熱穩(wěn)定性木霉屬纖維素酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述涉及熱穩(wěn)定性真菌纖維素酶EGV的組合物和方法，以及具有修飾的木霉屬宿主細(xì)胞，該修飾包含用于這個(gè)纖維素的表達(dá)的核苷酸的中斷或者缺失或者實(shí)質(zhì)上由該中斷或者缺失組成，由此EGV表達(dá)得到防止。
【專利說(shuō)明】熱穩(wěn)定性木霉屬纖維素酶
[0001]以引用方式并入本文
[0002]本申請(qǐng)要求2010年10月20日提交的系列號(hào)為61/394，946的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)和2010年10月20日提交的第10188285.0號(hào)歐洲專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
[0003] 前述申請(qǐng)，以及其中引證的或者在它們審查過(guò)程中引證的所有文件(“申請(qǐng)引證文件”)以及申請(qǐng)引證文件中引證或者參考的所有文件，以及本文引證或者參考的所有文件(“本文引證文件”)以及本文引證文件中引證或者參考的所有文件，還有關(guān)于在本文中或者在以引用方式并入本文的任何文件中提到的任何產(chǎn)品的任何生產(chǎn)商說(shuō)明書、描述、產(chǎn)品規(guī)格和產(chǎn)品單，都以引用方式并入本文，并且可應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)施。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及具有這樣的修飾的木霉屬(Trichoderma)例如里氏木霉(T.reesei)宿主細(xì)胞，該修飾包含據(jù)以防止或者減少熱穩(wěn)定性真菌纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV))的表達(dá)的中斷或者缺失,或者該修飾實(shí)質(zhì)上由該中斷或者缺失組成，比如,具有這樣的修飾的木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞，該修飾包含參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷，或者該修飾實(shí)質(zhì)上由該缺失或者中斷組成，該修飾例如是這個(gè)纖維素酶的編碼基因或者編碼區(qū)或者用于這個(gè)纖維素酶的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的中斷或者缺失。這種宿主細(xì)胞特別可用于表達(dá)不含不需要的纖維素酶活性的熱穩(wěn)定性多肽。本發(fā)明有利地涉及包含和表達(dá)這樣的外源核酸分子的木霉屬例如里氏木霉，該核酸編碼目的蛋白，例如編碼疏水蛋白(例如疏水蛋白II)，并具有這樣的修飾，該修飾包含參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷，或者該修飾實(shí)質(zhì)上由該缺失或者中斷組成，由此目的蛋白例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)得到表達(dá)，而EGV表達(dá)被防止或者減少。例如，該木霉屬修飾可實(shí)質(zhì)上由egl5的缺失或者中斷組成。
【背景技術(shù)】
[0005]纖維素和半纖維素是通過(guò)光合作用產(chǎn)生的最豐富的植物材料。它們可被多種產(chǎn)生能夠?qū)⒕酆衔锏孜锼獬蓡误w糖類的胞外酶類的微生物(例如細(xì)菌、酵母和真菌)降解和用作能源(Aro 等人，(2001)，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，276:24309-14)。
[0006]纖維素酶是水解纖維素(β-1，4-葡聚糖或者β-D-糖苷鍵)而導(dǎo)致葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的形成的酶類。傳統(tǒng)上將纖維素酶分為三大類:內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4) ( “EG”)、外切葡聚糖酶或者纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91; “CBH”)和β -葡糖苷酶(β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21 ;“BG”) (Knowles 等人，(1987)，TIBTECH5:255-61 ;以及 Schulein，(1988)，《酶學(xué)方法》(Methods Enzymol.)，160:234-43)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的無(wú)定形部分，以水解低結(jié)晶度區(qū)域中的內(nèi)部β -1, 4-糖苷鍵。纖維二糖水解酶從纖維素的還原端或者非還原端水解纖維二糖，并且能夠降解結(jié)晶纖維素(Nevalainen 和 Penttila, (1995),《真菌界》(Mycota), 303-319)。纖維二糖水解酶(CBH)在纖維素酶系統(tǒng)中的存在據(jù)認(rèn)為是結(jié)晶纖維素的有效溶解所需(Suurnakki等人，(2000)，《纖維素》Cellulose，7:189-209)。β -葡糖苷酶起到從纖維二糖、纖維寡糖和其他葡萄糖苷釋放D-葡萄糖單元的作用(Freer, (1993),《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.),268:9337-42)。β -葡糖苷酶還已被證實(shí)能催化水解烷基和/或芳基β -D-葡萄糖苷如甲基β -D-葡萄糖苷和對(duì)硝基苯基葡萄糖苷以及僅含碳水化合物殘基的糖苷如纖維二糖。[0007]已知纖維素酶由大量細(xì)菌、酵母和真菌產(chǎn)生。某些真菌能產(chǎn)生包括外切纖維二糖水解酶或者說(shuō)CBH型纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶或者說(shuō)EG型纖維素酶和β -葡糖苷酶或者說(shuō)BG型纖維素酶的完全纖維素酶系統(tǒng)。其他真菌和細(xì)菌極少表達(dá)或者不表達(dá)CBH型纖維素酶。里氏木霉(也稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))能表達(dá)大量的纖維素酶，包括兩種 CBH,即 CBHI (Ce17a)和 CBHII (Cel6a)，至少八種 EG,即 EGI (Cel7b)、EGII(CeI5a)、EGIII(Cel12a)、EGIV(Cel61a)、EGV(Cel45a),EGVI(CeI74a)、EGVII(Cel61b)和 EGVIII (Cel5b)，和至少五種 BG,即 BGl (Ce13a)、BG2 (Celia)、BG3 (Cel3b)、BG4 (Cel3c)和BG5 (Cellb)。EGIV、EGVI和EGVIII還具有木葡聚糖酶活性。
[0008]在一些情況中，希望使用從里氏木霉獲得的全纖維素酶培養(yǎng)液作為纖維素酶來(lái)源，例如用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化、紡織品加工、紙張和紙漿處理等。在其他情況中，里氏木霉用作表達(dá)經(jīng)工程改造的纖維素酶、來(lái)自其他生物體的纖維素酶或者另外的酶類或者純粹其他蛋白質(zhì)(例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、結(jié)構(gòu)蛋白等)的優(yōu)良宿主生物。尤其是在后面這些情況中，可能希望在內(nèi)源里氏木霉纖維素酶不存在下表達(dá)目的蛋白。雖然這可通過(guò)缺失內(nèi)源里氏木霉纖維素酶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，但由于這些基因?yàn)閿?shù)眾多，使得這種方案費(fèi)時(shí)耗力。
[0009]在本申請(qǐng)中引證或者確認(rèn)任何文件并不是承認(rèn)這種文件可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供與木霉屬例如里氏木霉中存在的熱穩(wěn)定性纖維素酶有關(guān)的組合物和方法，所述組合物例如經(jīng)修飾的細(xì)胞，包括那種經(jīng)工程改造以表達(dá)目的蛋白如疏水蛋白(例如疏水蛋白II)的細(xì)胞。
[0011]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞，其包含據(jù)以顯著地減少或者防止熱穩(wěn)定性EGV多肽的產(chǎn)生的修飾，或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成。
[0012]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞，其包含據(jù)以顯著地減少或者防止熱穩(wěn)定性EGV多肽的產(chǎn)生的修飾，或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成，其中該修飾實(shí)質(zhì)上由參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷組成，例如這個(gè)纖維素酶的編碼基因或者編碼區(qū)或者用于這個(gè)纖維素酶的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的中斷或者缺失。
[0013]在其中一個(gè)實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞包含據(jù)以顯著地減少或者防止熱穩(wěn)定性EGV多肽的產(chǎn)生的修飾，或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成，其中該修飾包含egl5的缺失或者中斷或者實(shí)質(zhì)上由該缺失或者中斷組成。
[0014]在一些實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞包含被中斷的egl5或者實(shí)質(zhì)上由被中斷的egl5組成。
[0015]在一些實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞包含被缺失的egl5或者實(shí)質(zhì)上由被缺失的egl5組成。[0016]在具體的實(shí)施例中，egl5通過(guò)同源重組進(jìn)行缺失。它還可通過(guò)同源重組進(jìn)行中斷。
[0017]在一些實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞通過(guò)對(duì)包含功能性egl5的親本宿主細(xì)胞進(jìn)行修飾來(lái)產(chǎn)生。
[0018]在一些實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞包含一個(gè)或者多個(gè)編碼熱不穩(wěn)定性酶而使該熱不穩(wěn)定性酶得以表達(dá)的內(nèi)源功能性基因或者核酸分子，或者實(shí)質(zhì)上由所述內(nèi)源功能性基因或者核酸分子組成；例如該熱不穩(wěn)定性酶可以是纖維素酶、半纖維素酶或者蛋白酶或者這些酶中的任何兩種或者所有三種。在一些實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉可表達(dá)一種或者多種另外的蛋白質(zhì)，其可以是外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶或者β-葡糖苷酶或者這些蛋白質(zhì)中的任何兩種或者所有三種。
[0019]在一些實(shí)施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞還包含功能性目的基因或者編碼目的蛋白且讓目的蛋白表達(dá)的核苷酸。 [0020]在一些實(shí)施例中，目的基因編碼或者目的蛋白是熱穩(wěn)定性多肽；例如疏水蛋白，如疏水蛋白II。
[0021]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞中產(chǎn)生熱穩(wěn)定性目的蛋白的方法，該方法包括:將編碼熱穩(wěn)定性目的蛋白的核酸分子在目的蛋白據(jù)以進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)的條件下引入到木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞中，例如其中目的核酸分子有效連接到用于表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件；且其中木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞包含據(jù)以顯著地減少或者防止熱穩(wěn)定性EGV多肽的產(chǎn)生的修飾或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成，其中該修飾實(shí)質(zhì)上由參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷組成，例如這個(gè)纖維素酶的編碼基因或者編碼區(qū)或者用于這個(gè)纖維素酶的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的中斷或者缺失；例如，其中該修飾包含egl5的缺失或者中斷或者實(shí)質(zhì)上由egl5的缺失或者中斷組成。熱穩(wěn)定性目的蛋白可以是疏水蛋白，例如疏水蛋白II。該木霉屬例如里氏木霉可另外包含一個(gè)或者多個(gè)編碼另外的功能性蛋白的基因或者一個(gè)或者多個(gè)編碼另外的功能性蛋白的核酸分子，其處于該一個(gè)或者多個(gè)另外的功能性蛋白據(jù)以進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)的條件下，例如其中該一個(gè)或者多個(gè)核酸分子有效連接到用于表達(dá)的啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)元件。該方法還可包括使該細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物一包括目的蛋白和任何表達(dá)在表達(dá)產(chǎn)物中的另外的功能性蛋白在內(nèi)一經(jīng)歷足以顯著地滅活所述另外的蛋白質(zhì)的高溫；其中該高溫不足以滅活熱穩(wěn)定性目的蛋白且會(huì)不足以滅活EGV纖維素酶；其中熱穩(wěn)定性目的蛋白得以以活性或者功能形式產(chǎn)生，而基本上不存在來(lái)自所述另外的蛋白質(zhì)的活性。
[0022]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生熱穩(wěn)定性目的蛋白例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)的方法，所述方法包括:使從木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞獲得的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)歷高溫，其中:木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞包含據(jù)以顯著地減少或者防止熱穩(wěn)定性EGV多肽的產(chǎn)生的修飾或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成，其中該修飾實(shí)質(zhì)上由參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷組成，例如這個(gè)纖維素酶的編碼基因或者編碼區(qū)或者用于這個(gè)纖維素酶的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的中斷或者缺失；例如，其中該修飾包含egl5的缺失或者中斷或者實(shí)質(zhì)上由egl5的缺失或者中斷組成；并且木霉屬例如里氏木霉可另外包含一個(gè)或者多個(gè)編碼另外的功能性蛋白的基因或者一個(gè)或者多個(gè)編碼另外的功能性蛋白的核酸分子，其處于該一個(gè)或者多個(gè)另外的功能性蛋白據(jù)以進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)的條件下，例如其中該一個(gè)或者多個(gè)核酸分子有效連接到用于表達(dá)的啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)元件；其中該高溫足以滅活該一種或者多種另外的功能性蛋白(如果存在的話)，但不足以滅活熱穩(wěn)定性目的蛋白或者EGV ;由此產(chǎn)生出活性或者功能形式的熱穩(wěn)定性目的蛋白，而不存在來(lái)自所述另外的功能性蛋白的活性。
[0023]前述方法可另外包括將經(jīng)修飾的木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞在適合產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)和另外的功能性蛋白(如果存在的話)的培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育。
[0024]前述方法還可包括在使目的蛋白和另外的功能性蛋白(如果存在的話)經(jīng)歷高溫之前，從經(jīng)修飾的木霉屬例如里氏木霉宿主細(xì)胞分離表達(dá)產(chǎn)物(或者蛋白質(zhì)混合物)。
[0025]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，在本來(lái)會(huì)天然包含egl5的宿主細(xì)胞中中斷掉egl5。
[0026]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，在本來(lái)天然包含egl5的宿主細(xì)胞中缺失掉egl5。
[0027]因此，在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，被中斷或者缺失的egl5是內(nèi)源的。
[0028]因此，所述方法可另外包括缺失或者中斷egl5或者以別的方式修飾木霉屬例如里氏木霉，以顯著地減少或者防止熱穩(wěn)定性EGV多肽的產(chǎn)生，其中該修飾實(shí)質(zhì)上由參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷組成，例如這個(gè)纖維素酶的編碼基因或者編碼區(qū)或者用于這個(gè)纖維素酶的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的中斷或者缺失。
[0029]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，egl5通過(guò)同源重組進(jìn)行缺失。它還可通過(guò)同源重組進(jìn)行中斷。
[0030]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，所述一種或者多種另外的蛋白質(zhì)是熱不穩(wěn)定性蛋白。在一些實(shí)施例中，所述一種或者多種另外的蛋白質(zhì)可以是纖維素酶、半纖維素酶或者蛋白酶或者這些酶中的任何兩種或者所有三種。在一些實(shí)施例中，所述一種或者多種另外的蛋白質(zhì)可以是外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶或者β -葡糖苷酶或者這些蛋白質(zhì)中的任何兩種或者所有三種。
[0031 ] 在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，目的蛋白由于可逆地可熱變性從而是熱穩(wěn)定的。
[0032]在任何所述方法的情況中，在具體的實(shí)施例中，目的蛋白是疏水蛋白，例如疏水蛋白II。
[0033]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，高溫是90 V或者更高的溫度。在一個(gè)有利的實(shí)施例中，高溫可以小于約100°c。
[0034]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，暴露于高溫達(dá)5分鐘或者更長(zhǎng)的時(shí)間。
[0035]在任何所述方法的情況中，在一些實(shí)施例中，暴露于高溫達(dá)60分鐘或者更長(zhǎng)的時(shí)間。
[0036]在又一個(gè)方面，提供通過(guò)任何這些方法產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性或者可逆地可熱變性蛋白。
[0037]在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供從絲狀真菌宿主細(xì)胞例如木霉屬(例如里氏木霉)獲得并包含疏水蛋白(例如疏水蛋白II)的發(fā)酵液組合物，其中該發(fā)酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性。例如，從任何前述方法獲得或者可從任何前述方法獲得的基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性的發(fā)酵液。因此，在一些實(shí)施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在熱不穩(wěn)定性纖維素酶和/或甘露聚糖酶的存在下產(chǎn)生，并經(jīng)歷高溫以滅活纖維素酶和/或甘露聚糖酶多肽。
[0038]在一些實(shí)施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在這樣的宿主細(xì)胞如木霉屬(例如里氏木霉)中產(chǎn)生，該宿主細(xì)胞包含據(jù)以顯著地減少或者防止纖維素酶和/或甘露聚糖酶的產(chǎn)生的修飾或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成，其中該修飾實(shí)質(zhì)上由參與纖維素酶和/或甘露聚糖酶的表達(dá)的核苷酸中的一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷組成，例如纖維素酶和/或甘露聚糖酶的編碼基因或者編碼區(qū)或者用于纖維素酶和/或甘露聚糖酶的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的中斷或者缺失，由此從產(chǎn)生該疏水蛋白得到(并含有該疏水蛋白)的發(fā)酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性。
[0039]在一些實(shí)施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在這樣的宿主細(xì)胞如木霉屬(例如里氏木霉)中產(chǎn)生，該宿主細(xì)胞包含據(jù)以使宿主細(xì)胞缺乏編碼纖維素酶和/或甘露聚糖酶的基因或者核酸分子的修飾或者實(shí)質(zhì)上由該修飾組成，由此從產(chǎn)生該疏水蛋白得到(并含有該疏水蛋白)的發(fā)酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性。
[0040]在發(fā)酵液實(shí)施例中，發(fā)酵液可進(jìn)行濃縮，且還可包含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性以外的多種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。
[0041]在任何本發(fā)明實(shí)施例中，目的多肽可以是熱穩(wěn)定的、熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的。
[0042]本發(fā)明方法還涉及控制由本發(fā)明的經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞表達(dá)的目的多肽的活性，其中該目的多肽是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的，其中所述方法可包括使熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性目的多肽以及內(nèi)源多肽經(jīng)歷高溫，其中該高溫可足以滅活該內(nèi)源多肽或者該熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性多肽。在一個(gè)有利的實(shí)施例中，內(nèi)源多肽可以是纖維素酶。所述方法還可包括在使熱敏感性或者熱 不穩(wěn)定性目的多肽經(jīng)歷高溫之前，使該目的多肽與該目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫幕衔锝佑|。所述方法還可包括在使熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性目的多肽經(jīng)歷高溫之前，使該目的多肽與纖維素酶和該目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫囊环N或者多種化合物接觸。
[0043]本發(fā)明方法還涉及控制本發(fā)明的發(fā)酵液中的目的多肽的活性的方法，其中該目的多肽可以是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的，其中所述方法可包括使發(fā)酵液經(jīng)歷足以滅活內(nèi)源多肽和熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性多肽的高溫。在一個(gè)有利的實(shí)施例中，內(nèi)源多肽可以是纖維素酶。所述方法還可包括在使發(fā)酵液經(jīng)歷高溫之前，使發(fā)酵液與目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫幕衔锝佑|。所述方法還可包括在使發(fā)酵液經(jīng)歷高溫之前，使發(fā)酵液與纖維素酶和目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫囊环N或者多種化合物接觸。
[0044]本發(fā)明還涉及控制從經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞獲得的組合物中存在的纖維素酶的活性的方法，其中該組合物可包含至少一種EGV之外的纖維素酶，且所述方法可包括使該組合物經(jīng)歷足以滅活目的多肽的高溫，并且其中在使該組合物經(jīng)歷高溫后該組合物基本上不含纖維素酶活性。目的多肽可以是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該多肽可以是耐熱的或者熱穩(wěn)定的。使該組合物經(jīng)歷高溫可在食品或者飲料中進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，高溫可為小于約100°C。在另一個(gè)實(shí)施例中，從經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞獲得的組合物可以是包含疏水蛋白的發(fā)酵液。
[0045]因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是不將任何之前知道的產(chǎn)品、制造該產(chǎn)品的工藝或者使用該產(chǎn)品的方法涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，從而本 申請(qǐng)人:保留權(quán)利并據(jù)此公開對(duì)任何之前知道的產(chǎn)品、工藝或者方法的棄權(quán)。還要指出，本發(fā)明不旨在將任何不符合美國(guó)專利商標(biāo)局(USPTO)(美國(guó)法典第35卷第112條(35USC § 112)，第一段)或者歐洲專利局(EPO)(歐洲專利公約(EPC)第83條)的書面說(shuō)明要求和可實(shí)施性要求的產(chǎn)品、制造該產(chǎn)品的工藝或者使用該產(chǎn)品的方法涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，從而本 申請(qǐng)人:保留權(quán)利并據(jù)此公開對(duì)任何之前描述的產(chǎn)品、制造該產(chǎn)品的工藝或者使用該產(chǎn)品的方法的棄權(quán)。
[0046]應(yīng)指出，在本公開說(shuō)明書中特別是在權(quán)利要求書和/或段落中，術(shù)語(yǔ)“包含”(各種語(yǔ)法形式)可具有美國(guó)專利法中賦予它的含義；例如，它可以意指“包括”(各種語(yǔ)法形式)；而術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上由…組成”(各種語(yǔ)法形式)具有美國(guó)專利法中賦予它的含義，例如它允許沒有明確敘及的要素，但排除在現(xiàn)有技術(shù)中存在的要素或者影響本發(fā)明的基本特征或者新特征的要素。
[0047]術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上由…組成”(各種語(yǔ)法形式)旨在具體避免權(quán)利要求指示(read on)現(xiàn)有技術(shù)所公開或者提示的各單獨(dú)實(shí)施例或者其任何組合，因?yàn)橐殉龊跻饬系匕l(fā)現(xiàn)，參與EGV的表達(dá)的核苷酸中的缺失或者中斷，例如這個(gè)纖維素酶的編碼基因或者編碼區(qū)的中斷或者缺失，如egl5的缺失或者中斷，有助于熱穩(wěn)定性外源多肽例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)的表達(dá)和/或獲得。
[0048]這些和其他的實(shí)施例由以下“【具體實(shí)施方式】”(包括附圖在內(nèi))公開，或者從以下“【具體實(shí)施方式】”(包括附圖在內(nèi))顯而易見并被其所涵蓋。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]下文以舉例方式給出、但不旨在使本發(fā)明僅局限于所描述的具體實(shí)施例的“【具體實(shí)施方式】”可以結(jié)合附圖得到最好的理解，附圖中:
[0050]圖1 是 pFl (EG5RPyr)的質(zhì)粒圖。
`[0051]圖2是在中斷egl5后里氏木霉染色體的一部分的圖譜。
[0052]圖3的圖象顯示經(jīng)過(guò)和不經(jīng)過(guò)熱處理的對(duì)照里氏木霉培養(yǎng)物和缺失了 egl5的里氏木霉培養(yǎng)物的上清液中存在的纖維素酶活性的量。
[0053]圖4的圖象顯示葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0054]圖5的圖象顯示相比于對(duì)照菌株，來(lái)自AEG5菌株的上清液中熱穩(wěn)定性纖維素酶活性失去。
[0055]圖6是在中斷egl5和切除pyr2標(biāo)志后里氏木霉染色體的一部分的圖譜。
[0056]圖7是攜帶與己糖激酶啟動(dòng)子融合的sucA基因的片段的3.5kb DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0057]圖8是pFIX，的核苷酸序列，pFIX,是包含來(lái)自pUC19的復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因以及噬菌體fl復(fù)制起點(diǎn)的小質(zhì)粒(SEQ ID N0:2)。
[0058]圖9由圖9A和9B構(gòu)成，是基于egl5基因和pyr2基因的已知染色體DNA序列推導(dǎo)出的經(jīng)中斷的基因(即“中斷盒”)的核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。
[0059]圖10 是 egl5 的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)。
[0060]圖11是EGV的氨基酸序列(SEQ ID NO: 33)。
[0061]圖12是載體PTrex3gM(Hfb2)和pTrex8R(Hfb2)的功能性和部分限制圖譜。[0062]圖13A是pTrex3gM(Hfb2)的核苷酸序列。
[0063]圖13B是pTrex8R(Hfb2)的核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0064]在詳細(xì)描述本發(fā)明組合物和方法之前，為清楚起見定義了以下術(shù)語(yǔ)。未定義的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)被賦予其在相關(guān)領(lǐng)域中使用的普通含義。
[0065]本文所用的“纖維素酶”是從纖維素水解β-1，4_葡聚糖或者β-D-糖苷鍵而導(dǎo)致例如葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖的形成的酶。纖維素酶包含例如內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶等。
[0066]本文所用的“內(nèi)切葡聚糖酶(EG) ”是主要作用于纖維素纖維的無(wú)定形部分以水解低結(jié)晶度區(qū)域中的內(nèi)部β -1, 4-糖苷鍵的纖維素酶。
[0067]本文所用的術(shù)語(yǔ)“半纖維素酶”和“木聚糖酶”可互換使用，通指能夠水解包含5碳糖的多糖中的糖苷鍵的酶。這種酶包含例如甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶等。
[0068]本文所用的里氏木霉(Trichoderma reesei或者T.reesei)指子囊菌門的一種絲狀真菌。這種生物之前稱為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。
[0069]本文所用的詞語(yǔ)“里氏木霉EGV纖維素酶”指具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的多肽或者相關(guān)多肽。 相關(guān)多肽與SEQ ID NO: 33具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或者甚至至少約99%或者更高的氨基酸序列同一性，對(duì)纖維素底物具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，并且使用本文描述的測(cè)定法測(cè)出是熱穩(wěn)定的?！癊GV”在本文中可稱為“EG5”。
[0070]本文使用的詞語(yǔ)“里氏木霉egl5基因”或者“egl5”指編碼本文描述的EGV纖維素酶或者相關(guān)多肽的核酸。示例性的egl5的核苷酸序列以SEQ ID NO:32顯示。EGV的氨基酸序列在SEQ ID N0:33中顯示。
[0071]本文使用的關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定的(熱穩(wěn)定性)”，指多肽在經(jīng)歷預(yù)選的高溫達(dá)預(yù)選的一段時(shí)間后能夠保持生物活性。生物活性可以是該多肽的酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)或者任何其他活性或者性質(zhì)特征。如果多肽在暴露于預(yù)選的高溫達(dá)預(yù)選的一段時(shí)間后保持其原始活性的至少一半，則認(rèn)為它是熱穩(wěn)定的。廣義上講，預(yù)選的溫度和時(shí)間是為顯著地滅活EGV之外的里氏木霉纖維素酶所需的溫度和時(shí)間。這些條件可容易地通過(guò)測(cè)定包含egl5缺失或者實(shí)質(zhì)上由egl5缺失組成的里氏木霉宿主細(xì)胞中的纖維素酶活性來(lái)確立。
[0072]在一些情況中，如果蛋白質(zhì)在暴露于至少約70°C、至少約75°C、至少約80°C、至少約85°C、至少約90°C或者甚至至少約95°C的溫度達(dá)至少約3分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約15分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘或者甚至至少約60分鐘的時(shí)間后保持其生物活性的至少一半(即至少50%)，則認(rèn)為它是熱穩(wěn)定的。在一個(gè)例子中，預(yù)選溫度為約90°C或者更高，預(yù)選時(shí)間為約5分鐘或者更長(zhǎng)。在另一個(gè)例子中，預(yù)選溫度為約90°C或者更高，預(yù)選時(shí)間為約60分鐘或者更長(zhǎng)。熱穩(wěn)定性多肽包含在高溫下可逆地變性，使得在所描述的暴露之后恢復(fù)其生物活性的至少一半(即至少50%)的多肽。
[0073]本文使用的關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“熱不穩(wěn)定的(熱不穩(wěn)定性)”和“非熱穩(wěn)定的(非熱穩(wěn)定性)”可互換使用，指多肽在經(jīng)歷預(yù)選的高溫達(dá)預(yù)選的一段時(shí)間后不能夠保持生物活性。生物活性可以是該多肽的酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)或者任何其他活性或者性質(zhì)特征。多肽如果在暴露于預(yù)選的高溫達(dá)預(yù)選的一段時(shí)間之后失去其原始活性的至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或者甚至幾乎100%，則認(rèn)為它是熱不穩(wěn)定的。這種溫度和時(shí)間剛剛在上文描述，以及在本說(shuō)明書中別處描述。對(duì)熱不穩(wěn)定性多肽的數(shù)目或者類型沒有限制。例子包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶、過(guò)水解酶、植酸酶、漆酶以及其他商業(yè)上相關(guān)的酶、結(jié)合蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。
[0074]本文所用的詞語(yǔ)“目的蛋白”指需要在里氏木霉中表達(dá)的EGV之外的多肽。這種蛋白可以是酶、結(jié)合蛋白、表面活性蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等。目的蛋白可以是熱穩(wěn)定的或者熱不穩(wěn)定的。在指明的情況下，它是熱穩(wěn)定的。
[0075]本文所用的詞語(yǔ)“基本上無(wú)活性”(或者類似詞語(yǔ))意思是，指定的活性要么在多肽混合物中不可檢測(cè)到，要么以不會(huì)干擾該混合物的預(yù)定用途的量存在。
[0076]本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指包含通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基的任何長(zhǎng)度的聚合物。本文使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母密碼或三字母密碼。聚合物可為直鏈或支鏈的，其可包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且其可間夾有非氨基酸。所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋天然修飾或通過(guò)干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；所述干預(yù)例如是二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，如與標(biāo)記組分綴合。在所述定義中還包括(例如)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)類似物的多肽，以及本領(lǐng)域中已知的其他修改形式。
[0077]如本文所用，功能上和/或結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì)認(rèn)為是“相關(guān)蛋白”。這種蛋白質(zhì)可衍自另外屬和/或種的生物，或者甚至另外類別的生物(例如細(xì)菌和真菌)。相關(guān)蛋白質(zhì)還涵蓋通過(guò)一級(jí)序列分析確定的、通過(guò)二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)分析確定的或通過(guò)免疫交叉反應(yīng)性確定的同源物。
[0078]本文所用的術(shù)語(yǔ)“衍生的多肽/蛋白質(zhì)”是指這樣的蛋白質(zhì)，其通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸`序列中的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在該蛋白質(zhì)的一端或兩端或者氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸、和/或在該氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自另一蛋白質(zhì)。制備蛋白質(zhì)衍生物可通過(guò)修飾編碼天然蛋白的DNA序列、將DNA序列轉(zhuǎn)到合適的宿主中以及表達(dá)經(jīng)修飾的DNA序列以形成衍生的蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。
[0079]相關(guān)(以及衍生的)蛋白質(zhì)包括“變體蛋白質(zhì)”。變體蛋白質(zhì)由于置換、缺失和/或插入少量的氨基酸殘基而不同于參考蛋白質(zhì)/親本蛋白質(zhì)，例如野生型蛋白質(zhì)。不同的氨基酸殘基的數(shù)量可以為一個(gè)或多個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基。變體蛋白質(zhì)與參考蛋白質(zhì)享有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或甚至至少約99%或更高的氨基酸序列同一性。變體蛋白質(zhì)還可在所選的基序、結(jié)構(gòu)域、表位、保守性區(qū)域等方面不同于參考蛋白質(zhì)。
[0080]本文所用的術(shù)語(yǔ)“類似序列”指蛋白質(zhì)內(nèi)的提供與目的蛋白(即，通常是原始目的蛋白)相似的功能、三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守殘基的序列。例如，在包含α -螺旋或β -片層結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域中，類似序列中的置換氨基酸優(yōu)選地保持相同的特定結(jié)構(gòu)。所述術(shù)語(yǔ)還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，開發(fā)了類似序列，使得置換氨基酸導(dǎo)致變體酶顯示相似或改進(jìn)的功能。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注蛋白質(zhì)中氨基酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守性殘基位于目的區(qū)段或片段處或其附近。因此，在目的區(qū)段或片段包含(例如)α-螺旋或β -片層結(jié)構(gòu)的情況下，置換氨基酸優(yōu)選地保持該特定結(jié)構(gòu)。
[0081]本文所用的術(shù)語(yǔ)“同源蛋白”是指與參考蛋白具有相似的活性和/或結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。這并不意味著各同源物一定在進(jìn)化上相關(guān)因此，該術(shù)語(yǔ)的意圖是涵蓋得自不同生物體的相同、相似或相應(yīng)的酶(即，在結(jié)構(gòu)和功能方面)。在一些實(shí)施例中，很希望識(shí)別與參考蛋白質(zhì)具有相似的四級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源物。在一些實(shí)施例中，同源蛋白質(zhì)引起與參考蛋白質(zhì)相似的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，工程構(gòu)造出同源蛋白質(zhì)以制備具有所需活性的酶。
[0082]序列之間同源性的程度可使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法確定(參見例如Smith 和 Waterman, (1981)，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》(Adv.Appl.Math.) ,2:482 ；Needleman 和ffunsch, (1970),《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.), 48:443 ;Pearson 和 Lipman, (1988),《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444 ;程序，如在威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麥迪遜市遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；以及Devereux 等人,(1984),《核酸研究》(Nucleic Acids Res.), 12:387-395)。
[0083]例如，PILEUP是可用于測(cè)定序列同源程度的程序。PILEUP使用漸進(jìn)式逐對(duì)比對(duì)從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多個(gè)序列對(duì)比。其還能夠繪制顯示聚類關(guān)系(用于產(chǎn)生比對(duì))的樹形圖。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進(jìn)式比對(duì)方法(參見Feng和Doolittle, (1987),《分子進(jìn)化學(xué)雜志》(J.Mol.Evol.)，35: 351-360)。所述方法與Higgins和Sharp描述的方法類似(Higgins和Sharp， 1989年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》(CABIOS)，5:151-153)?？捎玫腜ILEUP參數(shù)包括:默認(rèn)間隙權(quán)重3.00、默認(rèn)間隙長(zhǎng)度權(quán)重0.10，以及加權(quán)末端間隙。可用的算法的另一例子是Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，(1990),《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，215:403-410 ;以及Karlin等人，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，90:5873-5787)。一種尤其可用的 BLAST 程序是WU-BLAST-2 程序(參見 Altschul 等人，(1996)，《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.)，266:460-480)。參數(shù) “W”、“T”和“X”確定比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認(rèn)值:字長(zhǎng)(W)為11，BL0SUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915)比對(duì)(B)為50，期望值(E) % 10,Mi 5，N' _4，以及對(duì)兩條鏈的比較。
[0084]本文所用的詞語(yǔ)“基本上相似”和“基本上相同”，在至少兩個(gè)核酸或者多肽的情形中，通常意指多核苷酸或者多肽包含與參考(即野生型)序列相比具有至少約70%同一性、至少約75%同一性、至少約80%同一性、至少約85%同一性、至少約90%同一性、至少約91%同一^丨生、至少約92%同一‘丨生、至少約93%同一‘丨生、至少約94%同一‘丨生、至少約95%同一‘丨生、至少約96%同一性、至少約97%同一性、至少約98%同一性、或者甚至至少約99%或者更高的同一性的序列。序列同一性可使用諸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類的已知程序，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定。(參見例如Altschul等人，(1990)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.) ,215:403-410 ；Henikoff 等人，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA), 89:10915 ；Karin等人，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，90:5873 ;以及Higgins等人，(1988)，《基因》(Gene) ,73:237-244)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。另外，可使用FASTA對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索(Pearson等人，(1988),《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444-2448)。兩條多肽實(shí)質(zhì)上相同的一個(gè)指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。通常，因保守氨基酸置換而不同的多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。因此，一種多肽與第二多肽實(shí)質(zhì)上一致，例如，在此情況下兩個(gè)多肽僅因保守置換而不同。兩種核酸序列實(shí)質(zhì)上一致的另一個(gè)指示是兩種分子在嚴(yán)格的條件(例如，在中至高嚴(yán)格度的范圍內(nèi))下彼此雜交。
[0085]本文所用的“野生 型”和“天然”基因或者蛋白質(zhì)是那些在自然界中存在的基因或者蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“野生型序列”和“野生型基因/蛋白質(zhì)”在本文中互換使用，指天然的或天然存在于宿主細(xì)胞中的序列。
[0086]本文所用的“基因缺失”指基因從宿主細(xì)胞的基因組中移除。
[0087]本文所用的“基因中斷”廣義上指任何能極大地防止功能性基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的遺傳操作或化學(xué)操作。示例性的中斷方法包括完全或部分缺失掉基因的任何部分(包括多肽編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者別的調(diào)節(jié)元件在內(nèi)，或者誘變它們(包括置換、插入、缺失及其組合在內(nèi))，以極大地防止功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)。
[0088]本文所用的“功能性基因”是能夠被細(xì)胞組分使用以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物(通常是蛋白質(zhì))的基因?！肮δ苄曰颉迸c“被中斷基因”相反，后者被修飾，使得它們不能被細(xì)胞組分使用以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物。示例性的功能性基因包括但不限于EGV之外的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、過(guò)水解酶、酯酶、果膠酸裂解酶、果膠酶、漆酶、氧化酶、還原酶、酰胺酶以及其他酶類、結(jié)構(gòu)蛋白、表面活性蛋白、結(jié)合蛋白等。
[0089]如本文所用，里氏木霉宿主細(xì)胞如果已被遺傳變更或者化學(xué)變更以防止表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性纖維素酶活性(例如使用本文描述的測(cè)定法測(cè)定)的EGV多肽的產(chǎn)生，則它們“已被修飾以防止熱穩(wěn)定性EGV纖維素酶的產(chǎn)生”。這種修飾包括但不限于對(duì)egl5進(jìn)行的缺失、對(duì)egl5進(jìn)行的中斷、對(duì)egl5進(jìn)行的使得所編碼的EGV多肽不再熱穩(wěn)定的修飾、對(duì)egl5進(jìn)行的使得所編碼的EGV多肽不再表現(xiàn)出纖維素酶活性的修飾、對(duì)egl5進(jìn)行的使得所編碼的EGV多肽不再被分泌的修飾、對(duì)啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件進(jìn)行的使得EGV不被表達(dá)的修飾，以及它們的組合。
[0090]本文所用的“功能多肽/蛋白”是這樣的蛋白質(zhì)，其具有活性如酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)等，且未被誘變、截短或以其他方式修飾以去除(或者實(shí)質(zhì)上消除)該活性。如所指明，功能多肽可以是熱穩(wěn)定的或者熱不穩(wěn)定的。
[0091]本文所用的“不想要的活性”是在從里氏木霉宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)制品中不需要的活性(例如酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)等)。不想要的活性通常在還包含具有所需的或者合乎需要的活性的目的蛋白的蛋白質(zhì)制品中出現(xiàn)。
[0092]本文所用的“發(fā)酵液組合物”指含有目的蛋白如疏水蛋白的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基可包括細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片，且可以進(jìn)行濃縮。示例性的發(fā)酵液組合物是含疏水蛋白的經(jīng)超濾濃縮的發(fā)酵液。
[0093]本文所用的“甘露聚糖酶甘露糖單位(MMU) ”，是在0.24%刺槐豆膠(LBG)存在下在pH 7.0和50°C下每分鐘產(chǎn)生I微摩爾的還原端對(duì)等物(包括但不限于D-甘露糖)所需的甘露聚糖酶量每毫克疏水蛋白。
[0094]本文所用的“內(nèi)切葡聚糖酶單位(EGU) ”是每分鐘產(chǎn)生I微摩爾的還原糖所需的內(nèi)切葡聚糖酶量每毫克疏水蛋白。
[0095]本文所用的“蛋白酶單位(PU) ”對(duì)應(yīng)于在pH 6.2和25 °C下每分鐘水解I微摩爾的N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)所需的半胱氨酸蛋白酶量每毫克疏水蛋白。
[0096]本文所用的“處理”食品或者其他材料以在該材料中實(shí)現(xiàn)變化，意思是使該食品或者其他材料與從里氏木霉宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)制品接觸，其中該蛋白質(zhì)制品中存在的一種或者多種蛋白質(zhì)作用于該食品或者其他材料的組分，以由于例如酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)等而引起化學(xué)變化。處理的例子包括使焙烤食品制品接觸淀粉酶以水解支鏈淀粉、使食品制品接觸脂肪酶以產(chǎn)生乳化劑和使食品制品接觸疏水蛋白以改變質(zhì)構(gòu)。
[0097]本文所用的單數(shù)名詞涵蓋多個(gè)指代物，除非上下文明確地表明并非如此。本文引用的全部參考文獻(xiàn)均以引用方式全文并入本文。 [0098]除非另外指明，否則以下縮寫/首字母縮略詞具有下列含義:
[0099]
【權(quán)利要求】
1.一種木霉屬宿主細(xì)胞，其包含: 修飾，其中所述修飾顯著地減少或者防止所述木霉屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生熱穩(wěn)定性內(nèi)切葡聚糖酶 V (EGV)， 與啟動(dòng)子有效連接的編碼目的多肽的外源目的核酸分子，所述啟動(dòng)子使得至少一種內(nèi)源多肽和所述目的多肽各自被所述木霉屬宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述修飾在參與EGV的表達(dá)的核苷酸中包含一個(gè)或者多個(gè)缺失或者中斷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述中斷或者缺失包含EGV編碼基因或者編碼區(qū)或者用于EGV的表達(dá)的啟動(dòng)子或者調(diào)節(jié)元件的缺失或者中斷。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述缺失或者中斷包含egl5的缺失或者中斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述缺失或者中斷包含egl5中斷。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述缺失或者中斷包含egl5缺失。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中egl5通過(guò)同源重組進(jìn)行缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述內(nèi)源多肽包含纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶或者它們的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述熱不穩(wěn)定性酶包含纖維素酶或者半纖維素酶。`
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉屬宿主細(xì)胞,其中所述木霉屬是里氏木霉。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述目的多肽是疏水蛋白II。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述目的多肽是疏水蛋白II。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述目的多肽是熱穩(wěn)定的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉屬宿主細(xì)胞，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的。
15.一種在根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞中制備所述目的多肽的方法，其中所述目的多肽是熱穩(wěn)定的，所述方法包括: 將所述經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞在適合于所述經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育以產(chǎn)生所述熱穩(wěn)定性目的多肽和所述內(nèi)源多肽，由此所述內(nèi)源多肽和所述熱穩(wěn)定性目的多肽各自被所述經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞表達(dá)；以及 使所述熱穩(wěn)定性目的多肽和所述內(nèi)源多肽經(jīng)歷高溫， 其中所述高溫足以顯著地滅活所述內(nèi)源多肽，但不足以滅活所述熱穩(wěn)定性目的多肽和EGV，如果它存在的話； 由此所述熱穩(wěn)定性目的多肽得以以活性或者功能形式產(chǎn)生，而基本上不存在來(lái)自所述內(nèi)源多肽的活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，還包括在將所述目的多肽和所述內(nèi)源多肽經(jīng)歷所述高溫的步驟之前從所述經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞分離蛋白質(zhì)混合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞表達(dá)外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖苷酶或者它們的組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述熱穩(wěn)定性目的多肽是可逆地可熱變性的。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述高溫是約90°C或者更高的溫度。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中暴露于所述高溫達(dá)約5分鐘或者更長(zhǎng)時(shí)間。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中暴露于所述高溫達(dá)約60分鐘或者更長(zhǎng)時(shí)間。
22.—種控制由根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞表達(dá)的所述目的多肽的活性的方法，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的，所述方法包括使所述熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性目的多肽和所述內(nèi)源多肽經(jīng)歷高溫， 其中所述高溫足以滅活所述內(nèi)源多肽和所述熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述內(nèi)源多肽是纖維素酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，還包括在使所述熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性目的多肽經(jīng)歷所述高溫之前，使所述目的多肽與所述目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫幕衔锝佑|。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，還包括在使所述熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性目的多肽經(jīng)歷所述高溫之前，使所述目的多肽與所述纖維素酶和所述目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫囊环N或者多種化合物接觸。
26.一種從絲狀真菌宿主細(xì)胞獲得或者可從絲狀真菌宿主細(xì)胞獲得并包含疏水蛋白II的發(fā)酵液組合物，所述發(fā)酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性，且其中所述疏水蛋白II在根據(jù)權(quán)利要求11或者12中任一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。
27.一種從根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的木霉屬獲得或者可從所述經(jīng)修飾的木霉屬獲得的發(fā)酵液。
28.一種控制權(quán)利要求27所述的發(fā)酵液中的所述目的多肽的活性的方法，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的，所述方法包括使所述發(fā)酵液經(jīng)歷足以滅活所述內(nèi)源多肽和所述熱敏感性或者熱不穩(wěn)定性多肽的高溫。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述內(nèi)源多肽是纖維素酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，還包括在使所述發(fā)酵液經(jīng)歷所述高溫之前，使所述發(fā)酵液與所述目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫哪康幕衔锝佑|。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，還包括在使所述發(fā)酵液經(jīng)歷所述高溫之前，使所述發(fā)酵液與所述纖維素酶和所述目的多肽能夠?qū)ζ淦鹱饔玫囊环N或者多種化合物接觸。
32.—種控制從權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞獲得的組合物中存在的纖維素酶的活性的方法，其中所述組合物包含至少一種EGV之外的纖維素酶，所述方法包括使所述組合物經(jīng)歷足以滅活所述目的多肽的高溫，并且其中在使所述組合物經(jīng)歷高溫之后所述組合物基本上不含纖維素酶活性。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩(wěn)定的。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述目的多肽是耐熱的或者熱穩(wěn)定的。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中使所述組合物經(jīng)歷高溫是在食品或者飲料中進(jìn)行。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述高溫是小于約100°C。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中從所述經(jīng)修飾的木霉屬宿主細(xì)胞獲得的組合物是包含疏水蛋白的發(fā)酵液。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK103562402SQ201180050749
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月20日
【發(fā)明者】A·米亞斯尼科夫, M·舍爾, M·華德 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司