專利名稱：使用靶向核酸內(nèi)切酶和單鏈核酸的基因組編輯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及使用靶向核酸內(nèi)切酶和單鏈核酸編輯特定染色體序列。
背景技術(shù)：
常規(guī)的基因組工程具有貫穿基礎(chǔ)研究、藥物發(fā)現(xiàn)和基于細胞的藥物的巨大潛力。許多用于靶向基因敲除、誘變或整合的現(xiàn)有方法依賴于同源重組。然而，許多細胞中低自發(fā)重組率以及篩選工作規(guī)模和分離靶向事件所要求的時間已經(jīng)阻礙這個領(lǐng)域中的進展。因此，存在對于可以以高的速度、效率和準確度快速實現(xiàn)靶向基因組編輯的技術(shù)的需要。發(fā)明簡述在本公開的各個方面，提供了一種用于編輯細胞中至少一種內(nèi)源染色體序列的方法。這種方法包括向細胞中引入(i)至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂，和( )至少一種單鏈核 酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的第一部分。該方法還包括將所述細胞在如此條件下維持，從而通過同源重組法(homology-directed process)修復由革巴向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂,從而所述染色體序列與單鏈核酸的序列交換，因而編輯所述染色體序列。又一個方面提供一種用于編輯細胞中染色體序列的試劑盒。該試劑盒包含(a)至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂，和(b)至少一種單鏈核酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的第一部分。下文更詳盡地描述本公開的其他方面和特征。對彩色圖片的參考本申請文件含有彩色制作的至少一張照片。此專利申請公開連同彩色照片的副本將由專利辦公室在請求并支付必需費用時提供。附圖簡述

圖1展示用來修飾RSK2激酶基因座的寡核苷酸的設(shè)計。在頂部展示RSK2激酶野生型基因組序列，同時指出ZFN結(jié)合位點。在底部展示攜帶特定突變的寡核苷酸的序列。圖2記錄了 BamHI位點整合至RSK2激酶基因座中。細胞匯集物用BamHI消化并且片段由凝膠電泳分離。圖3描述了在RSK2激酶基因座處攜帶BamHI位點的分離的單個細胞克隆。將各個克隆中的RSK2基因座進行PCR擴增并且用BamHI消化。圖4圖示了用來修飾AAVSl基因座的寡核苷酸的設(shè)計。在頂部展示AAVSl野生型基因組序列，同時指出ZFN結(jié)合位點。下方顯示包含位點的有義和反義寡核苷酸的序列。圖5顯示HindIII位點整合至AAVSl基因座中。上圖描述與ZFN和寡核苷酸接觸的細胞，并且下圖描述與僅寡核苷酸接觸的細胞。細胞匯集物用HindIII消化并且片段由凝膠電泳分離。圖6描述了在AAVSl基因座處攜帶HindIII位點的分離的單個細胞克隆。將各個克隆中的AAVSl基因座進行PCR擴增并且用HindIII消化。圖7顯示使用不同長度的有義寡核苷酸，使HindIII位點整合至AAVSl基因座中。將源自細胞匯集物的基因組DNA進行PCR擴增并且用HindIII消化。沿頂部的數(shù)字指每種寡核苷酸的核苷酸長度。M代表標記，G代表GFP ( S卩，無ZFN對照)，并且Z代表ZFN。圖8描述使用不同長度的反義寡核苷酸，使HindIII位點整合至AAVSl基因座中。將源自細胞匯集物的基因組DNA進行PCR擴增并且用HindIII消化。沿頂部的數(shù)字指每種寡核苷酸的核苷酸長度。M代表標記，G代表GFP ( S卩，無ZFN對照)，并且Z代表ZFN。 圖9顯示當ZFN作為與不同長度的寡核苷酸組合的mRNA或DNA遞送時，使HindIII位點整合至AAVSl基因座中。將源 自細胞匯集物的基因組DNA進行PCR擴增并且用HindIII消化。沿頂部的數(shù)字指每種寡核苷酸的核苷酸長度。R代表RNA，D代表DNA，M代表標記，G代表GFP ( S卩，無ZFN對照)，并且Z代表ZFN。圖10描述了在AAVS l基因座處包含HindIII位點的細胞的Cel-1測定法。沿頂部的數(shù)字指每種寡核苷酸的核苷酸長度。M代表標記，G代表GFP ( S卩，無ZFN對照)，并且Z代表ZFN。圖11顯不同源寡核苷酸與非同源寡核苷酸用于在AAVSl基因座處整合HindIII位點的用途。1，8=有義，單鏈；2，9=反義，單鏈；3，10=有義加反義；4=有義，單鏈(2x) ;5，11=雙鏈(預退火)；6，12=僅寡核苷酸(無ZFN)和7=野生型。圖12顯示用單鏈DNA寡核苷酸(ssODN)和ZFN在特定基因座處靶向缺失
0.1-1OOkb基因組DNA。圖12A顯示在ZFN切割位點5’的缺失。圖12B顯示在ZFN切割位點3’的缺失。染色體序列中的遠端缺失端點區(qū)域命名為I，并且在靶向的切割位點附近的ZFN結(jié)合位點命名為II。ssODN供體包含與遠端缺失端點區(qū)域具有序列同一性的區(qū)域(命名為I’)和與靶向的切割位點附近的ZFN結(jié)合位點具有序列同一性的區(qū)域(命名為II)。圖13描述了用單鏈寡核苷酸和ZFN在K562中AAVSI基因座處靶向缺失基因組DNA的PCR證實結(jié)果。標記為“I”的泳道使用同時暴露于寡核苷酸和ZFN的K562細胞，并且因此PCR片段源自缺失等位基因。標記為“2”的泳道使用僅暴露于寡核苷酸但不暴露于ZFN的K562細胞，并且所產(chǎn)生的PCR片段是野生型等位基因(無缺失)。標記為“3”的泳道使用僅暴露于ZFN的K562細胞，并且因此PCR產(chǎn)物也指示野生型等位基因的片段。在圖13中的每個泳道組上方展示野生型等位基因PCR片段和缺失等位基因PCR片段的預期大小，并且展示和驗證了使用單鏈寡核苷酸和ZFN時約0.1kb,0.5kb、l.0kbU.5kb、2kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb、4.5kb、5.0kb、10.0kb、10.2kb、20.0kb、20.2kb、50kb 和 IOOkb 的革巴向基因組DNA缺失。在泳道組當中，帶有星號的組表示ZFN切割位點的3’缺失；無星號
的組表示ZFN切割位點的5’缺失；帶有雙星號“**”的一個組表示ZFN切割位點的5’和3’缺失?！癕”代表DNA標記。圖14展示了用單鏈寡核苷酸和ZFN在不同細胞類型中AAVSl基因座處靶向缺失5kb基因組DNA的PCR證實結(jié)果。缺失等位基因PCR片段在包括K562、HCT116、U20S、A549、HEK293、HepG2和MCF7細胞的全部細胞樣品中均具有預期大小303bp?！癐”代表“寡核苷酸+ZFN"; “ 2 ”代表“僅寡核苷酸”;“ 3 ”代表“僅ZFN” ；并且“M”代表DNA標記。預期的野生型等位基因PCR片段是5303bp，并且預期缺失等位基因PCR片段是303bp。圖15描述了用單鏈寡核苷酸和ZFN在K562中IRK4、RSK2和RSK4基因座處靶向缺失基因組DNA的PCR證實結(jié)果。缺失等位基因PCR片段在全部細胞樣品中對于IRAK4基因座、RSK2基因座和RSK4基因座分別具有預期大小334bp、281bp和190bp?！癐”代表“寡核苷酸+ZFN” ； “ 2 ”代表“僅寡核苷酸” ；“ 3 ”代表“僅ZFN” ；并且“M”代表DNA標記。圖16顯示用ssDNA寡核苷酸和ZFN在細胞中實現(xiàn)同時靶向基因組缺失和插入的示例性方案。遠端缺失端點區(qū)域命名為I，并且在靶向的切割位點附近的ZFN結(jié)合位點命名為II。ssODN供體包含與遠端缺失端點區(qū)域具有序列同一性的區(qū)域(命名為I’)、與靶向的切割位點附近的ZFN結(jié)合位點具有序列同一性的區(qū)域(命名為II)和1xP序列(命名為III)。正向引物㈧和反向引物⑶位于區(qū)域I和II的側(cè)面并且可以用來驗證靶向缺失。引物C包含在ZFN右結(jié)合臂和相鄰基因組DNA的連接部位處的核苷酸，從而正向引物(A)和反向引物C可以用來驗證靶向插入。圖17顯示使用圖16中所示的引物A和B，PCR驗證5kb基因組序列的靶向缺失，所述靶向缺失產(chǎn)生從缺失等位基因中預期的303bp PCR片段(泳道6:AAVS1-ZFN和AAVS1-5kb ssODN)。使用引物A和C，1xP位點的靶向插入的PCR驗證由泳道10中具有預期大小的PCR片段顯示。泳道I和2代表DNA標記；泳道3代表GFP ;泳道4代表僅AAVSIZFN(mRNA);泳道5代表僅寡核苷酸供體；泳道6代表AAVS1ZFN+寡核苷酸供體；泳道7代表GFP ;泳道8代表AAVSIZFN(mRNA);泳道9代表僅寡核苷酸供體；泳道10代表AAVS1ZFN+寡核苷酸供體。圖18展示 5’連接序列(SEQ ID NO: 29)和證實供體序列在5’連接處整合的序列分析。高亮綠色的序列代表用于PCR擴增的引物(小寫字母不來自測序結(jié)果)，黑色字母的序列代表寡核苷酸供體中不存在的小鼠Rosa26質(zhì)粒序列；藍色字母的序列代表寡核苷酸供體中的小鼠Rosa26質(zhì)粒序列；紅色字母的序列代表寡核苷酸供體中的AAVSl序列；粉紅色字母的序列代表寡核苷酸供體中不存在的AAVSl序列。圖19展示3’連接序列(SEQ ID NO:30)和證實供體序列在3’連接處整合的序列分析。高亮綠色的序列代表用于PCR擴增的引物(小寫字母不來自測序結(jié)果)，黑色字母的序列代表寡核苷酸供體中不存在的小鼠Rosa26質(zhì)粒序列；藍色字母的序列代表寡核苷酸供體中的小鼠Rosa26質(zhì)粒序列；紅色字母的序列代表寡核苷酸供體中的AAVSl序列；粉紅色字母的序列代表寡核苷酸供體中不存在的AAVSl序列。圖20顯示僅暴露于兩種ZFN(Z)、兩種寡核苷酸供體(O)和質(zhì)粒供體(D)的克隆(Z+0+D)包含了表示供體序列整合的大小390bp的5’連接部位PCR片段(圖20A)和大小309bp的3’連接部位PCR片段(圖20B)。圖21描述了(與靶向序列的)寡核苷酸序列同一性和寡聚物介導的IOkb基因組序列靶向缺失的效率的關(guān)系。IOkb缺失的效率由SYBR Green實時PCR測量。1=100%同一性；2=98%同一性；3=90%同一性；4=50%同一性；5=陰性對照。圖22展示由ssDNA寡核苷酸和ZFN介導的通用質(zhì)粒插入方法的方案。ZFN產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。用與ZFN切割位點互補的區(qū)段，兩個寡核苷酸供體隨后結(jié)合DSB末端。兩個寡核苷酸供體的5’末端與所需質(zhì)粒序列的任一末端處的質(zhì)粒主鏈序列(通用或非通用)的同源性造成侵入質(zhì)粒供體中。當使用供體質(zhì)粒解開DSB時，在ZFN切割位點處引入和插入來自供體質(zhì)粒的所需序列。發(fā)明詳述本公開提供了使用靶向核酸內(nèi)切酶和單鏈核酸編輯內(nèi)源染色體序列的方法。具體而言，該靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂，并且這種單鏈核酸包含與染色體序列在靶向切割位點的至少一側(cè)上具有顯著序列同一性的區(qū)域。使用單鏈核酸，通過同源重組修復法(homology-directed repair process)修復由革巴向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂，從而染色體序列與單鏈核酸的序列交換，因而編輯所述染色體序列。編輯的染色體序列可以包含至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的缺失、至少一個核苷酸的置換或其組合。本文中還提供試劑盒，其包含使用本文中公開的方法編輯染色體序列的適宜試劑。(I)用于編輯染色體序列的方法本公開的一個方面提供一種用于編輯細胞中至少一種內(nèi)源染色體序列的方法。這種方法包括向細胞中引入(a)至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸，所述靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂，和(b)至少一種單鏈核酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的序列。該方法還包括將所述細胞在如此條件下維持，從而通過同源重組修復法修復由靶向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂，從而所述染色體序列與所述單鏈核酸至少之一的序列交換，因而編輯這個染色體序列。下文詳細描述該方法的組成部分。(a)靶向核酸內(nèi)切酶該方法包括向細胞中引入至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸。靶向核酸內(nèi)切酶是識別和結(jié)合特定雙鏈染色體DNA序列并且在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂的實體。靶向核酸內(nèi)切酶可以是天然存在的蛋白質(zhì)或工程化蛋白質(zhì)?？蛇x地，靶向核酸內(nèi)切酶可以不含蛋白質(zhì)(例如，人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑)。靶向核酸內(nèi)切酶的類型可以并且將變化。在一些實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是鋅指核酸酶。在其他實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是大范圍核酸酶(meganuclease)或歸巢核酸內(nèi)切酶。在其他實施方案中，革巴向核酸內(nèi)切酶可以是轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物(TALE)-核酸酶。在其他實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是位點特異性核酸酶。在其他實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑。(i)鋅指核酸酶在一個實施方案中，引入細胞中的靶向核酸內(nèi)切酶可以是鋅指核酸酶(ZFN)。一般而言，鋅指核酸酶包含DNA結(jié)合作用結(jié)構(gòu)域(即，鋅指)和切割結(jié)構(gòu)域(即，核酸酶)，二者均在下文描述。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)工程化以識別并且結(jié)合選擇的任何核酸序列。見例如，Beerli 等人，(2002)Nat.Biotechnol.20:135-141 ;Pabo 等人，(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340 ;Isalan 等人,(2001)Nat.Biotechnol.19:656-660 ；Segal等人,(2001) Curr.0pin.Biotechnol.12:632-637 ；Choo 等人,(2000) Curr.0pin.Struct.Biol.10:411-416 ；Zhang 等人，(2000)J.Biol.Chem.275(43):33850-33860 ；Doyon 等人,(2008)Nat.Biotechnol.26:702-708 ；和 Santiago 等人,(2008)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105:5809-5814。與天然存在的鋅指蛋白相比，工程化的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以具有新的結(jié)合特異性。工程化方法包括但不限于理性設(shè)計和多種類型的選擇。理性設(shè)計例如使用包含雙聯(lián)體、三聯(lián)體和/或四聯(lián)體核苷酸序列和獨立鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，其中每個雙聯(lián)體、三聯(lián)體或四聯(lián)體核苷酸序列與結(jié)合特定三聯(lián)體或四聯(lián)體序列的鋅指的一個或多個氨基酸序列相關(guān)。見例如，美國專利N0.6，453，242和6，534，261，所述專利的公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。作為實例，美國專利6，453，242中描述的算法可以用來設(shè)計靶向預選擇的序列的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。替代性方法，如使用非簡并性識別密碼表的理性設(shè)計也可以用來設(shè)計靶向特定序列的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Sera等人，(2002)Biochemistry41:7074-7081)。公共可用的基于網(wǎng)頁的用于鑒定DNA序列中潛在祀位點并且設(shè)計鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的工具可以分別在http://www.zincfingertools.0rg和http://bindr.gdcb.1astate.edu/ZiFiT/(Mandell 等人,(2006)Nuc.Acid Res.34:W516-ff523 ；Sander 等人，(2007)Nuc.Acid Res.35:W599-ff605)找到?？梢詫\指結(jié)合結(jié)構(gòu)域設(shè)計成識別并且結(jié)合約3個核苷酸至約21個核苷酸長度或優(yōu)選地約9個至約18個核苷酸長度的DNA序列。通常，本文中公開的鋅指核酸酶的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少3個鋅指識別區(qū)(即，鋅指)。在一個實施方案中，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含4個鋅指識別區(qū)。在另一個實施方案中，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含5個鋅指識別區(qū)。在又一個實施方案中，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含6個鋅指識別區(qū)?？梢詫\指結(jié)合結(jié)構(gòu)域設(shè)計成與任何適合的靶DNA序列結(jié)合。見例如，美國專利N0.6，607，882,6, 534，261和6,453，242，所述專利的公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。選擇鋅指識別區(qū)的示例性方法可以包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng)，并且這些方法在美國專利 N0.5，789，538,5, 925，523,6, 007，988,6, 013，453,6, 410，248,6, 140，466、6，200，759 和 6，242，568，以及 W098/37186、W098/53057、W000/27878、W001/88197 和GB2, 338, 237中公開，所述的每個專利以引`用方式整體并入本文。此外，已經(jīng)例如在W002/077227中描述了增強鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和用于設(shè)計和構(gòu)建融合蛋白(和編碼它們的多核苷酸)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在美國專利申請公開N0.20050064474和20060188987中詳細描述，所述的每個專利以引用方式整體并入本文。鋅指識別區(qū)和/或多指狀鋅指蛋白可以使用適合的接頭序列(包括例如，5個或更多個氨基酸長度的接頭)連接在一起。對于6個或更多個氨基酸長度的接頭序列的非限制性實例，見，美國專利N0.6，479，626,6, 903，185和7，153，949，所述專利的公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。本文所述的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括在蛋白質(zhì)的各個鋅指之間的合適接頭的組合。在一些實施方案中，鋅指核酸酶還可以包含核定位信號或序列(NLS)。NLS是促進靶向鋅指核酸酶蛋白至胞核中以便在染色體中靶序列處引入雙鏈斷裂的氨基酸序列。核定位信號是本領(lǐng)域已知的。見例如，Makkerh等人，(1996)Current Biology6:1025-1027。切割結(jié)構(gòu)域。鋅指核酸酶還包括切割結(jié)構(gòu)域。鋅指核酸酶的切割結(jié)構(gòu)域部分可以從任何核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶獲得。可以源自其中的切割結(jié)構(gòu)域的核酸內(nèi)切酶的非限制性實例可以源自包括但不限于限制性核酸內(nèi)切酶和歸巢核酸內(nèi)切酶。見例如，2002-2003目錄，New England Biolabs, Beverly, Mass.;和 Belfort 等人，(1997) Nucleic AcidsRes.25:3379-3388或www.neb.com。切割DNA的另外的酶是已知的(例如，SI核酸酶、綠豆核酸酶、胰DNA酶1、微球菌核酸酶、酵母HO核酸內(nèi)切酶)。還見Linn等人，(編著)Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993?？梢允褂眠@些酶(或其功能性片段)的一種或多種作為切割結(jié)構(gòu)域的來源。切割結(jié)構(gòu)域也可以源自如上文所述的其切割活性需要二聚化的酶或其部分?？赡苄枰獌煞N鋅指核酸酶用于切割，因為每種核酸酶包含活性酶二聚體的單體?？蛇x地，單一鋅指核酸酶可以包含產(chǎn)生活性酶二聚體的兩種單體。如本文所用，“活性酶二聚體”是能夠切割核酸分子的酶二聚體。這兩個切割單體可以源自相同的核酸內(nèi)切酶(或其功能性片段)，或每個單體可以源自不同的核酸內(nèi)切酶(或其功能性片段)。當兩個切割單體用來形成活性酶二聚體時，這兩種鋅指核酸酶的識別位點優(yōu)選地如此布置，從而兩種鋅指核酸酶與其相應識別位點的結(jié)合將切割單體以允許切割單體(例如，通過二聚化)彼此形成活性酶二聚體的空間取向安置。作為結(jié)果，識別位點的近端面可以由約5個至約18個核苷酸隔開。例如，近端面可以由約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17或18個核苷酸隔開。然而，將理解，任何整數(shù)數(shù)字的核苷酸或核苷酸對可以間插在兩個識別位點之間(例如 ，約2個至約50個或更多個核苷酸對)。鋅指核酸酶(例如本文中詳述的那些)的識別位點的近端面可以由6個核苷酸隔開。通常，切割部位存在于識別位點之間。限制性核酸內(nèi)切酶(限制性酶)存在于許多物種中并且能夠序列特異結(jié)合于DNA(在識別位點)并在結(jié)合位點處或其附近切割DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在離開識別位點的部位切割DNA并且具有可分開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域。例如，IIS型酶Fok I在一條鏈上距其識別位點9個核苷酸處并且在另一條鏈上距其識別位點13個核苷酸處催化DNA的雙鏈切割。見例如，美國專利N0.5，356，802,5, 436，150和5，487，994 ；以及Li 等人，(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:4275-4279 ；Li 等人，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2764-2768 ；Kim 等人，(1994a)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:883-887 ；Kim 等人，(1994b) J.Biol.Chem.269:31, 978-31，982。因此，鋅指核酸酶包含來自至少一種IIS型限制性酶的切割結(jié)構(gòu)域和可以經(jīng)工程化或可以未經(jīng)工程化的一個或多個鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。示例性IIS型限制性酶例如在國際公開W007/014275中描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。另外的限制性酶還含有可分開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域，并且這些限制性酶還由本公開涵蓋。見例如，Roberts等人，(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。一種示例性IIS型限制性酶(其切割結(jié)構(gòu)域與結(jié)合結(jié)構(gòu)域可分開)是Fok10這種特定的酶作為二聚體有活性(Bitinaite等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:10，570-10，575)。因此，出于本公開的目的，將用于鋅指核酸酶中的Fok I酶部分視為切割單體。因此，對于使用Fokl切割結(jié)構(gòu)域的靶向切割雙鏈，各自包含F(xiàn)okl切割單體的兩種鋅指核酸酶可以用來重構(gòu)活性酶二聚體?？蛇x地，也可以使用含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個Fok I切割單體的單一多肽分子。在某些實施方案中，切割結(jié)構(gòu)域可以包含最小化或防止同型二聚化的一個或多個工程化切割單體，例如，在美國專利公開N0.20050064474、20060188987和20080131962中描述，所述每個專利的公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。以非限制性實例方式，在FokI的位置 446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537 和 538 處
的氨基酸殘基是影響Fok I切割半結(jié)構(gòu)域二聚化的全部靶。形成專性異二聚體的示例性工程化的FokI切割單體包括其中第一切割單體在Fok I的氨基酸殘基位置490和538處包含突變并且在氨基酸殘基位置486和499處包含突變的第二切割單體。因此，在一個實施方案中，在氨基酸位置490處的突變將Glu(E)替換為Lys(K)；在氨基酸位置538處的突變將Iso (I)替換為Lys (K);在氨基酸位置486處的突變將Gln (Q)替換為Glu (E);在氨基酸499處的突變將Iso (I)替換為Lys (K)。具體而言，通過以下方式制備工程化切割單體:將一個切割單體中位置490處的E突變成K和538位置處的I突變成K以產(chǎn)生命名為“E490K:1538K”的工程化切割單體，并且將另一個切割單體中位置486處的Q突變成E和499位置處的I突變成L以產(chǎn)生命名為“Q486E:1499L”的工程化切割單體。上述的工程化切割單體是其 中最小化或消除異常切割作用的專性異二聚體突變體?？梢允褂眠m合的方法制備工程化切割單體，例如通過如美國專利公開N0.20050064474中所述的野生型切割單體(Fok I)的定點誘變制備。(ii)其他靶向核酸內(nèi)切酶在另一個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是大范圍核酸酶。大范圍核酸酶以大識別位點(即，通常約12堿基對至約40堿基對的識別位點)為特征的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。由于這種要求，這種識別位點通常僅在任何給定的基因組中出現(xiàn)一次。在大范圍核酸酶當中，歸巢核酸內(nèi)切酶的LAGLIDADG家族已經(jīng)變成用于研究基因組和基因組工程的有價值工具?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)修飾其識別序列，將大范圍核酸酶靶向特定的染色體序列。在又一個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物(TALE)核酸酶。TALE是來自植物病原體黃單胞菌屬(Xanthomonas)的轉(zhuǎn)錄因子,其可以輕易地經(jīng)工程化以結(jié)合新的DNA靶。TALE或其截短形式可以與核酸內(nèi)切酶(如Fok I)的催化性結(jié)構(gòu)域連接，以產(chǎn)生稱作TALE核酸酶或TALEN的靶向核酸內(nèi)切酶。在又一個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是位點特異性核酸酶。具體而言，位點特異性核酸酶可以是其識別序列很少在基因組中出現(xiàn)的“稀有切割”核酸內(nèi)切酶。優(yōu)選地，位點特異性核酸酶的識別序列僅在基因組中出現(xiàn)一次。在又一個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑(也稱作人工限制性DNA切割物)。例如，人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑可以包含切割與靶向切割位點互補的DNA和至少一個寡核苷酸的金屬/螯合劑復合物。因此，人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑不含有任何蛋白質(zhì)，金屬/螯合劑復合物的金屬可以是鈰、鎘、鈷、鉻、銅、鐵、鎂、錳、鋅等。金屬/螯合劑復合物的螯合劑可以是EDTA、EGTA, BAPTA等。在一個優(yōu)選實施方案中，金屬/螯合劑復合物可以是Ce (IV) /EGTA。在另一個優(yōu)選實施方案中，人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑可以包括Ce (IV)/EGTA的復合物和假互補性肽核酸(PNA)的兩條鏈(Katada 等人,Current Gene Therapy, 2011, 11 (I):38-45)。(iii)編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸在一些實施方案中，可以將靶向核酸內(nèi)切酶作為核酸引入細胞中，其中所述細胞隨后表達并產(chǎn)生靶向核酸內(nèi)切酶。編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸可以是DNA或RNA。RNA可以信使RNA，并且mRNA可以是5’加帽的、聚腺苷酸化的或兩者。通常，編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸將與啟動子控制區(qū)可操作地連接。該控制區(qū)域可以是組成型或誘導型的?？梢詫⒕幋a靶向核酸內(nèi)切酶的核酸(及其連接的控制區(qū))作為載體如質(zhì)粒等引入細胞中。可選地，可以將編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸(及其連接的控制區(qū))作為線形分子引入細胞中。(b)單鏈核酸(i) 一般特性該方法還包括向細胞中引入至少一種單鏈核酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一'I"生的區(qū)域。在一些實施方案中，將一條單鏈核酸引入細胞中。在其他實施方案中，將兩條單鏈核酸引入細胞中。在其他實施方案中，將三條或更多條單鏈核酸引入細胞中。短語“顯著序列同一性”意指寡核苷酸與靶向染色體序列具有至少約75%序列同一性。在一些實施方案中，寡核苷酸可以與靶向染色體序列具有約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性。另外，單鏈核酸通常與靶向切割位點的至少一側(cè)上的至少約10個核苷酸具有顯著序列同一性。在一些實施方案中，單鏈核酸可以與靶向切割位點的至少一側(cè)上的約15個核苷酸、約20個核苷酸、約25個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸或多于100個核苷酸具有顯著序列同一'I"生。引入細胞中的單鏈核酸的長度可以并且將變化。例如，單鏈核酸的范圍可以為約20個核苷酸長度直至約200，000個核苷酸長度。在各個實施方案中，單鏈核酸的范圍可以是約20個核苷酸至約100個核苷酸長度、約100個核苷酸至約1000個核苷酸長度、約1000個核苷酸至約10，000個核苷酸長度、約10，000個核苷酸至約100，000個核苷酸長度或約100，000個核苷酸至約200，000個核苷酸長度。在一些實施方案中，單鏈核酸可以是線形的。在其他實施方案中，單鏈核酸可以是環(huán)形的(例如，通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的噬菌體方法制備)。單鏈核酸可以相對于目的染色體序列是有義或反義的。單鏈核酸的組成可以并且將變化。核酸的核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其組合。核苷酸可以是標準核苷酸(即，腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸類似物。核苷酸類似物指具有修飾的嘌呤或嘧啶堿基或修飾的核糖部分的核苷酸。核苷酸類似物可以是天然存在的核苷酸(例如，肌苷)或非天然存在的核苷酸。對核苷酸的糖或堿基部分的修飾的非限制性實例包括添加(或移除)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羥基、甲基、磷?；蛶€基以及將堿基的碳和氮原子用其他原子置換(例如，7-氮雜嘌呤類)。核苷酸類似物也包括雙脫氧核苷酸、2’-0_甲基核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和嗎啉代。單鏈核酸的核苷酸可以通過磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、磷酰亞胺鍵、磷酰二胺鍵或其組合連接。在優(yōu)選的實施方案中，單鏈核酸包含脫氧核糖核苷酸。(ii)優(yōu)選的單鏈核酸在一個實施方案中，單鏈核酸可以包含與靶向切割位點的上游側(cè)處的染色體序列具有顯著序列同一性的第一區(qū)域和與靶向切割位點的下游側(cè)處的染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域(例如，見圖1和圖4)。在這個實施方案的各種重復中，單鏈核酸還可以包含相對于染色體序列的至少一個核苷酸變化。例如，單鏈核酸將通常包含至少一個核苷酸的置換、至少一個核苷酸的缺失、至少一個核苷酸的插入或其組合。在各種重復中，單鏈核酸可以包含I個、2個、3個、4個、5個或更多個核苷酸變化。作為這些核苷酸變化的結(jié)果，編輯的染色體序列可以包含改變的序列或小突變，從而產(chǎn)生修飾的基因產(chǎn)物，不產(chǎn)生基因產(chǎn)物等。在替代性實施方案中，單鏈核酸可以包含側(cè)面為第一和第二區(qū)域的外源序列，所述第一和第二區(qū)域與靶向切割位點的任一側(cè)具有顯著序列同一性(如上文詳細)。因此，編輯的染色體序列可以包含整合的外源核酸序列。如本文所用，術(shù)語“外源”指正常情況下不在這個染色體位置存在的任何序列。例如，外源序列可以是來自另一種生物體的“基因”、來自相同生物體的“基因”的另外的拷貝、人工序列、編碼報道分子的序列等。在另一個實施方案中，單鏈核酸可以包含與靶向切割位點的一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的第一區(qū)域和與處于靶向切割位點遠端的染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域(見圖12)。遠端染色體序列可以靶向切割位點的上游或下游；并且遠端染色體序列可以與靶向切割位點相距約20堿基對至約1，000, 000堿基對存在。例如，遠端染色體序列可以距靶向 的切割位點約0.1,0.3、1、3、10、30、100、300或1,000千堿基對(上游或下游)。作為結(jié)果，編輯的染色體序列可以包含直至約1，000，000堿基對的缺失。在這個實施方案的一種重復中，單鏈核酸可以包含與靶向切割位點的下游側(cè)的染色體序列具有顯著序列同一性的第一區(qū)域和與位于靶向切割位點上游的遠端染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域，其中編輯的染色體可以相對于靶向切割位點包含上游(或5’)缺失。在這個實施方案的另一種重復中，單鏈核酸可以包含與靶向切割位點的上游側(cè)的染色體序列具有顯著序列同一性的第一區(qū)域和與位于靶向切割位點下游的遠端染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域，其中編輯的染色體可以相對于靶向切割位點包含下游(或3’)缺失。在又一個實施方案中，單鏈核酸可以包含側(cè)面為第一區(qū)域和第二區(qū)的外源序列，所述第一區(qū)域與靶向切割位點的一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性，所述第二區(qū)域與處于靶向切割位點遠端的染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域(如上文詳述)。在這個實施方案中，編輯的染色體序列可以包含缺失，以及外源序列在靶向的切割位點處的整合(見圖16)。外源序列的同一性可以并且將變化。例如，外源序列可以是來自另一種生物體的“基因”、來自相同生物體的“基因”的另外的拷貝、報道分子等。(C)任選的供體多核苷酸在某些實施方案中，該方法還包括將至少一種供體多核苷酸引入細胞中。供體多核苷酸包含用于在靶向的切割位點處整合至染色體序列中的序列，其中用于整合的序列側(cè)面為第一序列和第二序列，所述序列的每一種與單鏈核酸的一部分具有顯著序列同一性。因此，將供體多核苷酸連同第一單鏈核酸和第二單鏈核酸(和至少一種靶向核酸內(nèi)切酶)一起引入。第一單鏈核酸包含與靶向切割位點的上游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分和與供體多核苷酸中的第一序列具有顯著序列同一性的第二部分。第二單鏈核酸包含與靶向切割位點的下游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分和與供體多核苷酸中的第二序列具有顯著序列同一性的第二部分。供體多核苷酸可以包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸、核苷酸類似物等。另外，供體多核苷酸可以是環(huán)形或線形的。一般地，供體多核苷酸將是DNA。例如，供體多核苷酸可以是DNA質(zhì)粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、病毒載體等。供體多核苷酸還可以包含復制起點、選擇標記、多克隆位點等。供體多核苷酸的大小可以并且將變化。例如，供體核苷酸的范圍可以是約I千堿基(kb)至約200kb。在一個實施方案中，供體多核苷酸可以包含約IOOkb的編碼目的蛋白的人DNA序列的外顯子和內(nèi)含子序列。(d)細胞該方法包括將上文描述的靶向核酸內(nèi)切酶分子和核酸引入細胞中。多種細胞適用于所述方法中。通常，細胞將是真核細胞或單細胞真核生物體。在一些情況下，細胞可以是培養(yǎng)的細胞、原代細胞或永生細胞。合適的細胞包括真菌或酵母，如畢赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyce);昆蟲細胞如來自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的 SF9 細胞或來自黑腹果妮(Drosophila melanogaster)的 S2細胞；和動物細胞，如小鼠、大鼠、倉鼠、非人靈長類或人細胞。示例性細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可以是原代細胞。通常，可以使用對雙鏈斷裂敏感的任何原代細胞。這些細胞可以是多種細胞類型的，例如，成纖維細胞、成肌細胞、T或B細胞、巨噬細胞、上皮細胞等。當使用哺乳動物細胞系時，細胞系可以是任何建立的細胞系或未曾描述過的原代細胞系。細胞系可以是貼壁的或非貼壁，或可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)，在刺激貼壁、非貼壁或器官型生長的條件下培育細胞系。合適的哺乳動物細胞系的非限制性實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI系(C0S7)、人胚腎系293、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠Sertoli細胞(TM4)、猴腎細胞(CV1-76)、非洲綠猴腎細胞(VERO)、人宮頸癌細胞(HeLa)、犬腎細胞(MDCK)、buffalo大鼠肝細胞(BRL3A)、人肺細胞(W138)、人肝細胞Ofep G2)、小鼠乳腺瘤細胞(MMT)、大鼠肝瘤細胞(HTC)、HIH/3T3細胞、人U2-0S骨肉瘤細胞、人A549細胞、人K562細胞、人HEK293細胞、人HEK293T細胞、人HCT116細胞、人MCF-7細胞和TRI細胞。對于哺乳動物細胞系的廣泛列表，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以參考美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄(ATCC' Mamassas, VA)。在其他實施方案中，細胞可以是干細胞。合適的干細胞包括而不限于胚胎干細胞、ES樣干細胞、胎兒干細胞、 成人干細胞、多潛能干細胞、誘導的多潛能干細胞、多能干細胞、寡能干細胞和單能干細胞。在其他實施方案中，細胞可以是單細胞胚。胚可以是脊椎動物或無脊椎動物的。合適的脊椎動物包括哺乳動物、鳥、爬行類、兩棲類和魚類。合適的哺乳動物的實例包括而不限于嚙齒類、伴侶動物、家畜和非靈長類。嚙齒類的非限制性實例包括小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠和豚鼠。合適的伴侶動物包括但不限于貓、犬、兔、刺猬和雪貂。家畜的非限制性實例包括馬、山羊、羊、豬、牛、駱駝和羊駝。合適的非靈長類包括但不限于僧帽猴、黑猩猩、狐猴、獼猴、狨猴、絹毛猴、蜘蛛猴、松鼠猴和綠猴。鳥的非限制性實例包括雞、火雞、鴨和鵝。可選地，動物可以是無脊椎動物如昆蟲、線蟲等。昆蟲的非限制性實例包括果蠅和蚊子。(e)遞送至細胞上文描述的靶向核酸內(nèi)切酶分子和核酸可以由多種手段引入細胞中。合適的遞送手段包括微量注射法、電穿孔法、聲致穿孔法(sonoporation)、基因槍法、磷酸鈣介導轉(zhuǎn)染、陽離子轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、樹狀物轉(zhuǎn)染法、熱休克轉(zhuǎn)染法、核轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染法、磁性轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、刺穿轉(zhuǎn)染(impalefection)、光學轉(zhuǎn)染法、專利試劑增強的核酸攝取和借助脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、病毒體或人工病毒粒的遞送法。在一個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶分子和核酸可以由核轉(zhuǎn)染法引入細胞中。在另一個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶分子和核酸可以由微量注射法引入細胞(例如，單細胞胚)中。可以將靶向核酸內(nèi)切酶分子和核酸微量注射至細胞的胞核或細胞質(zhì)中。在其中將多于一種祀向核酸內(nèi)切酶分子和多于一種單鏈核酸引入細胞的實施方案中，可以同時或依次地引入分子。例如，可以同時引入分別對靶向切割位點特異的靶向核酸內(nèi)切酶分子以及相應的單鏈核酸?？蛇x地，可以依次引入每種靶向核酸內(nèi)切酶分子以及相應的單鏈核酸。可以類似地引入任選的供體多核苷酸。靶向核酸內(nèi)切酶分子與單鏈核酸的比率可以并且將變化。通常，靶向核酸內(nèi)切酶分子與核酸的比率范圍可以是約1:10至約10:1。在各個實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶分子與核酸的比率可以是約 1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一個實施方案中，該比率可以是約1:1。(f)培養(yǎng)細胞該方法還包括將所述細胞在適宜的條件下維持，從而可以使用單鏈核酸，通過同源重組法修復由靶向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂，從而編輯該染色體序列。在其中將編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸引入細胞的實施方案中，該方法包括將細胞在適宜的條件下維持，從而細胞表達靶向核酸內(nèi)切酶。通常，細胞將在對于細胞的適宜條件下維持。合適的細胞培養(yǎng)物條件是本領(lǐng)域熟知的并且例如在 Santiago 等人，(2008)PNAS105:5809-5814 ；Moehle 等人，(2007)PNAS104:3055-3060 ；Urnov 等人，(2005) Nature435:646-651 ；和 Lombardo 等人(2007)Nat.Biotechnology25:1298-1306中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，用于培養(yǎng)細胞的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以并且將根據(jù)細胞類型變化。在全部情況下，常規(guī)優(yōu)化可以用來確定用于特定細胞類型的最好技術(shù)。

在其中細胞是單細胞胚的實施方案中，胚可以在體外培養(yǎng)(例如，在細胞培養(yǎng)中)。一般而言，將胚在適宜的溫度并且在適宜的培養(yǎng)基中伴隨必需o2/co2比率的情況下培養(yǎng)，以允許修復雙鏈斷裂并且允許胚胎發(fā)育。培養(yǎng)基的合適的非限制性實例包括M2、M16、KSOM、BMOC和HTF培養(yǎng)基。技術(shù)人員將理解培養(yǎng)條件可以并且將根據(jù)胚的物種變化。在全部情況下，常規(guī)優(yōu)化可以用來確定用于特定胚胎物種的最好培養(yǎng)條件。在一些情況下，也可以通過將胚胎轉(zhuǎn)移至雌性宿主的子宮中，在體內(nèi)培養(yǎng)胚胎。通常而言，雌性宿主來自與胚胎相同或相似的物種。優(yōu)選地，雌性宿主是假孕的。準備假孕雌性宿主的方法是本領(lǐng)域已知的。另外，將胚胎轉(zhuǎn)移至雌性宿主中的方法是已知的。在體內(nèi)培養(yǎng)胚胎允許胚胎發(fā)育并且可以導致源自該胚胎的動物活產(chǎn)。在所述方法的這個步驟期間，靶向核酸內(nèi)切酶(在一些情況下，此酶從引入的編碼的靶向核酸內(nèi)切酶的核酸中表達)識別、結(jié)合和產(chǎn)生在染色體序列中靶向切割位點處的雙鏈斷裂。染色體序列中的雙鏈斷裂通過同源重組用單鏈核酸修復，從而核酸序列與染色體序列交換。核酸序列可以物理地整合或，可選地，可以使用核酸序列作為修復斷裂的模板，導致編輯染色體序列。靶向編輯染色體序列的頻率可以并且將根據(jù)多種因素變化。在一些實施方案中，編輯的頻率可以是大于約0.01%,0.03%,0.1%、0.3%、1%、3%、10%或30%。可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分離單一細胞克隆，其包含編輯的染色體序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于產(chǎn)生對所編輯染色體序列純合的細胞的方法。換而言之，細胞可以對所編輯的染色體序列是雜合或純合的。編輯的染色體序列可以包含一個或多個點突變(即，其中將一個核苷酸置換為另一個核苷酸)、一個或多個缺失和/或一個或多個插入。點突變可以是錯義突變、無義突變或沉默突變。缺失的范圍可以是約I堿基對至約500千堿基對，并且插入的范圍可以是約I堿基對至約200千堿基對。因此，編輯的染色體序列，可以產(chǎn)生修飾的基因產(chǎn)物(即，蛋白質(zhì)或非編碼RNA)。例如，在其中編輯的染色體序列存在于蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)部的實施方案中，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以包含至少一個氨基酸變化。在其他實施方案中，修飾的染色體序列可以產(chǎn)生修飾的非編碼RNA或者修飾的染色體序列可以具有改變的調(diào)節(jié)功能。可選地，編輯的染色體序列可以失活，從而不產(chǎn)生功能性基因產(chǎn)物(或消除調(diào)節(jié)區(qū)的功能)。例如，在其中編輯的染色體序列存在于蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)部的實施方案中，點突變、缺失和/或插入可以引入過早終止密碼子、剪接位點連接突變和/或移碼突變，從而不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。在其中編輯的染色體序列包含插入的實施方案中，插入的序列可以編碼肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)亞基、蛋白質(zhì)標簽等。可選地，插入的序列可以提供限制性核酸內(nèi)切酶識別側(cè)、編碼非編碼RNA、包含微RNA結(jié)合位點或作為轉(zhuǎn)錄性控制元件發(fā)揮作用。(II)包含至少一個編輯的染色體序列的細胞本公開的另一個方面提供了包含至少一個編輯的染色體序列的細胞，其中所述染色體序列由上文在部分(I)中描述的方法編輯。在上文部分(I) (d)中詳述了合適的細胞。(III)試 劑盒又一個方面包括用于編輯細胞中染色體序列的試劑盒。試劑盒包含(a)至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向切割位點處引入雙鏈斷裂，和(b)至少一種單鏈核酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的第一部分。因此，試劑盒提供了使用由上文在部分(I)中詳述的方法編輯染色體序列的手段。該試劑盒還可以包含用于實施所公開的方法以便使用靶向核酸內(nèi)切酶和單鏈核酸編輯基因組的一種或多種另外的試劑。試劑盒通常包括帶有一個或多個容器的包裝物，所述容器裝有試劑作為一種或多種獨立組合物或任選地作為其中將允許所述試劑的相容性的混合物。試劑盒也可以包含從使用者的觀點看可能合乎需要的其他材料，如緩沖液劑、稀釋劑、培養(yǎng)基(culture medium)/介質(zhì)(media)、標準物和/或在加工或?qū)嵤┗蚪M編輯方法的任何步驟中有用的任何其他材料。本文中提供的試劑盒優(yōu)選地包括如上文在部分(I)中詳述的用于編輯染色體序列的說明書。試劑盒中包括的說明書可以附屬于包裝材料或可以作為包裝物插頁包括。雖然說明書一般是書寫或打印的材料，但它們不限于此。本公開涵蓋能夠儲存這類說明并將它們傳達給終端用戶的任何媒介。這類媒介包括但不限于電子儲存媒介(例如磁盤、磁帶、膠卷、芯片)、光學媒介(例如CD ROM)等。如本文所用，術(shù)語“說明書”可以包括提供該說明書的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站地址。
(IV)應用本文中公開的編輯染色體序列的方法可以具有多種應用。在一些實施方案中，該方法可以出于研究目的用來將靶向突變引入目的蛋白，從而可以檢查修飾的蛋白質(zhì)的功能。這種方法也可以用來失活蛋白質(zhì)編碼序列，從而無蛋白質(zhì)產(chǎn)生，其中可以檢查細胞或包含這種細胞的生物體的表型。另外，該方法可以出于研究目的用來調(diào)節(jié)或失活RNA編碼區(qū)或轉(zhuǎn)錄性控制區(qū)。在其他實施方案中，該方法可以用來缺失染色體序列的大區(qū)域和/或整合外源核酸序列。在其他實施方案中，本文中公開的方法可以用于臨床目的或治療目的。即，該方法可以用來修復或校正致病基因或染色體序列。作為實例，鐮刀形紅細胞病可以由單核苷酸變化引起(即，珠蛋白基因中A至T的變化導致β-珠蛋白中谷氨酸鹽至纈氨酸的變化)。因而，本公開的方法可以用來在具有鐮刀形紅細胞性狀或疾病的個體的細胞中糾正β_珠蛋白基因中的SNP。類似地，該方法可以用來校正在特定疾病或疾病狀態(tài)中發(fā)揮作用的其他基因或染色體序列中的剪接連接突變、缺失、插入等。除非另外定義，本文中所用的全部技術(shù)與科學術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。以下參考文獻為技術(shù)人員提供用于本發(fā)明中的許多術(shù)語的一般定義:Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第 2版，1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 編著，1988)；The Glossary of Genetics,第 5 版，R.Rieger 等人(編著)，Springer Verlag (1991);以及 Hale 和 Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文所用，除非另外指明，否則以下術(shù)語具有歸屬于它們的含義。當介紹本公開或其優(yōu)選實施方案的要素時，冠詞“一個(a)”、“一種(an)”、“該(the) ”和“所述”意指存在一個或多個所述要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”意在是包括性的并且意指可以存在除所列要素之外的另外的要素。術(shù)語“編輯”或“基因組編輯”指借以改變特定染色體序列的方法。編輯的染色體序列可以包含至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的缺失和/或至少一個核苷酸的置換。編輯的修飾的染色體序列可以編碼修飾的基因產(chǎn)物(例如，具有改變的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、具有改變的核苷酸序列的非編碼RNA等)、提供修飾的功能(例如，改變的啟動子功能、改變的增強子功能等)、可能未能產(chǎn)生基因產(chǎn)物(即，序列未轉(zhuǎn)錄和/或沒有產(chǎn)生功能性產(chǎn)物)、未能提供調(diào)節(jié)功能、編碼外源序列，或提供新功能(即，作為調(diào)節(jié)型啟動子、誘導型啟動子、微RNA結(jié)合位點等)。如本文所用，術(shù)語“內(nèi)源的”指相對于細胞為天然的染色體序列。如本文所用的術(shù)語“外源”指正常情況下不在特定染色體位置存在的核酸序列。外源序列可以來自另一種生物體，可以是人造的，或可以是在另一個染色體位置處存在的核酸序列的重復拷貝。如本文所用，“基因”指編碼基因產(chǎn)物的DNA區(qū)域(包括外顯子和內(nèi)含子)，以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的全部 DNA區(qū)域，無論這類調(diào)節(jié)序列是否與編碼序列和/或轉(zhuǎn)錄的序列相鄰。因此，基因包括但未必限于啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列如核糖體結(jié)合位點和內(nèi)部核糖體進入位點、增強子、沉默子、絕緣子、交界元件、復制起點、基質(zhì)附著位點和基因座控制區(qū)域。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”指處于線形或環(huán)狀構(gòu)象的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公開的目的，這些術(shù)語不得解釋為在聚合物的長度方面起限制作用。這些術(shù)語可以包括天然核苷酸的已知類似物以及在堿基、糖和/或磷酸酯部分經(jīng)修飾(例如，硫代磷酸酯主鏈)的核苷酸。通常，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對特異性；即，A的類似物將與T發(fā)生堿基配對。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”互換地使用來指氨基酸殘基的聚合物。如本文所用，術(shù)語“靶位點”或“靶序列”指限定待編輯的染色體序列的部分和鋅指核酸酶針對其工程化以識別并且結(jié)合的核酸序列，前提是存在用于結(jié)合的充分條件。術(shù)語“上游”和“下游”指核酸序列中相對于固定位置的定位。上游指相對于該位置為5’(即，靠近鏈的5’末端)區(qū)域并且下游指相對于該位置為3’(即，靠近鏈的3’末端)區(qū)域。用于確定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。一般而言，這類技術(shù)包括測定基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定由其編碼的氨基酸序列，并且將這些序列與第二核苷酸序列或氨基酸序列比較。也可以測定基因組序列并且以這種方式比較。通常，同一性分別指兩個多核苷酸或多肽序列的精確核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸對應性。兩個或更多個序列(多核苷酸或氨基酸)可以通過確定它們的同一性百分比進行比較。兩個序列(無論是核酸 序列或氨基酸序列)的同一性百分比是兩個比對的序列之間的精確匹配數(shù)目除以較短序列的長度并乘以100。核酸序列的近似比對結(jié)果由Smith和 Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482-489 (1981)的局部同源性算法提供。通過使用由 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.0.Dayhoff 編著，第 5 增刊 3:353-358，National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.，USA 開發(fā)并由 Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)歸一化的評分矩陣，這種算法可以適用于氨基酸序列。這種算法確定序列的同一性百分比的示例性實施由Genetics Computer Group (Madison, Wis.)在 “BestFit” 應用中提供。用于計算序列之間同一性百分比或相似性的其他合適程序通常是本領(lǐng)域已知的，例如，另一種比對程序是BLAST,隨默認參數(shù)使用。例如，使用以下默認參數(shù)，可以使用BLASTN和BLASTP:遺傳密碼=標準；過濾=無；鏈=兩條鏈；截值=60 ;期望=10 ;矩陣=BL0SUM62 ;描述=50個序列；分選=高評分；數(shù)據(jù)庫=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+Spupdate+PIRo可以在GenBank網(wǎng)站上找到這些程序的細節(jié)。就本文所述的序列，所需的序列同一性程度的范圍是大約80%至100%和其之間的任何整數(shù)值。一般而言，序列之間的同一性百分比是至少70-75%、優(yōu)選地80-82%、更優(yōu)選地85_90%、甚至更優(yōu)選地92%、仍更優(yōu)選地95%并且最優(yōu)選地98%序列同一性。可選地，可以通過以下方式確定多核苷酸之間的序列相似性程度:在允許共有序列同一性程度的區(qū)域之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，隨后用單鏈特異性核酸酶消化并且確定消化片段的大小。如使用以上方法所測定，當兩個核酸序列或兩個多肽序列在限定的分子長度范圍內(nèi)顯示至少約70%-75%、優(yōu)選地80%-82%、更優(yōu)選地85%_90%、甚至更優(yōu)選地92%、仍更優(yōu)選地95%和最優(yōu)選地98%序列同一性時，這兩個序列是基本上彼此相似的。如本文所用，基本上相似還指與指定的DNA或多肽序列顯示完全同一性的序列。基本上相似的DNA序列可以在Southern雜交實驗中例如在如對這個特定系統(tǒng)所限定的嚴格條件下鑒定。限定適宜雜交條件屬于本領(lǐng)技術(shù)范圍內(nèi)。見，例如，Samtoook等人，上文；Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach,編者 B.D.Hames 和
S.J.Higgins, (1985) Oxford !Washington, D.C.; IRL Press)。兩個核酸片段的選擇性雜交可以如下確定。兩個核酸分子之間序列同一性的程度影響這些分子之間雜交事件的效率和強度。部分相同的核酸序列將至少部分地抑制完全相同的序列與祀分子的雜交?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的雜交測定法(例如，Southern(DNA)印跡、Northern (RNA)印跡、溶液雜交等，見 Sambrook,等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第 2版，(1989)Cold Spring Harbor, N.Y.)評估對完全相同序列的雜交的抑制?？梢允褂貌煌潭鹊倪x擇性，例如，使用從低嚴格性至高嚴格性變化的條件實施此類測定法。如果使用低嚴格性條件，可以使用甚至缺少部分序列同一性程度的第二探針(例如，與靶分子具有小于約30%序列同一性的探針)評估非特異性結(jié)合的不存在，從而，在不存在非特異性結(jié)合事件的情況下，第二探針將不與靶雜交。當使用基于雜交的檢測系統(tǒng)時，選擇與參考核酸序列互補的核酸探針，并且隨后通過選擇適宜的條件，探針和參考序列選擇性地雜交或彼此結(jié)合以形成雙鏈體分子。能夠在中等嚴格雜交條件下與參考序列選擇性雜交的核酸分子一般地在允許檢出至少約10-14個核苷酸長度的靶核酸序列的條件下雜交，其中所述靶核酸序列與選擇的核酸探針的序列具有至少大約70%序列同一性。嚴格雜交條件一般地允許檢出至少約10-14個核苷酸長度的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列與選擇的核酸探針的序列具有大于約90-95%的序列同一性。如本領(lǐng)域已知，可以確定用于探針/參考序列雜交的雜交條件，其中探針和參考序列具有特定的序列同一性程度(見例如，Nucleic Acid Hybridization:A PracticalApproach,編者 B.D.Hames 和 S.J.Higgins, (1985) Oxford !Washington, D.C.; IRL Press)。用于雜交的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。雜交嚴格性指雜交條件不利于形成含有錯配核苷酸的雜交分子的程度，較高的嚴格性與較低的錯配雜 交分子耐受性相關(guān)。影響雜交嚴格性的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括但不限于溫度、pH、離子強度和有機溶劑(例如，甲酰胺和二甲亞砜)的濃度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，雜交嚴格性因較高的溫度、較低的離子強度和較低的溶劑濃度而增加。就嚴格性雜交條件而言，本領(lǐng)域熟知可以通過變化例如以下因素:序列的長度和性質(zhì)、多個序列的堿基組成、鹽和其他雜交溶液組分的濃度、雜交溶液中存在或不存在封閉劑(例如，硫酸葡聚糖和聚乙二醇)、雜交反應溫度和時間參數(shù)以及變化洗滌條件，使用眾多的等同條件來建立具體的嚴格性?？梢宰裱绢I(lǐng)域的標準方法選擇特定的雜交條件集合(見例如，Sambrook,等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manua,第 2 版，(1989)Cold SpringHarbor, N.Y.)。
實施例包括以下實施例以說明本發(fā)明。實施例1:RSK2激酶的修飾以下實施例詳述RSK2激酶基因座的修飾。將寡核苷酸(125nt)設(shè)計成將3個不同突變并入RSK2激酶染色體序列。寡核苷酸包含:(I)在ZFN結(jié)合位點中防止后續(xù)非同源末端接合(NHEJ)的兩個點突變，(2) TGC至GTT變化以使Cys轉(zhuǎn)換成ValjP (3)沉默性C至A變化以產(chǎn)生用于克隆篩選的單一 BamHI位點(圖1)。使用標準合成方法產(chǎn)生寡核苷酸(例如，無化學修飾)并且用PAGE使其純化。將一對鋅指核酸酶(ZFN)設(shè)計成靶向RSK2激酶基因座。將一種ZFN設(shè)計成結(jié)合序列5’-GTATACATAAAGCTA-3’(SEQ ID N0:6;圖1中所示的左側(cè)結(jié)合位點)，并且將另一種ZFN設(shè)計成結(jié)合序列5’ -GGAGTTTGCAGTGAAGGTA-3’ (SEQID N0:7 ;圖1中所示的右側(cè)結(jié)合位點)。人K562細胞用8 μ g編碼ZFN的mRNA和0.3nmol寡核苷酸核轉(zhuǎn)染。在孵育兩日后，對細胞匯集物分析BamHI位點的存在。如圖2中所示，同時暴露于寡核苷酸和ZFN的細胞攜帶BamHI位點，而單獨引入寡核苷酸沒有效果。整合頻率的范圍是約20_30%。將單個細胞克隆分離并且使用qPCR測定法篩選以鑒定攜帶BamHI位點的那些細胞克隆(見圖3)。篩選大約750個克隆并且鑒定出約40個陽性克隆。陽性克隆隨后針對靶向的染色體位置周圍進行PCR擴增并且用BamHI消化以證實對RSK2激酶染色體基因座的編輯。測序數(shù)據(jù)揭示，BamHI陽性克隆也對所需的Cys至Val密碼子變化為陽性。實施例2 =AAVSl基因座的修飾以下實施例詳述了寡核苷酸向AAVSl基因座中引入HindIII位點的用途。圖4展示AAVSl基因座的野生型序列和包含HindIII位點的有義和反義寡核苷酸的序列(IOSnt)。使用標準方法產(chǎn)生這些寡核苷酸(例如，無化學修飾)并且用PAGE純化。將一對ZFN設(shè)計成靶向AAVSl基因座。將一種ZFN設(shè)計成結(jié)合序列5’ -ACCCCACAGTGG-3’ (SEQ ID N0:8 ;圖4中所示的左側(cè)結(jié)合位點)，并且將另一種ZFN設(shè)計成結(jié)合序列5’-TAGGGACAGGAT-3’ (SEQ ID NO:9 ;圖4中所示的右側(cè)結(jié)合位點)。使用標準方法，制備加帽、聚腺苷酸化的編碼ZFN的mRNA。將ZFN mRNA和包含HindIII位點的寡核苷酸經(jīng)核轉(zhuǎn)染至1(562、!1(:1'116、似03、4549、冊1(293、!1印62或1077細胞中。在孵育一段時間后，對細胞匯集物分析HindIII位點的存在。同時暴露于寡核苷酸和ZFN的細胞含有HindIII片段，其中單獨用寡核苷酸處理的那些沒有HindIII片段(圖5)。將單個細胞A549克隆分離并且使用qPCR測定法篩選以鑒定攜帶HindIII位點的那些細胞克隆(圖6)。篩選大約933個克隆，308個鑒定為陽性。因此，遞送HindIII位點的頻率是約33%。陽性克隆隨后針對靶向的染色體位置周圍進行PCR擴增并且用HindIII消化以證實寡核苷酸序列的插入。將親本PCR產(chǎn)物的位置處顯示模糊條帶的克隆測序并且證實含有HindIII位點(見圖6)。親本PCR產(chǎn)物的位置周圍顯示多個強烈條帶的克隆假設(shè)含有源自NHEJ的小插入。實施例3 =AAVSl基因座的修飾-寡核苷酸的長度為確定較短的寡核苷酸是否可能用來遞送HindIII位點至AAVSl基因座，制備長度范圍36至106nt的寡核苷酸。例如，106nt寡核苷酸在ZFN切割位點的任一側(cè)上具有50nt序列同一性(即，具有50nt的同源性臂)，而同源性臂之間存在一個HindIII位點(6nt)。在下表I中顯示寡核苷酸的序列。
權(quán)利要求
1.一種用于編輯細胞中至少一種內(nèi)源染色體序列的方法，所述方法包括: a)向細胞中引入(i)至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸，所述靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂，和(ii)至少一種單鏈核酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的第一部分；和 b)將所述細胞在如此條件下維持，從而通過同源重組法修復由所述靶向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂，從而所述染色體序列與所述單鏈核酸的序列交換，因而編輯所述染色體序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸包含與靶向的切割位點的另一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述單鏈核酸還包含相對于所述染色體序列的至少一個核苷酸變化，從而編輯的染色體序列包含至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的缺失、至少一個核苷酸的置換或其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述單鏈核酸還包含側(cè)面為所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域的外源序列，從而所述編輯的染色體序列包含整合的外源序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸包含與位于靶向的切割位點上游或下游的遠端染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域，從而編輯的染色體序列包含缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述單鏈核酸還包含側(cè)面為所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域的外源序列，從而所述編輯的染色體序列還包含整合的外源序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸是線形或環(huán)形的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸具有約20個核苷酸至約100，000個核苷酸的長度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸模擬物、修飾的核苷酸、2’ -O-甲基核苷酸、鎖核酸、肽核酸或其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸包含磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、磷酰亞胺鍵、磷酰二胺鍵或其組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸是有義或反義的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單鏈核酸與靶向切割位點的至少一側(cè)上的至少10個核苷酸具有至少約90%序列同一性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸酶、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物(TALE)核酸酶、位點特異性核酸酶或人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將至少一種供體多核苷酸引入所述細胞中。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中將一種靶向核酸內(nèi)切酶、包含與靶向切割位點的上游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分的第一單鏈核酸、包含與靶向切割位點的下游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分的第二單鏈核酸和一個供體多核苷酸引入所述細胞中，所述供體多核苷酸包含與第一單鏈核酸的第二部分具有顯著序列同一性的第一序列和與第二單鏈核酸的第二部分具有顯著序列同一性的第二序列，并且其中所述供體多核苷酸的第一和第二序列位于用于插入所述染色體序列中的序列的側(cè)面。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中將第一革巴向核酸內(nèi)切酶、包含與第一革巴向核酸內(nèi)切酶的靶向切割位點的上游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分的第一單鏈核酸、第二靶向核酸內(nèi)切酶、包含與第二靶向核酸內(nèi)切酶的靶向切割位點的下游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分的第二單鏈核酸和一個供體多核苷酸引入所述細胞中，所述供體多核苷酸包含與所述第一單鏈核酸的第二部分具有顯著序列同一性的第一序列和與所述第二單鏈核酸的第二部分具有顯著序列同一性的第二序列，并且其中所述供體多核苷酸的第一和第二序列位于用于插入染色體序列中的序列的側(cè)面。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞是培養(yǎng)的細胞、原代細胞、永生細胞、干細胞、誘導的多潛能干細胞(iPS)或單細胞胚。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞是人細胞、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞或單細胞真核生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸酶并且所述單鏈核酸是包含至少30個核苷酸的脫氧核糖核酸。
20.一種用于編輯細胞中內(nèi)源染色體序列的試劑盒，所述試劑盒包括: a)至少一種靶向核酸內(nèi)切酶或編碼靶 向核酸內(nèi)切酶的核酸，所述靶向核酸內(nèi)切酶能夠在染色體序列中靶向的切割位點處引入雙鏈斷裂；和 b)至少一種單鏈核酸，其包含與靶向切割位點的至少一側(cè)上的染色體序列具有顯著序列同一'I"生的第一部分。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸包含與靶向的切割位點的另一側(cè)上的所述染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸還包含相對于所述染色體序列的至少一個核苷酸變化，從而所述編輯的染色體序列包含至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的缺失、至少一個核苷酸的置換或其組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸還包含側(cè)面為第一區(qū)域和第二區(qū)域的外源序列，從而所述編輯的染色體序列包含于整合的外源序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸包含與位于靶向的切割位點上游或下游的遠端染色體序列具有顯著序列同一性的第二區(qū)域，從而所述編輯的染色體序列包含缺失。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸還包含側(cè)面為第一區(qū)域和第二區(qū)域的外源序列，從而所述編輯的染色體序列還包含整合的外源序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸是線形或環(huán)形的。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸具有約20個核苷酸至約100, 000個核苷酸的長度。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸模擬物、修飾的核苷酸、2’ -O-甲基核苷酸、鎖核酸、肽核酸或其組合。
29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸包含磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、磷酰亞胺鍵、磷酰二胺鍵或其組合。
30.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸是有義或反義的。
31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述單鏈核酸與靶向切割位點的至少一側(cè)上的至少10個核苷酸具有至少約90%序列同一性。
32.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸酶、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物(TALE)核酸酶、位點特異性核酸酶或人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含第一單鏈核酸和第二單鏈核酸，所述第一單鏈核酸包含與靶向切割位點的上游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分，所述第二單鏈核酸包含與靶向切割位點的下游側(cè)具有顯著序列同一性的第一部分，并且還包含供體多核苷酸，所述供體 多核苷酸包含與所述第一單鏈核酸的第二部分具有顯著序列同一性的第一序列和與所述第二單鏈核酸的第二部分具有顯著序列同一性的第二序列，并且其中所述供體多核苷酸的第一和第二序列位于用于插入所述染色體序列中的序列的側(cè)面。
34.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述試劑盒還包含至少一種用于PCR的引物。
35.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述試劑盒還包含至少一種選自緩沖液、稀釋劑和培養(yǎng)基的試劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述靶向核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸酶并且所述單鏈核酸是包含至少30個核苷酸的脫氧核糖核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供用于編輯細胞中特定染色體序列的方法和試劑盒。具體而言，將靶向核酸內(nèi)切酶和單鏈核酸用來編輯所述染色體序列。
文檔編號C12N15/00GK103168101SQ201180045842
公開日2013年6月19日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者陳福強, S.M.普呂特-米勒, G.D.戴維斯 申請人:西格馬-奧爾德里奇有限責任公司