專利名稱：用于檢測存在于肉中的驢肉的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含特異性引物-探針組的試劑盒，其借助于實時PCR TaqMan探針技術(shù)用于檢測肉產(chǎn)品中存在的驢肉。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)簡言之是通過與側(cè)接待擴(kuò)增的DNA區(qū)段的3’ -末端互補(bǔ)的短單鏈寡核苷酸序列(引物)，對DNA上的一個或多個靶區(qū)的酶促擴(kuò)增過程。在PCR應(yīng)用中，在擴(kuò)增屬于任何生物的特異性基因或基因區(qū)域以獲得足夠的遺傳材料用于分析后，可以使用次級方法通過進(jìn)一步分析擴(kuò)增子(PCR產(chǎn)物)執(zhí)行物種鑒定。近年來，開始使用給出定量結(jié)果的實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，以便檢測肉產(chǎn)品中的物種。在實時PCR方法中，靶基因的擴(kuò)增通過增加的熒光信號進(jìn)行監(jiān)控，所述熒光信號與反應(yīng)中的PCR產(chǎn)物量按比例增加。在實時PCR方法中，水解探針(TaqMan 探針)方法在為檢測肉物種執(zhí)行的研究中是特別優(yōu)選的，因為發(fā)出的熒光信號的強(qiáng)度與每個循環(huán)中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)的量平行。在這種方法中，使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針(熒光標(biāo)記的短單鏈寡核苷酸分子)。它設(shè)計為在PCR反應(yīng)的退火和延伸期期間退火到引物內(nèi)部的靶序列。以其游離完整形式，無法測量熒光發(fā)射，因為報道染料的熒光發(fā)射被猝滅染料吸收。然而，一旦在探針退火到靶鏈之一后，探針將被Taq聚合酶的5’ _3’外切核酸酶活性降解。因此，報道和猝滅染料變得分離，并且報道染料的發(fā)射不再轉(zhuǎn)移至猝滅染料，導(dǎo)致報道熒光發(fā)射增加。這個過程在每個循環(huán)中發(fā)生且不干擾PCR產(chǎn)物的指數(shù)累積。熒光的增加按循環(huán)進(jìn)行測量且與形成的PCR產(chǎn)物量直接關(guān)聯(lián)。在其下超過閾值的循環(huán)數(shù)目稱為“Ct (循環(huán)閾值)值”，并且它給出關(guān)于靶DNA區(qū)域的起始量的信息。對于靶物種特 異性的PCR引物僅在合適反應(yīng)條件下在它們對于其特異性的DNA的存在下產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。待擴(kuò)增的DNA片段根據(jù)所檢測的目的個體、群體、物種或家族所顯示的差異水平進(jìn)行選擇。待用于物種區(qū)分的靶DNA片段的堿基序列需要顯示出在物種之間的最大差異和在物種內(nèi)的個體和群體之間的最小差異。因此，將在靶向基因區(qū)域的擴(kuò)增中使用的寡核苷酸引物和探針的特異性直接鑒定方法的特異性。關(guān)于用實時PCR TaqMan探針技術(shù)檢測肉產(chǎn)品中的驢的首個和僅有研究已由Chisholm等人執(zhí)行。他們使用TaqMan探針方法執(zhí)行關(guān)于馬和驢物種的檢測的研究，并且他們使用線粒體細(xì)胞色素b (cytb)基因設(shè)計引物和探針[I]。但是他們的研究中使用的方法在第30個循環(huán)(Ct 30)后不足以區(qū)分緊密相關(guān)的物種，并且出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。擴(kuò)增子大小對于馬物種是69 bp (堿基對)，并且對于驢物種是119 bp。馬特異性引物和探針組顯示出牛和驢DNA的非特異性反應(yīng)。并且對于驢特異性的引物和探針組引起與馬DNA的交叉反應(yīng)(Ct 30.77)。在這個應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)對于馬的檢測極限是25ng和對于驢的檢測極限是Ing0Doole等人描述了通過使用在線粒體細(xì)胞色素b (cytb)上設(shè)計的特異性引物和探針組的基于實時PCR的檢測方法，以便鑒定在肉和肉產(chǎn)品中存在的牛、綿羊、豬、火雞和雞物種組織。對于豬特異性的引物和探針組顯示出與牛、綿羊、雞和火雞的交叉反應(yīng)。對于這些物種檢測到的Ct值分別為31.13,37.08,30.00,34.64，并且對于豬的理論檢測極限是0.02%。Tanabe等人在線粒體細(xì)胞色素b基因上設(shè)計了對于豬、雞、牛、綿羊和馬特異性的引物和探針，并且用實時PCR TaqMan技術(shù)以100 fg/水平檢測每個物種[3]。Jonker等人也開發(fā)了通過使用物種特異性引物和探針組以0.01%水平用于鑒定加工的肉產(chǎn)品中存在的牛、豬、馬、綿羊、雞和火雞物種的實時PCR方法[4]。Frezza等人可以通過使用16S rRNA基因以0.01-0.05ng水平檢測牛和綿羊物種，以及通過使用細(xì)胞色素b基因以0.5ng水平檢測雞和豬物種[5]。K5ppel等人開發(fā)了通過使用P -肌動蛋白和促乳素受體基因以0.32_32ng水平用于檢測牛、豬、雞和火雞物種的多重實時PCR方法[6]。現(xiàn)有技術(shù)已知的申請，國際專利文件號W02007119066，公開了致使食物中存在的肉類中的動物組織能夠通過使用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測的試劑盒。發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是實現(xiàn)包含用于檢測其它肉產(chǎn)品中的驢肉的特異性引物探針組的試劑盒。本發(fā)明的另一個目的是實現(xiàn)包含特異性引物探針組的試劑盒，其致使能夠檢測到肉產(chǎn)品中直到0.1皮克的驢DNA。本發(fā)明的其他目的是實現(xiàn)包含特異性引物探針組的試劑盒，其直到第40個循環(huán)不顯示與可以存在于反應(yīng)混合物中的屬于其他動物物種的DNA的任何交叉反應(yīng)，并且因此僅顯示與驢DNA的反應(yīng)，并且致使能夠特異性檢測驢物種。本發(fā)明的另外一個目的是實現(xiàn)包含特異性引物探針組的試劑盒，其致使能夠檢測熱處理的肉產(chǎn)品中的驢DNA。發(fā)明詳述
實現(xiàn)為達(dá)到本發(fā)明的目的的“用于檢測肉產(chǎn)品中的驢肉的試劑盒”在附圖中舉例說明，
其中
(

圖1)是響應(yīng)在0.0001和IOOng之間的驢DNA的DNA稀釋度所接受的熒光信號視圖。(圖2)是響應(yīng)驢DNA的對數(shù)濃度檢測到的Ct值之間的線性關(guān)系視圖。本發(fā)明包含借助于實時PCR TaqMan探針技術(shù)用于檢測肉產(chǎn)品中存在的驢肉的特異性引物-探針組。特異性引物-探針組是用實時PCR技術(shù)檢測驢物種所需的組分之一。在試劑盒內(nèi)，存在設(shè)計為對于驢物種特異性的具有21個核苷酸長度的正向引物，對于驢物種特異性的具有18個核苷酸長度的反向引物，和其為具有28個核苷酸長度的水解探針的TaqMan探針,其可以特異性退火到用正向和反向引物擴(kuò)增的區(qū)域。在試劑盒內(nèi)還存在無核酸酶水和實時PCR反應(yīng)混合物。第一次DNA分離應(yīng)從肉產(chǎn)品完成，以便通過使用試劑盒檢測驢物種。分離的DNA的純度需要很高，它不應(yīng)包含PCR抑制劑，并且其260/280nm比應(yīng)是至少1.7。實時反應(yīng)在200 μl的PCR管和50μl的總體積中執(zhí)行。反應(yīng)混合物由以下組成:商購可得的實時PCR主混合物(25 μl)(在實時PCR主混合物中:存在HotStarTaq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP混合物和8 mM MgCl2),0.8 μ M正向和反向引物、0.2 μ M TaqMan探針、2μ M分離的DNA(其濃度小于500ng)和21.2 μl無核酸酶水。在實時PCR裝置中，使用對于在其下用于標(biāo)記TaqMan探針的熒光染料(報道熒光色素)的激發(fā)和發(fā)射的波長合適的濾光器。執(zhí)行的溫度循環(huán)為在95°C激活15分鐘后在95°C 15秒、在60°C I分鐘共40個循環(huán)。提及的試劑盒中存在的弓丨物探針組由正向引物、反向引物和雙重標(biāo)記的寡核苷酸探針組成，它們互補(bǔ)靶向線粒體DNA NADH脫氫酶亞單位5基因(ND5)上的區(qū)域(圖表I)。引物-探針組包括位于ND5基因(登記號X97337)上的11802-11823核苷酸之間的21核苷酸長度正向引物；位于11867-11884核苷酸之間的20核苷酸長度反向引物；和位于11827-11855核苷酸之間的28核苷酸長度雙重標(biāo)記的寡核苷酸探針(表I)。在引物探針組的設(shè)計中，線粒體DNA (MtDNA)的重復(fù)數(shù)目和針對熱效應(yīng)分解的抗性高于核DNA (nDNA)。由于這個原因，選擇線粒體DNA，因為它致使能夠檢測驢物種，其具有足夠高的突變率以致使能夠即使在低濃度下測定并分開緊密相關(guān)的物種。對于驢物種特異性的引物和TaqMan探針組在線粒體ND5 (NADH脫氫酶亞單位5)基因上進(jìn)行設(shè)計，并且使它適配用于檢測驢的試劑盒。ND5基因的核苷酸長度和突變程度足以設(shè)計物種特異性引物-探針。因此，在通過使用用于檢測驢肉的引物和探針組實現(xiàn)的實時PCR方法中，反應(yīng)繼續(xù)，即使直至第40個循環(huán)，也不會出現(xiàn)與其它動物物種的交叉反應(yīng)。并且這增加了所開發(fā)的方法的靈敏度。對于驢物種特異性設(shè)計的引物的核苷酸序列以及擴(kuò)增產(chǎn)物的長度和基因組定位在表I中給出。表1.用于檢測驢物種的引物和探針組的核苷酸序列和基因組定位信息
權(quán)利要求
1.一種試劑盒，其特征在于與線粒體ND5基因上的區(qū)域互補(bǔ)的正向引物、反向引物和探針，其包含用實時PCR TaqMan探針技術(shù)檢測肉產(chǎn)品中存在的驢肉的引物-探針組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于位于11802-11823核苷酸之間的21核苷酸長度正向引物；位于11867-11884核苷酸之間的20核苷酸長度反向引物；和位于ND5基因上的11827-11855核苷酸之間的28核苷酸長度雙重標(biāo)記的寡核苷酸探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1- 2的試劑盒，其特征在于引物-探針組直到用實時PCR TaqMan探針技術(shù)用于檢測肉產(chǎn)品中存在的驢肉的第40個循環(huán)，顯示僅與驢物種的DNA的反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1- 3的試劑盒，其特征在于引物-探針組能應(yīng)用于在其中檢測驢肉的肉產(chǎn)品，例如意大利香腸、香腸、肉丸和肉罐頭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1- 4的試劑盒，其特征在于引物-探針組能應(yīng)用于生肉和在120°C和在15psi的壓力下熱處理的肉產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 - 5的試劑盒，其特征在于引物-探針組能應(yīng)用于在200°C熱處理30分鐘的肉產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含特異性引物-探針組的試劑盒，其借助于實時PCRTaqMan探針技術(shù)用于檢測肉產(chǎn)品中存在的驢肉。本發(fā)明能夠檢測直到0.1皮克的驢肉污染。用對驢物種具有特異性的試劑盒，借助于直到第40個循環(huán)與馬、豬、牛、綿羊、雞和火雞物種無交叉反應(yīng)，特異性檢測在生和熱處理的肉混合物中的驢肉成為可能。
文檔編號C12Q1/68GK103154268SQ201180045727
公開日2013年6月12日 申請日期2011年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者H.耶蒂姆, F.薩欣, Z.科斯門 申請人:耶迪特普大學(xué)