專利名稱：包含用于使赭曲毒素去毒的酰胺酶的食品添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使霉菌毒素去毒的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及酰胺酶和包含至少一種用于使赭曲毒素(尤其是赭曲毒素A)去毒的酰胺酶的飼料和/或食品添加劑。
背景技術(shù)：
霉菌毒素是基本上屬于曲霉屬(Aspergillus)、青霉素(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)的真菌的有毒次級(jí)代產(chǎn)物。它們可在廣泛的農(nóng)業(yè)商品上以及在世界范圍的各種農(nóng)藝、生態(tài)和采收后條件下產(chǎn)生。霉菌毒素可在田地中、飼料或食品材料的存儲(chǔ)期間，或在食品鏈的后面的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入食品鏈中。它們?cè)谑称泛惋暳现蟹e聚是對(duì)人和動(dòng)物健康的一個(gè)巨大威脅，因?yàn)橄M(fèi)霉菌毒素污染的飲食可能會(huì)導(dǎo)致致畸效果、致癌效果和雌激素效果或免疫抑制效果。在1985年，世界衛(wèi)生組織估計(jì)大約25%的世界糧食被霉菌毒素污染(Jelinek等人1989)。由于糧食和谷物全球輸入和輸出的增加以及不斷變化的環(huán)境和氣候特點(diǎn)，該數(shù)字自此以后有可能已經(jīng)增長(zhǎng)。目如有超過400種霉菌毒素有文獻(xiàn)記載，但最令人關(guān)注的以及因此研究最多的霉菌毒素包括:黃曲霉毒素、脫氧瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和赭曲毒素。盡管存在許多產(chǎn)毒素霉菌物種，但僅少數(shù)霉菌毒素被視為對(duì)人而言是值得注意的。三個(gè)真菌屬(曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬)最常涉及霉菌毒素污染的情形。真菌的定植、生長(zhǎng)和霉菌毒素產(chǎn)生通常受多種因素影響。最重要的因素是溫度和水活度。一般來講，在溫暖區(qū)域黃曲霉素是主要的關(guān)注點(diǎn)。這是因?yàn)楫a(chǎn)生這些毒素的曲霉屬物種可找到熱帶區(qū)域存在的最適條件。相比之下，鐮刀菌屬和青霉屬物種具有較低的最適溫度，因此適應(yīng)于更溫和的氣候。赭曲毒素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮因此在提供這些條件的區(qū)域產(chǎn)生。赭曲毒素是一組由曲霉菌屬或青霉屬的數(shù)種真菌作為次級(jí)代謝物產(chǎn)生的霉菌毒素，是由香豆素衍生物組成的弱有機(jī)酸。有三種公認(rèn)的赭曲毒素，定為A、B和C。赭曲毒素A是赭曲毒素家族中最豐富的成員，因而最常被檢查到，但也是最有毒性的。赭曲毒素A(赭曲毒素A)是谷物和其他富含淀粉的食品中存在的腎毒性的、致畸的和致癌的霉菌毒素。除了谷物和谷物產(chǎn)品外，赭曲毒素A也存在于廣泛的其他食品中，包括咖啡、可可、酒、啤酒、干豆、調(diào)味料、干果、葡萄汁、豬腎和暴露于受該霉菌毒素污染的飼料的非反芻動(dòng)物的其他肉和肉產(chǎn)品。許多國(guó)家已對(duì)食品中的赭曲毒素A水平設(shè)定了極限，取決于食品的類型和質(zhì)量，通常在I至IOppb (份/十億份)之間。
權(quán)利要求
1.一種分離的酰胺酶，其能夠降解赭曲毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酰胺酶，其中所述赭曲毒素是赭曲毒素A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的酰胺酶，其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一個(gè),優(yōu)選至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)，更優(yōu)選九個(gè):1)x_P_G_x_x_D_x_H_x_H_x_xG；2)G-x-T；3)G-x-x-x-G-P；4)G-H-x-D；5)D_G_x_x_x_C_x_x_x_x_R_x_x_x_R_x_x-A_x_x_I_K；6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P；7)V_x-A_H_x_x_G_x_x_G；8)H-x-x-x-x-D； 9)G-V-x-1-x-x-G-T-D。
4.根據(jù)權(quán)利要求中I至4中任一項(xiàng)所述的酰胺酶，其中所述酰胺酶具有Tim桶結(jié)構(gòu)，所述桶結(jié)構(gòu)包括包含6個(gè)組氨酸殘基、I個(gè)賴氨酸殘基和I個(gè)天冬氨酸殘基的活性位點(diǎn)，其中當(dāng)將所述酰胺酶和SEQ ID NO: I的三級(jí)結(jié)構(gòu)相比較時(shí)所述活性位點(diǎn)中的所述氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 1的位置11111、11113、11191、1(246、11287、11289、11307 和0378。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的酰胺酶，其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的酰胺酶，其中所述酰胺酶是在PH3-9和21-40°C下溫育時(shí)可降解赭曲毒素的酰胺酶。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的酰胺酶，其中所述酰胺酶包含具有SEQID NO: 1、SEQID NO:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中任一者的序列，或具有與 SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:3 或 SEQ ID NO:5-ll、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或與SEQ ID NO:USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
8.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的酰胺酶，其中所述酰胺酶包含:具有SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含與SEQ IDNO:2具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID N0:2不同的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由與SEQ ID N0:2相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸，或在嚴(yán)格條件下雜交至SEQ ID N0:2的互補(bǔ)序列或雜交至與所述互補(bǔ)序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的序列表達(dá)所產(chǎn)生的多肽。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的酰胺酶，其中在pH7.0和40°C下所述酰胺酶每毫克蛋白質(zhì)每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
10.一種飼料或食品添加劑，其包含能夠降解赭曲毒素的酰胺酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的飼料或食品添加劑，其中所述赭曲毒素是赭曲毒素A。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶是分離的。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)，更優(yōu)選九個(gè):1)x_P_G_x_x_D_x_H_x_H_x_xG；2)G-x-T；3)G-x-x-x-G-P；4)G-H-x-D；5)D_G_x_x_x_C_x_x_x_x_R_x_x_x_R_x_x-A_x_x_I_K；6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P；7)V_x-A_H_x_x_G_x_x_G；8)H-x-x-x-x-D；9)G-V-x-1-x-x-G-T-D。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶具有Tim桶結(jié)構(gòu)，所述桶結(jié)構(gòu)包括包含6個(gè)組氨酸殘基、I個(gè)賴氨酸殘基和I個(gè)天冬氨酸殘基的活性位點(diǎn)，其中當(dāng)將所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三級(jí)結(jié)構(gòu)相比較時(shí)所述活性位點(diǎn)中的所述氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:l 的位置 H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307 和 D378。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15中任一項(xiàng) 所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶是在PH3-9和21-40°C下溫育時(shí)可降解赭曲毒素的酰胺酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶包含具有 SEQ ID NO: U SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 5-11、13、14 或 15 中任一者的序列，或具有與 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 5_11、13、14 或 15 中的任一者具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5-11、13、14或15相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求10至17中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶包含:具有 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 3具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或由包含SEQ IDNO: 2的序列或包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID NO: 2不同的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由與SEQ ID NO: 2相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸，或在嚴(yán)格條件下雜交至SEQ ID NO: 2的互補(bǔ)序列或雜交至與所述互補(bǔ)序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的序列表達(dá)所產(chǎn)生的多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中在pH7.0和40°C下所述酰胺酶每毫克蛋白質(zhì)每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
20.根據(jù)權(quán)利要求10至19中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述酰胺酶是重組的。
21.根據(jù)權(quán)利要求10至20中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其包含能夠表達(dá)所述酰胺酶的重組細(xì)胞或孢子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的飼料或食品添加劑，其中所述細(xì)胞選自:大腸桿菌、鏈霉菌屬、漢遜酵母屬、木霉屬(特別是里氏木霉)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬(特別是黑曲霉)、植物細(xì)胞和/或牙抱桿囷屬、木霉屬或曲霉屬的抱子。
23.根據(jù)權(quán)利要求10至22中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其還包含至少一種生理上可接受的載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的飼料或食品添加劑，其中所述生理上可接受的載體選自如下物質(zhì)中的至少一種:麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環(huán)糊精、小麥、麥麩或小麥組分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它們的混合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求10至24中任一項(xiàng)所述的飼料或食品添加劑，其中所述飼料包含一種或多種另外的酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的飼料或食品添加劑，其中所述一種或多種另外的飼料用酶選自:涉及蛋白質(zhì)降解的酶，包括羧肽酶，優(yōu)選羧肽酶A、羧肽酶Y，黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb, PEPAc和PEPAd，彈性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶或胃蛋白酶樣蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶，和細(xì)菌蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶及其變體，涉及淀粉代謝、纖維降解、脂質(zhì)代謝的酶，涉及糖原代謝的蛋白質(zhì)或酶，淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、表異構(gòu)酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，-葡糖苷酶，包括3 -葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解、果膠乙酰酯酶、果膠去聚合酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02_氧化還原酶，EC 1.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它們的組合。
27.一種飼料或食品材料，其包含根據(jù)權(quán)利要求10至26中任一項(xiàng)所述的飼料添加劑。
28.—種飼料或食品，其包含根據(jù)權(quán)利要求27所述的食品或飼料材料。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的飼料，其包含一種或多種選自如下的飼料材料:a)谷類，例如小粒谷物(如小麥、大麥、裸麥、燕麥以及它們的組合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)來自谷類的副產(chǎn)物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麥麩、小麥粗粉、小麥次粉、米糠、稻殼、燕麥殼，棕櫚仁和柑橘渣；c)青貯飼料；d)得自如下來源的蛋白質(zhì):例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、卡諾拉、魚粉、干血漿蛋白、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)從植物和動(dòng)物來源獲得的油和脂肪；f)礦物質(zhì)和維生素。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的食品，其中所述食品包含谷類，例如玉米、小麥、大麥、高粱、谷類產(chǎn)品，例如粥、面、面包或蛋糕、咖啡、可可、酒、啤酒、干豆、調(diào)味料、干果、葡萄汁、奶、奶制品如奶酪、肉或肉制品。
31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)所述的飼料或食品,其以約0.0Olmg/kg至約IOg/kg飼料/食品的水平包含所述酰胺酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項(xiàng)所述的飼料，其用于單胃動(dòng)物，優(yōu)選選自禽、豬、家養(yǎng)寵物、魚、貝類和甲殼類的單胃動(dòng)物消費(fèi)。
33.一種制備根據(jù)權(quán)利要求28至32中任一項(xiàng)所述的食品或飼料的方法，其包括向食品或飼料材料添加根據(jù)權(quán)利要求10至27中任一項(xiàng)所述的食品或飼料添加劑。
34.一種制備根據(jù)權(quán)利要求10至27中任一項(xiàng)所述的食品或飼料添加劑的方法，其包括將所述酰胺酶與至少一種生理上可接受的載體混合。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述至少一種生理上可接受的載體選自如下物質(zhì)中的至少一種:麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環(huán)糊精、小麥、麥麩或小麥組分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它們的混合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的方法，其包括均化所述食品或飼料添加劑的額外步驟。
37.根據(jù)權(quán)利要求34至36中任一項(xiàng)所述的方法，其包括將所述食品或飼料添加劑制粒的額外步驟。
38.一種組合物，其包含赭曲毒素污染的材料和赭曲毒素降解酰胺酶。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述酶為赭曲毒素A降解酰胺酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述材料污染有赭曲毒素A和/或赭曲毒素B。
41.根據(jù)權(quán)利要求38至40中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶是分離的。
42.根據(jù)權(quán)利要求38至41中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)，更優(yōu)選九個(gè):
43.根據(jù)權(quán)利要求38至42中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶具有Tim桶結(jié)構(gòu)，所述桶結(jié)構(gòu)包括包含6個(gè)組氨酸殘基、I個(gè)賴氨酸殘基和I個(gè)天冬氨酸殘基的活性位點(diǎn)，其中當(dāng)將所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三級(jí)結(jié)構(gòu)相比較時(shí)所述活性位點(diǎn)中的所述氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于 SEQ ID 勵(lì):1的位置11111、11113、11191、1(246、11287、11289、11307 和0378。
44.根據(jù)權(quán)利要求38至43中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
45.根據(jù)權(quán)利要求38至44中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶包含具有SEQIDNO:USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或 15 中任一者的序列，或具有與SEQ ID NO: USEQ ID N0:3 或 SEQ ID N0:5_ll、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID N0:USEQ ID N0:3或SEQ ID N0:5_ll、13、14或15相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
46.根據(jù)權(quán)利要求38至45中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶包含:具有SEQID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99% 同一1注的序列的多肽序列，或者與 SEQID N0:1或SEQ ID N0:3相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或由包含SEQID NO: 2 的序列或包含與 SEQ ID NO: 2 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID N0:2不同的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由與SEQ ID NO:2相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由在嚴(yán)格條件下雜交至SEQ ID N0:2的互補(bǔ)序列或雜交至與所述互補(bǔ)序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一丨丨生的序列的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽。
47.根據(jù)權(quán)利要求38至46中任一項(xiàng)所述的組合物，其中在pH7.0和40°C下溫育時(shí)所述酰胺酶每毫克蛋白質(zhì)每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
48.根據(jù)權(quán)利要求38至47中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酰胺酶是重組的。
49.根據(jù)權(quán)利要求38至48中任一項(xiàng)所述的組合物，其包含能夠表達(dá)所述酰胺酶的重組細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述細(xì)胞選自大腸桿菌、鏈霉菌屬、漢遜酵母屬、木霉屬(特別是氏木霉)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬(特別是黑曲霉)、植物細(xì)胞和/或芽孢桿菌屬、木霉屬或曲霉屬的孢子。
51.根據(jù)權(quán)利要求38至50中任一項(xiàng)所述的組合物，其包含一種或多種另外的酶。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述一種或多種另外的酶是選自如下的飼料或食品酶:涉及蛋白質(zhì)降解的酶，包括羧肽酶，優(yōu)選羧肽酶A、羧肽酶Y，黑曲霉天冬氨酸蛋白酶，優(yōu)選PEPAa、PEPAb, PEPAc和PEPAd，彈性蛋白酶，氨基肽酶，胃蛋白酶或胃蛋白酶樣蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶，和細(xì)菌蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶及其變體，以及涉及淀粉代謝、纖維降解、脂質(zhì)代謝的酶、涉及糖原代謝的蛋白質(zhì)或酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、表異構(gòu)酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，-葡糖苷酶，包括3 -葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解、果膠乙酰酯酶、果膠去聚合酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02_氧化還原酶，ECl.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它們的組合。
53.根據(jù)權(quán)利要求51或52所述的組合物，其還包含選自霉菌毒素降解酶例如黃曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮內(nèi)酯酶、伏馬毒素羧基酯酶、伏馬毒素氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌醇環(huán)氧化物水解酶中的至少一者、霉菌毒素降解微生物例如枯草芽孢桿菌或吸收劑(即霉菌毒素結(jié)合劑)，包括至少一種聚合物，例如微生物細(xì)胞壁或諸如膨潤(rùn)土之類的無機(jī)物質(zhì)。
54.根據(jù)權(quán)利要求38至53中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物是飼料組合物、發(fā)酵液或廢水。
55.根據(jù)權(quán)利要求38至54中任一項(xiàng)所述的組合物,其以約0.0Olmg/kg至約10g/kg的水平包含所述酰胺酶。
56.一種減少材料的赭曲毒素污染的方法，其包括向所述材料添加赭曲毒素降解酰胺酶。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述酶是赭曲毒素A降解酶。
58.根據(jù)權(quán)利要求56或權(quán)利要求57所述的方法，其中所述材料污染有赭曲毒素A和/或赭曲毒素B。
59.根據(jù)權(quán)利要求56至58中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶是分離的。
60.根據(jù)權(quán)利要求56至59中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一個(gè),優(yōu)選至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)，更優(yōu)選九個(gè):
61.根據(jù)權(quán)利要求56至60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶具有Tim桶結(jié)構(gòu)，所述桶結(jié)構(gòu)包括包含6個(gè)組氨酸殘基、I個(gè)賴氨酸殘基和I個(gè)天冬氨酸殘基的活性位點(diǎn)，其中當(dāng)將所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三級(jí)結(jié)構(gòu)相比較時(shí)所述活性位點(diǎn)中的所述氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于 SEQ ID 勵(lì):1的位置11111、11113、11191、1(246、11287、11289、11307 和0378。
62.根據(jù)權(quán)利要求56至61中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
63.根據(jù)權(quán)利要求56至62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶包含具有SEQIDN0:USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或 15 中任一者的序列，或具有與SEQ ID NO: USEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、.98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5-11、.13、14或15相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
64.根據(jù)權(quán)利要求56至63中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶包含:具有SEQIDNO:1 或 SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 具有至少 10%、20%、30%、.40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99% 同一1性的序列的多肽序列，或者與 SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 3相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽序列；或由包含SEQ ID NO: 2 的序列或包含與 SEQ ID NO: 2 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID NO:2不同的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由與SEQ ID NO:2相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由在嚴(yán)格條件下雜交至SEQ ID NO:2的互補(bǔ)序列或雜交至與所述互補(bǔ)序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽。
65.根據(jù)權(quán)利要求56至64中任一項(xiàng)所述的方法,其中在pH7.0和40°C下溫育時(shí)所述酰胺酶每毫克蛋白質(zhì)每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
66.根據(jù)權(quán)利要求56至65中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酰胺酶是重組的。
67.根據(jù)權(quán)利要求56至66中任一項(xiàng)所述的方法，其包含能夠表達(dá)所述酰胺酶的重組細(xì)胞。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述細(xì)胞選自大腸桿菌、鏈霉菌屬、漢遜酵母屬、木霉屬(特別是氏木霉)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬(特別是黑曲霉)、植物細(xì)胞和/或芽孢桿菌屬、木霉屬或曲霉屬的孢子。
69.根據(jù)權(quán)利要求56至68中任一項(xiàng)所述的方法,還包括添加一種或多種另外的酶。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述一種或多種另外的酶是選自:涉及蛋白質(zhì)降解的酶，包括羧肽酶，優(yōu)選羧肽酶、羧肽酶Y，黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb, PEPAc和PEPAd，彈性蛋白酶，氨基肽酶，胃蛋白酶或胃蛋白酶樣蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶，和細(xì)菌蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶及其變體，以及涉及淀粉代謝、纖維降解、月旨質(zhì)代謝的酶、涉及糖原代謝的蛋白質(zhì)或酶、乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、表異構(gòu)酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，-葡糖苷酶，包括3 -葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解、果膠乙酰酯酶、果膠去聚合酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02_氧化還原酶，ECl.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它們的組合。
71.根據(jù)權(quán)利要求69或70所述的方法，其還包含選自霉菌毒素降解酶例如黃曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮內(nèi)酯酶、伏馬毒素羧基酯酶、伏馬毒素氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌醇環(huán)氧化物水解酶中的至少一者、霉菌毒素降解微生物例如枯草芽孢桿菌或吸收劑(即霉菌毒素結(jié)合劑)，包括至少一種聚合物，例如微生物細(xì)胞壁或諸如膨潤(rùn)土之類的無機(jī)物質(zhì)。
72.根據(jù)權(quán)利要求56至71中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物是飼料組合物、發(fā)酵液或廢水。
73.根據(jù)權(quán)利要求56至72中任一項(xiàng)所述的方法,其以約0.001mg/kg至約10g/kg的水平包含所述酰胺酶。
74.—種飼料材料，其可通過根據(jù)權(quán)利要求56至73中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
75.—種增加動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和/或健康的方法，其包括給所述動(dòng)物飼喂有效量的根據(jù)權(quán)利要求28至32中任一項(xiàng)所述的飼料。
76.—種重組細(xì)胞或孢子，其編碼可降解赭曲毒素的酰胺酶。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶可降解赭曲毒素A。
78.根據(jù)權(quán)利要求76或權(quán)利要求77所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶是重組的。
79.根據(jù)權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶是分離的。
80.根據(jù)權(quán)利要求76至79中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)，更優(yōu)選九個(gè):
81.根據(jù)權(quán)利要求76至80中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶具有Tim桶結(jié)構(gòu)，所述桶結(jié)構(gòu)包括包含6個(gè)組氨酸殘基、I個(gè)賴氨酸殘基和I個(gè)天冬氨酸殘基的活性位點(diǎn)，其中當(dāng)將所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三級(jí)結(jié)構(gòu)相比較時(shí)所述活性位點(diǎn)中的所述氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:1 的位置 H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307 和 D378。
82.根據(jù)權(quán)利要求76至81中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
83.根據(jù)權(quán)利要求76至82中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶包含具有SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中任一者的序列，或具有與 SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:5-11、13、14或15相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
84.根據(jù)權(quán)利要求76至83中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述酰胺酶包含:具有SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID N0:3 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99% 同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽序列；或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含與SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQID NO:2不同的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由與SEQ ID NO:2相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸添力口、缺失和/或置換的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽；或由在嚴(yán)格條件下雜交至SEQ ID NO: 2的互補(bǔ)序列或雜交至與所述互補(bǔ)序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽。
85.根據(jù)權(quán)利要求76至84中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或孢子，其中所述細(xì)胞選自大腸桿菌、鏈霉菌屬、漢遜酵母屬、木霉屬(特別是氏木霉)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬(特別是黑曲霉)、植物細(xì)胞和/或牙抱桿囷屬、木霉屬或曲霉屬的抱子。
86.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶、根據(jù)權(quán)利要求13所述的飼料或食品添加劑、根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求80所述的細(xì)胞或孢子，其中所述基序包含:
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的酶、飼料或食品添加劑、組合物、方法或者細(xì)胞或孢子，其中所述基序包含:
88.—種飼料或食品添加劑，其包含基本上如本文所述的酰胺酶。
89.—種飼料或食品，其包含基本上如本文所述的飼料添加劑。
90.一種制備飼料或食品 的方法，所述飼料或食品基本上如本文所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及酰胺酶和包含能夠降解赭曲毒素的酰胺酶的飼料或食品添加劑。
文檔編號(hào)A23L1/03GK103209597SQ201180042549
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者于書坤, C.H.波爾森, S.達(dá)爾斯加爾德, 王華明, I.尼科萊夫 申請(qǐng)人:杜邦營(yíng)養(yǎng)生物科學(xué)有限公司