專利名稱：一種用于從蔗糖制備1,3-丙二醇的方法
—種用于從蔗糖制備1 ’ 3-丙二醇的方法本發(fā)明涉及一種用于從蔗糖生物制備1，3-丙二醇的新方法，包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾用于生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含用于從4-羥基-2-酮丁酸產(chǎn)生1，3-丙二醇的兩步代謝途徑，其包括第一步脫羧基和第二步還原，并且其中所述微生物經(jīng)修飾而能夠使用蔗糖作為唯一碳源。背景通過培養(yǎng)產(chǎn)生1，3-丙二醇的微生物來發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇是本領(lǐng)域中已知的。涉及維生素B12依賴性酶的1，3-丙二醇生產(chǎn)方法已經(jīng)有敘述；這些方法使得生產(chǎn)工藝流程
非常昂貴。正需要可替代的解決方案以不依賴維生素B12的途徑從可再生的碳源生產(chǎn)1，3-丙二醇。而且，正需要基于這種生產(chǎn)的必需能量改進(jìn)被生產(chǎn)的產(chǎn)物的總得率(overallyield)。最后，正需要控制雜質(zhì)和副產(chǎn)品的水平，用于產(chǎn)物分離、其銷售和進(jìn)一步的使用。I, 3-丙二醇主要從甘油(見專利申請PCT/EP2010/056078)和從葡萄糖經(jīng)由中間物甘油產(chǎn)生。因?yàn)槿澜绲母视蛢?chǔ)備(mondial glycerol stock)有限，因此需要發(fā)現(xiàn)其它的碳水化合物資源。發(fā)酵培養(yǎng)基中使用的碳源一般由碳水化合物組成，所述碳水化合物大多來自于植物。淀粉是植物中最豐富的碳水化合物儲(chǔ)備。由于生物技術(shù)生產(chǎn)的大宗化學(xué)品(commodity chemicals)的成本主要與原材料的成本(即發(fā)酵底物的成本)有關(guān)，因此對于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)而言，使用精制糖不是經(jīng)濟(jì)上可持續(xù)的選擇。需要較廉價(jià)、保持高含量可發(fā)酵糖的底物。在這個(gè)方面，來自制糖工業(yè)的蔗糖代表了一種好的選擇。蔗糖從含糖植物，如糖用甜菜、甘蔗、甜高粱、糖楓、糖棕櫚或藍(lán)色龍舌蘭(blueagaves)獲得。含有制糖工藝的中間物、產(chǎn)物或副產(chǎn)物的不同蔗糖(原汁、稀汁或澄清汁、濃汁、蔗糖糖漿、純蔗糖、糖蜜(molasses))均可用作發(fā)酵給料。微生物中攝取和利用蔗糖的兩種不同系統(tǒng)已經(jīng)被表征。第一種是基于磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴的蔗糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)(蔗糖PTS)，其中蔗糖被攝取并以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)作為供體被磷酸化，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)蔗糖-6-磷酸。蔗糖-6-磷酸隨后被轉(zhuǎn)化酶水解成D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖。D-果糖進(jìn)一步被ATP依賴的果糖激酶磷酸化成為D-果糖-6-磷酸，然后可以進(jìn)入中心代謝。這種系統(tǒng)已經(jīng)在數(shù)種細(xì)菌菌種，革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性中被描述。在腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中，超過90%的野生型克雷伯氏菌屬(Klebsiella),少于50%的埃希氏菌屬(Escherichia)和少于10%的沙門氏菌屬(Salmonella)菌株是鹿糖陽性的。已經(jīng)從沙門氏菌屬中分離出了攜帶編碼蔗糖PTS的scrKYABR基因的接合型質(zhì)粒pUR400(Schmid 等,1982, Schmid 等,1988)。最近在大腸桿菌(Esc herichia coli)EC3132中發(fā)現(xiàn)了稱作“非-PTS系統(tǒng)”的第二系統(tǒng)(Bockmann等，1992)。該系統(tǒng)包括編碼鹿糖:質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(CscB)、果糖激酶(CscK)和蔗糖特異性阻抑物(CscR)的cscBKAR基因。
大腸桿菌K12及其衍生物不能利用蔗糖。然而，可以通過轉(zhuǎn)移編碼兩種先前描述的系統(tǒng)的基因而賦予這種能力。這已經(jīng)通過在大腸桿菌K12中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUR400 (Schmid等，1982)或在大腸桿菌的蔗糖陰性菌株中轉(zhuǎn)移攜帶cscBKAR基因的不同質(zhì)粒(包括PKJL101-1) (Jahreis等，2002)得到證明。關(guān)于工業(yè)應(yīng)用，從蔗糖生產(chǎn)色氨酸已經(jīng)在大腸桿菌K12中有文獻(xiàn)報(bào)道(Tsunekawa等，1992)，生產(chǎn)氫已經(jīng)在攜帶pUR400質(zhì)粒的大腸桿菌中顯示(Penfold和Macaskie, 2004)，并且通過轉(zhuǎn)移兩種系統(tǒng)，即PTS和非PTS，生產(chǎn)不同氨基酸已在專利申請EP1149911中報(bào)道。令人驚訝地，通過將導(dǎo)致在不能利用蔗糖的大腸桿菌菌株中利用蔗糖的遺傳修飾和用于1，3-丙二醇的特異性生物合成途徑組合，本發(fā)明的發(fā)明人能夠獲得從可再生的碳源(蔗糖)生產(chǎn)1，3-丙二醇的得率的改善。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種經(jīng)遺傳修飾、用于從蔗糖生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含:-用于產(chǎn)生1，3-丙二醇的兩步代謝途徑，包括第一步用具有2-酮酸脫羧酶活性的酶將4-羥基-2-酮丁酸脫羧基，和第二步用具有羥基醛還原酶活性的酶還原所得的3-羥基丙醛，和-能夠使微生物利用蔗糖作為唯一碳源的基因。根據(jù)本發(fā)明，所述微生物至少包含一個(gè)編碼具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽的基因和一個(gè)編碼具有羥基醛還原酶活性的多肽的基因。這些基因可是外源的或內(nèi)源的，并且可以是染色體表達(dá)或者染色體外表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的微生物被進(jìn)一步遺傳修飾而能夠使用蔗糖作為唯一碳源。發(fā)明詳述如本文所使用的，如下的術(shù)語可以用于解釋權(quán)利要求和說明書。術(shù)語“蔗糖”是指通過α (1,2)糖苷鍵連接的葡萄糖和果糖的二糖，具有分子式C12H22O11。它的系統(tǒng)名為ct-D-卩比喃匍糖基-(I—-呋喃果糖苷。術(shù)語“經(jīng)遺傳修飾的微生物”意思是本發(fā)明的微生物不是在自然中發(fā)現(xiàn)的，而是通過引入或者通過缺失新的遺傳元件而被修飾的。它也可以通過如下而轉(zhuǎn)化:在定點(diǎn)誘變和在特異選擇壓力下進(jìn)化的組合中強(qiáng)迫新的代謝途徑的產(chǎn)生和進(jìn)化(參見例如W02004/076659)。如果將外源基因與允許它們在宿主微生物中表達(dá)的所有元件一起引入到微生物中，則微生物就能夠表達(dá)外源基因。用外源DNA轉(zhuǎn)化微生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)任務(wù)。外源基因可以整合入宿主基因組，或者可以通過質(zhì)?；蜉d體在染色體外表達(dá)。不同類型的質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們的不同在于其復(fù)制起點(diǎn)和在細(xì)胞中的拷貝數(shù)。在具體的實(shí)施方案中，內(nèi)源基因也可以被修飾以調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或活性，這可以通過或者在編碼序列中引入突變而修飾基因產(chǎn)物，或者通過引入異源序列疊加(inaddition)或者替換(in replacement of)內(nèi)源的調(diào)節(jié)元件。內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)可以有兩種方式:一方面上調(diào)和/或增強(qiáng)基因產(chǎn)物的活性，或者另一方面下調(diào)和/或降低內(nèi)源基因產(chǎn)物的活性。調(diào)控基因表達(dá)的重要元件是啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基因可以用具有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子表達(dá)，其可為誘導(dǎo)型的。這些啟動(dòng)子可為同源的或者異源的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇最方便的啟動(dòng)子，例如啟動(dòng)子Ptrc, Ptac, Plac或λ啟動(dòng)子cl是廣泛使用的。根據(jù)本發(fā)明，“具有2-酮酸脫羧酶活性的酶”是指具有脫羧酶活性的酶，其底物是2-酮酸。編碼2-酮酸脫羧酶活性酶的基因是本領(lǐng)域中公知的，包括來自多個(gè)物種的Pdc 基因，更具體為來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 Pdcl, Pdc5, Pdc6, ArolO和Thi3基因；來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的kivD基因；丙麗丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的pdc基因；來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的Pdc2和Pdc3基因；來自樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的Pdcl, Pdc2和ArolO ;和來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的pdc基因。由來自大腸桿菌的基因sucA編碼的2-酮戊二酸脫羧酶復(fù)合體的第一個(gè)亞基，以及由大腸桿菌的基因dxs編碼的酶也具有2-酮酸脫羧酶活性。所述基因和蛋白的功能同源物、功能變體和功能片段也涵蓋在本定義中。根據(jù)本發(fā)明，“具有羥基醛還原酶活性的酶”是指具有還原酶活性的酶，其底物是羥基醛。編碼羥基醛還原酶活性的基因是本領(lǐng)域中公知的，包括來自大腸桿菌的yqhD, fucO, dkgA, dkgB基因和來自釀酒酵母的ADHl和ADH2基因。所述基因和蛋白的功能同源物、功能變體和功能片段也涵蓋在本定義中。術(shù)語“利用蔗糖作為唯一碳源”是指微生物能夠在含有蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。然而應(yīng)當(dāng)理解，在根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)1，3_丙二醇的方法中，培養(yǎng)基中的蔗糖源除了蔗糖之外，可包含額外的 碳源，如己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、單糖、雙糖(例如蔗糖、纖維二糖或麥芽糖)、寡糖、淀粉或其衍生物、半纖維素、甘油，和其組合。 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，微生物包括編碼PTS蔗糖利用系統(tǒng)和/或非PTS蔗糖利用系統(tǒng)的功能基因。PTS蔗糖利用系統(tǒng)是一種基于由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴的蔗糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(蔗糖-PTS)轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的蔗糖利用系統(tǒng)。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)將糖(例如蔗糖或葡萄糖)的轉(zhuǎn)運(yùn)與使用PEP作為磷酸供體的糖的磷酸化偶聯(lián)。在轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞后，蔗糖-磷酸被轉(zhuǎn)化酶切割成葡萄糖-6-磷酸和果糖。果糖進(jìn)一步被果糖激酶磷酸化為果糖-6-磷酸。編碼此PTS蔗糖利用系統(tǒng)的基因可受到調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。非-PTS蔗糖利用系統(tǒng)是基于由不依賴磷酸烯醇式丙酮酸的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的蔗糖利用系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞后，蔗糖被轉(zhuǎn)化酶切割成葡萄糖和果糖。果糖進(jìn)一步被果糖激酶磷酸化為果糖-6-磷酸，葡萄糖被葡萄糖激酶磷酸化為葡萄糖-6-磷酸。編碼此非-PTS蔗糖利用系統(tǒng)的基因可受到調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面中，微生物天然表達(dá)或者通過引入如下基因而被修飾:來自沙門氏菌屬的scrKYABR(scrK編碼果糖激酶，scrY編碼膜孔蛋白(porin)，scrA編碼蛋白IIBC，scrB編碼蔗糖_6_P轉(zhuǎn)化酶，scrR編碼阻抑物)。攜帶所述scrKYABR基因的接合質(zhì)粒PUR400可以用于轉(zhuǎn)化微生物。這些基因可以全部組合在一起使用，或者以包含這些基因中至少一種的任意組合使用。特別地，scrR基因可以被省略。在本發(fā)明的另一個(gè)具體方面中，微生物天然表達(dá)或者通過引入來自大腸桿菌EC3132的基因而被修飾:即編碼蔗糖:質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(cscB)，果糖激酶(cscK)，轉(zhuǎn)化酶(cscA)和蔗糖特異性阻抑物(cscR)的cscBKAR基因。這些基因可以全部組合在一起使用，或者以包含這些基因中至少一種的任意組合使用。特別地，cscR基因可以被省略。也可以使用來自其它生物體的同源基因。根據(jù)本發(fā)明，這些基因的定名具有更一般的意義，并且涵蓋其它微生物中的相應(yīng)基因。使用來自沙門氏菌屬和來自大腸桿菌的基因的GenBank參考，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定除沙門氏菌屬或大腸桿菌之外的生物體中的等同基因。同源序列及其百分比同源性的鑒定手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且特別包含在BLAST程序中，其可以在http:"www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/網(wǎng)站上以該網(wǎng)站上所示的默認(rèn)參數(shù)使用。所得序列可以用例如CLUSTALW程序(http://www.eb1.ac.uk/clustalw/)使用這些網(wǎng)站上所示的默認(rèn)參數(shù)加以利用(比對)。PFAM數(shù)據(jù)庫(蛋白質(zhì)家族比對和隱馬爾可夫模型數(shù)據(jù)庫http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是一個(gè)大型的蛋白質(zhì)序列比對集合。每個(gè)PFAM均使其能夠顯示多重比對，觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，評(píng)價(jià)在生物體中的分布，獲取其它的數(shù)據(jù)庫和顯示已知的蛋白結(jié)構(gòu)。COGs (蛋白質(zhì)直向同源組的簇http://www.ncb1.nlm.nih.gov/COG/)是通過比較來自66個(gè)完全測序的代表14個(gè)主要系統(tǒng)發(fā)育譜系(phylogenetic line)的單細(xì)胞基因組的蛋白質(zhì)序列而獲得的。每一個(gè)COG由至少3個(gè)譜系限定，使其有可能鑒定古老的保守結(jié)構(gòu)域。目前本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用數(shù)種技術(shù)用于將DNA引入到細(xì)菌株內(nèi)。一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)是電穿孔，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶活性的內(nèi)源基因。所述微生物優(yōu)選 地選自:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(包括Pdcl, Pdc5, Pdc6, ArolO, Thi3 基因);乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) (Kivd);丙麗丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) (Pdc);樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)(Pdcl, Pdc2, ArolO);運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis) (Pdc);結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼2-酮酸脫羧酶的內(nèi)源基因的表達(dá)在所述微生物中增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，微生物不包含編碼2-酮酸脫羧酶的內(nèi)源基因。這種缺乏內(nèi)源2-酮酸脫羧酶的微生物優(yōu)選選自大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。對于這些微生物,本發(fā)明的微生物包含一個(gè)編碼2-酮酸脫羧酶的異源基因。編碼2-酮酸脫羧酶活性的基因包括來自多個(gè)物種的Pdc基因，更特別地是來自釀酒酵母的Pdcl, Pdc5, Pdc6, ArolO, Thi3基因)；來自乳酸乳球菌的kivd基因；來自丙酮丁醇梭菌pdc基因；來自擬南芥的Pdc2和Pdc3基因；來自樹干畢赤酵母的Pdcl, Pdc2和ArolO基因；和來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的Pdc基因。由來自大腸桿菌的sucA基因編碼的2-酮戊二酸脫羧酶復(fù)合體的第一個(gè)亞基以及由大腸桿菌dxs基因編碼的酶也具有2-酮酸脫羧酶活性。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述微生物包括編碼羥基醛還原酶活性的內(nèi)源基因。其優(yōu)選選自:大腸桿菌(yqhD, fucO, dkgA, dkgB);釀酒酵母(ADH1，ADH2);和具有至少一種具有醛還原酶活性或醇脫氫酶活性的酶的所有生物體。這種具有內(nèi)源羥基醛還原酶活性的微生物可以進(jìn)一步修飾，以增強(qiáng)編碼羥基醛還原酶的內(nèi)源基因的表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述微生物包括編碼羥基醛還原酶活性的異源基因。編碼羥基醛還原酶活性的基因包括來自大腸桿菌的yqhD，fucO, dkgA, dkgB基因和來自釀酒酵母的ADHl和ADH2基因。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述微生物經(jīng)遺傳修飾，以改進(jìn)從蔗糖產(chǎn)生4-羥基-2-酮丁酸。這個(gè)結(jié)果可以通過增加高絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶或高絲氨酸氧化酶的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。這些酶使L-高絲氨酸(從L-天冬氨酸獲得)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基-2-酮丁酸。增加高絲氨酸氧化酶的表達(dá)可以通過如下達(dá)成:引入和過表達(dá)來自不透明紅球菌(R.0pacUS)的編碼L-氨基酸氧化酶的基因，或者通過在基因中引入突變以增加相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。增加高絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)水平可以通過如下達(dá)成:引入驅(qū)動(dòng)大腸桿菌serC基因的表達(dá)的人工啟動(dòng)子，增加細(xì)胞中的拷貝數(shù)，或者在serC基因中引入突變以增加相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。I, 3-丙二醇的整體生物合成途徑如圖1所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物顯示草酰乙酸生物合成途徑中刺激的通量；此結(jié)果可通過增加由PPC基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。增加磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)水平可以通過如下達(dá)成:引入驅(qū)動(dòng)PPC基因表達(dá)的人工啟動(dòng)子，增加細(xì)胞中的拷貝數(shù)，或者在PPC基因中引入突變以增加相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。草酰乙酸匯集物/池(pool)的增加也可以通過增加由埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)或谷氨酸棒桿菌的Pyc基因編碼的外源丙酮酸羧化酶的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。丙酮酸羧化酶表達(dá)水平的增加可以通過(于染色體上或者在染色體外)過表達(dá)這些基因而達(dá)成。特別地，在厭氧條件下，草酰乙酸匯集物的增加還可以通過增加由PckA基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。丙酮酸羧化酶表達(dá)水平的增加可以通過如下達(dá)成:引入驅(qū)動(dòng)pckA基因表達(dá)的人工啟動(dòng)子，增加細(xì)胞中的拷貝數(shù)，或者在PckA基因中引入突變以增加相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。中間產(chǎn)物草酰乙酸的 可用性也可以通過減弱分別由pckA和/或sfcA或maeB基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或蘋果酸酶的基因的表達(dá)水平而增加。這可以通過用較低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替這些基因的野生型啟動(dòng)子，或者通過使用使相應(yīng)的信使RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的元件來完成。如果需要，也可以通過缺失相應(yīng)的DNA序列而實(shí)現(xiàn)這些基因的完全弱化或消除。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物向高絲氨酸生物合成途徑提供刺激的通量。這可以通過增加分別由thrA/metL和asd基因編碼的天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶和/或天冬氨酸半醛脫氫酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。增加天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶和/或天冬氨酸半醛脫氫酶的表達(dá)可以通過如下達(dá)成:引入驅(qū)動(dòng)thrA/metL和/或asd基因表達(dá)的人工啟動(dòng)子，增加細(xì)胞中的拷貝數(shù)，或者在thrA和/或asd基因內(nèi)引入突變以增加相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，可將突變弓I入thrA基因中，降低其對反饋抑制物蘇氨酸的敏感性(反饋脫敏的等位基因)，從而允許在蘇氨酸存在下活性的增加。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，微生物經(jīng)修飾以顯示高絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槌?，3_丙二醇之外的化合物的水平減弱。這個(gè)結(jié)果可以通過減弱高絲氨酸消耗酶，如高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶(由thrB和thrC編碼)、高絲氨酸O-轉(zhuǎn)琥珀酰基酶(由metA編碼)的水平而實(shí)現(xiàn)。這些基因可以通過如下弱化:用更弱的啟動(dòng)子代替天然啟動(dòng)子，或者使用使相應(yīng)的信使RNA或蛋白不穩(wěn)定的元件。如果需要，也可以通過缺失相應(yīng)的DNA序列而實(shí)現(xiàn)這些基因的完全弱化或消除。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)菌經(jīng)修飾以顯示高絲氨酸前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌?-羥基丙酸之外的化合物的水平減弱；這個(gè)結(jié)果可以通過減弱二氫吡啶二羧酸合酶(由dapA編碼)的水平而實(shí)現(xiàn)。該基因的弱化可以通過如下完成:用較低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替天然啟動(dòng)子，或者使用使相應(yīng)的信使RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的元件。如果需要，也可以通過缺失相應(yīng)的DNA序列而實(shí)現(xiàn)基因的完全弱化或消除。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明此具體實(shí)施方案中使用的細(xì)菌。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，微生物經(jīng)修飾以顯示3-羥基丙醛轉(zhuǎn)變?yōu)槌?，3-丙二醇之外的化合物的水平減弱。這個(gè)結(jié)果可以通過減弱3-羥基丙醛消耗酶，如3-羥基丙醛脫氫酶(由aldA，aldB, aldH編碼)的水平實(shí)現(xiàn)。這些基因可以通過如下弱化:用更弱的啟動(dòng)子代替天然啟動(dòng)子，或者使用使相應(yīng)的信使RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的元件。如果需要，也可以通過缺失相應(yīng)的DNA序列而實(shí)現(xiàn)基因的完全弱化或消除。所有用于轉(zhuǎn)化微生物的技術(shù)和用于增強(qiáng)本發(fā)明蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的調(diào)節(jié)元件均是本領(lǐng)域公知的，并且可在文獻(xiàn)中獲得，包括申請人自己的關(guān)于在多種微生物中修飾生物合成途徑的專利申請，包括 W02008/052973, W02008/052595, W02008/040387, W02007/144346, WO2007/141316，W02007/077041, W02007/017710, W02006/082254, W02006/082252, W02005/111202，W02005/073364, W02005/047498, W02004/076659，其內(nèi)容通過提述并入本文。如前所述，根據(jù)本 發(fā)明，這些基因的定名具有更一般性的意義，并且涵蓋在其它微生物中的相應(yīng)基因。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“微生物”是指細(xì)菌、酵母或真菌。優(yōu)選地，微生物選自:腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽抱桿菌科(Bacillaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)和棒桿菌科(Corynebacteriaceae)。更優(yōu)選地，微生物是埃希氏菌屬(Escherichia)、梭菌屬(Clostridium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬或棒桿菌屬(Corynebacterium)。甚至更優(yōu)選地，微生物是大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌或丙酮丁醇梭菌或枯草芽孢桿菌菌種。本發(fā)明還涉及用于從蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括如下步驟:-在含有鹿糖的合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物和-從培養(yǎng)基回收1，3-丙二醇。發(fā)酵在具有合適培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中一般地進(jìn)行，該合適培養(yǎng)基適合于(adaptedto)所述微生物，含有蔗糖和，如果需要的話，共底物?！昂线m培養(yǎng)基”是指如下的培養(yǎng)基(例如無菌的液體培養(yǎng)基)，其包含對于細(xì)胞的維持和/或生長必需的或有利的營養(yǎng)物，如碳源或碳底物、氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和磷酸銨；磷源例如磷酸一鉀或磷酸二鉀；痕量元素(例如金屬鹽)如鎂鹽、鈷鹽、和/或錳鹽；以及生長因子如氨基酸、維生素、生長促進(jìn)劑等。作為大腸桿菌已知培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例，培養(yǎng)基可以和M9培養(yǎng)基(Anderson, 1946，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA32:120-128)，M63 培養(yǎng)基(Miller, 1992; AShort Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York)或如 Schaefer 等(1999, Anal.Biochem.270:88-96)定義的培養(yǎng)基具有相同或相似的組成。發(fā)酵過程的培養(yǎng)條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地定義。特別地，細(xì)菌在200C -55°C，優(yōu)選在25°C _40°C，且優(yōu)選對于梭菌科在約35°C，而對于腸桿菌科在約37°C的溫度發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“培養(yǎng)”、“培育”、“生長”和“發(fā)酵”可互換使用，表示細(xì)菌在含有簡單(simple)碳源的合適生長培養(yǎng)基中的生長。發(fā)酵是一個(gè)經(jīng)典的過程，其可以在需氧、微氧或厭氧條件下進(jìn)行?！霸谛柩鯒l件下”意指通過使氣體溶解于液相中向培養(yǎng)物提供氧氣。這可以通過如下獲得:(1)將含氧氣體(例如空氣)噴射到液相或者⑵振蕩含有培養(yǎng)基的容器以便將頭部空間內(nèi)含有的氧氣轉(zhuǎn)移到液相。在需氧條件代替厭氧條件下發(fā)酵的優(yōu)勢在于，氧氣作為電子受體存在可改進(jìn)菌株以ATP形式產(chǎn)生更多能量用于細(xì)胞過程的能力。因此，菌株的一般代謝得到改進(jìn)。微氧條件被定義為如下的培養(yǎng)條件，其中將低百分比的氧氣(例如使用含有
0.1-10%氧氣、以氮?dú)庋a(bǔ)足至100%的氣體混合物)溶解到液相中。厭氧條件被定義為如下的培養(yǎng)條件，其中不向培養(yǎng)基中提供氧氣。嚴(yán)格的厭氧條件可以通過向培養(yǎng)基中噴射惰性氣體如氮?dú)庖猿ズ哿康钠渌鼩怏w而獲得。硝酸鹽可以用作電子受體以改進(jìn)菌株的ATP產(chǎn)生并改進(jìn)其代謝。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面中，蔗糖從生物質(zhì)，特別是從植物生物質(zhì)獲得。整個(gè)植物或者植物的任何具體部分均可用于制備用作含蔗糖培養(yǎng)基的原料。制備可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何處理，以從含蔗糖植物生物質(zhì)提取蔗糖。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，含蔗糖培養(yǎng)基從選自下組的植物中獲得:甘蔗、糖用甜菜、甜高粱、糖楓、糖棕櫚和藍(lán)色龍舌蘭。優(yōu)選地，含蔗糖培養(yǎng)基從甘蔗或糖用甜菜獲得?？墒褂煤崽桥囵B(yǎng)基的不同形式:汁(juice)、濃縮汁、糖漿、澄清汁、糖蜜或結(jié)晶蔗糖。優(yōu)選的形式是來自 甘蔗的原汁，從植物直接提取而不經(jīng)任何處理。簡言之，在用于提取汁液的磨制過程之前，洗滌收獲的甘蔗。將甘蔗的結(jié)構(gòu)打斷，隨后研磨，同時(shí)用水提取蔗糖以獲得原汁。然后，添加石灰使原汁澄清，加熱，并將澄清汁與沉淀物分離。通過蒸發(fā)獲得濃縮的糖漿。因?yàn)橐恍┐种坪崽桥囵B(yǎng)基，特別是如上所述從生物質(zhì)獲得的那些，除了含蔗糖培養(yǎng)基之外，還含有其它可用于微生物生長的營養(yǎng)物，因此用于微生物生長的合適培養(yǎng)基可通過如下設(shè)計(jì):使用僅含有蔗糖的培養(yǎng)基，即由含蔗糖培養(yǎng)基組成的合適培養(yǎng)基，或者用磷源和/或氮源補(bǔ)足含蔗糖培養(yǎng)基。優(yōu)選地，含蔗糖培養(yǎng)基包含至少7%的蔗糖。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，將回收的1，3_丙二醇進(jìn)一步純化。從培養(yǎng)基回收1，3-丙二醇是本領(lǐng)域技術(shù)人員的日常任務(wù)?；厥蘸图兓椒ㄔ谌缦碌膶＠暾堉杏泄_:W02009/068110 和 W02010/037843。在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不僅限于特定的例示的方法，當(dāng)然可以改變。特別地，實(shí)施例顯示了經(jīng)過修飾的大腸桿菌菌株，但是這些修飾可容易地在相同科的其它微生物上進(jìn)行。大腸桿菌屬于腸桿菌科，其包括革蘭氏陰性、棒狀、不形成孢子，并且通常為1_5μπι長的成員。大多數(shù)成員具有用于四處移動(dòng)的鞭毛，但是少數(shù)菌屬是不動(dòng)的。該科的許多成員是人類和其它動(dòng)物的腸中發(fā)現(xiàn)的腸道菌群中的正常部分，而其它的則見于水和土壤中，或者是不同動(dòng)物和植物品種上的寄生物。大腸桿菌(E.coli)是最重要的模式生物之一，但是我們也可以引用克雷伯氏菌屬(特別是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae))和沙門氏菌屬作為腸桿菌科的重要成員。


圖1從蔗糖生物合成1，3-丙二醇的途徑。
實(shí)施例實(shí)施例1以葡萄糖和蔗糖生產(chǎn)1，3-丙二醇的最大得率(yield)的計(jì)算1.1 -用于模擬的參數(shù)用METEX專有的軟件ΜΕΤ0ΡΤ 進(jìn)行模擬。使用大腸桿菌的簡化代謝網(wǎng)絡(luò)，其包括中心代謝網(wǎng)絡(luò)、用于所有生物質(zhì)前體的代謝途徑和如上所述的特定生產(chǎn)途徑。使用用于大腸桿菌的經(jīng)典生物質(zhì)組成。使用葡萄糖或蔗糖碳源進(jìn)行模擬。對于蔗糖使用，對PTS系統(tǒng)和非PTS系統(tǒng)均進(jìn)行建模。因?yàn)樵谒?jì)算的最大得率上沒有差異，所以僅報(bào)告了一個(gè)使用蔗糖的得率。對實(shí)際最大得率進(jìn)行了計(jì)算，考慮0.1tT1的生長速度和5mmolATP.gD/.1T1的維持能量。所有的模擬均以3mmol.gD:1.1T1的葡萄糖的比攝取速率(specific uptake rate)進(jìn)行。模擬在需氧條件下進(jìn)行。1.2 -模擬結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)遺傳修飾用于從蔗糖生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含: -用于產(chǎn)生1，3-丙二醇的兩步代謝途徑，包括第一步用具有2-酮酸脫羧酶活性的酶將4-羥基-2-酮丁酸脫羧基，和第二步用具有羥基醛還原酶活性的酶還原所得的3-羥基丙醛，和 -能夠使微生物利用蔗糖作為唯一碳源的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物包含編碼PTS蔗糖利用系統(tǒng)和/或非PTS蔗糖利用系統(tǒng)的功能基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物，其中所述微生物經(jīng)修飾而引入了scrKYABR或scrKYAB基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物，其中所述微生物經(jīng)修飾而引入了cscBKAR或cscBKA基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的微生物，其中具有2-酮酸脫羧酶活性的酶由內(nèi)源基因編碼。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的微生物，其中增強(qiáng)了編碼具有2-酮酸脫羧酶活性的酶的內(nèi)源基因的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4的微生物，其中具有2-酮酸脫羧酶活性的酶由異源基因編碼。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的微生物，其中改進(jìn)了所述微生物中從蔗糖產(chǎn)生4-羥基-2-酮丁酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的微生物，選自下組:細(xì)菌、酵母和真菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的微生物，其選自下組:腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽抱桿菌科(Bacillaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)和棒桿菌科(Corynebacteriaceae)。
11.一種用于從蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括如下步驟: -在包含蔗糖的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的微生物，和 -從所述培養(yǎng)基中回收1，3-丙二醇。
12.權(quán)利要求11的方法，其中進(jìn)一步純化1，3-丙二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)遺傳修飾的用于從蔗糖生物生產(chǎn)1,3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含-用于產(chǎn)生1,3-丙二醇的兩步代謝途徑，包括第一步用具有2-酮酸脫羧酶活性的酶將4-羥基-酮丁酸脫羧基，和第二步用具有羥基醛還原酶活性的酶還原所得的3-羥基丙醛，和-能夠使微生物利用蔗糖作為唯一碳源的基因。本發(fā)明還涉及一種通過發(fā)酵生物制備1,3-丙二醇的新方法，包括培養(yǎng)所述經(jīng)遺傳修飾的微生物，其中該培養(yǎng)在包含蔗糖源的合適培養(yǎng)基中進(jìn)行，和回收所生產(chǎn)的1,3-丙二醇。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，蔗糖源從植物生物量獲得。
文檔編號(hào)C12P7/18GK103097514SQ201180042798
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者P.索凱勒, C.波伊薩特 申請人:代謝探索者公司