shí)別其切割末端彼此互補(bǔ)的序列，所述雙鏈DNA例如包含識(shí)別回文序列的限制性酶位點(diǎn)的雙鏈DNA。另外，在第二實(shí) 施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生單環(huán)狀DNA的方法，所述單環(huán)狀DNA由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA組成，不包括由多分子DNA形成的環(huán)狀DNA，所述方法包括以下步驟:I)使每個(gè)目標(biāo)DNA分子的一端與用于第一環(huán)化的適配體(A)結(jié)合并且使其另ー端與用于第二環(huán)化的包含適配體(b)和適配體(A)的適配體(B)結(jié)合的步驟，其中適配體(B)通過適配體(b)側(cè)與所述DNA分子結(jié)合，從而使得適配體(B)中的適配體(A)位于所述DNA分子與適配體(b)的鍵的外側(cè)，其中適配體⑷是包含識(shí)別回文序列的限制性酶位點(diǎn)的雙鏈DNA，和適配體(B)包含適配體(b)和適配體(A)，其中適配體(b)是雙鏈DNA，其包含彼此取向相反的相同產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)，其中適配體(b)是雙鏈DNA，所述雙鏈DNA包含在彼此取向相反的相同產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)之間具有對(duì)于每個(gè)適配體(b)來說特有的序列的雙鏈DNA序列，如果在彼此取向相反的相同產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)切割適配體(b)，那么切割位點(diǎn)僅與來自相同適配體(b)的切割位點(diǎn)再結(jié)合；2)利用識(shí)別在適配體(A)中包含的限制性酶位點(diǎn)的限制性酶切割在步驟I)中得到的DNA分子的第一切割步驟；3)連接在步驟2)中得到的DNA分子的兩端使所述DNA分子環(huán)化的第一環(huán)化步驟；4)除去步驟3)中未環(huán)化的線性單分子和多分子結(jié)合的DNA的步驟；5)利用識(shí)別適配體(b)的產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)的產(chǎn)切ロ酶或限制性酶切割在步驟3)和步驟4)中得到的環(huán)狀DNA分子的第二切割步驟；和6)連接在步驟5)中得到的DNA分子的兩端使所述DNA分子環(huán)化的第二環(huán)化步驟。優(yōu)選地，上述本發(fā)明的第二實(shí)施方案還包括利用核酸內(nèi)切酶消化環(huán)狀DNA的步驟，所述環(huán)狀DNA是在上述步驟6)中通過經(jīng)彼此部分不同的切割序列位點(diǎn)使適配體(b)結(jié)合(錯(cuò)誤退火)和環(huán)化而形成的。因此，可以更可靠地除去由多個(gè)分子組成的環(huán)狀DNA。在本發(fā)明的第二實(shí)施方案中，優(yōu)選地，適配體(A)是包含識(shí)別回文序列的限制性酶位點(diǎn)X的雙鏈DNA，和適配體⑶是由彼此互補(bǔ)的兩條DNA鏈組成的雙鏈DNA，其具有以下結(jié)構(gòu)yrY-y2-x:
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生環(huán)狀DNA的方法，所述環(huán)狀DNA僅由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA組成，并且其不包含由多分子DNA形成的環(huán)狀DNA，所述方法包括以下步驟: 1)使每個(gè)目標(biāo)DNA分子的一端與用于第一環(huán)化的適配體(A)結(jié)合并且使其另一端與用于第二環(huán)化的包含適配體(b)和適配體(A)的適配體(B)結(jié)合的步驟，其中適配體(B)通過適配體(b)側(cè)與所述DNA分子結(jié)合，從而使得適配體(B)中的適配體(A)位于所述DNA分子與適配體(b)之鍵的外側(cè)，其中 適配體(A)包含切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)產(chǎn)生與適配體(A)的全部切割末端非特異性結(jié)合的切割末端，和 適配體(b)包含切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)產(chǎn)生僅與相同適配體(b)的切割末端特異性結(jié)合的切割末端； 2)在適配體(A)的切割位點(diǎn)切割在步驟I)中得到的DNA分子的第一切割步驟； 3)使在步驟2)中得到的D NA分子的兩端結(jié)合以環(huán)化所述DNA分子的第一環(huán)化步驟； 4)除去步驟3)中未環(huán)化的線性單分子和多分子結(jié)合之DNA的步驟； 5)在適配體(b)的切割位點(diǎn)切割在步驟3)和步驟4)中得到的環(huán)狀DNA分子的第二切割步驟；和 6)使在步驟5)中得到的DNA分子的兩端結(jié)合以環(huán)化所述DNA分子的第二環(huán)化步驟。
2.一種用于產(chǎn)生環(huán)狀DNA的方法，所述環(huán)狀DNA由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA組成，并且其不包含由多分子DNA形成的環(huán)狀DNA，所述方法包括以下步驟: 1)使每個(gè)目標(biāo)DNA分子的一端與用于第一環(huán)化的適配體(A)結(jié)合并且使其另一端與用于第二環(huán)化的包含適配體(b)和適配體(A)的適配體(B)結(jié)合的步驟，其中適配體(B)通過適配體(b)側(cè)與所述DNA分子結(jié)合，從而使得適配體(B)中的適配體(A)位于所述DNA分子與適配體(b)之鍵的外側(cè)，其中 適配體(A)是包含識(shí)別回文序列之限制性酶位點(diǎn)的雙鏈DNAjP 適配體(B)包含適配體(b)和適配體(A)，其中適配體(b)是雙鏈DNA，其包含彼此取向相反的相同產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)，其中適配體(b)是雙鏈DNA，其包含在彼此取向相反的相同產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)之間具有對(duì)于每個(gè)適配體(b)來說特有的序列的雙鏈DNA序列，如果在彼此取向相反的相同產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)切割適配體(b)，那么切割位點(diǎn)僅與來自相同適配體(b)的切割位點(diǎn)再結(jié)合； 2)利用識(shí)別適配體(A)中所包含的限制性酶位點(diǎn)的限制性酶切割在步驟I)中得到的DNA分子的第一切割步驟； 3)連接在步驟2)中得到的DNA分子的兩端以環(huán)化所述DNA分子的第一環(huán)化步驟； 4)除去步驟3)中未環(huán)化的線性單分子和多分子結(jié)合之DNA的步驟； 5)利用識(shí)別適配體(b)中的產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)或限制性酶位點(diǎn)的產(chǎn)切ロ酶或限制性酶切割在步驟3)和步驟4)中得到的環(huán)狀DNA分子的第二切割步驟；和 6)連接在步驟5)中得到的DNA分子的兩端以環(huán)化所述DNA分子的第二環(huán)化步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包括利用核酸內(nèi)切酶消化環(huán)化DNA的步驟，所述環(huán)化DNA是在權(quán)利要求2的步驟6)中通過經(jīng)彼此部分不同的切割序列位點(diǎn)使適配體(b)連接和環(huán)化而形成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中適配體(A)是包含識(shí)別回文序列之限制性酶位點(diǎn)X的雙鏈DNAjP 適配體(B)是由彼此互補(bǔ)的兩條DNA鏈組成的雙鏈DNA，其具有以下結(jié)構(gòu)y1-Y-y2-X: [式I]
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中yi和I2分別包含產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述產(chǎn)切ロ酶是Nb.BtsI或Nt.BsqQI。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中yi和y2分別包含限制性酶位點(diǎn)。
8.—種用于產(chǎn)生環(huán)狀DNA的適配體，所述適配體由彼此互補(bǔ)的兩條DNA鏈組成，其具有以下結(jié)構(gòu)Y1-Yi2-X: [式2]
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的適配體，其中yi和y2分別包含產(chǎn)切ロ酶識(shí)別位點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的適配體，其中所述產(chǎn)切ロ酶是Nb.BtsI或Nt.BsqQI。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的適配體，其中yi和y2分別包含限制性酶位點(diǎn)。
12.一種用于產(chǎn)生環(huán)狀DNA的試劑盒，其包含:根據(jù)權(quán)利要求8的由包含限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的雙鏈DNA組成的適配體(A)，所述限制性酶位點(diǎn)與用X表示的限制性酶位點(diǎn)相同，和根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的適配體(B)。
13.ー種用于產(chǎn)生cDNA文庫的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法。
14.一種用于通過對(duì)利用根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述方法得到的環(huán)狀DNA分子使用配對(duì)方法來鑒定基因的方法，所述方法包括以下步驟: 1)閱讀利用根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述方法得到的環(huán)狀DNA分子中適配體(B)兩側(cè)的側(cè)翼各自由15至600個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列的步驟；和 2)通過將讀出的核苷酸序列與已知基因兩端的序列進(jìn)行比較來鑒定所述環(huán)狀DNA分子中所含基因的步驟。
15.一種用于通過對(duì)利用根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述方法得到的環(huán)狀DNA分子使用配對(duì)方法來檢測(cè)融合基因的方法，所述方法包括以下步驟: 1)閱讀利用根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述方法得到的環(huán)狀DNA分子中適配體(B)兩側(cè)的側(cè)翼各自由15個(gè)或更多個(gè)核苷酸至600或更少個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列的步驟；和 2)將讀出的核苷酸序列與已知基因兩端的序列進(jìn)行比較的步驟，其中，如果兩端的所述基因?qū)?yīng)于不同的已知基因，那么所述環(huán)狀DNA分子中所含基因就被鑒定為融合基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述用于檢測(cè)融合基因的方法，其中適配體(B)兩側(cè)之側(cè)翼的兩側(cè)序列與已知融合基因的兩側(cè)末端對(duì)應(yīng)。
17.一種用于通過根據(jù)權(quán)利要求15的所述方法檢測(cè)以融合基因表達(dá)為特征的疾病的方法，其中所述融合基因被用作標(biāo)志物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，如果適配體(B)兩側(cè)側(cè)翼的序列與不同基因的末端序列對(duì)應(yīng)并且不與已知融合基因的兩端對(duì)應(yīng)時(shí)，那么環(huán)狀DNA分子中所含基因被鑒定為新融合基因。
19.通過 根據(jù)權(quán)利要求18所述方法檢測(cè)到的新融合基因在藥物發(fā)現(xiàn)篩選中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生環(huán)狀DNA的方法，所述環(huán)狀DNA由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA組成，并且其不包括由多分子DNA形成的環(huán)狀DNA。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以可靠地產(chǎn)生僅由單分子DNA形成的環(huán)狀DNA分子。
文檔編號(hào)C12N15/09GK103119162SQ201180042478
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者水野晉一, 長(zhǎng)藤宏司, 岡村孝 申請(qǐng)人:學(xué)校法人久留米大學(xué)