專利名稱：用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的可增壓筒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實踐中使用的循環(huán)變溫器領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)領(lǐng)域中重要的工具是被稱為“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(PCR)的過程。PCR從少量的遺傳物質(zhì)樣品產(chǎn)生大量的遺傳物質(zhì)。
PCR過程在含有下列DNA復(fù)制成分的小反應(yīng)瓶中進(jìn)行:待復(fù)制的DNA和通常在載流中攜帶的PCR反應(yīng)試劑，所述PCR反應(yīng)試劑包括被組裝形成DNA的四種核苷酸、兩種不同類型的被稱為“引物”的合成DNA (每條DNA互補(bǔ)鏈一種引物)，以及被稱為DNA聚合酶的酶。
DNA是雙鏈的。PCR過程開始于將DNA的雙鏈分成單個互補(bǔ)鏈，這個步驟被稱為“變性”。這通常通過將PCR反應(yīng)混合物加熱至大約94到96攝氏度持續(xù)數(shù)秒到超過I分鐘的時間段而完成。
在將DNA分成單鏈后，將混合物冷卻至大約45到大約60攝氏度(通常選定為低于引物將熔解的溫度大約5度)，以便允許引物在混合物中結(jié)合到DNA的每個對應(yīng)單鏈。這個步驟通常被稱為“退火”。退火步驟通?；ㄙM(fèi)從大約幾秒到高達(dá)幾分鐘之間的任何時間。
接下來，將反應(yīng)容器加熱至大約72到73攝氏度，反應(yīng)混合物中的DNA聚合酶在該溫度發(fā)揮作用，以通過將核酸增加到引物上從而在單鏈上建立DNA的第二條鏈，使得形成與DNA的原始鏈相同的雙鏈DNA。這個步驟通常被稱為“延伸”。延伸步驟通?；ㄙM(fèi)幾秒到幾分鐘來完成。
這連續(xù)的三個步驟有時也被稱為“階段”，限定一個“循環(huán)”。PCR循環(huán)的完成導(dǎo)致在反應(yīng)瓶中使DNA的量加倍。重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致在反應(yīng)瓶中使DNA的量再一次加倍。通常，該過程被重復(fù)多次，例如10 到40次，導(dǎo)致大量相同的DNA片段。進(jìn)行20次循環(huán)產(chǎn)生超過一百萬原始DNA樣品的拷貝。進(jìn)行30次循環(huán)產(chǎn)生超過十億原始DNA樣品的拷貝?！把h(huán)變溫器”被用來使反應(yīng)容器在期望的溫度之間變動期望時間段的過程自動化。
用于擴(kuò)增的DNA必須從生物樣品獲得，其包括破壞生物組織、細(xì)胞壁、衣殼等，以便釋放感興趣的特定DNA。在一些實例中，特定RNA是感興趣的，盡管RNA必須被轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA以便使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
當(dāng)變性發(fā)生的溫度范圍接近載流的沸騰溫度時，管理PCR反應(yīng)的難題發(fā)生。例如，在較高海拔下，例如在像丹佛這樣的城市中可見的，水——常用的載流——在97攝氏度下沸騰。將樣品從大約94攝氏度加熱到大約96攝氏度可能引起水汽氣泡和/或溶解的氣體形成。這些氣泡在PCR期間造成難題，特別是依靠光學(xué)探測系統(tǒng)的那些系統(tǒng)。換句話說，光學(xué)探測系統(tǒng)發(fā)射光信號通過反應(yīng)容器和樣品。然而，氣泡可以至少部分地阻塞和/或扭曲和/或折射光信號，并且這樣一來，降低信號質(zhì)量和/或引入在光學(xué)探測器處接收的噪聲?，F(xiàn)有技術(shù)方案試圖通過使用非常精確并且因此非常昂貴的熱控制器以嘗試并且阻止沸騰發(fā)生來解決這個問題，但常常具有有限的成功。
氣泡也可能在熱循環(huán)過程之前存在，諸如隨著樣品流入反應(yīng)容器而可在樣品的湍流中形成的那些氣泡或當(dāng)樣品進(jìn)入反應(yīng)容器時被捕集在反應(yīng)容器內(nèi)的氣囊。這類氣泡造成與溫度循環(huán)期間產(chǎn)生的那些相同的問題。
另外，流體內(nèi)氣泡的存在和發(fā)展改變該流體的體積。這在當(dāng)溫度循環(huán)期間氣泡體積變化比流體和樣品體積變化更加顯著時發(fā)生。氣泡體積的變化導(dǎo)致流體和攜帶的DNA樣品流入和流出反應(yīng)容器。流體這種流入和流出反應(yīng)容器可以改變和/或稀釋反應(yīng)容器內(nèi)DNA樣品和/或PCR反應(yīng)試劑的濃度。
因此，存在對改進(jìn)信號質(zhì)量的PCR過程和系統(tǒng)的需要。另外，存在對減少樣品內(nèi)氣泡存在的PCR系統(tǒng)的需要。發(fā)明內(nèi)容
傳統(tǒng)的PCR系統(tǒng)和方法需要使用實驗室設(shè)備和熟練技術(shù)人員。本發(fā)明涉及這樣的方法和裝置，其可以減少對實驗室設(shè)備和熟練技術(shù)人員的需要并且甚至可以在不存在熟練技術(shù)人員的場地的應(yīng)用中使用。
描述示例性樣品處理模塊，其包括樣品組件和PCR組件。在使用時將樣品添加到樣品組件中，然后將該樣品組件連接到PCR組件。將樣品引入PCR組件內(nèi)的PCR反應(yīng)瓶中，該P(yáng)CR反應(yīng)瓶含有處理該樣品以及如果DNA存在于該樣品中提供擴(kuò)增的感興趣DNA所必需的PCR反應(yīng)混合物的所有成分。
本發(fā)明的實施方式包括:PCR反應(yīng)瓶組件內(nèi)的樣品可通過使用流動限制裝置而增壓超過環(huán)境壓力。流動限制裝置與至少一個PCR反應(yīng)瓶流體連通。流動限制裝置的一個實施方式包括滲透膜，該滲透膜至少部分允許至少第一流體穿過該膜并且至少部分阻止至少第二流體流動穿過該膜。流動限制裝置的另一實施方式包括各種類型的閥。
參照如下描述和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)以及特征將變得更加顯而易見，或可以通過如下文中提出的發(fā)明實踐而了解。


為進(jìn)一步闡明本發(fā)明的上述和其它優(yōu)點(diǎn)與特征，通過參考在附圖中圖解的其具體實施方式
，進(jìn)行本發(fā)明更具體的描述。應(yīng)當(dāng)理解，這些附圖僅僅描繪本發(fā)明的典型實施方式，并且因此不被認(rèn)為限制其范圍。通過使用附圖，描述和解釋本發(fā)明的額外的特征和細(xì)節(jié)，其中:
圖1是樣品處理模塊實施方式的透視圖。
圖2是樣品組件的側(cè)視圖。
圖3是沿圖2的剖面線3-3取的橫截面?zhèn)纫晥D。
圖4是圖2的樣品組件和棉簽(swab)的側(cè)視圖。
圖5是圖2的樣品組件和棉簽的另一個側(cè)視圖。
圖6是PCR組件的透視圖。
圖7是圖6的PCR組件的俯視圖。
圖8是圖6的PCR組件的橫截面?zhèn)纫晥D。
圖9是圖6的PCR組件的仰視圖。
圖10是圖1的樣品處理模塊和任選關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖。
圖11是圖6的PCR組件的實施方式的部分截面圖。
圖12是圖6的PCR組件的實施方式的部分俯視圖。
圖13是對應(yīng)于圖12的仰視圖。
圖14是PCR組件的另一實施方式的橫截面圖。
圖15是沿圖2的剖面線3-3取的樣品組件的另一個實施方式的橫截面?zhèn)纫晥D。
具體實施方式
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用作多種活動的前體的重要工具，所述多種活動諸如鑒定樣品中小量的特定遺傳物質(zhì)、測定樣品中存在多少遺傳物質(zhì)或產(chǎn)生足夠的用于各種應(yīng)用的遺傳物質(zhì)。
傳統(tǒng)的循環(huán)變溫器采取多種形式。最常用的循環(huán)變溫器使用放入大的固體導(dǎo)熱塊中的多個樣品瓶。每個瓶手動加載期望被擴(kuò)增的樣品DNA——在下文中有時也被稱為“模板DNA”——和聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)必需的化學(xué)成分。PCR過程的步驟在實驗室由熟練的技術(shù)人員進(jìn)行。
參照圖1，本發(fā)明提供簡化PCR過程的樣品處理模塊20，其各方面在2007年12月17號提交并且題目為“PCR Sample Processing Module (PCR樣品處理模塊)”的共同未決的美國專利申請第11/958，332號中公開，其出于所有目通過引用以其整體并入本文。樣品處理模塊20包括樣品組件22和PCR組件24。樣品組件22用于收集和任選地處理生物樣品、模板DNA或模板RNA。PCR組件24用于進(jìn)行模板DNA的PCR擴(kuò)增。
圖2是樣品組件22在被連接到PCR組件24之前的側(cè)視圖。如在沿圖2的剖面線3-3取的樣品組件22的橫截面視圖中更容易看見的，圖3示出樣品組件22具有主體26，該主體26包含圓柱內(nèi)腔28，其具有用于接收生物材料樣品或含有模板DNA或RNA的溶液諸如載流的開口端31。樣品組件22有利地設(shè)置有可拆卸的螺帽34，以便在使用之前保護(hù)腔28免受污染并且在樣品放入腔28內(nèi)之后但在樣品組件22被固定到PCR組件24前緊閉內(nèi)容物，所述螺帽34具有與樣品組件22的主體26上的對應(yīng)的主體螺紋17配合的帽螺紋33。當(dāng)然，可以使用將主體26配合到蓋34和PCR組件24的其它方式，諸如摩擦配合、密封件、扣鉤、碰鎖等，均落于本公開的范圍內(nèi)。腔28的上端可以設(shè)置有防濺污結(jié)構(gòu)36。
腔28的底端由可移動活塞30密封，可移動活塞30在其上端配備有防止腔內(nèi)容物漏出的密封件32?？梢苿踊钊?0被機(jī)械地連接到線性致動器38，線性致動器38沿軸39將可移動活塞30移入或移出腔28。在一些實施方式中，線性致動器被手動致動，諸如使用者壓下活塞(未示出)。在其它實施方式中，線性致動器38被連接到控制器35，控制器35產(chǎn)生移動信號并將其傳遞到線性致動器38，線性致動器38可以包括任意各種類型的電動機(jī)、螺桿驅(qū)動器(screw drive)和等同系統(tǒng)。控制器35可以是具有為實現(xiàn)所描述動作而寫入的程序的通用計算機(jī)，和/或它可以是特定指令計算機(jī)或芯片。任選地，在給定的時間段后，控制器35停止發(fā)送移動信號和/或傳遞停止信號，可計算在給定的時間段內(nèi)行進(jìn)的距離以得到線性致動器38移動可移動活塞30的速率。
任選地，可操作地連接到樣品組件22和/或PCR組件24 (圖8)的壓力傳感器41被連接到控制器35。任選地，壓力傳感器41被配置為產(chǎn)生反映腔28和/或PCR組件24的一個或更多個區(qū)域諸如PCR反應(yīng)瓶56 (圖8)中的壓力的壓力信號，并將該壓力信號傳遞到控制器35。控制器35響應(yīng)壓力信號停止發(fā)送移動信號和/或?qū)⑼Ｖ剐盘杺鬟f到線性致動器38。任選地，配置為探測由線性致動器38作用于可移動活塞30的力并產(chǎn)生表示該力的力信號的測力計43被連接到控制器35。測力計的實施方式包括電力、機(jī)電、機(jī)械開關(guān)和當(dāng)所選力或目標(biāo)力滿足時改變狀態(tài)的二進(jìn)制裝置。測力計43將力信號傳遞到控制器35。控制器35響應(yīng)力信號停止發(fā)送移動信號和/或?qū)⑼Ｖ剐盘杺鬟f到線性致動器38。
除了可移動活塞30，圖15中圖解的樣品組件122的另一個實施方式包括柔性膜或氣囊132，柔性膜或氣囊132并入或被機(jī)械地連接到樣品組件122的主體126。柔性膜132與可移動活塞30類似地起作用，因為柔性膜向內(nèi)朝樣品組件122的腔128偏斜，并且這樣一來推動樣品進(jìn)入PCR組件24，如下描述。與由可移動活塞30相對于主體26提供的密封相比，使用柔性膜132的潛在優(yōu)點(diǎn)是其可以降低柔性膜132連接到主體126的界面處較高壓力下發(fā)生泄漏的風(fēng)險。通過使用施加于柔性膜132的空氣壓縮或其它力作為線性致動器38的替代，使柔性膜132向內(nèi)偏斜。
樣品組件22可以用溶液或干燥的成分、反應(yīng)物、基本化學(xué)試劑諸如脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)等預(yù)加載，或可以被設(shè)置為空的直至使用。盡管模板DNA可以放入樣品組件22用于PCR樣品處理模塊20，但考慮樣品組件22可以使用完整生物樣品。圖4和5描繪使用棉簽38，棉簽38被用來例如從患者咽喉收集生物樣品。棉簽頂端40可以在削弱區(qū)域42處與棉簽38分開，這允許棉簽頂端40落入樣品組件22的腔28內(nèi)。樣品組件22然后可以經(jīng)受超聲處理以便根據(jù)2007年12月17日提交且并題目為“Ultrasonic Release ofDNA and RNA (DNA和RNA的超聲釋放)”的共同未決的美國專利申請第11/958，299號的方法和裝置從生物樣品中釋放DNA和RNA，該申請的公開內(nèi)容出于各種目的以其整體通過引用并入本文。
圖6-9和11-13描繪圖1的PCR組件24的不同視圖。PCR組件24設(shè)置有接口 44，其與在圖3中最佳示出的樣品組件22的開口端31和主體螺紋27配合。正如在圖8中最佳所見的，提供密封元件46諸如O型圈(密封圈，Ο-ring)、橡膠墊片等以作為PCR組件24與樣品組件22之間的密封件起作用。
優(yōu)選地，接口 44和樣品組件22設(shè)置有圖9中示出的鎖定結(jié)構(gòu)48，在樣品組件22被固定到PCR組件24后，該鎖定結(jié)構(gòu)48防止樣品組件22脫離，以便防止樣品組件的內(nèi)容物隨后暴露于樣品處理模塊20的使用者或操作者，當(dāng)處理劇毒物質(zhì)時這個特征尤其是期望的。例如，鎖定結(jié)構(gòu)48任選地包括疾齒凹口(ratchet notch),該疾齒凹口與樣品組件22上的凸緣50 (見圖5)接合，以便允許樣品組件22與PCR組件24密封附連，但在此后防止樣品組件22從PCR組件24脫離。
PCR組件24中的流體管道47提供樣品組件22的腔28內(nèi)含有的流體和樣品行進(jìn)的路線。過濾器52被設(shè)置在流體管道47上 以防止固體物質(zhì)從樣品組件22進(jìn)入PCR組件24的流體輸送通道54。換句話說，通過將可移動活塞30向上升高入腔28，推動樣品組件22的腔28內(nèi)含有的溶液——所述溶液含有待被擴(kuò)增的模板DNA——通過過濾器52并進(jìn)入輸送通道54，使得將溶液從腔28注射進(jìn)輸送通道54。輸送通道54將樣品溶液從樣品組件22運(yùn)送到一個或更多個PCR反應(yīng)瓶56。所示的PCR組件24示出使用兩個PCR反應(yīng)瓶56，每個反應(yīng)瓶經(jīng)由在參考數(shù)字54a處所示的輸送通道54中的分支而被提供樣品。
優(yōu)選地，在將樣品組件22附連到PCR組件24之后，將樣品處理模塊20永久地固定到適當(dāng)位置，以便防止釋放潛在危險物質(zhì)。由于這導(dǎo)致封閉的不通風(fēng)空間——其總體體積隨著可移動活塞在腔28內(nèi)推進(jìn)而減小，優(yōu)選提供一個或更多個氣室用于容許體積的減小而不阻止溶液從樣品組件22流到PCR反應(yīng)瓶45，并且該氣室也用作PCR反應(yīng)瓶56內(nèi)形成的氣泡的通風(fēng)位置。所示的實施方式出于這個目的使用通風(fēng)室58，通風(fēng)室58通過通風(fēng)通道60與PCR反應(yīng)瓶56連通，但是通風(fēng)室58在其它方面是密封的。
盡管圖6-9示出對每個PCR反應(yīng)瓶56使用獨(dú)立的通風(fēng)室58，但應(yīng)當(dāng)理解這不是必需的并且其他構(gòu)造能夠提供與通風(fēng)室58相同的功能。例如，并且將在下面討論的，圖14中示出的PCR組件124的實施方式任選地完全摒棄通氣室而提供了可將氣體直接排放到環(huán)境的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選地，每個PCR反應(yīng)瓶56含有凍干的珠62，凍干的珠62包括擴(kuò)增從樣品組件22供應(yīng)的模板DNA所需的多種成分，在下文中被稱為“PCR反應(yīng)混合物”。凍干的珠62內(nèi)的PCR反應(yīng)混合物將包括擴(kuò)增模板DNA必需的引物、聚合酶、dNTP和其它必需的成分。如果更方便或如果PCR反應(yīng)混合物的各種成分需要在使用之前彼此分開，則可以提供超過一種的凍干珠62。
取決于待被擴(kuò)增的模板DNA，PCR反應(yīng)混合物將不同。由于PCR組件24以預(yù)加載的形式因素(form factor)提供，應(yīng)當(dāng)貼上識別該預(yù)加載的PCR組件的標(biāo)簽。圖8和9示出使用射頻識別(RFID)標(biāo)簽64，射頻識別(RFID)標(biāo)簽64也可以被用來向使用樣品模塊的循環(huán)變溫器提供信息。最佳運(yùn)行條件和協(xié)議——諸如由控制器35使用的那些——可以不同，這取決于模板DNA或PCR反應(yīng)混合物的成分，因此RFID識別信息也可以被用來選擇循環(huán)變溫器程序，該循環(huán)變溫器程序可以包括關(guān)于諸如目標(biāo)溫度和循環(huán)次數(shù)的參數(shù)的指令，這些參數(shù)對于PCR反應(yīng)混合物的內(nèi)含物是最佳的。
實時監(jiān)測并控制PCR 是優(yōu)選的。圖7描繪提供透鏡66以幫助直接視覺觀察PCR反應(yīng)瓶56的內(nèi)容物。圖10描繪使用激發(fā)光源68和照片接收器70，激發(fā)光源68用于激發(fā)PCR反應(yīng)混合物的熒光成分，照片接收器70通過透鏡66監(jiān)測熒光發(fā)射物。題目為“Fluorescence Detection System (突光探測系統(tǒng))”的共審未決的美國專利申請公開申請第US2006/0152727號包括可實現(xiàn)供PCR組件24使用的熒光探測系統(tǒng)的額外細(xì)節(jié)，該申請出于所有目的以其整體通過引用并入。題目為“Methods and Apparatus for ControllingDNA Amplification (控制DNA擴(kuò)增的方法和裝置)”的共同未決的美國專利申請公開第US2006/018889號提供關(guān)于利用來自光學(xué)探測系統(tǒng)的實時信息控制PCR的信息，該申請出于所有目的以其整體通過引用并入。
如上所述，氣泡可能隨著樣品和載流在填充反應(yīng)瓶56期間和/或在溫度循環(huán)過程期間形成，特別是如果樣品和載流的蒸汽壓接近變性過程發(fā)生的溫度，因此增加了非故意使樣品沸騰的風(fēng)險。例如，典型地，理想變性溫度為大約94攝氏度到大約96攝氏度。然而，例如，在科羅拉多州丹佛的海拔高度的城市，水的沸點(diǎn)大約為97攝氏度。因此，為避免在PCR反應(yīng)在丹佛進(jìn)行期間非故意使樣品沸騰，需要使用非常精確并且因此非常昂貴的熱控制系統(tǒng)。另外，由于載流將溶解的氣體保留在溶液中的能力在溫度循環(huán)的加熱階段期間降低，溶解氣體的氣泡可能在溫度循環(huán)過程期間從溶液中出來。此外，流體內(nèi)氣泡的存在和發(fā)展改變該流體的體積。當(dāng)在溫度循環(huán)期間，氣泡體積變化明顯大于流體和樣品體積變化時，這種情況發(fā)生。氣泡體積的改變導(dǎo)致流體和攜帶的DNA樣品流入和流出反應(yīng)容器。流體流入和流出反應(yīng)容器可改變和/或稀釋反應(yīng)容器內(nèi)DNA樣品和/或PCR反應(yīng)試劑的濃度。
這些氣泡在精度復(fù)制與分析經(jīng)歷PCR反應(yīng)的樣品方面造成若干潛在的困難。舉例來說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣泡常常在透鏡66下方形成，并且這些氣泡可導(dǎo)致照片接收器70不準(zhǔn)確讀取。
為了管理和減輕氣泡形成后任何氣泡可能存在的影響，圖11-13描繪透鏡66的構(gòu)造和關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)，該關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)可用于引導(dǎo)氣泡遠(yuǎn)離透鏡，使得不妨礙讀取的準(zhǔn)確性。圖11示出使用在反應(yīng)瓶56之上的PCR組件的結(jié)構(gòu)中形成的成角度部分80。這個成角度部分80用于引導(dǎo)氣泡遠(yuǎn)離透鏡66之下的區(qū)域，并朝向連接的通向通風(fēng)室58的通風(fēng)通道60。如參照圖11和13最佳可見的，使用淚珠形腔82進(jìn)一步有助于引導(dǎo)氣泡朝向通風(fēng)通道60。
在第一實例中，盡管成角度部分80在氣泡形成后起領(lǐng)導(dǎo)和引導(dǎo)氣泡遠(yuǎn)離透鏡66的作用，但是希望減少產(chǎn)生的氣泡的數(shù)量。此外，希望在氣泡形成后減小任意單個氣泡的體積。這樣，成角度部分80領(lǐng)導(dǎo)和引導(dǎo)產(chǎn)生的氣泡的效率可能被改進(jìn)。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)瓶56下游和反應(yīng)瓶56與通風(fēng)室58之間包括任選的流動限制裝置57(圖6和8)。在一個實施方式中，圖6和8中的流動限制裝置57是被密封——諸如通過加熱、激光、超聲波等焊接——到PCR組件24的滲透膜。在圖6和8中示出的實施方式中，每個滲透膜57與相關(guān)聯(lián)的通風(fēng)室58的長度和寬度基本上是相同的。當(dāng)然，應(yīng)理解滲透膜57的尺寸可以適當(dāng)?shù)剡x擇。另外，滲透膜的位置可以位于不同的位置處，其包括在通風(fēng)通道60的內(nèi)徑之內(nèi)。
在另一個實施方式中，滲透膜157可以形成反應(yīng)瓶56的壁55的至少一部分,如在圖11中所示的。滲透膜157形成壁55的一部分的實施方式的優(yōu)點(diǎn)是其可以在填充和/或增壓過程期間防止PCR反應(yīng)物、樣品和/或載流被沖刷或稀釋到反應(yīng)瓶56外。此外，從溶液中出來的任何氣泡可以經(jīng)過滲透膜并進(jìn)入通風(fēng)通道60。
滲透膜57的實施方式的特征是其是可選擇性滲透的。換句話說，滲透膜57對所選流體是可滲透的，諸如水蒸汽以及從樣品和載流的溶液中出來的之前溶解的氣體。同時，滲透膜阻止和/或防止其它流 體諸如水、載流以及其它液體流動經(jīng)過滲透膜57。因此，氣體能夠流動通過滲透膜57并進(jìn)入通風(fēng)室58，而樣品和載流被保留在反應(yīng)瓶56內(nèi)和取決于滲透膜57的位置在通風(fēng)通道60內(nèi)。
任選地，膜57和它的其它實施方式包括當(dāng)在滲透膜57兩側(cè)之間存在壓力差時最小化或減少滲透膜57的任何膨脹或偏斜的框架或結(jié)構(gòu)59，如圖6所示的。滲透膜57的偏斜如果未被制止，可能引起通風(fēng)室58的相對體積與通風(fēng)室58上游的體積(即反應(yīng)瓶56和相關(guān)聯(lián)的流體通道)的扭曲或改變。換句話說，隨著滲透膜57使大部分的載流膨脹并且樣品流動通過反應(yīng)瓶56,這可能造成大部分的任意PCR反應(yīng)物被沖刷到反應(yīng)瓶56外并進(jìn)入通風(fēng)通道60。相對體積的這種變化可能需要更高或更低的流體壓力，并因此比期望獲得所選壓力更多或更少的流體。因此，框架或支撐結(jié)構(gòu)59諸如肋或格構(gòu)(lattice)任選地被插入滲透膜內(nèi)或滲透膜57的一側(cè)或兩側(cè)上。當(dāng)滲透膜57遭受其兩側(cè)之間的壓力差時，支撐結(jié)構(gòu)59阻擋滲透膜57偏斜。在一些實施方式中，除了物理結(jié)構(gòu)59，滲透膜57任選地包括承載負(fù)荷的纖維矩陣和改進(jìn)滲透膜的彈性和剛度的其它類似增強(qiáng)。
流動限制裝置的另一個實施方式是圖12中示出的位于通風(fēng)通道60內(nèi)的閥67，以及任選地，位于流體輸送通道54內(nèi)的閥69。閥可以由使用者或來自控制器35的命令選擇性地操作以部分地和/或完全地打開以及選擇性地關(guān)閉閥。在任何氣體已被排放到通風(fēng)室58后關(guān)閉閥67允許超過環(huán)境的壓力施加于反應(yīng)瓶56內(nèi)的樣品，這將在下面更詳細(xì)地被描述。閥的實施方式包括由彈性體元件制成的那些閥。
流動限制裝置允許壓力施加于反應(yīng)瓶56內(nèi)包含的樣品和載流。換句話說，反應(yīng)瓶56內(nèi)的壓力可以維持在環(huán)境壓力之上，諸如從大約大氣/環(huán)境壓力到環(huán)境壓力之上大約80磅每平方英寸(psi )，并且在一些實施方式中，壓力甚至更高。在其它實施方式中，流動限制裝置提供維持反應(yīng)瓶內(nèi)的壓力從環(huán)境壓力之上大約15psi到60psi的能力。
在包含滲透膜57的流動限制裝置的實施方式中，以如下方式提供壓力。如上所述，線性移動可移動活塞30，推動樣品和攜帶的載流流動通過流體輸送通道54，進(jìn)入反應(yīng)瓶56，流過通風(fēng)通道60直至其到達(dá)滲透膜57。樣品和載流內(nèi)的氣體、空氣和其它氣泡通過滲透膜，同時該樣品和載流擠壓滲透膜57。超過環(huán)境的壓力可以在反應(yīng)瓶56內(nèi)通過使可移動活塞30進(jìn)一步前進(jìn)而產(chǎn)生。如上面討論的，可移動活塞30的運(yùn)動可以由控制器響應(yīng)不論樣品組件22和/或反應(yīng)瓶56處的力信號或壓力信號進(jìn)行控制。換句話說，使流體相對于滲透膜57加壓用作探測何時所選體積或量的樣品和載流已進(jìn)入反應(yīng)瓶56的方法，因為任意氣體將已經(jīng)透過滲透膜57并進(jìn)入通風(fēng)室58。當(dāng)這發(fā)生并且流體到達(dá)滲透膜57而不能穿過該滲透膜時，立即發(fā)生壓力的可探測的增加。在一些實例中，壓力增加可能是相當(dāng)突然的，從而表明PCR組件24被充分填充以進(jìn)行PCR反應(yīng)。因此，壓力上升部分用作探測樣品和載流何時到達(dá)滲透膜57的方法。
相對于滲透膜57使樣品和載流加壓的另一個益處是測得的壓力和/或力的穩(wěn)定性用作探測泄漏的方法。換句話說，如果在可移動活塞30處測得的壓力和/或力減小，則是暗示泄漏的指示，該泄漏允許流體從樣品組件22和PCR組件24中的至少一個中漏出。這樣的指示將允許使用者調(diào)查原因、運(yùn)行新的樣品和/或采取其他補(bǔ)充措施，特別是如果待測樣品是危險性的話。`
另外，通風(fēng)室58的體積可以部分調(diào)整以獲得反應(yīng)瓶56內(nèi)的期望壓力和由遷移到通風(fēng)室58內(nèi)的任何氣體在通風(fēng)室58內(nèi)產(chǎn)生的壓力。換句話說，在一些實施方式中，通風(fēng)室58的體積是樣品組件22的腔28和反應(yīng)瓶56的尺寸與通風(fēng)室58和反應(yīng)瓶56中獲得的期望或所選壓力以及樣品和載流的類型以及反應(yīng)容器內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)的函數(shù)。通過當(dāng)使用時校準(zhǔn)通風(fēng)室58和反應(yīng)瓶56的體積和每個內(nèi)的壓力，可以管理和優(yōu)化橫跨滲透膜57的壓力差，以改進(jìn)滲透膜57的效率，并確保該壓力差不超過滲透膜57的設(shè)計限制。
在一些實施方式中，通風(fēng)室58的體積充分小，使得氣體進(jìn)入通風(fēng)室58——如上面討論的，產(chǎn)生足夠的背壓以便消除對流動限制裝置如滲透膜57或閥67的需要。在這樣的實施方式中，通風(fēng)室58的設(shè)計是使通風(fēng)通道60向上彎曲并離開進(jìn)入通風(fēng)室58，產(chǎn)生U型管靜水壓力效應(yīng)。在氣體到達(dá)通風(fēng)室58后，U型管防止氣體遷移回到反應(yīng)瓶56中。
在反應(yīng)瓶56內(nèi)對樣品和載流施加超過環(huán)境的壓力提供若干益處。例如，在反應(yīng)瓶56中對樣品施加壓力增加樣品和載流的沸騰溫度。因此，在之前針對科羅拉多州丹佛的描述的實例中，不加壓的樣品在大約97攝氏度沸騰，這個溫度非常接近從大約94攝氏度到大約96攝氏度的所選變性溫度。然而，壓力下的樣品在更高的溫度下沸騰，并且取決于壓力，有時顯著高于97攝氏度。換句話說，因為沸騰溫度被提高顯著遠(yuǎn)離期望的變性溫度，所以摒棄(forego)非常精確并且因此非常昂貴的溫度控制方法是可能的。這樣，由于溶液的沸騰或從溶液中出來而可能不利地產(chǎn)生的氣泡不被產(chǎn)生，并且因此避免如上面所討論的氣泡對光學(xué)掃描系統(tǒng)造成的問題。
建立如所公開的可增壓筒(增壓柱體,pressurizable cartridge)的另一個優(yōu)點(diǎn)是樣品和載流被維持的較高壓力減小存在的氣泡的尺寸，并減少這些氣泡的體積隨著溫度循環(huán)過程發(fā)生而產(chǎn)生的變化。如上所述，氣泡體積的變化引起泵送行為，通過該泵送行為樣品和載流可以通過改變氣泡體積移進(jìn)或移出反應(yīng)瓶。因此，使用壓力使氣泡的體積最小化減小可能導(dǎo)致反應(yīng)瓶56中PCR反應(yīng)物稀釋的該泵送行為。另外，減小氣泡的體積減少了那些氣泡對光學(xué)掃描系統(tǒng)的影響。換句話說，較小氣泡將造成熒光探測系統(tǒng)使用的光信號中的較少噪聲，如上面所討論的。
另一個優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)瓶56任選地由薄塑料制成并具有錐形的形狀，以確保與被用來在溫度循環(huán)過程期間加熱和冷卻反應(yīng)瓶56和其中樣品的加熱/冷卻塊的良好接觸。在反應(yīng)瓶56內(nèi)以較高壓力容納樣品和載流引起反應(yīng)瓶56的薄塑料壁55 (圖11)輕微膨脹并更緊緊地擠壓加熱和冷卻塊，因此改進(jìn)向其傳熱和溫度循環(huán)過程的效率。
圖10描繪與樣品組件關(guān)聯(lián)的聲傳感器72的任選使用。2007年12月17日提交的并且題目為“Ultrasonic Release of DNA and RNA (DNA和RNA的超聲釋放)”的共同未決的美國專利申請第US11/958，299號出于所有目的通過該引用以其整體并入，并且公開了利用聲能從生物材料釋放DNA或RNA的方法和裝置。
如已描述的，PCR過程對DNA操作。當(dāng)必需探測RNA而不是DNA時，在使用PCR之前，必須將RNA首先轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA。2007年4月9號提交、題目為“Rapid Reverse Transcriptionof PCR (PCR的快速逆轉(zhuǎn)錄)”并且通過引用以其整體并入本文的共同未決的美國專利申請第11/733，035號公開了用于從模板RNA形成模板cDNA的方法和裝置，并且進(jìn)一步公開了將這個過程的適當(dāng)成分并入PCR反應(yīng)混合物并在PCR之前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄步驟。
任何合適的循環(huán)變溫器可被用于使樣品和PCR反應(yīng)混合物達(dá)到期望的PCR目標(biāo)溫度，但是目前優(yōu)選使用在與此同時提交的并且名稱為“Rapid Thermocycler (快速循環(huán)變溫器)”的美國專利申請第11/697，917號中公開類型的循環(huán)變溫器，該申請通過引用以其整體并入本文。本發(fā)明的方法和裝置允許以多種形式因素進(jìn)行樣品處理，該形式因素基于任意期望數(shù)量的樣品、可攜帶要求、可使用的PCR探測組件的類型、待使用的化學(xué)成分、處理條件和步驟以及基于此處所教對普通技術(shù)人員將是顯而易見的其它特征而被優(yōu)化。
應(yīng)理解，用于描述本發(fā)明的示例性實施方式的各種方面的附圖是這些示例性實施方式的概略和示意圖，并且不限制本發(fā)明，它們也不必按比例繪制。此外，已給出在以上描述中提出的具體細(xì)節(jié)，以便提供本發(fā)明的徹底理解，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明可以在不具有這些具體細(xì)節(jié)或具有不同細(xì)節(jié)的情況下實施。在許多方面，PCR和循環(huán)變溫器的公知方面已被以具體細(xì)節(jié)描述，以便避免不必要地模糊本發(fā)明。
在不違背本發(fā)明的精神或必要特征的情況下，本發(fā)明可以以其它具體形式體現(xiàn)。所描述的實施方式在所有方面僅僅被認(rèn)為是示范性的和非限制性的。因此，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求指出，而不是由上述描述指出。權(quán)利要求的等同性的含義和范圍內(nèi)出現(xiàn)的所有變化被包含在它們 的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.樣品處理模塊，其包括: PCR組件，所述PCR組件包括至少一個PCR反應(yīng)瓶； 樣品組件，所述樣品組件被配置為在其中容納流體樣品，所述樣品組件被聯(lián)結(jié)到所述PCR組件以便形成封閉系統(tǒng)； 輸送通道，所述輸送通道在所述PCR組件中形成，所述輸送通道與所述PCR反應(yīng)瓶和所述樣品組件流體連通； 增壓裝置，所述增壓裝置被配置為在所述樣品組件中增加所述流體樣品的壓力并引導(dǎo)至少部分所述流體樣品通過所述輸送通道到達(dá)所述PCR反應(yīng)瓶；以及 流動限制裝置，所述流動限制裝置位于所述樣品組件與所述PCR反應(yīng)瓶之間，所述流動限制裝置被配置為能夠使所述壓力的所述增加施加于被輸送至所述PCR反應(yīng)瓶的所述流體樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模塊，進(jìn)一步包括通風(fēng)通道，所述通風(fēng)通道與所述PCR反應(yīng)瓶流體連通。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的模塊，其中所述流動限制裝置是所述通風(fēng)通道與所述PCR反應(yīng)瓶之間的滲透膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模塊，其中所述滲透膜位于所述樣品組件與所述至少一個PCR反應(yīng)瓶之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的模塊，其中所述流動限制裝置是位于所述通風(fēng)通道和所述PCR反應(yīng)瓶之間的閥。
6.樣品處理模塊，其包括: 樣品組件，所述樣品組件被配置為在其中容納流體樣品，所述樣品組件包括被配置為在所述樣品組件中增加所述流體樣品的壓力的增壓裝置；以及 PCR組件，所述PCR組件包括至少一個PCR反應(yīng)瓶，所述PCR組件被配置為接收所述樣品組件以便形成封閉系統(tǒng)，所述PCR組件包括: 輸送通道，所述輸送通道與所述PCR反應(yīng)瓶和所述樣品組件流體連通； 通風(fēng)通道，所述通風(fēng)通道與所述PCR反應(yīng)瓶流體連通；以及 流動限制裝置，所述流動限制裝置位于所述通風(fēng)通道與所述PCR反應(yīng)瓶之間，所述流動限制裝置被配置為能夠使所述壓力的所述增加 施加于被輸送至所述PCR反應(yīng)瓶的所述流體樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)合進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用的方法和裝置。描述了示例性樣品處理模塊，其包括樣品組件和PCR組件，該樣品處理模塊被配置為在高于環(huán)境壓力的壓力下在其中容納樣品。樣品在使用時被添加到樣品組件中，該樣品組件然后被連接到PCR組件。筒的實施方式包括流動限制裝置，該流動限制裝置能夠或幫助在反應(yīng)瓶內(nèi)產(chǎn)生較高的壓力。將樣品引入PCR反應(yīng)瓶，該P(yáng)CR反應(yīng)瓶含有處理該樣品以及如果該DNA在該樣品中存在提供擴(kuò)增的感興趣DNA所必需的PCR反應(yīng)混合物的所有成分。
文檔編號C12M1/34GK103210079SQ201180047876
公開日2013年7月17日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月2日
發(fā)明者B·L·韋特, W·D·比克莫爾, D·K·西廷 申請人:B·L·韋特, W·D·比克莫爾, D·K·西廷