專(zhuān)利名稱(chēng)：抗腫瘤抗原抗體及其使用方法
抗腫瘤抗原抗體及其使用方法交叉引用本申請(qǐng)要求于2010年7月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.61/366，823，該申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院頒發(fā)的第CA058207號(hào)撥款下借助政府資助進(jìn)行的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。引言癌癥轉(zhuǎn)錄模式的廣泛研究已導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)區(qū)分惡性與良性癌癥以及區(qū)分最具侵略性的癌癥與侵略性較差的癌癥的分子靶標(biāo)。癌癥通常過(guò)表達(dá)許多蛋白質(zhì)，包括某些細(xì)胞表面抗原，例如細(xì)胞表面受體。結(jié)合此類(lèi)過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體可促進(jìn)此類(lèi)癌癥的檢測(cè)和治療。已利用許多方法來(lái)產(chǎn)生可用作潛在治療劑的癌細(xì)胞表面受體的抗體。對(duì)過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表面受體和結(jié)合它們的抗體的鑒定提供了開(kāi)發(fā)癌癥治療的路徑，尤其提供了具有較差預(yù)后和對(duì)傳統(tǒng)療法具有抗性的那些癌癥亞型。CD44和EphA2是兩種此類(lèi)過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表面受體，并且由轉(zhuǎn)錄特征識(shí)別和蛋白質(zhì)組分析為人們所知，在基底乳腺癌中過(guò)表達(dá)。對(duì)在許多癌癥上過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表面受體特異的抗體已被用于開(kāi)發(fā)靶向的免疫治療劑。例如，HER2、⑶20和EGFR在許多腫瘤上過(guò)表達(dá)并且已開(kāi)發(fā)識(shí)別這些受體的抗體來(lái)治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌(曲妥珠單抗(trastuzamab))、淋巴瘤(利妥昔單抗(rituximab))和結(jié)直腸瘤(西妥昔單抗(cetuximab))。數(shù)種治療方法(包括抗體-藥物綴合物、免疫毒素和靶向核酸遞送)需要不僅結(jié)合受體而且在結(jié)合時(shí)內(nèi)化到細(xì)胞中的抗體。簡(jiǎn)述本文公開(kāi)了結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原CD44或腫瘤相關(guān)抗原EphA2的抗體，以及相關(guān)組合物及使用方法。使用方法包括癌癥療法、診斷和篩選方法。在某些實(shí)施方案中，抗體結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗原(例如，酵母展示的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗原)，在其他實(shí)施方案中，它們?cè)谂c哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合后被胞吞。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1A6特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1A6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD44。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞(被細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1A6的VhCDR1、F2-1A6的Vh CDR2和F2-1A6的Vh CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1A6的Vl CDRUF2-1A6的\ CDR2和F2-1A6的\ CDR3。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與包含F(xiàn)2-1A6的全長(zhǎng)Vh和F2-1A6的全長(zhǎng)\的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD44表位。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1H9特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1H9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD44。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的⑶44結(jié)合時(shí)被胞吞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1H9的Vh⑶R1、F2-1H9的Vh CDR2和F2-1H9的Vh CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1H9的\CDR1、F2-1H9的Vl CDR2和F2-1H9的Vl CDR3。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含F(xiàn)2-1H9的全長(zhǎng)Vh和F2-1H9的全長(zhǎng)
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、DIC5、DID1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF I 和 HH3 的抗體特異性結(jié)合的 CD44 表位；或與選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl和HH3的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD44。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含:E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的Vh CDRl ;E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或 HH3 的 Vh CDR2 ;和 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VHCDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含:E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的 Vl CDRl ;E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的 \ CDR2 ;和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 或 HH3的Vl⑶R3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含:E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的全長(zhǎng) Vh ;和 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的全長(zhǎng) VL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體2D6特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體2D6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A7特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A9特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。在另一方面，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1B1特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1B1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。所述抗體可以當(dāng)與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗體特異性結(jié)合的 EphA2 表位或與選自 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含:A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vh CDRl ;A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vh CDR2 ;和 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vh CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含:A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 VlCDRI ;A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 Vl CDR2 ;和 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7UD8 或 15H11 的 \ CDR3。在某些實(shí)施方案中，任一種前述單克隆抗體是單鏈Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fabj)2或(scFv’)2。任一種所述抗體可被標(biāo)記和/或與抗癌劑綴合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含表面和內(nèi)部空間的脂類(lèi)納米粒子，所述內(nèi)部空間包含抗癌劑，其中前述分離的抗體中的任一種或多種與所述脂類(lèi)納米粒子的表面連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)脂類(lèi)納米粒子與表達(dá)細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44的細(xì)胞接觸時(shí)，所述抗體與細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44結(jié)合并且脂類(lèi)納米粒子被胞吞。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體和任何一種前述抗體或任何一種前述脂類(lèi)納米粒子。所述組合物可被配制用于胃腸外施用。可選地，所述組合物可被配制用于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)或室內(nèi)施用或用于增強(qiáng)傳送的遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含該組合物的試劑盒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用一定量的任何一種前述抗體或任何一種前述脂類(lèi)納米粒子，其中所述量足以延緩癌癥的發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體被內(nèi)化到癌細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)受試者的癌細(xì)胞的方法，包括使任何一種前述抗體的抗體與疑似為癌性的所述受試者細(xì)胞接觸并且檢測(cè)與所述細(xì)胞結(jié)合的所述抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的核酸，包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列:包含克隆F2-1A6的抗體的Vh CDR1、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh ;包含克隆F2-1A6的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl ;包含克隆 F2-1H9 的抗體的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 VhCDR3的Vh ;包含克隆F2-1H9的抗體的Vl CDRl、Vl CDR2和VLCDR3的Vl ;包含選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗體的 Vh CDRUVh 0 2和￥11 CDR3 的 Vh ;或包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 VLCDR3 的\。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列:包含克隆F2-1A6的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1A6的抗體的Vl CDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ;包含克隆F2-1H9的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1H9 的抗體的 Vl CDRUVl CDR2 和 VLCDR3 的 Vl ;或包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1 C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗體的 Vh CDRUVh CDR2 和Vh CDR3 的 Vh 和包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDU HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗體的 \CDR1、\CDR2 和 \CDR3 的 \。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的核酸，其包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列:包含克隆2D6的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh、包含克隆2D6的抗體的\CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的包含克隆 D2-1A7 的抗體的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的VH、包含克隆D2-1A7的抗體的Vl CDR1、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl、包含克隆D2-1A9的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh、包含克隆 D2-1A9 的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3的Vl、包含克隆D2-1B1的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh、包含克隆D2-1B1的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 VLCDR3 的 Vl ;包含選自 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗體的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh ;包含選自 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗體的Vl CDRUVl CDR2和Vl CDR3的Vl ;或分離的核酸，其包含編碼I)和2) ；3)和4) ；5)和6)；7)和8);或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中,提供了表達(dá)載體,其包含任一種前述核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組宿主細(xì)胞(“基因修飾的宿主細(xì)胞”)，其包含所述載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞表達(dá)抗_EphA2抗體或抗-⑶44抗體。附圖簡(jiǎn)述

圖1.抗原結(jié)構(gòu)域在酵母表面上的展示。圖A，受體EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域(E⑶)在酵母表面上展示并且被抗-EphA2抗體和重組小鼠肝配蛋白A1(R&D, Minneapolis)識(shí)別，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)測(cè)定。圖B，CD44的連接結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1，或Dl)在酵母表面上展示并且被抗-CD44兔單克隆抗體識(shí)別，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)測(cè)定。兩種抗_EphA2和抗-CD44抗體不識(shí)別在酵母表面上展示的無(wú)關(guān)蛋白。圖2.噬菌體抗體從酵母展示的抗原中的回收率。圖A，已知結(jié)合EphA2(2D6)的噬菌體抗體從展示EphA2ECD的酵母(Y-Ep hA2)中的回收率與從展示無(wú)關(guān)蛋白的酵母(Y-CON)中的回收率的比較。用酵母展示的抗原中的每一種孵育總計(jì)IO11個(gè)抗-EphA2噬菌體抗體2D6。圖B，洗脫緩沖液對(duì)從展示EphA2ECD的酵母的表面洗脫的EphA2噬菌體抗體的效價(jià)的影響。在洗脫之前用酵母展示的抗原蛋白質(zhì)中的每一種孵育總計(jì)IO11個(gè)抗-EphA2噬菌體抗體2D6。圖C，輸入噬菌體效價(jià)對(duì)洗脫的噬菌體效價(jià)的影響。用酵母展示的EphA2ECD或無(wú)關(guān)酵母展示的蛋白質(zhì)孵育指示效價(jià)的抗_EphA2噬菌體抗體2D6并且測(cè)定洗脫的噬菌體的效價(jià)。圖3.選擇內(nèi)化抗原特異性噬菌體抗體的策略。圖A，在基底乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231上的內(nèi)化的兩輪選擇后，用無(wú)關(guān)對(duì)照酵母第一次孵育噬菌體抗體庫(kù)以除去任何酵母結(jié)合抗體，然后對(duì)展示EphA2ECD或CD44結(jié)構(gòu)域I的酵母進(jìn)行淘選。圖B，通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)量2輪淘選后多克隆噬菌體抗體庫(kù)與EphA2ECD或CD44結(jié)構(gòu)域I的結(jié)合信號(hào)。用未選擇的噬菌體抗體文庫(kù)(RO)、第I輪(Rl)和第2輪(R2)多克隆噬菌體染色無(wú)關(guān)對(duì)照酵母。圖C，對(duì)酵母展示的抗原的I輪和2輪選擇后抗原特異性噬菌體抗體的頻率。通過(guò)分析96個(gè)隨機(jī)挑選的與酵母展示的抗原結(jié)合的噬菌體抗體用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定結(jié)合頻率。用未選擇的噬菌體文庫(kù)(RO)以及分別來(lái)自Rl和R2的多克隆噬菌體染色所誘導(dǎo)的展示無(wú)關(guān)蛋白、EphA2-ECD或CD44結(jié)構(gòu)域I的酵母細(xì)胞。未誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞(僅酵母)、無(wú)關(guān)噬菌體抗體(噬菌體對(duì)照)和未選擇的噬菌體抗體文庫(kù)用作對(duì)照。圖4.來(lái)自酵母抗原生物淘選的單克隆噬菌體抗體的結(jié)合特異性。圖A，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的單克隆噬菌體抗體與酵母展示的抗原結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。用從Y_EphA2和Y-CD44D1選擇分離的單克隆噬菌體抗體染色所誘導(dǎo)的展示無(wú)關(guān)蛋白(Y-C0N)、EphA2-ECD(Y-EphA2ECD)、CD44 連接結(jié)構(gòu)域(Y-CD44ECD Dl)和 CD44 全長(zhǎng) ECD (Y-CD44ECD)的酵母細(xì)胞。圖B顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的單克隆噬菌體抗體與MDAMB231細(xì)胞的結(jié)合。圖C顯示單克隆噬菌體抗體與包括魯米那乳腺癌細(xì)胞系SUM52PE和MCF7的乳腺癌細(xì)胞系，以及基底乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231的差異結(jié)合。圖5.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)scFv抗體的表征。圖A，使用抗-EphA2scFv2D6或D2-1A7和抗_CD44scFv F2-1A6來(lái)免疫沉淀來(lái)自MDAMB231細(xì)胞的其革巴抗原。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡使用抗-EphA2抗體D7 (Upstate Biotech,Billerica)或抗-0)44抗體 Ab-4 (NeoMarkers，F(xiàn)remont)來(lái)檢測(cè)抗原。圖 B，EphA2 抗體 D2-1A7、D2-1A9 和 2D6 與肝配蛋白Al競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MDAMB231細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定噬菌體抗體D2_1A7、D2_1A9和2D6在遞增濃度的EphA2配體肝配蛋白Al的存在下與MDAMB231細(xì)胞結(jié)合的能力。
圖6.對(duì)EphA2和⑶44特異的噬菌體抗體被MDAMB231細(xì)胞胞吞。在37 °C用無(wú)關(guān)噬菌體(圖A)、抗-EphA2噬菌體D2-1A7 (圖B)和D2-1A9 (圖C)、抗-CD44噬菌體F2-1A6 (圖D和E)孵育經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞3小時(shí)，然后甘氨酸緩沖液洗滌。通過(guò)用抗_fd抗體檢測(cè)胞內(nèi)噬菌體、并且通過(guò)共焦顯微鏡分析來(lái)測(cè)定胞吞作用。圖7.對(duì)來(lái)自各種克隆的⑶44特異的抗體的全長(zhǎng)Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長(zhǎng)可變區(qū)。圖8.對(duì)來(lái)自各種克隆的EphA2特異的抗體的全長(zhǎng)Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長(zhǎng)可變區(qū)。圖9A和9B.來(lái)自克隆2D6的全長(zhǎng)抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。圖1OA和10B.來(lái)自克隆D2-1A7的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。圖1IA和11B.來(lái)自克隆D2-1A9的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。圖12A和12B.來(lái)自克隆D2-1B1的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。圖13A和13B.來(lái)自克隆F2-1A6的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。圖14A和14B.來(lái)自克隆F2-1H9的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸序列和編碼核酸序列。圖15A和15B.來(lái)自克隆E8H11的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:19)和編碼核酸(SEQ ID NO:20)序列。圖16A和16B.來(lái)自克隆E8H7的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:58)和編碼核酸(SEQ ID NO:59)序列。

圖17A和17B.來(lái)自克隆E8G12的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:60)和編碼核酸(SEQ ID NO:61)序列。圖18A和18B.來(lái)自克隆E8F11的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:63)和編碼核酸(SEQ ID NO:64)序列。圖19A和19B.來(lái)自克隆E8C9的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:72)和編碼核酸(SEQ ID NO:73)序列。圖20A和20B.來(lái)自克隆D6G9的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:85)和編碼核酸(SEQ ID NO:86)序列。圖21A和21B.來(lái)自克隆D6D3的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:127)和編碼核酸(SEQ ID NO:128)序列。圖22A和22B.來(lái)自克隆A3H9的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO: 129)和編碼核酸(SEQ ID NO:130)序列。圖23A和23B.來(lái)自克隆A3G3的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO: 138)和編碼核酸(SEQ ID NO:139)序列。圖24A和24B.來(lái)自克隆A3D10的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO: 140)和編碼核酸(SEQ ID NO:141)序列。圖25A和25B.來(lái)自克隆A3D1的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:310)和編碼核酸(SEQ ID NO:311)序列。圖26A和26B.來(lái)自克隆A3C8的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:312)和編碼核酸(SEQ ID NO:313)序列。圖27A和27B.來(lái)自克隆1A3的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:314)和編碼核酸(SEQ ID NO:315)序列。圖28A和28B.來(lái)自克隆1A5的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:316)和編碼核酸(SEQ ID NO:317)序列。圖29A和29B.來(lái)自克隆1A8的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:318)和編碼核酸(SEQ ID NO:319)序列。圖30A和30B.來(lái)自克隆1A12的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:320)和編碼核酸(SEQ ID NO:321)序列。圖31A和31B.來(lái)自克隆1B2的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:322)和編碼核酸(SEQ ID NO:323)序列。圖32A和32B.來(lái)自克隆1C2的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:324)和編碼核酸(SEQ ID NO:325)序列。圖33A和33B.來(lái)自克隆1C7的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:326)和編碼核酸(SEQ ID NO:327)序列。圖34A和34B.來(lái)自克隆1D8的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:328)和編碼核酸(SEQ ID NO:329)序列。圖35A和35B.來(lái)自克隆15H11的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:330)和編碼核酸(SEQ ID NO:331)序列。圖36A和36B.來(lái)自克隆D1C5的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:332)和編碼核酸(SEQ ID NO:333)序列。圖37A和37B.來(lái)自克隆DlDl的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:334)和編碼核酸(SEQ ID NO:335)序列。圖38A和38B.來(lái)自克隆H1B8 (在本文也稱(chēng)為“HB8”)的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:336)和編碼核酸(SEQ ID NO:337)序列。圖39A和39B.來(lái)自克隆H1C2 (在本文也稱(chēng)為“HC2”)的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:338)和編碼核酸(SEQ ID NO:339)序列。圖40A和40B.來(lái)自克隆H1C4 (在本文也稱(chēng)為“HC4” )的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:340)和編碼核酸(SEQ ID NO:341)序列。圖41A和41B.來(lái)自克隆H1E3 (在本文也稱(chēng)為“HE3”)的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:342)和編碼核酸(SEQ ID NO:343)序列。圖42A和42B.來(lái)自克隆HlFl (在本文也稱(chēng)為“HF1 ” )的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:344)和編碼核酸(SEQ ID NO:345)序列。圖43A和43B.來(lái)自克隆H1H3 (在本文也稱(chēng)為“HH3”)的全長(zhǎng)scFv抗體的氨基酸(SEQ ID NO:346)和編碼核酸(SEQ ID NO:347)序列。圖44.對(duì)來(lái)自各種克隆的⑶44特異的抗體的全長(zhǎng)Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長(zhǎng)可變區(qū)。提供E8H11(SEQ ID NO:348) ；E8H7 (SEQID NO:349) ；E8G12(SEQ ID NO:350) ；E8F11(SEQ ID NO:351) ；E8C9(SEQ ID NO:352)；D6G9 (SEQ ID NO:353) #PD6D3(SEQ ID NO:354)的 Vh 序列。提供 E8H11 (SEQ ID NO:355)；E8H7(SEQ ID NO:356) ；E8G12(SEQ I D NO:357) ；E8F11(SEQ ID NO:358) ；E8C9(SEQ ID NO:359) ；D6G9 (SEQ ID NO:360) JPD6D3(SEQ ID NO:361)的 Vl 序列。
圖45A和45B.對(duì)來(lái)自各種克隆的⑶44特異的抗體的全長(zhǎng)Vh和'的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長(zhǎng)可變區(qū)。提供D1C5(SEQ ID NO:362)；DlDl (SEQ ID NO:363) ；HB8(SEQ ID NO:364) ；HC2(SEQ ID NO:365) ；HC4(SEQ ID NO:366) ；HE3 (SEQ ID NO:367) ; HF I (SEQ ID NO:368) jPHH3(SEQ ID NO:369)的 Vh 序列。提供 D1C5(SEQ ID NO:370) ；D1D1(SEQ ID NO:371) ；HB8(SEQ ID NO:372) ；HC2(SEQ ID NO:373) ；HC4(SEQ ID NO:374) ；HE3 (SEQ ID NO:375) ; HF I (SEQ ID NO:376) JPHH3(SEQ IDNO:377)的 Vl 序列。圖46.對(duì)來(lái)自各種克隆的EphA2特異的抗體的全長(zhǎng)Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長(zhǎng)可變區(qū)。提供A3H9(SEQ ID NO:378) ；A3G3 (SEQID NO:379) ；A3D10(SEQ ID NO:380) ；A3D1 (SEQ ID NO:381) #PA3C8(SEQ ID NO:382)的 Vh 序列。提供 A3H9(SEQ ID NO:383) ；A3G3 (SEQ ID NO:384) ；A3D10(SEQ ID NO:385)；A3D1 (SEQ ID NO:386) JPA3C8(SEQ ID NO:387)的 Vl 序列。圖47.對(duì)來(lái)自各種克隆的EphA2特異的抗體的全長(zhǎng)Vh和\的氨基酸序列。也指示框架和互補(bǔ)決定區(qū)。SEQ ID NO是指全長(zhǎng)可變區(qū)。提供1A3(SEQ ID NO:388) ；1A5(SEQID NO:389) ； 1A8(SEQ ID NO:390) ；1A12(SEQ ID NO:391) ；1B2(SEQ ID NO:392) ；1C2(SEQID NO:393) ；1C7(SEQ ID NO:394);和 1D8 (SEQ ID NO:395)的 Vh 序列。提供 1A3 (SEQ IDNO:396) ； 1A5(SEQ ID NO:397) ； 1A8(SEQ ID NO:398) ；1A12(SEQ ID NO:399) ；1B2(SEQ IDNO:400) ；1C2(SEQ ID NO:401) ；1C7(SEQ ID NO:402) JP1D8(SEQ ID NO:403)的Vl序列。定義下列縮寫(xiě)可在 本文使用:⑶R，互補(bǔ)決定區(qū)；Fab，具有可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段；FACS，熒光活化細(xì)胞分選；IgG，免疫球蛋白G ;KD，解離平衡常數(shù)，締合速率常數(shù)，解離速率常數(shù);mAb，單克隆抗體;MFI，平均熒光強(qiáng)度；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；PCR，聚合酶鏈反應(yīng)；SCFv，單鏈形式的抗體可變區(qū)；VH，重鏈可變區(qū)；'，輕鏈可變區(qū)；TAA，腫瘤相關(guān)抗原；EGFR，表皮生長(zhǎng)因子受體；ECD，胞外結(jié)構(gòu)域；IMAC，固定化金屬親和色譜；IL，免疫脂質(zhì)體；IPTG，異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷；2-ΜΕΑ，2-巰基乙胺；DTT，二硫蘇糖醇；TEA，三乙胺；TBS-T，Tris-緩沖鹽水Tween-20 ;Ni_NTA，鎳-次氮基三乙酸；PE，藻紅蛋白；HMEC，人乳腺上皮細(xì)胞，如本文所用的，“EphA2”是指可結(jié)合肝配蛋白A配體的受體酪氨酸激酶家族的成員，并且也可被稱(chēng)為“上皮細(xì)胞激酶(ECK)”。術(shù)語(yǔ)“EphA2”可以是指任何天然存在同種型的EphA2。EphA2的氨基酸序列是已知的并且可以作為GenBank登錄號(hào)NP_004422.2被發(fā)現(xiàn)。如本文所用的，“⑶44”是指透明質(zhì)酸(HA)的受體，并且也可以被稱(chēng)為“吞噬細(xì)胞糖蛋白I”、“透明質(zhì)酸鹽受體”或“⑶44抗原”。例如，術(shù)語(yǔ)“⑶44”可以是指任何一種天然存在同種型的⑶44。⑶44的氨基酸序列是已知的并且最長(zhǎng)同種型的⑶44可以作為GenBank登錄號(hào)NP_000601.3被發(fā)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”或“蛋白”可在本文交換地使用，指通過(guò)相鄰殘基的α -氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接到一起的一系列線(xiàn)性氨基酸殘基。此外，除了 20個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)”遺傳上可編碼的氨基酸之外，氨基酸還包括氨基酸類(lèi)似物。而且，應(yīng)當(dāng)指出，在氨基酸殘基序列的開(kāi)始或結(jié)束處的破折號(hào)，表示與一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的另一序列的肽鍵，或與羧基或羥基末端基團(tuán)的共價(jià)鍵。然而，缺少破折號(hào)不應(yīng)是指羧基或羥基末端基團(tuán)的此類(lèi)肽鍵或共價(jià)鍵不存在，因?yàn)楸硎景被嵝蛄袝r(shí)省略破折號(hào)是約定俗成的?！翱贵w”涵蓋組合物，其包含單獨(dú)或作為包含其多個(gè)的制備物的抗原-結(jié)合蛋白，具有一種或多種可以由免疫球蛋白基因、或免疫球蛋白基因的片段遺傳上編碼或包含獲自或源自免疫球蛋白的CDR并且結(jié)合目標(biāo)抗原的多肽。輕鏈被分為K或λ。重鏈可被分為Υ、μ、α、δ或ε，其分別定義免疫球蛋白類(lèi)別，IgG, IgM, IgA、IgD和IgE0抗體的實(shí)例是具有由兩對(duì)多肽鏈(每對(duì)多肽鏈具有一條“輕”鏈和一條“重”鏈)組成的四聚體的結(jié)構(gòu)單元的抗體。每條鏈的N-端部分定義介導(dǎo)抗原結(jié)合的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈和可變重鏈(Vh)分別是指輕鏈和重鏈?！翱贵w”還涵蓋含有連接在一起作為單一多肽的重鏈和輕鏈的單鏈抗體，盡管如此這種連接的重鏈或輕鏈中的每條在本文被稱(chēng)為重鏈或輕鏈。抗體還可以是指僅有重鏈的抗體例如重鏈抗體或HCAb。如上所述，“抗體”涵蓋完整的免疫球蛋白以及抗體的抗原-結(jié)合片段。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合部分，其可通過(guò)全抗體的修飾來(lái)制備或重新使用重組DNA方法來(lái)合成。實(shí)例包括但不限于Fab’、Fab' 2、scFv、納米抗體、單抗體(unibody)和雙鏈抗體?！凹{米抗體”是指單鏈抗體的最小抗原-結(jié)合片段，也被稱(chēng)為VhH或單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)?！皢慰寺】贵w”是指包含一個(gè)或多個(gè)抗體的組合物，所述抗體獲自大體上均質(zhì)的抗體的群體，即，除可以以少量存在的任何天然存在的突變之外其單獨(dú)抗體是相同的群體。單克隆抗體針對(duì)單一抗原位 點(diǎn)并且一般針對(duì)抗原上的單一表位是高度特異性的。修飾詞“單克隆”是指獲自大體上均質(zhì)的抗體群體的抗體的字符，并且不要求抗體由任何特定方法產(chǎn)生或?yàn)榻M合物中的唯一抗體。單鏈Fv( “scFv”)多肽是共價(jià)連接的VH:異二聚體，其可由包括直接連結(jié)或通過(guò)肽-編碼連接體連結(jié)的Vh-和編碼序列的核酸表達(dá)(Huston,等人(1988) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:5879-5883)。許多結(jié)構(gòu)可用于將來(lái)自抗體V區(qū)的多肽輕鏈和重鏈轉(zhuǎn)化成scFv分子，scFv分子將折疊成大體上類(lèi)似于抗原-結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。除為雙鏈抗體外，scFvs還可以三鏈抗體或四鏈抗體存在。應(yīng)當(dāng)指出，盡管各種抗體片段根據(jù)完整抗體的消化來(lái)定義，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解此類(lèi)片段可用化學(xué)方法或通過(guò)利用重組DNA方法來(lái)重新合成。術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋多克隆和單克隆抗體，并且進(jìn)一步涵蓋任何類(lèi)別(例如，IgM.1gG及其子類(lèi))的抗體。“抗體”還涵蓋雜交抗體、雙特異性抗體、異種抗體、嵌合抗體、人源化抗體和其保留抗原結(jié)合的功能片段?！半p特異性抗體”可類(lèi)似單一抗體(或抗體片段)但具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))。異種抗體是指兩個(gè)或更多個(gè)連接在一起的抗體或抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab)，每個(gè)抗體或片段具有不同的特異性?？贵w可與其它部分綴合，和/或可結(jié)合至支架(例如，固體支架)例如聚苯乙烯板或珠、測(cè)試條等。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由被三個(gè)高可變區(qū)(也稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”)截?cái)嗟摹翱蚣堋眳^(qū)(FR)組成?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍可基于本領(lǐng)域已知的數(shù)據(jù)庫(kù)被定義。參見(jiàn)，例如，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，，E.Kabat 等人，Sequences of proteins of immunological interest,第 4 版 U.S.Dept.Health andHuman Services, Public Health Services, Bethesda, MD(1987), Lefranc 等人 IMGT,the international ImMunoGeneTics information system .Nuc1.Acids Res., 2005, 33:D593-D597 (WWW.1mgt.0rg/textes/IMGTScientif icChart/)和 / 或在 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/的V Base)。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種內(nèi)相對(duì)保守?？贵w的框架區(qū)(其為組成型輕鏈和重鏈的組合框架區(qū))用于定位并對(duì)齊⑶R。⑶R主要負(fù)責(zé)與抗原的表位結(jié)合。除非另有指示，否則由本公開(kāi)提供的所有CDR和框架根據(jù)Kabat等人(同上)來(lái)定義?！翱?EphA2抗體”或"抗-⑶44抗體"是指優(yōu)選以高親和性與EphA2或⑶44特異性結(jié)合的抗體。對(duì)EphA2或⑶44特異的抗體未顯示相對(duì)于EphA2或⑶44的結(jié)合，與EphA2或CD44無(wú)關(guān)的其他抗原相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。術(shù)語(yǔ)“高親和性”當(dāng)針對(duì)抗體使用時(shí)是指特異性結(jié)合(“識(shí)別”)其靶的親和性(Kd)值小于或等于10_6M、小于ιο 、小于10_8M、優(yōu)選小于10_9M、小于ΙΟ,Μ或小于1(ΓηΜ的抗體。較低Kd值對(duì)應(yīng)于較高的結(jié)合親和性(B卩，較強(qiáng)的結(jié)合)以使10_7的Kd值指示比10_6的Kd值高的結(jié)合親和性。“抗原-結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部分”是指參與免疫反應(yīng)性抗原結(jié)合的抗體分子的部分(例如免疫球蛋白分子或scFv的片段)。抗原結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)重(“H”)鏈和/或輕(“L”)鏈的N-端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。重鏈和輕鏈的V區(qū)內(nèi)的三個(gè)高度發(fā)散的延伸部分被稱(chēng)為“高可變區(qū)”，其插入在稱(chēng)為“框架區(qū)”或“FR”的更保守側(cè)翼延伸部分之間。因此，術(shù)語(yǔ)“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高可變區(qū)之間和與高可變區(qū)相鄰的氨基酸序列。在三聚體抗體分子中，輕鏈的三個(gè)高可變區(qū)和重鏈的三個(gè)高可變區(qū)在三維空間中相對(duì)于彼此布置以形成抗原結(jié)合“表面”。 該表面介導(dǎo)靶抗原的識(shí)別和結(jié)合。重鏈和/或輕鏈中的每個(gè)鏈的三個(gè)高可變區(qū)被稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”并且例如基于Kabat等人(同上)來(lái)測(cè)定。" F2-1A6抗體”是指由克隆F2-1A6表達(dá)的抗體或以其它方式合成但是具有與由克隆F2-1A6表達(dá)的抗體相同的CDR并且任選地具有相同的框架區(qū)，并且具有大體上相同的抗原結(jié)合特異性的抗體。類(lèi)似地，抗體2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1H9等(例如，抗體E8H11、E8H7、E8G12、E8F11 和 E8C9 ;抗體 D6G9 和 D6D3 ;抗體 D1C5 和 DlDl ;抗體 HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 ;抗體 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1 和 A3C8 ;抗體 1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7和1D8 ;以及抗體15H11)是指由相應(yīng)克隆表達(dá)的抗體和/或以其它方式合成但是具有與參考抗體相同的CDR并且任選地具有相同的框架區(qū)，并且具有大體上相同的抗原結(jié)合特異性的抗體。這些抗體的⑶R通過(guò)Kabat等人(同上)來(lái)定義，如圖7、8和44-47以及下表所示?！氨砦弧笔强贵w所結(jié)合的抗原上的位點(diǎn)(例如EphA2胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)上的位點(diǎn))。表位可以由連續(xù)氨基酸或通過(guò)蛋白的折疊(例如，三級(jí)折疊)而并置的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位暴露于變性溶劑后通常仍保持，然而通過(guò)折疊形成的表位用變性溶劑的處理后通常喪失。在線(xiàn)性或空間構(gòu)象中，表位通常包括至少3個(gè)、更通常至少5或8-10個(gè)氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如，X-射線(xiàn)結(jié)晶學(xué)和2維核磁共振。參見(jiàn)，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,GlennE.Morris編輯(1996)。數(shù)個(gè)商業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供表位作圖服務(wù)。通過(guò)與膜相關(guān)抗原具有免疫反應(yīng)性的抗體結(jié)合的表位可位于細(xì)胞的表面(例如跨膜蛋白的胞外區(qū)中)，以使此類(lèi)表位被認(rèn)為是細(xì)胞表面可及的，溶劑可及的和/或細(xì)胞表面暴露的?！胺蛛x的”是指在與實(shí)體可天然出現(xiàn)的環(huán)境不同的環(huán)境中的目標(biāo)實(shí)體(例如蛋白，如抗體)。“分離的”實(shí)體從本質(zhì)上伴隨其的所有或一些組分分離并且可以是大體上富集的。“分離的”也是指從在生成(例如，化學(xué)合成、重組表達(dá)、培養(yǎng)基等)過(guò)程中伴隨其的所有或一些組分分離的實(shí)體的狀態(tài)。主題抗體可以是大體上純的?！按篌w上純的”可以是指其中至少75 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %或多于99 %的總組合物是目標(biāo)實(shí)體(例如，主題抗體)的組合物。當(dāng)提及抗體時(shí)，短語(yǔ)“特異性結(jié)合”、“對(duì)...特異”、“免疫反應(yīng)性”和“免疫反應(yīng)性”和“抗原結(jié)合特異性”是指與抗原的結(jié)合反應(yīng)，其對(duì)抗原或其片段具有高優(yōu)先性，以使在抗原的異質(zhì)群體(例如，蛋白和群體生物制品，例如在組織中)存在下確定抗原的存在。因此，在特定的免疫測(cè)定條件下，指定的抗體與特定抗原結(jié)合并且不以顯著量與存在于樣品中的其他抗原結(jié)合。在此類(lèi)條件下與抗原的特異性結(jié)合可需要因其對(duì)特定抗原的特異性而被選擇的抗體。例如，抗-CD44抗體可以與CD44特異性結(jié)合，并且不展示與存在于組織樣品中的其他蛋白相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合(例如，不展示可檢測(cè)的結(jié)合)。參見(jiàn)Harlow和Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York,用于描述可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件。詳述本文公開(kāi)了與腫瘤相關(guān)抗原CD44特異性結(jié)合的抗體和與腫瘤相關(guān)抗原EphA2特異性結(jié)合的抗體，以及相關(guān)組合物及使用方法。使用方法包括癌癥治療、診斷和篩選方法。當(dāng)抗體對(duì)CD44特異時(shí)，抗體含有克?。?-認(rèn)6、？2-1!1948!11148!174861248卩11、E8C9、D6G9、D6D3、DIC5、DID1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF I 或 HH3 (例如，通過(guò)其表達(dá)而獲得)的抗體的Vh的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)⑶R?？贵w還涵蓋含有克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、 E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 或 HH3 的抗體的\的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)⑶R的抗體?？贵w還涵蓋含有獨(dú)立地選自克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗體的'和Vh中的每個(gè)的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)⑶R的抗體?？蛇x地，抗體與克隆 F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3的抗體(例如，結(jié)合與其相同的表位)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合⑶44。當(dāng)抗體對(duì)EphA2 特異時(shí),抗體含有克隆 2D6、D2_1A7、D2-1A9、D2_1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗體的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)重鏈(Vh)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)?？贵w還涵蓋含有克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗體的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)輕鏈(V互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的抗體?？贵w還涵蓋含有獨(dú)立地選自克隆 2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體的Vl和Vh中的每個(gè)的至少一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)CDR 的抗體?？蛇x地，抗體與克隆 2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體(例如，結(jié)合與其相同的表位)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。
本公開(kāi)的抗體也可以含有克隆F2-1A6、F2_1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗體的所有乂11 CDR 和 / 或 Vl CDR?？贵w可以含有克隆 F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗體的全長(zhǎng)Vh鏈?？贵w也可以或可選地含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的抗體的全長(zhǎng)Vl鏈?？贵w可以是全長(zhǎng)抗體(即，包含至少一個(gè)全長(zhǎng)Vh序列和至少一個(gè)全長(zhǎng)'序列的抗體)或片段例如單鏈Fv(scFv )、Fab、(Fab’)2、(ScFv)2等?？贵w可以是IgG(例如，IgG2)或任何其他同種型，或可以是雙特異性抗體。抗體可以例如與抗癌藥物、標(biāo)記、或與改善或提升血清半衰期(例如聚(乙二醇)(PEG))、胞吞、或另一種生物功能或特征的部分綴合?？贵w也可以在包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物中，例如，適用于注射的組合物(例如，在單位劑量制劑中)。本公開(kāi)還提供包括一個(gè)或多個(gè)抗體的組合物，所述抗體選自本文所述的抗體和/或包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自這些抗體的CDR的抗體，和/或包含這些抗體的突變體或衍生物的一個(gè)或多個(gè)抗體。組合物可以包括一種或多種抗體，例如 F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11。本公開(kāi)的方法包括提供以有效治療患有表達(dá)由一個(gè)或多個(gè)主題抗體特異性結(jié)合的抗原的癌癥的受試者的量施用一個(gè)或多個(gè)本文公開(kāi)的主題抗體的方法。由本公開(kāi)提供的抗體也可以用于診斷/預(yù)后癌癥或使癌癥成像。本文提供的核酸編碼本文描述的一個(gè)或多個(gè)抗體。本文還提供含有此類(lèi)核酸的宿主細(xì)胞，以及生成主題抗體(例如通過(guò)分泌)的宿主細(xì)胞。還提供用于制備含有主題抗體的組合物或用于進(jìn)行主題方法的試劑盒。優(yōu)選的抗體對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、EphA2或⑶44中的一個(gè)或多個(gè)具有高親和性(例如，顯示IO-7M或更低的Kd值)，在至少一些部分的細(xì)胞周期中細(xì)胞表面暴露于癌細(xì)胞上。還設(shè)想對(duì)EphA2或⑶44具有較低親和性(例如，具有10_5M至10_6M的Kd值)的抗體。癌細(xì)胞例如包括源自乳腺癌細(xì)胞(例如MDAMB231)等等的癌細(xì)胞。主題抗體包括在與抗原例如活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的抗原結(jié)合時(shí)，例如通過(guò)胞吞、例如受體介導(dǎo)的胞吞內(nèi)化到細(xì)胞中的那些。主題抗體包括與克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD44表位的那些?？贵w還涵蓋與克隆 2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EphA2上的表位的抗體。特定抗體識(shí)別與另一抗體相同的表位的能力可通過(guò)一個(gè)抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制第二抗體(例如，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合)與抗原的結(jié)合來(lái)測(cè)定(例如，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定例如美國(guó)專(zhuān)利公布N0.20090291085中公開(kāi)的那些來(lái)測(cè)定)。結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制也可以被稱(chēng)為抗體的交叉反應(yīng)性。許多競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的任一種可用于測(cè)量?jī)蓚€(gè)抗體對(duì)相同抗原的競(jìng)爭(zhēng)。例如，夾心ELISA測(cè)定可以用于該目的。交叉反應(yīng)性的測(cè)定方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見(jiàn)，例如，Dowbenko 等人(1988) J.Virol.62:4703-4711)。如果在第一抗體存在下第二抗體與抗原的結(jié)合減少至少30%、通常至少約40%、50%、60%或75%、常常至少約90% (使用任一種用于評(píng)估競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的測(cè)定)，則抗體被認(rèn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制第二抗體與抗原的結(jié)合。這可以通過(guò)提供連接至固體支架的一個(gè)或多個(gè)分離的靶TAA、EphA2和/或⑶44并且測(cè)定抗體結(jié)合靶TAA或與 ·本文所述的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶TAA的能力(例如使用表面等離子體共振)來(lái)確定。如上所述，主題抗體涵蓋與下列抗體中的一種或多種競(jìng)爭(zhēng)的那些:2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11。此外，抗體對(duì)EphA2或⑶44可以具有結(jié)合親和性，與約1χ10_6Μ相當(dāng)或大于約1x10_6M(即，抗體可顯示低于10_6M，例如約10_7M、10_8M、10_9M、KTkiM的Kd值或甚至更高的結(jié)合親和性例如約10_nM或10_12M的Kd值)。在相關(guān)實(shí)施方案中，主題抗體涵蓋結(jié)合與F2-1A6或F2-1H9相同的表位，或結(jié)合2D6、D2-1A7、D2-1A9 或 D2-1B1 的表位，或結(jié)合 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 或 HH3 的表位，或結(jié)合 A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的表位的那些。表位作圖可使用導(dǎo)致接近飽和及至少100相對(duì)單位(RU)的所結(jié)合抗體的濃度的抗體對(duì)來(lái)執(zhí)行。測(cè)定一對(duì)中每個(gè)成員的所結(jié)合抗體的量，然后將兩個(gè)抗體混合在一起以得到等于用于測(cè)量各個(gè)抗體的濃度的最終濃度。識(shí)別不同表位的抗體顯示一起注入時(shí)所結(jié)合的RU的實(shí)質(zhì)累積增加，盡管識(shí)別相同表位的抗體僅顯示RU的最小增加。據(jù)信抗體可以是交叉反應(yīng)性的，如果當(dāng)一起“注入”時(shí)它們顯示實(shí)質(zhì)累積增加(例如增加至少約1.4倍、增加至少約1.6倍、或增加至少約1.8或2倍)?？贵w的表位也可通過(guò)許多其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)，例如，Geysen等人(1987)J.1mmunol.Meth 102 =259-2 74)來(lái)測(cè)定。該技術(shù)包括大量EphA2或CD44的重疊肽的合成。然后針對(duì)一個(gè)或多個(gè)原型抗體(例如，2D6等)篩選合成肽并且由這些抗體特異性結(jié)合的特征表位可以通過(guò)結(jié)合特異性和親和性來(lái)鑒定。由此得以鑒定的表位可適宜地用于本文所述的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定以鑒定交叉反應(yīng)抗體。用于表位作圖的肽可適宜地使用“Multipin”肽合成技術(shù)來(lái)制備(參見(jiàn)，例如，Geysen 等人(1987) Science 235:1184-1190)。使用一個(gè)或多個(gè) EphA2 和 / 或 CD44 的已知序列，重疊多肽序列可在一個(gè)或多個(gè)96-孔顯微檢驗(yàn)板的陣列中的膠針上以相繼方式逐一合成。杭-CD44本公開(kāi)的抗體包括特異性結(jié)合⑶44的抗體?？?⑶44抗體涵蓋與F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD44的表位(例如在結(jié)構(gòu)域I中)的那些。由抗-CD44抗體結(jié)合的表位存在于來(lái)自殘基位置21-169的⑶44的連續(xù)氨基酸序列，如下所列出。QIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMFKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITIIIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY(SEQ ID NO:1)CD44的殘基位置數(shù)基于GenBank登錄號(hào)NP_000601.3或UniProt登錄號(hào)P16070中列出的序列來(lái)測(cè)定。共享與⑶44類(lèi)似的表位的抗原也可以是主題抗體的結(jié)合靶。當(dāng)與⑶44結(jié)合時(shí)，主題抗體可以被表達(dá)CD44蛋白的細(xì)胞內(nèi)化?？?CD44抗體對(duì)其具有親和性的表位在很多癌細(xì)胞上，特別在細(xì)胞質(zhì)膜上是細(xì)胞表面暴露的并且溶劑可及的。當(dāng)細(xì)胞活著時(shí)，表位對(duì)于主題抗體可以是可及的。例如，表位可以在源自乳腺癌、結(jié)腸癌、腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)、前列腺癌、胰腺癌等的癌細(xì)胞上存在?？?CD44抗體對(duì)其具有親和性的癌細(xì)胞也可以來(lái)自任何轉(zhuǎn)移性癌癥和/或具有轉(zhuǎn)移潛力。主題抗體的附加實(shí)例涵蓋具有相同結(jié)合特異性并且包含至少兩個(gè)⑶R的那些，每個(gè)CDR各自獨(dú)立地與圖7、44和45 (45A和45B)和下表中所示的抗體的Vh CDR(例如F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F1 1、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的Vh⑶Rl)的氨基酸序列共有至少約80%、至少約87%、至少約93%、至少約94%或最高100%氨基酸序列同一性。主題抗體還可包括來(lái)自圖7、44和45中所示的每個(gè)抗體的任何Vh⑶R的所有三個(gè)⑶R，以使主題抗體中的每AVh⑶R選自圖7、44和45或下表(例如，表I)中所示的單一抗體并且每個(gè)Vh CDR獨(dú)立地與圖7、44或45或下表(例如，表I)中所示的抗體的Vh CDR的氨基酸序列共有至少約80%、至少約87%、至少約93%、至少約94%或最高100%氨基酸序列同一性。例如，主題抗體的重鏈可含有F2-1A6的兩個(gè)Vh⑶R或所有三個(gè)Vh⑶R。可選地，重鏈可含有F2-1H9的兩個(gè)Vh⑶R或所有三個(gè)Vh⑶R。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體的重鏈可含有任何一種E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的兩個(gè) Vh CDR 或所有三個(gè) Vh CDR。同樣對(duì)于輕鏈，主題抗體將具有相同結(jié)合特異性并且可含有至少兩個(gè)⑶R，每個(gè)CDR各自獨(dú)立地與圖7、44和45(45A和45B)或下表中所示的每個(gè)抗體的Vl CDR(例如F2-1A6 的 Vl CDRl ;例如，E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDU HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的\ CDR1)的氨基酸序列具有至少約80%、至少約87%、至少約93%、至少約94%或最高100%氨基酸序列同一性。主題抗體也可以或可選地包括來(lái)自圖7、44和45或下表(例如，表2)中所示的任一種抗體的所有三個(gè)\⑶R并且每個(gè)' ⑶R獨(dú)立地與圖7、44或45或下表中所示的抗體的\⑶R的氨基酸序列共有至少約80%、至少約87%、至少約93%、至少約94%或最高100%氨基酸序列同一性。例如，主題抗體的輕鏈可含有F2-1A6的兩個(gè)Vl⑶R或所有三個(gè)Vl⑶R?？蛇x地，輕鏈可含有F2-1H9的兩個(gè)Vl⑶R或所有三個(gè)' CDR。作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體的輕鏈可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的兩個(gè)' CDR 或所有三個(gè)'CDR。任選地，抗體可含有與圖7、44和45或下表(例如，下表I和2)中提供的重鏈或輕鏈的任一種相應(yīng)框架序列相同(即100%同一性)、類(lèi)似或不同的框架序列(FR)，只要大體上維持結(jié)合特異性。在框架序列類(lèi)似時(shí)，框架可以與圖7、44和45或下表(例如，下表I和2)中所示的任一種抗體的相應(yīng)框架序列具有至少約85%、至少約86%、至少約90%、至少約93%、至少約96%、至少約98%或最高100%同一性。本公開(kāi)的抗體因此可含有與圖7、44或45或下表中所示的全長(zhǎng)Vh或\序列具有至少80%同一性、至少85%、至少90%、至少95%、最高100%氨基酸序列同一性的全長(zhǎng)Vh和/或全長(zhǎng)'序列。例如，主題抗體可含有F2-1A6的全長(zhǎng)V1^P/或全長(zhǎng)可選地，主題抗體可含有F2-1H9的全長(zhǎng)V1^P/或全長(zhǎng)作為進(jìn)一步的實(shí)例，主題抗體可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或 HH3 的全長(zhǎng) Vh和/或全長(zhǎng)與CD44結(jié)合的本公開(kāi)的抗體的實(shí)例列于下表(例如，表I和2)中。表1.特異性結(jié)合⑶ 44的抗體的重鏈FR和⑶R
權(quán)利要求
1.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1A6特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1A6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD44。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)F2-1A6 的 Vh CDRl ；b)F2-lA6的 Vh CDR2 ;和c)F2-lA6的 Vh CDR3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)F2-1A6 的 \ CDRl ；b)F2-lA6的 Vl CDR2 ;和c)F2-lA6的 \ CDR3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體,其中所述抗體包含: a)F2-lA6的全長(zhǎng)Vh;和 b)F2-lA6的全長(zhǎng) Vl。
6.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體F2-1H9特異性結(jié)合的CD44表位或與抗體F2-1H9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD44。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的單克隆抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的CD44結(jié)合時(shí)被胞吞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)F2-1H9 的 Vh CDRl ；b)F2-lH9的 Vh CDR2 ;和c)F2-lH9的 Vh CDR3。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)F2-1H9 的 \ CDRl ；b)F2-lH9的 Vl CDR2 ;和c)F2-lH9的 \ CDR3。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的抗體，其中所述抗體包含: a)F2-lH9的全長(zhǎng)Vh;和 b)F2-lH9的全長(zhǎng) Vl。
11.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗體特異性結(jié)合的 CD44 表位；或與選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl和HH3的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合⑶44。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 Vh CDRl ； b)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 Vh CDR2 ;和c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 或HH3 的 Vh CDR3。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 \ CDRl ；b)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3 的 Vl CDR2 ;和c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3 的 \ CDR3。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的抗體,其中所述抗體包含:a)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3的全長(zhǎng)Vh ;和b)E8Hll、E8H7、E8G12、E8Fll、E8C9、D6G9、D6D3、DlC5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl或HH3的全長(zhǎng)\。
15.一種分離的單克隆抗體，其 特異性結(jié)合被抗體2D6特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體2D6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。
17.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A7特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離的抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。
19.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1A9特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1A9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的分離的抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。
21.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被抗體D2-1B1特異性結(jié)合的EphA2表位或與抗體D2-1B1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA2。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離的單克隆抗體，當(dāng)其與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上的EphA2結(jié)合時(shí)被胞吞。
23.一種分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合被選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗體特異性結(jié)合的EphA2表位或與選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和 15H11 的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EphA20
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 VhCDRl ；b)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 VhCDR2 ;和c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 或 15H11 的 VhCDR3。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含:a)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 \CDRl ；b)A3H9、A3G3、A3D10、A3Dl、A3C8、lA3、lA5、lA8、lA12、lB2、lC2、lC7、lD8或 15H11 的 \CDR2 ;和c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或 15H11 的 \CDR3。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體是單鏈Fv (scFv)、IgG、Fab、(Fab，) 2 或(scFv，) 2。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體被標(biāo)記。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的分離的單克隆抗體，其中所述抗體與抗癌劑綴入口 o
29.—種包含表面和內(nèi)部空間的脂類(lèi)納米粒子，所述內(nèi)部空間包含抗癌劑，其中根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的分離的抗體與所述脂類(lèi)納米粒子的表面連接。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的脂類(lèi)納米粒子，其中當(dāng)所述脂類(lèi)納米粒子與表達(dá)細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44的細(xì)胞接觸時(shí)，所述抗體與細(xì)胞表面EphA2或細(xì)胞表面CD44結(jié)合并且所述脂類(lèi)納米粒子被胞吞。
31.一種組合物，其包含: 藥學(xué)上可接受的載體；和 根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或根據(jù)權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的脂類(lèi)納米粒子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述組合物被配制用于胃腸外施用。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物被配制用于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)或室內(nèi)施用或用于增強(qiáng)傳送的遞送。
34.一種治療患有癌癥的受試者的方法，其包括: 向所述受試者施用一定量的根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的脂類(lèi)納米粒子，其中所述量足以延緩所述癌癥的發(fā)展。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述抗體被內(nèi)化到癌細(xì)胞中。
36.一種檢測(cè)受試者的癌細(xì)胞的方法，其包括: 將根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的抗體與疑似為癌性的所述受試者細(xì)胞接觸；和 檢測(cè)與所述細(xì)胞結(jié)合的所述抗體。
37.一種分離的核酸，其包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列: 包含克隆F2-1A6的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh ； 包含克隆F2-1A6的抗體的Vl CDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ； 包含克隆F2-1H9的抗體的Vh CDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh ； 包含克隆F2-1H9的抗體的Vl CDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ； 包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗體的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh ;或 包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HFl 和 HH3 的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的分離的核酸，其中所述核酸包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列: 包含克隆F2-1A6的抗體的Vh CDR1、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1A6的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl ；包含克隆F2-1H9的抗體的Vh CDR1、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh和包含克隆F2-1H9的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl ;或 包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、DlDl、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗體的乂11 CDRUVh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh 和包含選自 E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1 和 HH3 的抗體的 Vl CDRUVlCDR2 和 \ CDR3 的
39.一種分離的核酸，其包含編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列: 1)包含克隆2D6的抗體的VhCDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh, 2)包含克隆2D6的抗體的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl, 3)包含克隆D2-1A7的抗體的VhCDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh, 4)包含克隆D2-1A7的抗體的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的\， 5)包含克隆D2-1A9的抗體的VhCDRl、Vh CDR2和Vh CDR3的Vh, 6)包含克隆D2-1A9的抗體的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的\， I)包含克隆D2-1B1的抗體的Vh CDRUVh CDR2和Vh CDR3的VH， 8)包含克隆D2-1B1的抗體的VlCDRl、Vl CDR2和Vl CDR3的Vl ； 9)包含選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和15H11 的抗體的 Vh CDRl、Vh CDR2 和 Vh CDR3 的 Vh ;或 10)包含選自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8 和15H11 的抗體的 Vl CDRl、Vl CDR2 和 Vl CDR3 的 Vl 或.， 一種分離的核酸，其包含編碼D和2) ；3)和4) ；5)和6) ；7)和8);或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。
40.—種表達(dá)載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求37、38或39所述的核酸。
41.一種重組宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求40所述的載體。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)抗_EphA2抗體或抗-⑶44抗體。
43.一種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原CD44或腫瘤相關(guān)抗原EphA2的抗體，以及相關(guān)組合物及使用方法。使用方法包括癌癥療法、診斷和篩選方法。
文檔編號(hào)C12P21/08GK103168104SQ201180044968
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者周育, J·D·馬克斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)