專利名稱：促進(jìn)植物的生長或生物量增加的ggps基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)植物的生長或生物量增加的GGPS基因及其用途，更詳細(xì)地，涉及一種將含有物牛兒基物牛兒基焦磷酸合酶(GGPS, geranylgeranyl pyrophosphatesynthase)基因的重組載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，從而與對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加的方法；一種與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)的轉(zhuǎn)化植物體的制備方法，其包括用含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的步驟；一種由上述方法制備的植物體及種子，所述植物體及種子與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)；及一種包含GPS基因的組合物，其用于和對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加。
背景技術(shù)：
由于全世界人口的增加及農(nóng)業(yè)有用耕地的減少，越來越需要對能夠提高農(nóng)業(yè)效率性方面進(jìn)行研究。此外，韓國的玉米、小麥、大豆等主要糧食作物的大部分依賴于從美國、中國等國家進(jìn)口，并且農(nóng)產(chǎn)品的輸入額是輸出額的幾倍。植物遺傳學(xué)的發(fā)展提供經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)及園藝方面性狀得到提高的作物或植物，對生長及生物量增加的轉(zhuǎn)化植物體的研究開發(fā)有望成為應(yīng)對糧食資源供給減少問題的方案。
到目前為止，已經(jīng)進(jìn)行了大量的用于增加植物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)化植物體的研究開發(fā)，已報(bào)道有大量的生長及生物量增加的多種轉(zhuǎn)化植物體，它們是利用源自多種植物(玉米、大豆、辣椒、擬南芥菜、煙草或水稻等)或微生物(集胞藻、假單胞菌、芽胞桿菌或魚腥藻等)基因制備。
已知GGPS是一種催化以下反應(yīng)的酶，該反應(yīng)是由作為羥甲戊二酸單酰輔酶a (HMG-CoA)還原酶途徑(reductase pathway)中間體的法尼焦憐酸(FPP, farnesylpyrophosphate)向GGPP的生成反應(yīng),在上述反應(yīng)中生成的GGPP為具有抗氧化活性的類胡蘿卜素(carotenoid)的前體物質(zhì)。
在韓國授權(quán)專利第10-0814941號中公開有一種通過轉(zhuǎn)化GGPS基因的大腸菌大量制備作為類胡蘿卜素之一的番茄紅素的方法，在韓國授權(quán)專利第10-0871591號中公開有一種利用源自辣椒的CaPLAl基因制備生物量增加的轉(zhuǎn)化植物體的方法，在韓國公開專利第2003-0011780號中公開有一種利用源自玉米的SH2-REV6-HS基因制備種子生產(chǎn)量及生物量增加的轉(zhuǎn)化植物體 的方法。發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明是為了實(shí)現(xiàn)上述目的而完成的。本發(fā)明人通過確認(rèn)與對照組植物相比，轉(zhuǎn)化源自向日葵的GGPS基因的煙草植物體的生長或生物量增加得到促進(jìn)，從而完成了本發(fā)明。
技術(shù)方案
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種將含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，從而與對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量增加的方法。此外，本發(fā)明提供一種與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)的轉(zhuǎn)化植物體的制備方法，其包括用含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的步驟。此外，本發(fā)明提供一種由上述方法制備的植物體及其種子，所述植物體及種子與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)。此外，本發(fā)明提供一種包含GGPS基因的組合物，其用于和對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加。有益效果利用本發(fā)明的源自向日葵的GGPS基因，能夠制備與對照組植物相比，生長及生物量的增加得到促進(jìn)的植物體，因此認(rèn)為將其應(yīng)用在糧食作物上，有助于解決糧食資源供給減少的問題。


圖1是表示與對照組⑶S-轉(zhuǎn)化煙草品系(T1)相比顯示出快速生長的GGPS-轉(zhuǎn)化煙早品系(T1)的圖片。圖2是對與對照組⑶S-轉(zhuǎn)化品系(T1)相比GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(T1)的植物體生長速度的增加(72%更高的高度)進(jìn)行量化的圖表。圖3是對與對照組⑶S-轉(zhuǎn)化品系(T1)相比顯示出更快速生長(51%更多的活體生物量的增加)的GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(T1)進(jìn)行量化的圖表。圖4是對與對照組⑶S-轉(zhuǎn)化品系(T1)相比顯示出更快速生長(增加多出69%的干燥生物量)的GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(Tl)進(jìn)行量化的圖表。圖5是 表示與野生型(非轉(zhuǎn)化母本，野生型)及比較組(異戊烯基焦磷酸(IPP)異構(gòu)酶；IPP1-T2)煙草植物體相比，GGPS轉(zhuǎn)化煙草品系(T2)的植物高度及生物量快速增加的照片。圖6是表示與對照組⑶S-轉(zhuǎn)化煙草品系(Ttl)相比，在GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(Ttl)中，心皮(seedpod)數(shù)量增加4倍的照片。圖7表示在GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(T1)中，與對照組⑶S-轉(zhuǎn)化煙草品系(T1)相比，開花所需的生長發(fā)育期縮短(縮短25%)的開花期。圖8是表示在GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(Ttl)中，與野生型(非轉(zhuǎn)化母本)煙草植物體相t匕，增加的花/心皮數(shù)量的照片。圖9是對與野生型(非轉(zhuǎn)化母本)植物體相比，在GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(Ttl)中，增加41%的心皮數(shù)量進(jìn)行量化的圖表。圖10是表示在GGPS-轉(zhuǎn)化煙草品系(T2)中，與野生型(非轉(zhuǎn)化母本)煙草植物體相比，增加的花/心皮數(shù)量的照片。
具體實(shí)施例方式為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種與對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加的方法，該方法包括將含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，從而使GGPS基因過表達(dá)的步驟。在本發(fā)明的方法中，上述植物的生長或生物量的增加可以是植物生長速度(growth rate)的增加、早花期(early flowering)的誘導(dǎo)、高度(height)的增加、種子產(chǎn)量(seed yield)的增加或花朵數(shù)量(number of flower)的增加,但不限定于此。優(yōu)選地,上述GGPS基因可以源自向日葵(Helianthus annuus),但不限制基因源(source)。對GGPS蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因組DNA和cDNA均包括在上述GGPS基因內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因可以包括SEQ ID N0.1所示的堿基序列。而且，上述堿基序列的變異體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體地，上述基因可以包括與SEQ ID N0.1的堿基序列分別具有70%以上、更優(yōu)選80%以上、尤其優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列同源性的堿基序列。對于多聚核苷酸的“序列同源性 的％ ”是通過比較兩個以最優(yōu)方式排列的序列和比較區(qū)域得以確認(rèn)。比較區(qū)域中的部分多聚核苷酸序列與對于兩個序列的最優(yōu)排列的參考序列(不包括添加或者刪除)相比，可包含添加或者刪除(即間隙(gap))。術(shù)語“重組”是指細(xì)胞復(fù)制異種核酸或表達(dá)上述核酸或表達(dá)由肽、異種肽或異種核酸編碼的蛋白質(zhì)細(xì)胞。重組細(xì)胞能將在上述細(xì)胞的天然形態(tài)中未被發(fā)現(xiàn)的基因或者基因片段表達(dá)為正義引物或者反義引物形態(tài)中的一個。而且，重組細(xì)胞可以表達(dá)從天然狀態(tài)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，但是上述基因是發(fā)生變形的，是通過人為的手段再導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的基因。本發(fā)明中，上述GGPS基因序列可以插入重組表達(dá)載體內(nèi)。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母菌質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其它載體。大體上，只要是在宿主內(nèi)能夠復(fù)制及穩(wěn)定化的質(zhì)粒及載體，均可使用。上述表達(dá)載體的重要特性在于，具有復(fù)制原點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因及翻譯控制單元(translation control element)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可以構(gòu)建包括GGPS基因序列及合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)節(jié)信號的表達(dá)載體。上述方法包括試管內(nèi)的重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)及活體內(nèi)重組技術(shù)等。為了引導(dǎo)mRNA的合成，上述DNA序列可以有效地連接到表達(dá)載體內(nèi)的合適的啟動子上。而且，表達(dá)載體可以包括作為翻譯起始部位的核糖體結(jié)合部位及轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明的重組載體的優(yōu)選例為T1-質(zhì)粒載體，其存在于根癌土壤桿菌等合適的宿主中時(shí)，能夠?qū)⑵渥陨淼囊徊糠?，所謂的T-區(qū)域轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。其它類型的T1-質(zhì)粒載體(參見EP0116718B1號)作為能夠?qū)⒛壳暗闹参锛?xì)胞，或者雜合DNA適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)移至植物基因組內(nèi)的，能夠生產(chǎn)出新型植物的原生質(zhì)體，用于轉(zhuǎn)移雜合DNA序列。T1-質(zhì)粒載體最優(yōu)選的形態(tài)是EP0120516B1號及美國專利第4，940, 838號中要求保護(hù)的所謂雙元(binary)載體。本發(fā)明中的可用于將基因?qū)胫参锼拗髦械钠渌m合的載體可以選自源自雙鏈植物病毒(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV))及單鏈病毒、雙粒病毒等病毒載體，例如可以選自非完整性植物病毒載體。這些載體特別有利于難以適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)化植物宿主時(shí)使用。優(yōu)選地，上述重組載體可以是PBIlOl載體，但不限定于此。表達(dá)載體優(yōu)選包含一個以上的選擇性標(biāo)記。上述標(biāo)記作為具有能夠用常規(guī)的化學(xué)方法篩選的特性的核酸序列，即，包括能將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中區(qū)分出來的所有的基因。例如有草甘膦(glyphosate)或草丁膦(phosphinothricin)等除草劑抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、G418、博來霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐受性基因,但不限定于此。在本發(fā)明的重組載體中，啟動子可以是CaMV35S、肌動蛋白、泛素、pEMU、MAS或組蛋白啟動子，但不限定于此。所謂“啟動子”是指始于結(jié)構(gòu)基因的DNA上游區(qū)域，為了開始轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶結(jié)合的DNA分子?！爸参飭幼印笔且环N在植物細(xì)胞內(nèi)能夠開始轉(zhuǎn)錄的啟動子?！敖M結(jié)構(gòu)型(constitutive)啟動子”是一種在大部分的環(huán)境條件及發(fā)育狀態(tài)或細(xì)胞分化下具有活性的啟動子。因?yàn)檗D(zhuǎn)化體的篩選能夠在各階段、通過各種組織形成，因此本發(fā)明優(yōu)選結(jié)構(gòu)型啟動子。因此，不限制結(jié)構(gòu)型啟動子的選擇可能性。
在本發(fā)明的重組載體中，可以使用普通的終止子，例如有胭脂堿合酶(N0S)、水稻α -淀粉酶RAmylA終止子、菜豆堿(phaseoline)終止子、根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章魚堿(Octopine)基因的終止子等,但不限定于此。關(guān)于終止子的必要性，一般被認(rèn)為是這些區(qū)域能促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的確定性及效率。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容中使用終止子是非常適合的。
能夠使本發(fā)明的載體穩(wěn)定在原核細(xì)胞內(nèi)并能夠連續(xù)地克隆及表達(dá)的宿主細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域公知的任何宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌(E.coli) JM109、大腸桿菌BL21、大腸桿菌RR1、大腸桿菌LE392、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776、大腸桿菌W3110、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌等芽孢桿菌屬菌株，還可以是鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌及多種假單胞菌屬等腸桿菌科菌株等。
此外，將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞的情況下，可以使用酵母(釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae))、昆蟲細(xì)胞、人類細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞系(中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary))、W138、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、非洲綠猴腎細(xì)胞(C0S_7)、293、HepG2.3T3.RIN及狗腎(MDCK)細(xì)胞系)及植物細(xì)胞等作為宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選植物細(xì)胞。
作為將載體運(yùn)送到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法，在宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞的情況下，可以通過 CaCl2 方法、Hanahan 方法(Hanahan, D.，J.Mol.Biol.，166:557-580 (1983 (Hanahan,D.，分子生物學(xué)雜志，166:557-580 (1983)))及電穿孔方法等來實(shí)施。此外，在宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞的情況下，可以通過顯微注射法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、二乙氨基乙醇(DEAE)-右旋糖酐處理法及基因槍等方法，將載體注入到宿主細(xì)胞內(nèi)。
植物的轉(zhuǎn)化是指將DNA轉(zhuǎn)移到植物的任意的方法。這些轉(zhuǎn)化方法不一定需要經(jīng)過再生及(或)組織培養(yǎng)期。目 前，植物種的轉(zhuǎn)化不僅對于雙子葉植物，包括單子葉植物量子的植物種也非常普遍。原則上，任意的轉(zhuǎn)化方法均可被用于將本發(fā)明的雜合DNA導(dǎo)入到祖細(xì)胞中。所述方法可選自對于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.etal.，1982，Nature296,72-74;Negrutiu 1.et al., Junel987, Plant Mol.Biol.8,363-373 (Krens,F.A.等人，1982，自然296，72-74; NegrutiuL等人，1987年6月，植物分子生物學(xué)8，363-373))、原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.et al.，1985Bio/Technol.3，1099-1102(ShillitoR.D.等人，1985生物/技術(shù)3，1099-1102))、作為植物元素的顯微注射法(Crossway A.et al., 1986,Mol.Gen.Genet.202,179-185 (克洛斯威 A.等人，1986，分子遺傳學(xué)和基因組202，179-185))、各種植物元素的(DNA或者RNA-涂布的)微粒轟擊法(KleinT.M.et al., 1987,Nature327, 70 (Klein T.M.等人，1987，自然 327，70))、依據(jù)植物的浸潤或者成熟花粉或者小孢子轉(zhuǎn)化的，根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(非完整性)中依據(jù)病毒的感染(ΕΡ0301316號)等。本發(fā)明的優(yōu)選方法包含土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。更為優(yōu)選的是利用EP Α120516號及美國專利第4，940，838號所記載的所謂雙元載體技術(shù)的方法。
此外，本發(fā)明提供一種與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)的轉(zhuǎn)化植物體的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:用含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；及從上述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中在分化植物。本發(fā)明的方法包括用本發(fā)明的重組載體對植物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟，上述轉(zhuǎn)化可以通過例如根癌土壤桿菌介導(dǎo)。此外，本發(fā)明的方法包括從上述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中對轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行再分化的步驟。從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中對轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行再分化的方法可以使用本領(lǐng)域公知的任意方法。本發(fā)明方法中的GGPS基因如上所述。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞要再分化成完整植物。來自愈傷組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)的用于成熟植物的再分化的技術(shù)為本領(lǐng)域所公知。此外，本發(fā)明提供一種由含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化的植物體及種子，所述植物體及種子與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)。優(yōu)選地，上述GGPS基因可以由SEQ ID N0.1的堿基序列構(gòu)成。優(yōu)選地，上述植物體可以是雙子葉植物，但并不限定于此。上述雙子葉植物可為巖梅科(裂緣花科，Diapensiaceae).榿葉樹科(Clethraceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、杜鹽花科(Ericaceae)、紫金?？?Myrsinaceae)^ 報(bào)春花科(Primulaceae)、藍(lán)雪科(Plumbaginaceae)、柿樹科(Ebenaceae)、安息香科(Styracaceae)、山帆科、灰木科(Symplocaceae)、木扉科(木扉，Oleaceae)、馬錢科(Loganiaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、夾竹桃科(亞洲絡(luò)石，Apocynaceae)、蘿摩科(Asclepiadaceae)、菌草科(Rubiaceae)、花蔥科(Polemoniaceae )、旋花科(Convolvulaceae )、紫草科(Boraginaceae )、馬鞭草科(Verbenaceae )、唇形科(Labiatae )、煎科(Solanaceae )、玄參科(Scrophulariaceae )、紫蔵科(Bignoniaceae)、爵床科(Acanthaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、列當(dāng)科(Orobanchaceae)、苦苣笞科(Gesneriaceae)、涯藻科(Lentibulariaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、車前草科(Plantaginaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、五?；?Adoxaceae)、敗醫(yī)科(Valerianaceae)、川續(xù)斷科(Dipsacaceae)、梧?？?Campanulaceae)、菊科(Compositae)、楊梅科(Myricaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、楊柳科(Salicaceae)、禪木科(Betulaceae)、山毛棒科(殼斗科，F(xiàn)agaceae)、偷科(Ulmaceae)、?？?Moraceae)、尊麻科(Urticaceae)、植香科(Santalaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、寥科(寥，Polygonaceae)^ 商陸科(商陸，Phytolaccaceae)^紫榮莉科(Nyctaginaceae)、番杏科(Aizoaceae)、馬齒覓科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、黎科(Chenopodiaceae)、覓科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、木蘭科(Magnoliaceae)、八角科(Illiciaceae)、棒科(Lauraceae)、連香樹科(Cercidiphyllaceae)、毛莫科(Ranunculaceae)、小梁科(Berberidaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科( 藤，Menispermaceae)、睡蓮科(Nymphaeaceae)、金魚藻科(CeratophylIaceae)、藥菜科(Cabombaceae)、三白草科(Saururaceae)、胡椒科(Piperaceae)、金粟蘭科(Chloranthaceae)、馬覽鈴科(Aristolochiaceae)、稱猴桃科(Actinidiaceae)、荼科(山荼科，Theaceae)、藤黃科(Guttiferae)、茅膏菜科(Droseraceae)、S粟科(Papaveraceae)、白花菜科(Capparidaceae)、十字花科(十字花，Cruciferae)、洋桐木科(懸鈴 木科，Platanaceae)、金縷梅科(金縷梅，Hamamelidaceae)、景天科(景天，Crassulaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)、海桐花科(Pittosporaceae )、蓄薇科(Rosaceae )、 科(Leguminosae )、酔衆(zhòng)草料(Oxali daceae)、牛兒苗科(Geraniaceae)、旱金蓮科(Tropaeolaceae)、蔡黎科(Zygophyllaceae)、亞麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、水馬齒科(Callitrichaceae)、蕓香料(Rutaceae)> 苦木科(Simaroubaceae)、棟科(Meliaceae)、遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、械樹科(柄樹科，Aceraceae)、無患子科(Sapindaceae)、七葉樹科(hippocastabaceae)、清風(fēng)藤科(Sabiaceae)、鳳仙花科(水鳳仙，Balsaminaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、衛(wèi)矛科(衛(wèi)茅科，Celastraceae)、旌節(jié)花科(Staphyleaceae)、黃楊科(Buxaceae )、巖高蘭科(Empetraceae )、鼠李科(Rhamnaceae )、葡萄科(Vitaceae )、杜英科(Elaeocarpaceae)、鍛樹科(Tiliaceae)、錦奏科(Malvaceae),梧桐科(Sterculiaceae),瑞香科(瑞噴鼻科，ThymeIaeaceae)> 胡顏?zhàn)涌?Elaeagnaceae)、大風(fēng)子科(Flacourtiaceae)、堇菜科(Violaceae)、西番蓮科(Passifloraceae)、徑柳科(Tamaricaceae)、溝繁縷科(Elatinaceae)、海棠科(Begoniaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、千屈菜科(千屈菜，Lythraceae)> 石槽科(Punicaceae)、柳葉菜科(Onagraceae)>小二仙草科(Haloragaceae)、八角楓科(Alangiaceae)、山茱萸科(四照花科，Cornaceae)、五爺科(五科加，Araliaceae)或者傘形科(傘形花科)(Umbelliferae(Apiaceae))，但不局限于此。此外，本發(fā)明提供一種包含GGPS基因的組合物，其用于和與對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加。在本發(fā)明的組合物中，上述GGPS基因可以由SEQ IN N0.1的堿基序列構(gòu)成。本發(fā)明的組合物含有GGPS基因作為有效成分，通過將上述基因GGPS轉(zhuǎn)化到植物體中，與對照組植物相比，能夠促進(jìn)植物體的生長或生物量的增加。上述植物如上所述。
下面，通過實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明。但是，下述實(shí)施例只是為了例示本發(fā)明，本發(fā)明的內(nèi)容并不限定于下述實(shí)施例。
植物材料
在塑料容器內(nèi)，在含有3% (w/v)蔗糖和0.3% (w/v)植物凝膠的穆拉西格(Murashige)及斯 庫格(Skoog) (1962) (MS)-基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長的試管內(nèi)培育的煙草植物體((Nicotiana tabacum xanthi)獲自高麗大學(xué)的申正燮教授。植物在23°C下,在由16小時(shí)的明亮及8小時(shí)的黑暗狀態(tài)構(gòu)成的長日照條件下維持1-2個月左右，所述16小時(shí)的明亮通過20 μ Hi0InT2iT1光強(qiáng)的40W冷白及富貴紅熒光燈(1:1混合)來實(shí)現(xiàn)。從試管內(nèi)培養(yǎng)的煙草葉上，在無菌狀態(tài)下切下外植體(直徑約為0.5cm)用于轉(zhuǎn)化。
葉子外植體的再分化
為了形成新枝，將剪切的葉子的外植體分別轉(zhuǎn)移到具有30ml培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)基含有MS鹽和3%蔗糖、1%麥芽糖、2mg/l丙烯酸丁酯(BA)、0.2mg/l萘乙酸(NAA)及0.2%植物凝膠(pH5.8)。為了測定生長調(diào)節(jié)劑的效果，將MS培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為NAA(0.2及0.5mg/l)及BA濃度(維持2mg/l)的組合。這些激素的組成基于對俄羅斯蒲公英的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(Bae et al.，Plant Cell Tiss 0rg2005,80:51-57) (Bae 等人，植物細(xì)胞、組織與器官培養(yǎng)2005，80:51-57))。培養(yǎng)條件是在20 μ molm^s^1光強(qiáng)的40W冷白及富貴紅熒光燈(1:1混合)下的16小時(shí)的光周期下，維持在23± 1°C。為了生根，將生出新枝(不定芽)的葉子的外植體在含有在1/2MS鹽、1.5%蔗糖、0.05mg/l NAA及0.2%植物凝膠(pH5.8)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
分別含有GGPS及⑶S基因的pBI121的GV3101轉(zhuǎn)化
根據(jù)冷凍解凍的方法對具有質(zhì)粒pBI121的根癌土壤桿菌菌株GV3101進(jìn)行分離，所述質(zhì)粒PBI121分別含有葡萄糖醛酸酶(⑶S)和GGPS ((Weigel and Glazebrook,Arabidopsis:A laboratory Manual.Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,2002，125-127 (Weigel, Glazebrook，擬南芥:實(shí)驗(yàn)手冊。冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，2002，125-127))。GGPS基因從向日葵cDNA表達(dá)庫中進(jìn)行擴(kuò)增，并在CaMV35S啟動子的調(diào)節(jié)下，向pBI121載體的XbaI及BamHI位點(diǎn)克隆。使用含有GUS的pBI121作為對照組。在含有50mg/l的利福平和50mg/l的卡那霉素的固體YEP培養(yǎng)基中篩選具有質(zhì)粒pBI121的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化體，所述質(zhì)粒分別含有GGPS及GUS基因。向農(nóng)桿菌GV3101的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化是從卡那霉素抗性GV3101菌落分離質(zhì)粒后，使用GGPS特異性引物，通過PCR進(jìn)行確認(rèn)。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化協(xié)議(Bae等人，植物細(xì)胞、組織與器官培養(yǎng)2005，80:51_57 (Baeet al.，Plant Cell Tiss 0rg2005,80:51-57))
1.葉子的外植體從實(shí)驗(yàn)管內(nèi)培養(yǎng)的煙草幼苗上切取，在光照條件下，在預(yù)培養(yǎng)基(MS 鹽、3% 鹿糖、1% 葡萄糖、0.2mg/l ΝΑΑ、2.0mg/lBA、50mg/l 舌甘菜堿(betaine)、0.3% 植物凝膠及0.1mM乙酰丁香酮，pH5.2)中培養(yǎng)6天左右。
2.農(nóng)桿菌在28°C下，在含有100mg/l卡那霉素及50mg/l利福平的50ml YEP培養(yǎng)基中晝夜培養(yǎng)至0D600nm的值為0.6-0.8。
3.對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，沉淀物(pellet)在28 °C下，在50ml的誘導(dǎo)溶液(1/2MS鹽、3%鹿糖、1%葡萄糖、50mg/l舌甘菜堿、0.5g/lMES及0.1mM乙酰丁香酮，pH5.2)中懸浮I小時(shí)左右。
4.在常溫下，將預(yù)培養(yǎng)的煙草葉外植體，輕輕地?cái)嚢?5分鐘，并浸潰到最終的細(xì)菌培養(yǎng)液中，在滅菌的濾紙上簡單地晾干，在25°C下，將用誘導(dǎo)溶液潤濕的過濾紙覆蓋到外植體上，從而能夠維持共培養(yǎng)基(MS鹽、3%蔗糖、1%葡萄糖、50mg/l甜菜堿、0.2mg/l NAA、2.0mg/1 ΒΑ、0.3%植物凝膠及0.2mM乙酰丁香酮，pH5.2)的水分，并在黑暗條件下培養(yǎng)3天左右。
5.用清洗液(1/2MS鹽、1.5%鹿糖、0.25g/l抗壞血酸及250mg/l頭孢噻HpH5.8)清洗后，將外植物體移植到新枝誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS鹽、3%蔗糖、1%麥芽糖、0.2mg/l NAA、2mg/lΒΑ、0.3%植物凝膠及250mg/l頭孢噻肟，pH5.8)中。
6.一周后，為了選擇性再分化，在含有100mg/l卡那霉素的新枝誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)外植體。
7.外植體在3-5周期間，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇性培養(yǎng)基中。
8.將生出新枝的外植體移植到含有100mg/l卡那霉素的生根培養(yǎng)基(1/2MS鹽、1.5% 蔗糖、0.05mg/l NAA,0.2% 植物凝膠、pH5.8、250mg/l 頭孢噻肟)中。
9.在形成根后，為了強(qiáng)化植物體的耐受性(hardening)，在移植到土壤3周之后，最終移植到溫室中。
轉(zhuǎn)化植物體的栽培
將轉(zhuǎn)化植物體 轉(zhuǎn)移到溫室中，用聚乙烯(有幾個窟窿的)覆蓋一周以防止水分的流失。使植物能夠生長2周左右，豎起鐵支撐桿使植物能夠垂直地生長。及時(shí)地供水以使植物能夠茁壯地生長。為了搜集關(guān)于花的個數(shù)、開花期、高度、生物量及種子的收獲量的數(shù)據(jù)，定期查看溫室。在其成熟時(shí)，搜集種子并收獲植物。
收集種子并在28°C下干燥I周左右。此外，為了計(jì)算生物量，在65°C下，將收獲的植物干燥10天左右。所搜集的種子用10% (v/v)次氯酸鈉(sodium hypochlorite)+0.05%(v/v)吐溫-20處理20分鐘，用滅菌水清洗5次。在含有卡那霉素(100mg/l)的MS培養(yǎng)基中使種子發(fā)芽，在4°C的黑暗條件下維持3天左右，之后在23°C下，在由16小時(shí)的明亮及8小時(shí)的黑暗狀態(tài)構(gòu)成的長日照條件下維持15天左右，所述16小時(shí)的明亮通過20 μ Hi0InT2iT1光強(qiáng)的40W冷白及富貴紅熒光燈(1:1混合)來實(shí)現(xiàn)。從培養(yǎng)基中篩選出茁壯的植物體，并移植到土壤中。使植物體在溫室中健康的條件下生長，定期地查看溫室并搜集數(shù)據(jù)。
酵母品系的篩選
為了獲得T2酵母品系，從卡那霉素選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化的煙草植物體(T0代)。在I；、T1及T2再分化植物體中均觀察到表現(xiàn)型特性。
實(shí)施例1:煙草的轉(zhuǎn)化及再分化
使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，生成對外來基因GGPS的3個獨(dú)立的煙草轉(zhuǎn)化品系。為了測定誘導(dǎo)不定芽的能力，對固定的BA濃度(2.0mg/1)和NAA的組合(0.2,0.5mg/l)進(jìn)行研究。基于顯示新枝形成的外植體的百分比及再分化的葉子形態(tài)，2mg/l BA及0.2mg/l NAA的組合最適合于煙草新枝的再分化。根的再分化不需要其它的細(xì)胞分裂素，在含有0.05mg/I NAA的MS培養(yǎng)基中顯著地得到誘導(dǎo)。上述轉(zhuǎn)化效率在20 50%的范圍內(nèi)。將再分化的新枝移植到含有100mg/l卡那霉素的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。在I個月之后觀察到這些新枝的根的形成。上述根的形成的比例約為90%左右。用流水清洗生根植物體后，在23°C下，在由16小時(shí)的明亮及8小時(shí)的黑暗狀態(tài)構(gòu)成的長日照條件下，為了根系的訓(xùn)化及壯實(shí)的發(fā)育，將其種植在土壤中，維持45天，所述16小時(shí)的明亮通過20 μ Hi0InT2iT1光強(qiáng)的40W冷白及富貴紅熒光燈(1:1混合)來實(shí)現(xiàn)。在45天之后，本發(fā)明人可以從植物中觀察到生長良好的根系，之后，將上述植物轉(zhuǎn)移到溫室中。
實(shí)施例2:與對照組(⑶S-轉(zhuǎn)化煙草)及野生型(非轉(zhuǎn)化母本)植物相比，GGPS-轉(zhuǎn)化煙草的高度及生物量快速 增加
過表達(dá)GGPS基因的轉(zhuǎn)化的煙草與對照組的煙草植物體進(jìn)行對比時(shí)，從整體上表現(xiàn)出快速的生長及發(fā)育。GGPS-T1-轉(zhuǎn)化的植物體與⑶S-Tl-轉(zhuǎn)化的植物體相比，顯示出生長得到促進(jìn)(高出72%的高度)(表1，圖2)。在與⑶S-T1-煙草品系(17cm)進(jìn)行對比時(shí)，轉(zhuǎn)化的GGPS-T1-煙草品系明顯具有更高的高度(29cm)(圖1)。此外，從T2轉(zhuǎn)化的煙草品系中也可以看到相同的現(xiàn)象(圖5)。因?yàn)镻值非常小(p=0.0013，表1)，因此原始數(shù)據(jù)非常具有顯著性。
表I對照組和GGPS-轉(zhuǎn)化的煙草植物體高度的比較
植物體j高度(cm)/植物體 對照組(GUS)16.67 + 2.52 GGPS-4、5、6 品系(T1)28.67 + 0.58
V 實(shí)驗(yàn)(p=0.0013)，(時(shí)間(Age) -50 天)
在對比轉(zhuǎn)化-GGPS-T1-品系及對照組(⑶S-T1-品系)活體及干燥的生物量時(shí)，與對照組煙草植物體相比，轉(zhuǎn)化-GGPS-煙草品系表現(xiàn)出多出51%的生物體生物量(表2，圖3)及多出69%的干燥生物量(表3，圖4)。不僅是活體的生物量，在與干燥生物量的比較相關(guān)的數(shù)據(jù)等各種情況下，因P值非常小，因此非常具有顯著性。
表2對照組及轉(zhuǎn)化煙草植物體的新鮮的(fresh)生物量的比較
權(quán)利要求
1.一種與對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加的方法，該方法包括將含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，從而使GGPS基因過表達(dá)的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物的生長或生物量的增加為植物生長速度的增加、早花期的誘導(dǎo)、高度的增加、種子產(chǎn)量的增加或花朵數(shù)量的增加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述GGPS基因由SEQID N0.1的堿基序列構(gòu)成。
4.一種與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)的轉(zhuǎn)化植物體的制備方法，其包括以下步驟:用含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；及從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再分化植物。
5.一種由權(quán)利要求4所述的方法制備的植物體，所述植物體與對照組相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物體，其特征在于，所述植物體為雙子葉植物。
7.權(quán)利要求5所述植物體的種子。
8.一種包含GGPS基因的組合物，所述組合物與對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述GGPS基因由SEQID N0.1的堿基序列構(gòu)成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述植物為雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，從而與對照組植物相比，在短時(shí)間內(nèi)增加植物的生長或生物量的方法；一種與對照組植物相比，在短時(shí)間內(nèi)生長或生物量得到增加的轉(zhuǎn)化植物體的制備方法，其包括用含有GGPS基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的步驟；一種由上述方法制備的植物體及其種子，所述植物體及種子與對照組植物相比，生長或生物量的增加得到促進(jìn)；以及一種包含GGPS基因組合物，其用于和對照組植物相比，促進(jìn)植物的生長或生物量的增加。
文檔編號C12N15/52GK103153043SQ201180048801
公開日2013年6月12日 申請日期2011年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月8日
發(fā)明者柳炳泰, 桑迪普·庫瑪爾塔塔 申請人:韓國生命工學(xué)研究院