專利名稱：一種含抗菌肽的組合物作為食品防腐劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對使食物腐敗變質(zhì)的微生物體的抗菌劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品保藏是預(yù)防或抑制由內(nèi)源性化學(xué)降解/酶降解引起的和/或由微生物導(dǎo)致或微生物加速的食品腐敗變質(zhì)的食品處理方法?，F(xiàn)有技術(shù)已有大量關(guān)于食品保藏技術(shù)，有些可以抑制內(nèi)源過程(如抗氧化劑)，有些是抑菌過程(如抗菌劑)，還有一些同時抑制這兩種過程(如冷凍)。用于抑制食品腐敗變質(zhì)的化合物通常被稱為防腐劑，例如，可能是抗氧化劑或抗菌劑。特殊的食品保藏技術(shù)包括干燥，加熱，冷藏，冷凍，滲透抑制(如使用糖或鹽)，真空包裝，罐頭和瓶 裝，膠凍化，裝罐，裝壺，電離輻射，脈沖電場處理，高壓食品保藏，以及超高水壓食品保藏，使用抗氧防腐劑，和/或使用抗菌性防腐劑(如二氧化硫，二氧化碳，乙醇，醋酸，檸檬酸，乳酸，山梨酸，苯甲酸鹽，硝酸鹽和亞硝酸鹽，亞硫酸鹽，丙酸鈣鹽和甲基氯異塞唑啉酮)。盡管現(xiàn)今使用了相對大量的食品保藏技術(shù)，但仍有需要開發(fā)一種新的抗菌防腐齊U。這是因?yàn)樵S多現(xiàn)有技術(shù)中能有效針對微生物的防腐技術(shù)還很欠缺，還因?yàn)橛绕涫乾F(xiàn)有許多抗菌防腐劑的效力和/或安全的問題。許多食品防腐技術(shù)試圖建立一個不利于微生物生長的環(huán)境，這對極端環(huán)境可生存的微生物是無效的(如假單胞菌(Pseudomonas)能在低溫下生長；凝結(jié)芽孢桿(Bacilluscoagulans)是耐高溫且酸耐受的；許多曲霉(Aspergillus)表現(xiàn)貧營養(yǎng)狀態(tài)；接合酵母(Zygosaccharomyces)具有高干燥耐受性)。許多現(xiàn)有抗菌防腐劑具有適度活性，特別針對先天或后天獲得性抗性的微生物，和/或具有窄譜的微生物。例如，接合酵母對乙醇，醋酸，山梨酸，苯甲酸和二氧化硫都具有高耐受性。此外，現(xiàn)有抗菌防腐劑都與各種副作用相關(guān)，如呼吸問題或衰老和殘疾(ADD)。在特殊實(shí)例中，二氧化硫?qū)獯颊叩闹夤芫叽碳ば?，亞硝酸鹽是潛在致癌的，苯甲酸鹽與各種過敏、哮喘、皮疹以及腦損傷有關(guān)。此外，抑制食品中微生物生長的有效的技術(shù)如低pH值或低水活性往往因?yàn)椴槐幌M(fèi)者接受(如有酸味)或?qū)】涤胸?fù)面影響(如高鹽或高糖)。本發(fā)明目的在于探求所有以上問題的解決方案，并尤其例如，提供一種針對微生物具有有效和廣譜活性并同時具有低毒性的新的抗菌劑。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)來自羽扇豆屬(Lupinus)的Blad多肽，針對能導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的多種不同的細(xì)菌和真菌生物表現(xiàn)出有效的抗菌活性。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)Blad多肽是非毒性的，因此Blad是作為抗菌食品防腐劑的極佳的化合物。因此，本發(fā)明提供了一種包括抗菌多肽的組合物在預(yù)防或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)中的應(yīng)用，其中所述抗菌多肽包含Blad或其活性變體。優(yōu)選的，所述微生物為細(xì)菌(優(yōu)選的選自假單胞菌(Pseudomonas)或芽孢桿菌(Bacillus)的導(dǎo)致食品腐敗的種屬)或?yàn)檎婢?優(yōu)選的選自以下導(dǎo)致食品腐敗的種屬:鏈格孢菌(Alternaria)，曲霉(Aspergillus),鍵刀霉(Fusarium),葡萄抱菌(Botrytis),炭疽菌(Colletotrichum),酵母菌(Saccharomyces),克魯維酵母(Kluyveromyces)和接合酵母(Zygosaccharomyces))。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述食品源自、或提供、或?yàn)椋?、?jiān)果、蔬菜、種子、糖、奶制品、液體食品或糊狀食品、肉、魚或面包。
在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述食品為草莓，優(yōu)選的，其中所述微生物為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)或尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum),優(yōu)選的為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中,所述組合物進(jìn)一步包括螯合劑。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)的方法，包括給有需要的食品施以有效劑量的包含抗菌多肽的組合物，其中所述抗菌多肽包含Blad或其活性變體的。


本發(fā)明將參考附圖進(jìn)行說明，其中:圖1顯示白花羽扇豆(Lupinus albus) β_球蛋白前體編碼序列(SEQ ID NO:1)；以及圖2顯示對應(yīng)于Blad的β -球蛋白前體的內(nèi)部片段的編碼序列(SEQ ID NO:3)。
具體實(shí)施例方式BladBlad(" ban da de Lupinus albus doce" -band from sweet L.albus,名稱源自白花羽扇豆)是以β -球蛋白的穩(wěn)定的中間的分解產(chǎn)物命名的，是羽扇豆屬(Lupinus)的種子中主要的儲存蛋白。Blad為一個20kD的多肽，由173個氨基酸殘基組成，并由羽扇豆(Lupinus)中的β-球蛋白前體的編碼基因(1791個核苷酸，GenBank中儲存的收錄編號為AAS97865)的內(nèi)部片段(519個核苷酸，GenBank中儲存的收錄編號為ΑΒΒ13526)所編碼。當(dāng)編碼Blad末端序列的引物用于擴(kuò)增羽扇豆DNA基因組序列時，可以得到一個大約620bp的產(chǎn)物，表明在編碼Blad的基因片段中有一個內(nèi)含子存在。天然存在的Blad是210kD的低聚糖的主要成分，該低聚糖在開始發(fā)芽之后的4-12天，特異的聚集于羽扇豆的子葉中(隨后β_羽扇豆球蛋白發(fā)生密集的限制性蛋白水解)。同時，所述低聚物被糖基化，天然存在的Blad是非糖基化的。含Blad的寡聚糖由多個多肽組成，其中主要的幾個分子量分別為
14、17、20、32、36、48和50kD。該20kD的多肽Blad，是至今為止低聚物中最豐富的多肽，并且可能是唯一一個具有凝集素活性的多肽。天然存在的Blad在8天齡植物子葉總蛋白中占大約80%。圖1顯示所述白花羽扇豆(L.albus) β -球蛋白前體的編碼序列(SEQ ID NO:1)。β -球蛋白母亞基編碼序列位于70-1668位殘基。編碼的533氨基酸殘基β -球蛋白母亞基(SEQ ID NO:2)為:
MGKMRVRFPTLVLVLGIVFLMAVSIGIAYGEKDVLKSHERPEEREQEEWQPRRQRP QSRREEREQEQEQGSPSYPRRQSGYERRQYHERSEQREEREQEQQQGSPSYSRRQRNPY HFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNLILPKHSDADYVL VVLNGRATIIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSSYILNPDDNQKLRffKLAIPINNPGYFY DFYPSSKDQQSYFSGFSRNTLEAFNTRYEEIQRIILGNEDEQEYEEQRRGQEQSDQDEGVIVIVSKKQIQKLTKHAQSSSGKDKPSDSGPFNLRSNEPIYSNKYGNFYEIPDRNPQVQDLNI SLTYIKINEGALLLPHYNSKAIYWWDEGEGNYELVGIRDQQRQQDEQEEKEEEVIRYSA RLSE⑶IFVIPAGYPISINASSNLRLLGFGINADENQRNFLAGSKDNVIRQLDRAVNELTFP GSAEDIERLIKNQQQSYFANGQPQQQQQQQSEKEGRRGRRGSSLPF圖2顯示了對應(yīng)Blad的β -球蛋白前體內(nèi)部片段的編碼序列(SEQ ID NO:3)。該Blad 多肽(SEQ ID NO:4)為:RRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLI LPKHSDADYVLVVLNGRATIIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSSYILNPDDNQKLRWK LAIPINNPGYFYDFYPSSKDQQSYFSGFSRNTLEAFNTRYEEIQRIILGNED本發(fā)明涉及一種包含含有Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物。因此，其涉及一種含抗菌多肽的組合物，該抗菌多肽含SEQ ID NO:4的多肽序列或其活性變體。在其中可選的具體實(shí)施例中，該組合物主要由含blad或其活性變體的抗菌多肽組成，和/或所述抗菌多肽主要由blad或其活性變體組成。在進(jìn)一步的具體實(shí)施例中，所述含(或主要包含)blad或其活性變體的抗菌多肽可能以單獨(dú)的方式使用。

Blad的活性變體是指保持了作為抗菌劑的能力(即具有抗菌活性-參照以下關(guān)于該活性水平和如何測量的說明)的Blad變體?！癰lad的活性變體”包括在其范圍內(nèi)的一個SEQ ID N0:4片段。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，SEQ ID NO:4片段為選自為SEQ ID NO:4序列長度的至少10%，優(yōu)選的為至少其長度的20%，優(yōu)選的為至少其長度的30%，優(yōu)選的為至少其長度的40%，優(yōu)選的為至少其長度的50%，優(yōu)選的為至少其長度的60%，優(yōu)選的為至少其長度的70%，優(yōu)選的為至少其長度的80%，優(yōu)選的為至少其長度的90%，以及最優(yōu)選的為至少SEQ ID NO:4序列長度的95%。Blad或其變體通常具有至少10個氨基酸殘基的長度，如至少20個、25個、30個、40個、50個、60個、80個、100個、120個、140個、160個或173個氨基酸殘基的長度。“Blad的活性變體”還包括在其范圍內(nèi)的一個與SEQ ID NO:4同源的多肽序列，比如至少40%相同,優(yōu)選的至少60%相同，優(yōu)選的至少70%相同,優(yōu)選的至少80%相同,優(yōu)選的至少85 %相同，優(yōu)選的至少90 %相同，優(yōu)選的至少95 %相同，優(yōu)選的至少97 %相同，以及最優(yōu)選的至少99%相同，例如，超過全序列或超過至少20個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少30個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少40個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少50個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少60個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少80個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少100個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少120個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少140個連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，以及最優(yōu)選的超過至少160或更多的連續(xù)氨基酸殘基的區(qū)域。測量蛋白同源性的方法是本領(lǐng)域公知常識，而且在本文內(nèi)容中本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解同源性是基于相同氨基酸而計(jì)算的(有時也稱為“硬同源”)。具有同源活性的Blad變體典型的是通過取代，插入或缺失從而與SEQ ID N0:4多肽序列區(qū)別開來的，例如，通過1、2、3、4、5到8或更多位取代，缺失或插入的方式。該取代更多為“保守的”，也即，一個氨基酸可能被另一個相似氨基酸取代，相似氨基酸可以借由為以下組的其中一個:芳香殘基(F/H/W/Y)，非極性脂肪族殘基(G/A/P/I/L/V)，極性不帶電脂肪族殘基(C/S/T/M/N/Q)和極性帶電脂肪族殘基(D/E/K/R)。優(yōu)選的亞族包括:G/A/P ；I/L/V ；C/S/T/M ；N/Q ；D/E ;和 K/R。一種含Blad或其活性變體的抗菌多肽(如上所述)可能由在N末端和/或C末端添加了任意數(shù)量的氨基酸的Blad或其活性變體組成，并且該抗菌多肽保持了抗菌活性(再次參照以下關(guān)于所述活性水平和如何測量的說明)。優(yōu)選的，不超過300個氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個末端或者兩個末端，更優(yōu)選的，不超過200個氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個末端或者兩個末端，更優(yōu)選的，不超過150個氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個末端或者兩個末端，更優(yōu)選的，不超過100個氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個末端或者兩個末端，更優(yōu)選的，不超過80、60、或40個氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個末端或者兩個末端，最優(yōu)選的，不超過20氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個末端或者兩個末端。一種包括(或主要包括)Blad或其活性變體的抗菌多肽(如上所述)可以以純化的形式(例如，從植物、動物或微生物來源中提取)和/或重組蛋白形式。重組形式的產(chǎn)品使得能夠產(chǎn)生Blad的活性變體。本領(lǐng)域已經(jīng)公開了純化天然存在的Blad的方法(如，Ramos et al.(1997)Planta203(l):26-34 和 Monteiro et al.(2010) PLoS 0NE5(1):e8542)。天然存在的 Blad的一個合適的來源為一種羽扇豆屬植物，如白色羽扇豆(Lupinus albus),優(yōu)選的,所述為所述植物的子葉，優(yōu)選的，取在發(fā)芽開始后大約4到14天收獲，更優(yōu)選的，取在發(fā)芽開始后大約6到12天收獲(如，發(fā)芽開始后的8天收獲)。本領(lǐng)域已經(jīng)公開了獲得含Blad的粗提的全蛋白提取物的方法，以及對上述提取物純化從而獲得部分純化提取物的蛋白純化方法，如包含Blad的 低聚糖構(gòu)成的Blad?？梢杂镁郾０纺z電泳(SDS-PAGE)法和/或，優(yōu)選的，采用C_18柱反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分離Blad本身。另一種獲得含Blad的低聚糖的部分純化提取物的方法是利用了 Blad的甲殼素綁定活性。所述低聚糖與甲殼素柱以強(qiáng)有力的形式結(jié)合，作為甲殼素親和色譜純化的一部分，以0.05N HCl洗脫。所述純化方法的實(shí)施例詳細(xì)說明如下:收獲8天齡的羽扇豆植物的子葉并在含IOmM CaCljP IOmM MgClJ^Mill1-Q plus中加水勻漿(pH調(diào)至8.0)。勻漿通過粗棉布過濾并30，000轉(zhuǎn)，4C離心I小時。隨后取沉淀物并懸浮于PH7.5的IOOMm三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液中，該緩沖液含重量體積比為 10% (w/v)的 NaCl，10mM EDTA和 IOmM EGTA，4°C攪拌 I 小時，并在 4°C，3000轉(zhuǎn)離心I小時。上清中的總球蛋白片段用硫酸銨(561g/L)沉淀，低溫?cái)嚢鐸小時并在4°C，3000轉(zhuǎn)離心30分鐘。所得的顆粒沉淀物溶解在pH7.5，50mM的Tris-HCl緩沖液中，在用相同緩沖液平衡過的ro-1o柱中脫鹽并通過在相同緩沖液中預(yù)平衡了的甲殼素親和層析柱。該柱用PH7.5,50mM Tris-HCl緩沖液沖洗，并且將該結(jié)合蛋白用0.05NHC1洗脫。該洗脫物片段立即用2M Tris中和，并用SDS-PAGE收集其峰值區(qū)的洗脫物片段，凍干并分析。甲殼素柱的制備，從Sigma公司購買粗甲殼素并做以下處理:甲殼素樣品用Mill1-Q plus加水充分洗滌，然后用0.05NHC1充分洗滌。然后用重量體積比為1% (w/v)的碳酸鈉洗滌，之后用乙醇洗滌，直至洗到光吸收度小于0.05。將甲殼素裝入移液管端部并用 pH7.5,50mMTris-HCl 平衡。生產(chǎn)重組蛋白的方法為本領(lǐng)域公知常識。其在本發(fā)明中使用的方法涉及將編碼含Blad或其活性變體的多肽的多核苷酸插入到合適的表達(dá)載體上，使得所述多核苷酸與一個或多個啟動子(如誘導(dǎo)性啟動子，如T71ac)以及其他目的多核苷酸或目的基因并置，將表達(dá)受體引入到合適的細(xì)胞或者組織中(比如，大腸桿菌E.Coli),在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織中表達(dá)該多肽，并將表達(dá)的重組多肽從細(xì)胞或組織中提取。表達(dá)載體可以包含多核苷酸額外編碼的構(gòu)建以輔助純化，例如，一個末端標(biāo)簽可以輔助純化:例如，用于親和純化的一個組氨酸殘基標(biāo)簽。一旦該重組多肽被純化，純化標(biāo)簽可以從多肽中去除。比如，通過溶蛋白性裂解。在一個包含含有(或主要含有)Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物中，所述多肽優(yōu)選的為以部分純化的形式，更優(yōu)選的以純化的形式。當(dāng)在缺少一種或多種天然與之相連的多肽的環(huán)境中和/或?yàn)橹辽?0%總蛋白的多肽代表時，所述多肽為部分純化形式。當(dāng)在一個缺少全部，或多數(shù)與之天然相連的其他多肽的環(huán)境中時，所述多肽為純化的形式。例如，純化的Blad是指組合物中Blad代表了至少50%的總蛋白，至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%的總蛋白。在一個包含含(或主要包括)Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物中，所述羽扇豆蛋白含量可能主要由含多肽的Blad-低聚糖組成，該多肽含(或主要包含)Blad或其變體。一個含(或主要包含)Blad的抗菌多肽的組合物其也可以是包含由本領(lǐng)域技術(shù)人員添加了其他化合物的配方。食品腐敗變質(zhì)和食品通過微生物的食品腐敗變質(zhì)是指微生物對食品的任何改變，其結(jié)果是在以下方面改變，例如，味道，氣味或外觀(如，形狀、顏色、質(zhì)地、硬度)，從而降低了其營養(yǎng)和/或商業(yè)價(jià)值。通過食品是指為營養(yǎng)或令人愉悅的目的被人類或動物消費(fèi)的任何液體或固體物質(zhì)。該食品可以是直接或間接消耗(如，烹飪或處理之后，如谷物精制)。在適用的情況下，該食品優(yōu)選的是一種從其天然環(huán)境中分離的形式，如收獲植物食品(如水果、蔬菜、種子)和從動物中分離的產(chǎn)品(如肉類、魚類、奶類)。該食品可以源自，可以提供，或可以是，一種水果、堅(jiān)果、蔬菜、種子、糖、奶制品、液體食品或糊狀食品、肉、魚或面包。源自水果的食品包括酒和果汁。提供種子的植物包括谷類(如玉米、小麥、大麥、高粱、小米、大米、燕麥和黑麥)以及豆類(如黃豆、豌豆和扁豆)。糖，優(yōu)選蔗糖，可以源自甜菜或甘蔗。奶制品包括奶、奶油、奶酪和酸奶。液體或糊狀食物包括湯、調(diào)味料、咸菜、蛋黃醬、色拉醬和其他色拉調(diào)味料、餞、糖漿和嬰兒食品。所述肉類和/或魚類食品估計(jì)可以是處理過或未處理過的，以及可以是烹飪過的或未烹飪過的。進(jìn)一步優(yōu)選的食品預(yù)計(jì)可以在下一部分涉及可能被微生物腐敗變質(zhì)的食品例子中找到，其可能是本發(fā)明的應(yīng)用和方法的針對對象。食品還包括預(yù)處理的復(fù)合食品，如三明治、派、乳蛋餅等，尤其是那些一般用來冷凍保藏的食品。

目標(biāo)微生物
本發(fā)明提供了含抗菌多肽的組合物在預(yù)防或抑制微生物引起食品腐敗變質(zhì)中的應(yīng)用，該抗菌多肽含Blad或其活性變體?？梢詫?dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的微生物，即食品腐敗微生物，包括，尤其是，細(xì)菌和真菌。在該應(yīng)用中，該抗菌多肽可以視為抗菌食品防腐劑。該抗菌多肽可以用來預(yù)防或抑制革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌引起的食品變質(zhì)腐敗。尤其優(yōu)選的目標(biāo)細(xì)菌(可能被腐敗變質(zhì)的食品的例子在括號中給出)包括:食品腐敗假單胞菌(Pseudomonas)如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(擬水芳:和萵苣)，丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)(各種取自植物的食品，如甜菜、小麥和大麥)，托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonas tolaasii)(蘑燕),蘑燕假單胞菌(Pseudomonasagarici)(蘑燕)，莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)(奶制品)和隆德假單胞菌(Pseudomonas Iundensis)(奶、奶酪、肉類和魚類)，最優(yōu)選的銅綠假單胞菌；和食品腐敗芽孢桿菌(Bacillus)種類,如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(番爺、土豆、面包)和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)(奶類、番爺汁)。所述抗菌多肽可用來防止或抑制單細(xì)胞(酵母)或多細(xì)胞(絲狀霉菌)真菌引起的食品腐敗變質(zhì)。尤其優(yōu)選的目標(biāo)酵母(可能被腐敗變質(zhì)的食品的例子在括號中給出)包括:食品腐敗酵母菌類(Saccharomyces)如，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(糖、糖楽；、酒、和軟飲如果汁)；食品腐敗克魯維酵母類(Kluyveromyces)如馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)(奶酪)；以及食品腐敗接合酵母類(Zygosaccharomyces),如 拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)(酒、果汁、色拉調(diào)味料和番爺醬)和魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)(糖衆(zhòng)、果汁、果醬和色拉調(diào)味料)。尤其優(yōu)選的目的霉菌(可能被腐敗變質(zhì)的食品的例子在括號中給出)包括:食品腐敗鏈格孢菌類(Alternaria)如互隔交鏈孢菌(Alternaria alternata)(馬鈴薯)、樹狀鏈格抱菌(Alternaria arborescens)(番爺)、果園鏈格抱菌(Alternaria arbusti)(亞洲梨)、蕓苔鏈格孢菌(Alternaria brassicae)(蔬菜)、甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternariabrassicicola)(甘藍(lán)類蔬菜)、Alternaria carotiincultae (胡蘿卜)、刺蛾鏈格抱菌(Alternaria conjutncta)(歐洲蘿卜)、胡蘿卜鏈格抱菌(Alternaria dauci)(胡蘿卜)、大戟生鏈格孢菌(Alternaria euphorbiicola)(甘藍(lán)類蔬菜)、，梨黑斑鏈格孢菌(Alternariagaisen)(梨)、感染鏈格孢菌(Alternaria infectoria)(小麥)、日本鏈格孢菌(Alternaria japonica)(甘藍(lán)類蔬菜)、洋芫荽鏈格抱菌(Alternaria petroselini)(歐芳:)、Alternaria selini (歐療)、索蘭尼鏈格孢.(Alternaria solani)(馬鈴薯,番^tOJPAlternaria smyrnii (alexanders,歐芳:)；食品腐敗曲霉類(Aspergillus)如煙曲霉(Aspergillus fumigatus)(堅(jiān)果、馬鈴薯、大米和面包)、黑曲霉(Aspergillus niger)(水果和蔬菜如葡萄和洋蔥)、黃曲霉(Aspergillus flavus)(谷物、花生)；食品腐敗鐮刀霉類(Fusarium)如尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)(水果)和禾谷鐮刀霉(Fusariumgraminearum)(大麥、小麥和玉米)；食品腐敗葡萄孢菌類(Bottytis)如灰葡萄孢菌(Bottytis cinerea)(草莓、葡萄和番爺)；和食品腐敗炭疽菌類(Colletotrichum)如尖孢炭疽菌(Colletotrichum actuatum)(草莓、療菜、蘋果、油梨、爺子、咖啡喝番石槽)、馬鈴薯炭疽菌(Colletotrichum coccodes)(番爺、馬鈴薯)、辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)(紫蘇、鷹嘴豆、胡椒)、殼皮炭疽菌(Colletotrichum crassipes)(百香果)、蒸枝炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)(蔬菜和水果如柑橘和蘋果)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)(谷類)、卡哈瓦刺盤抱菌(Colletotrichumkahawae)(咖啡)、菜豆炭疽菌(Colletotrichum Iindemuthianum)(豆類)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)(香蕉)、黑刺盤孢炭疽菌(Colletotrichum nigrum)(番爺)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)(甜瓜、黃瓜)、豌豆炭疽菌(Colletotrichumpisi)(豌豆)和亞線孢炭疽菌(Colletotrichum sublineolum)(大米)。在優(yōu)選具體實(shí)施例中，所述抗菌多肽用來防止或抑制微生物引起的水果腐敗變質(zhì)，優(yōu)選的為草莓，以及優(yōu)選的其中所述微生物為灰葡萄孢菌或炭疽菌，優(yōu)選的為灰葡萄孢菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常規(guī)方法，將含(或主要含)Blad (或其活性變體)的抗菌多肽用來在任何特定情況下預(yù)防或抑制腐敗變質(zhì)，確定一個合適的劑量濃度。優(yōu)選的，例如，Blad的濃度至少為I μ g/ml,濃度至少為5 μ g/ml,濃度至少為10 μ g/ml,濃度至少為50 μ g/ml,濃度至少為100 μ g/ml,濃度至少為150 μ g/ml,直到濃度為350 μ g/ml,直到濃度為500 μ g/ml，直到濃度為600 μ g/ml，直到濃度為lmg/ml，直到濃度為2.5mg/ml，直到濃度為5mg/ml，直到濃度為10mg/ml。優(yōu)選的，使用Blad的濃度選自10 μ g/ml和5mg/ml之間，更優(yōu)選的50 μ g/ml和2.5mg/ml之間，更優(yōu)選的100 μ g/ml和lmg/ml之間，以及更優(yōu)選的150 μ g/ml和600 μ g/ml之間(如大約250 μ g/ml)。本發(fā)明提供證據(jù)證明了 Blad直到濃度至少為400 μ g/ml，對宿主無毒(參照例4和5)。本發(fā)明驚訝的發(fā)現(xiàn)，將Blad與螯合劑(如EDTA)結(jié)合能產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用。因此，優(yōu)選的螯合劑用于改善所述含(或主要包含)Blad(或其活性變體)多肽的抗菌活性，以及該螯合劑的使用可能降低達(dá)到防止或抑制食品腐敗變質(zhì)的特定水平所需的抗菌多肽的濃度。螯合試劑(也稱螯合劑，絡(luò)合劑或多價(jià)螯合劑)可以是與金屬離子結(jié)合的以形成非共價(jià)復(fù)合物以及減少離子活性的任意組合物。合適的螯合劑包括多胺羧酸鹽，如EDTA(乙二胺四乙酸)和EGTA(乙二醇-雙-(β-氨基乙醚)-N，N, N’，N’ -四乙酸)。優(yōu)選的，螯合劑為EDTA,優(yōu)選的EDTA濃度至少為10 μ g/ml,至少為50 μ g/ml,至少為100 μ g/ml,至少為500 μ g/ml，直到濃度為lmg/ml，直到濃度為5mg/ml，直到濃度為10mg/ml，直到濃度為20mg/mlo優(yōu)選的，EDTA的濃度在0.lmg/ml,和lmg/ml之間。結(jié)果該抗菌多肽可以用于抑制食品上的食品腐敗微生物的生長(即其具有抑菌活性)和/或殺死所述微生物(即其具有殺菌活性)，如此以致防止或抑制了被該微生物引起的所述食品的腐敗變質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定一個合適的劑量和/或濃度從而實(shí)現(xiàn)生長抑制或殺死該微生物的特定的需要。優(yōu)選的，當(dāng)作為抑菌劑使用時，與相同條件下但無抗菌多肽時相比所述抗菌多肽降低了 10%的生長率，更優(yōu)選的降低了 50%的生長率，更優(yōu)選的降低了 75%的生長率，更優(yōu)選的降低了 90%的生長率，更優(yōu)選的降低了 95%的生長率，更優(yōu)選的降低了 98%的生長率，更優(yōu)選的降低了 99%的生長率，以及更優(yōu)選的，降低了 99.9%的生長率。最優(yōu)選的，抗菌多肽能防止任何微生物的生長。優(yōu)選的，當(dāng)用作殺菌劑時，與相同條件下無抗菌多肽時相比，該抗菌多肽能殺死微生物總數(shù)的10%，更優(yōu)選的，能殺死微 生物總數(shù)的50%，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的75 %，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的90 %，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的95 %，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的98%，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的99%，以及更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的99.9%，最優(yōu)選的，抗菌多肽殺死所有的微生物。當(dāng)用于防止或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)時，所述抗菌多肽優(yōu)選的使用有效劑量，也就是說，該劑量水平是指能夠殺死和/或抑制微生物生長，能達(dá)到防止或抑制腐敗的可檢測水平(如降低腐敗變質(zhì)率)優(yōu)選的，是同與相同條件的不加該抗菌多肽時對比。所述抗菌多肽的有效劑量對人或動物主體是無毒的。應(yīng)用和方法本發(fā)明提供了一種含抗菌多肽的組合物的在防止或抑制微生物引起的食物腐敗變質(zhì)中的應(yīng)用，所述抗菌多肽包含Blad或其活性變體。為此，本發(fā)明還提供了一種防止或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)的方法，包括給有需要的食品施用有效量的含抗菌多肽的組合物，其中所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。優(yōu)選的，所述抗菌多肽的有效量對人或動物是無毒的。所述防止或抑制腐敗變質(zhì)可以發(fā)生于食品的儲存過程、運(yùn)輸過程、處理操作過程、加工過程或展示過程。含抗菌多肽的組合物可以例如混合摻入食品中，或例如可以應(yīng)用于食品表面(如作為液態(tài)膜或噴霧)。食品也可以浸入(并可選的保持于)所述組合物中。對于任意特殊的食品，所述組合物作為防腐劑的應(yīng)用可以與任意其他公知的食品防腐技術(shù)、抗菌劑或相反的技術(shù)結(jié)合，包括干燥、加熱，冷藏，冷凍，滲透抑制(如使用糖或鹽)，真空包裝，罐頭，瓶裝，膠凍化，裝罐，裝壺，電離輻射，脈沖電場處理，高壓食品保藏，以及超高水壓食品保藏，使用抗氧防腐劑，和/或使用抗菌性防腐劑(如二氧化硫，二氧化碳，乙醇，醋酸，檸檬酸，乳酸，山梨酸，苯甲酸鹽，硝酸鹽和亞硝酸鹽，亞硫酸鹽，丙酸鈣鹽和甲基氯異塞唑啉酮)。實(shí)施例,在以下的例子中，BLAD是指天然形成的含Blad的低聚糖，其包含20kD的Blad多肽，按“per Ramos et al.(1997) Planta203 (I):26_34”中的方法純化，參照該文獻(xiàn)中材料和方法部分的“植物材料和生長條件”以及“蛋白純化”的內(nèi)容。定義:MIC-最小抑制濃度:抑制微生物可見生長的抗菌劑的最低濃度MFC/MBC-最低殺真菌濃度/最低殺細(xì)菌濃度(或最小致死濃度):在標(biāo)準(zhǔn)化條件下24小時后，殺死99.9%初始接種菌數(shù)所需的最低殺菌劑濃度。實(shí)施例1Blad的殺菌活性不同種類的細(xì)菌的BLAD的MIC和MBC (使用Mueller-Hinton培養(yǎng)基)
權(quán)利要求
1.一種包含抗菌多肽的組合物在防止或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)中的應(yīng)用，其中所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述微生物位細(xì)菌或真菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)菌是選自假單胞菌或芽孢桿菌的食品腐敗種類細(xì)菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述真菌是選自以下種屬的食品腐敗種類真菌:鏈格孢菌、曲霉菌、鐮刀霉、葡萄孢菌、炭疽菌、酵母、克魯維酵母和接合酵母。
5.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述食品為源自、提供、或?yàn)椋?、?jiān)果、蔬菜、種子、糖、奶制品、液態(tài)或糊狀食品、肉類、魚類或面包。
6.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述食品為草莓。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述微生物是灰葡萄孢菌或尖孢炭疽菌，優(yōu)選的為灰葡萄孢菌。
8.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述組合物進(jìn)一步包括螯合劑。
9.一種防止或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)的方法，包括給有需要的食品使用含有有效劑量抗菌多肽的組合物，所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含抗菌多肽的組合物在防止或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)中的應(yīng)用，所述抗菌多肽包含Blad或其活性變體。本發(fā)明還提供了一種防止或抑制微生物引起的食品腐敗變質(zhì)的方法，包括向有需要的食品食用有效量的含抗菌多肽的組合物，其實(shí)所述抗菌多肽包含Blad或其活性變體。
文檔編號A23B7/154GK103228161SQ201180049344
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者亞歷山德拉·曼露埃拉·洛倫索·卡雷拉, 薩拉·亞歷山德拉·瓦爾德斯·達(dá)席爾瓦·蒙泰羅, 里卡多·曼努埃爾·德塞夏斯·包維達(dá)·費(fèi)雷拉 申請人:肯蘇墨艾姆維德-生物技術(shù)達(dá)思植物有限公司