專利名稱：抗ox40抗體和使用其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及0X40受體活化的調(diào)節(jié)，以及更具體地，涉及調(diào)節(jié)0X40受體以抑制產(chǎn)生白介素IO(IL-1O)的⑶4+1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(“Trl細(xì)胞”)和表達(dá)Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(本文中有時也稱為“FoXp3+T-reg”細(xì)胞)的免疫抑制功能以及從CD4+細(xì)胞或初始細(xì)胞產(chǎn)生Trl細(xì)胞和IL-10生產(chǎn)。
_2] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2010年8月23號提交的美國專利申請序列第61/375，999號和2010年9月8日提交的美國專利申請序列第61/380，827號的優(yōu)先權(quán)。這兩個申請通過引用并入本文。
_4] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或研發(fā)的聲明本申請?jiān)诿绹鴩⑿l(wèi)生研究院授予的ROl A1061645-0UR01 A1062888-01和U19A1071130-01的政府支持下進(jìn)行。政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)利。聯(lián)合研究協(xié)議參與方的名稱無。對序列表的引用本發(fā)明內(nèi)容包括作為于2011 年8月23號生成的名為sequence listing, txt的根據(jù)37C.F.R.§ 1.52(e) (v)的文本文檔提交的序列表，具有13，836字節(jié)大小，其通過引用并入本文。所附的序列描述和序列表符合如37C.F.R.§ § 1.821-1.825中所闡述的適用于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的法則。序列表包含如符合Nucleic AcidsRes.13:3021-3030(1985)和 the Biochemical J.219 (N0.2):345-373(1984)中描述的IUPAC-1UBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義的用于核苷酸序列字符的單字母代碼和用于氨基酸的三字母代碼。用于核苷酸和氨基酸序列信息的符號和格式符合37C.F.R.§ 1.822中闡述的法則。
背景技術(shù)：
Trl細(xì)胞在外周耐受中具有關(guān)鍵作用。Trl細(xì)胞在于炎性免疫響應(yīng)期間將組織損傷限制于宿主中特別重要。Trl細(xì)胞的產(chǎn)生伴隨體內(nèi)和體外THl和TH2免疫響應(yīng)。Trl細(xì)胞在抗原驅(qū)動的T細(xì)胞免疫響應(yīng)期間從初始⑶4+T細(xì)胞生成。Trl在對經(jīng)由TCR、CD28和IL-2受體的信號傳導(dǎo)的響應(yīng)中是無變應(yīng)性的并且具有抑制抗原驅(qū)動的初始CD4+T細(xì)胞體內(nèi)和體外增殖的能力。Trl細(xì)胞具有抑制自身免疫疾病的發(fā)展并限制對微生物病原體的免疫響應(yīng)的等級的能力。盡管已經(jīng)研究了導(dǎo)致Trl細(xì)胞的分子信號，但關(guān)于反向調(diào)節(jié)這些細(xì)胞生成的分子信號所知甚少。盡管免疫抑制藥物、細(xì)胞活素類、共刺激分子和DC已經(jīng)牽涉于Trl細(xì)胞的誘導(dǎo)中，但反向調(diào)節(jié)Trl細(xì)胞的信號仍然是難以捉摸的。

發(fā)明內(nèi)容
0X40受體的活化阻斷Trl從初始或記憶⑶4+T細(xì)胞產(chǎn)生以及IL-10從Trl細(xì)胞生成和Trl細(xì)胞的免疫抑制功能。0X40受體的活化還阻斷IL-10經(jīng)由FoXp3+T-reg細(xì)胞產(chǎn)生和免疫抑制功能。像這樣，本文給出的是與0X40受體結(jié)合的激動劑抗體，由此所述激動劑調(diào)節(jié)0X40受體的活化以阻斷IL-10細(xì)胞因子分泌和/或Trl和FoXp3+T-reg細(xì)胞全部免疫抑制功能?；旧?，抗體可模擬0X40配體并且觸發(fā)Trl和/或初始T調(diào)節(jié)性細(xì)胞(“nTreg” )，也稱為 “Foxp3+T_reg”，上的 0X40 受體。如我們在共同未決專利申請美國序列第11/659，266和12/861，135號中所示，0X40L抑制由免疫抑制藥物地塞米松和維他命D3誘導(dǎo)的產(chǎn)生IL-10的Trl細(xì)胞從初始和記憶⑶4+T細(xì)胞的生成和功能。我們發(fā)現(xiàn)0X40L抑制產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成和功能。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)經(jīng)由0X40L的信號傳導(dǎo)0X40L抑制培養(yǎng)中產(chǎn)生人類IL-10的免疫抑制T細(xì)胞的產(chǎn)生。0X40L的這一獨(dú)有的功能未被兩個另外的共刺激TNF家族成員，GITR-配體和4-1BB-配體，所共有。0X40L還強(qiáng)烈抑制由可誘導(dǎo)的共刺激配體和不成熟DC提供的兩種生理刺激誘導(dǎo)的產(chǎn)生IL-10的Trl細(xì)胞的產(chǎn)生和功能。經(jīng)由單克隆抗體、小分子或者經(jīng)由0X40L或與其具有至少90百分比同源性的蛋白信號傳導(dǎo)人類T細(xì)胞上的0X40受體調(diào)節(jié)和控制產(chǎn)生IL-10的免疫抑制T細(xì)胞的產(chǎn)生和功能。所述發(fā)現(xiàn)帶來多個治療應(yīng)用。例如，激動型抗體、小分子或0X40L可被用于抑制產(chǎn)生IL-10的免疫抑制T細(xì)胞的產(chǎn)生和功能并因此可被用于增強(qiáng)免疫響應(yīng)以治療癌癥和傳染病或者作為癌癥疫苗的佐劑。0X40或0X40L的拮抗型抗體或拮抗型小分子可備用增強(qiáng)產(chǎn)生IL-10的免疫抑制T細(xì)胞的產(chǎn)生和功能并因此可被用于自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病的療法的開發(fā)。我們的發(fā)現(xiàn)還為用于癌癥或可選擇地自身免疫疾病和移植物抗宿主疾病的治療上文開發(fā)提供篩選活化T細(xì)胞上0X40受體(或反向阻斷0X40信號傳導(dǎo))的抗體或小分子的高通量方法。本文提供結(jié)合人0X40受體的單克隆抗體和人抗體(本文有時稱為“抗0X40抗體”和/或其另外的變化形式)。這些抗體被用于治療或預(yù)防其病理涉及0X40的急性或慢性疾病或病況。在一個方面，描述了與人0X40結(jié)合并作為癌癥治療或抗自身免疫疾病治療有效的分離的人抗體或其抗原結(jié)合片段。本文公開的抗0X40抗體中的任一個可被用作藥物?？?X40抗體中的任一 個或多個可被用于治療本文描述的多種癌癥或自身免疫疾病中的一種或多種。本文提供結(jié)合0X40的分離的人源化抗體。本文描述的分離的抗體與0X40結(jié)合并且可與來自下列基因編碼的0X40結(jié)合:NCBI登錄號NP_003317、Genp印t登錄號P23510或與其具有90百分比同源性的基因。本文提供的分離的抗體還與具有下列GenBank登錄號中的一個的 0X40 受體結(jié)合:AAB39944、CAE11757 或 AA105071。如本文教導(dǎo)的，示例性的是與0X40結(jié)合的分離的抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)CDRl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含氨基酸序列SEQ ID N0.3的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID N0.7的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID N0.9的輕鏈可變區(qū)⑶R3。而且，另一個實(shí)例是與0X40結(jié)合的分離的抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQID NO:13的重鏈可變區(qū)CDRl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的重鏈可變區(qū)CDR2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID N0.15的重鏈可變區(qū)CDR3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID N0.19的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID N0.20的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID N0.21的輕鏈可變區(qū)CDR3?？蛇x擇地，分離的抗體可具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或13的重鏈可變區(qū)⑶Rl ;包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或14的重鏈可變區(qū)⑶R2和/或包含氨基酸序列SEQID NO:3或15的重鏈可變區(qū)⑶R3，或與其具有90百分比同源性的重鏈可變區(qū)⑶R。此外，分離的抗體可具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或19的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或20的輕鏈可變區(qū)⑶R2和/或包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或21的輕鏈可變區(qū)CDR3或與其具有90百分比同源性的重鏈可變區(qū)。所述分離的抗體可具有包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10、11、22或23或者與氨基酸序列SEQ ID NO:10、11、22或23具有90百分比同源性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(“VL”)。所述分離的抗體可具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:4、5、16和17或者與氨基酸序列SEQ IDN0:4、5、16和17具有90百分比同源性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(“VH”)。像這樣，作為一個實(shí)例，分離的抗體可包含SEQ ID NO: 5的可變重鏈序列和SEQ ID N0:11的可變輕鏈序列或與其具有90百分比同源性的序列。相似地，分離的抗體可具有SEQ ID N0:17的可變重鏈序列和SEQ ID NO:23的 可變輕鏈序列或與其具有90百分比同源性的序列。所述分離的抗體可具有由核酸序列SEQ ID NO: 12或24或與核酸序列SEQ ID NO:12或24具有90百分比同一性的核酸序列編碼的可變輕鏈。所述分離的抗體可具有由核酸序列SEQ ID NO:6或18或與核酸序列SEQ ID NO:6或18具有90百分比同一性的核酸序列編碼的可變重鏈。本文還提供單克隆抗體。所述單克隆抗體可具有包含氨基酸序列SEQ ID N0:10或22或與氨基酸序列SEQ ID NO:10或22的氨基酸序列具有至少90百分比的氨基酸序列的可變輕鏈。本文還提供具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或16或與氨基酸序列SEQ IDNO:4或16具有至少90百分比的氨基酸序列的可變重鏈的單克隆抗體。本文還提供編碼本文教導(dǎo)的抗0X40抗體中的任一種的分離的核酸。本文還提供的是宿主細(xì)胞，其每個包含編碼本文描述的抗0X40抗體中的任一種的分離的核酸。進(jìn)一步提供生產(chǎn)抗體(例如包含編碼本文描述的抗0X40抗體中的任一種的分離的核酸的宿主細(xì)胞)的方法，其包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以便生產(chǎn)抗體和/或從所述宿主細(xì)胞回收所述抗體。


上文簡要概括的本發(fā)明的更具體的描述可通過參照在形成本說明書一部分的附圖中說明的其實(shí)施方案來完成，因此上文列舉的本發(fā)明的特征、方面和優(yōu)點(diǎn)以及其他將以變得清楚的方式獲得并被更詳細(xì)地理解，。然而應(yīng)注意的是

本發(fā)明的某些實(shí)施方案但并不因此被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)楸景l(fā)明可允許其他相當(dāng)?shù)挠行?shí)施方案。圖1顯示浸潤人類濾泡性淋巴瘤(FL)組織并與腫瘤B細(xì)胞和單核細(xì)胞共定位的F0XP3+Treg。左邊:F0XP3+Treg(紅色)和⑶20+B淋巴瘤細(xì)胞(綠色)的雙重免疫染色；右邊:F0XP3+Treg (紅色)和⑶IIc+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞/DC (綠色)。圖2A和2B患有FL的患者中增加數(shù)目的⑶4+F0XP3+Treg。從處于治療前的初次診斷的六個患有FL的患者獲得腫瘤細(xì)胞和PBMC。還從六個正常供體獲得PBMC用于比較。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占全部⑶4+T細(xì)胞的百分比通過⑶4+⑶25+CD127ffiF0XP3+Treg的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來確定。圖2A顯示Treg的代表性FACS分析。FL PBMC和FL腫瘤細(xì)胞來源于相同的患者。圖2B顯示所有供體的Treg百分比。單劃線表示平均值。圖3顯示從FL分離IC0S+F0XP3+或IC0S_F0XP3+Treg。從未進(jìn)行任何治療的脾樣本獲得單細(xì)胞懸浮液。在測定當(dāng)天將細(xì)胞解凍。將富集的⑶4+CD8TD14_CD16TD56TDllc_TCR Y δΤ細(xì)胞分為⑶25<￡和⑶25*亞類。將⑶4+⑶25*F0XP3+Treg根據(jù)ICOS的表面表達(dá)進(jìn)一步分選為ICOS*和ICOSffi亞類。在所有亞類中確定F0XP3的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
圖4顯示瘤內(nèi)Treg抑制FL中浸潤⑶4+⑶25_T細(xì)胞的增殖并且所述抑制可被抗IL-10中和抗體部分阻斷。用通過重組CD40L預(yù)活化的自體腫瘤細(xì)胞在自體IC0S+F0XP3+Treg或IC0ST0XP3+Treg或抗IL-10 (10 μ g/ml)存在或不存在的情況下培養(yǎng)浸潤C(jī)FSE標(biāo)記的⑶4+⑶25_腫瘤的T細(xì)胞。培養(yǎng)72小時后，通過CFSE稀釋法的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析確定⑶4+⑶25_細(xì)胞的增殖。圖5A顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。圖5B顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案如ELISA所確定的初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。圖5C顯示通過根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如[3H]胸腺嘧啶核苷摻入所確定的生產(chǎn)IL-10的Trl細(xì)胞的抑制功能。圖6A顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的記憶CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。圖6B顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如ELISA所確定的記憶CD4+T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。圖7A顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。圖7B顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如ELISA所確定的初始CD4+T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。圖7C顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案計(jì)數(shù)的可見T細(xì)胞的數(shù)目。圖8A顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。圖8B顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如ELISA所確定的初始⑶4+T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。圖SC顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的記憶CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。圖8D顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如ELISA所確定的記憶⑶4+T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。圖SE顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。圖8F顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如ELISA所確定的初始⑶4+T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如ELISA所確定的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的IL-1O產(chǎn)生。圖10顯示如ELISA所確定的抗L-0X40的抗人類0X40雜交瘤上清液對比L親本細(xì)胞的篩選結(jié)果。圖11顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析所確定的人0X40特異性單克隆抗體的篩選。圖12顯示使用根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的使用表達(dá)0X40的SUPM2細(xì)胞(SUPM2-0X40)確認(rèn)抗h0X40單克隆抗體特異性。圖13由顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的可抑制從vit D3(O-1yM)/Dex (50nm)、CD32L/IC0SL 和抗 CD3/CD28 (0.2 μ g/ml)的刺激的 CD4+T 細(xì)胞生成產(chǎn)生 IL-10的細(xì)胞(Trl)的0X40特異性單克隆抗體。代表性的熒光活化細(xì)胞分選(FACS)數(shù)據(jù)示于A而產(chǎn)生IL-10的細(xì)胞占0X40單克隆抗體處理的百分比示于B中。圖14顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的抑制Trl細(xì)胞生成同時刺激⑶4+T細(xì)胞增殖的h0X40特異性單克隆抗體的結(jié)果。圖15A、15B和15C詳述根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的對0X40單克隆抗體抑制Trl細(xì)胞從⑶4+T細(xì)胞生成的能力的滴定。代表性的FACS數(shù)據(jù)示于圖15A而用九種0X40單克隆抗體處理后Trl細(xì)胞的百分比示于圖15B。圖16A、16B和16C顯示抑制從⑶4+T細(xì)胞生成產(chǎn)生IL-10的Trl細(xì)胞還抑制IC0S+CD4+⑶25*⑶127—Treg的IL-10生產(chǎn)和免疫抑制功能的0X40特異性單克隆抗體。將新鮮分選的 Icos+CDfCDZssCDUT-Treg(Cos+Treg)用抗 CD3 (0.2 μ g/ml)在 CD32L/IC0SL 細(xì)胞和CD32L/0X40L細(xì)胞(圖16A)或0X40單克隆抗體或?qū)φ湛贵w(圖16B)存在的情況下刺激5天。之后將細(xì)胞用抗⑶3/⑶28再刺激24小時并且通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定上清液的IL-10。 圖16是基于單核細(xì)胞的增殖測定，顯示抗體中的兩種阻斷ICOS+Treg功能。圖17A^P 17Β顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的抑制Trl細(xì)胞生成并且阻斷F0XP3+CD4+CD25sTreg功能的抗h0X40單克隆抗體的鑒定，代表性的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析示于圖17A。六種單克隆抗體的數(shù)據(jù)示于圖17B。圖18證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的不抑制Trl細(xì)胞生成但阻斷F0XP3+CD4+ra25*Treg功能的抗h0X40單克隆抗體的鑒定。圖19A和19B顯示根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的阻斷淋巴瘤來源的⑶4+⑶25sTreg功能的抗h0X40激動型抗體。代表性的FACS分析示于圖19A中而所有實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)示于圖19B中。圖20顯示抗h0X40單克隆抗體可結(jié)合獼猴⑶4+T細(xì)胞。如所示的，抗h0X40mAb中的六種可結(jié)合獼猴活化的CD4+T細(xì)胞并與獼猴0X40結(jié)合并活化0X40信號傳導(dǎo)。圖21顯示實(shí)施例1中的HU106-222批次I和II抗體中的每一種由具有約50kD分子量的重鏈和約25kD分子量的輕鏈組成。HU106-222批次I和II抗體的純度顯示高于95%。圖22顯示小鼠106-122、Ch106和Hul06_222(批次II)抗體結(jié)合L/0X40細(xì)胞的分析(實(shí)施例1)。圖23描繪Hul06 IgGl/ κ抗體的表達(dá)載體(Expression Vector)的圖示結(jié)構(gòu)。從頂部的Sail位點(diǎn)順時針前進(jìn)，質(zhì)粒含有從人巨細(xì)胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子和增強(qiáng)子(CMV啟動子)開始的重鏈轉(zhuǎn)錄單元以起始抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。CMV啟動子之后是VH外顯子、含有包括CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3外顯子以及插入的內(nèi)含子的人Y _1重鏈恒定區(qū)的基因組序列以及CH3外顯子之后的多腺苷酸化位點(diǎn)。重鏈基因序列之后，輕鏈轉(zhuǎn)錄單元從CMV啟動子開始，之后是VL外顯子和內(nèi)含有人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)以及在其前面的部分內(nèi)含子的基因組序列以及CL外顯子之后的多腺苷酸化位點(diǎn)。輕鏈基因之后是SV40早期啟動子(SV40啟動子)，大腸桿菌(E.coli)黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和含有SV40多腺苷酸化位點(diǎn)的片段(SV40 poly(A)位點(diǎn))。最后，質(zhì)粒含有質(zhì)粒pUC19的一部分，包含細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(pUC ori)和β內(nèi)酰胺酶基因(β內(nèi)酰胺酶)。相關(guān)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)示于圖中。圖24顯示Hu 106-222批次I和II抗體之間結(jié)合L/0X40細(xì)胞的對比(下文實(shí)施例I)。圖25顯示Hull9-122由具有約50kD分子量的重鏈和具有約25kD分子量的輕鏈組成。Hul 19的純度顯示高于95% (下文實(shí)施例1I)。圖26顯示本文描述的Chl 19-122和Hul 19-122抗體的FACS分析的結(jié)果(下文實(shí)施例II)。圖27顯示人源化抗人0X40 mAb克隆119-122 (Hull9)及其結(jié)合FcR的突變抗體(Hull9-AA)增強(qiáng)初始⑶4+T細(xì)胞增殖。與親本小鼠抗人0X40mAb (小鼠119-122)相比Hull9-122產(chǎn)生較好的T細(xì)胞刺激活性。然而，嵌合的抗人0X40mAb(Chll9，小鼠VH和VL但是人Y-1和κ恒定區(qū))未能增強(qiáng)T細(xì)胞增殖。圖28顯示結(jié)合FcR的突變?nèi)嗽椿谷?X40mAb克隆106-222 (Hu222AA)和嵌合的抗人0X40mAb克隆106-222 (Ch222)增強(qiáng)抗⑶3刺激的初始⑶4+T細(xì)胞增殖。這些抗體與親本小鼠抗人0X40mAb (小鼠222)相比具有相似的刺激活性。然而，完整的人源化抗人0X40Ab, Hu222，與人IgGl相比未增強(qiáng)T細(xì)胞增殖。圖29A和B顯示人源化的和小鼠抗人0X40mAb克隆119-122阻斷⑶4+Treg抑制性功能。圖30提供數(shù)據(jù)顯示抗人0X40抗體增強(qiáng)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞增殖，使用板結(jié)合抗體。圖31顯示人源化和小鼠抗人0X40抗體需要交聯(lián)以便增強(qiáng)T細(xì)胞增殖。圖32顯示抗人0X40抗體阻斷⑶4+F0XP3+nTreg的活性，使用板結(jié)合抗體。圖33顯示高濃度的小鼠抗人0X40抗體優(yōu)先殺死F0XP3+Treg。圖34顯示小鼠抗人0X40mAb直接作用于效應(yīng)子T細(xì)胞或nTreg以阻斷Treg的抑制性功能。圖35A、35B和35C顯示小鼠中用h0X40+CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抗h0X40mAb腫瘤處理的結(jié)果?？谷?X40mAb促進(jìn)體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)展和存活。治療性疫苗接種時間表示于圖35A。體內(nèi)代表性生物發(fā)光圖片示于圖35B。抗體腫瘤處理的結(jié)果示于圖35C。 圖36 顯示 106-222、人源化 106-222 (Hul06)以及人類受體 X61012 (GenBank 登錄號)VH序列的氨基酸序列的比對被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。序列上的數(shù)字表不根據(jù) Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition，NIH Publication N0.91-3242, U.S.Department of Health and HumanServices, 1991)的定位。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而位點(diǎn)編號可能不同。在圖36中，由Kabat et al.(1991)定義的CDR序列是106-222VH中下劃線的。X61012 VH中CDR殘基在圖中被省略。在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與106-222VH框架同源的人VH序列并將由人X61012 cDNA(X61012VH)編碼的VH序列選作人源化接受體。106-222VH的CDR序列首先被轉(zhuǎn)移至X61012VH的相應(yīng)位點(diǎn)。之后在106-222可變區(qū)的三維模型顯示與⑶R明顯接觸的框架位點(diǎn)上，小鼠106-222 VH的氨基酸殘基取代為相應(yīng)的人殘基。這些取代在位點(diǎn)46和94進(jìn)行(Hul06 VH中下劃線的)。此外，發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的V區(qū)亞組中不典型的人框架殘基被最典型的殘基取代以減少可能的免疫原性。這一取代在位點(diǎn)105進(jìn)行(Hul06 VH中雙下劃線的)。圖37 顯示 106-222、人源化 106-222 (Hu106)以及人接受體 AJ388641 (GenBank 登錄號)VL序列的氨基酸序列的比對被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。序列上的數(shù)字表示根據(jù)Kabat et al.(1991)的定位。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而位點(diǎn)編號可能不同。由Kabat et al.(I)定義的CDR序列是106-222VH中下劃線的。AJ388641VL中⑶R殘基在圖中被省略。 在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與106-222 VL框架同源的人VL序列并將由人AJ388641 cDNA(AJ388641 VL)編碼的VL序列選作人源化接受體。106-222 VL的CDR序列被轉(zhuǎn)移至AJ388641 VL的相應(yīng)位點(diǎn)。在人源化形式中不進(jìn)行框架取代。圖38顯示兩側(cè)為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線的)的Hul06 VH基因的核苷酸序列與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VH的N端氨基酸殘基(Q)是雙劃線的。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而序列表中的位點(diǎn)編號可能不同。內(nèi)含子序列為斜體。用SpeI和HindIII消化的Hul06 VH基因片段被克隆至圖23所示的表達(dá)載體中的相應(yīng)位點(diǎn)之間。圖39顯示兩側(cè)為NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線的)的Hul06 VH基因的核苷酸序列與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VL的N端氨基酸殘基(D)是雙劃線的。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。內(nèi)含子序列為斜體。用NheI和EcoRI消化的Hul06VL基因片段被克隆至圖23所示的表達(dá)載體中的相應(yīng)位點(diǎn)之間。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而序列表中位點(diǎn)編號可能不同。圖40 顯示 119-122、人源化 119-122 (Hul 19)和人接受體 Z14189 (GenBank 登錄號)VH序列的氨基酸序列的比對被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。序列上的數(shù)字表示根據(jù)Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication N0.91-3242,U.S.Department of Health and Human Services,1991)的定位。由Kabat et al.(1991)定義的CDR序列是119-122VH中下劃線的。Z14189 VH中⑶R殘基在圖中被省略。在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與119-122 VH框架同源的人VH序列并將由人Z14189 cDNA(Z14189VH)編碼的VH序列選作人源化接受體。119-122 VH的CDR序列首先被轉(zhuǎn)移至Z14189 VH的相應(yīng)位點(diǎn)。之后在119-122可變區(qū)的三維模型顯示與⑶R明顯接觸的框架位點(diǎn)上，小鼠119-122 VH的氨基酸殘基取代為相應(yīng)的人殘基。這些取代在位點(diǎn)26、27、28、30和47進(jìn)行(Hull9 VH中下劃線的)。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而序列表中位點(diǎn)編號可能不同。
圖41 顯示 119-122、人源化 119-122 (Hull9)和人類接受體 M29469 (GenBank 登錄號)VL序列的氨基酸序列的比對被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。序列上的數(shù)字表示根據(jù) Kabat et al.(1991)定位。由 Kabat et al.(I)定義的 CDR 序列是 119-122 VH 中下劃線的。M29469 VL中⑶R殘基在序列中被省略。在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與119-122VL框架同源的人VL序列并將由人M29469 cDNA(M29469 VL)編碼的VL序列選作人源化接受體。119-122 VL的⑶R序列被轉(zhuǎn)移至M29469 VL的相應(yīng)位點(diǎn)。在人源化形式中不進(jìn)行框架取代。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而序列表中位點(diǎn)編號可能不同。圖42顯示兩側(cè)為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線的)的Hull9 VH基因的核苷酸序列與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VH的N端氨基酸殘基(E)是雙劃線的。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。內(nèi)含子序列為斜體。用SpeI和HindIII消化的Hull9 VH基因片段被克隆至圖23所示的表達(dá)載體中的相應(yīng)位點(diǎn)之間。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而序列表中位點(diǎn)編號可能不同。圖43顯示兩側(cè)為NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線的)的Hull9 VL基因的核苷酸序列與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起被顯示。氨基酸序列以單字母規(guī)則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VL的N端氨基酸殘基(E)是雙劃線的。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。內(nèi)含子序列為斜體。用NheI和EcoRI消化的Hull9VL基因片段被克隆至圖23所示的表達(dá)載體中的相應(yīng)位點(diǎn)之間。本文要求的相同序列同樣提供于序列表中而序列表中位點(diǎn)編號可能不同。
具體實(shí)施例方式術(shù)語“抗體”包括四個多肽鏈，通過二硫鍵內(nèi)部連接的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)，組成的免疫球蛋白分子。每個重鏈由重鏈可變區(qū)(本文簡稱為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文簡稱為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈 恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步分為超變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))，其間散布更保守的區(qū)(稱為構(gòu)架區(qū)(FR))。各VH和VL由三個⑶R和四個FR組成，從氨基末端至羧基末端的排列順序如下:FRUDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或“抗體部分”)包括保持特異性結(jié)合抗原(例如h0X40)能力的抗體片段。曾經(jīng)證實(shí)抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體片段完成。屬于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”的結(jié)合片段實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的一價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，包括通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個Fab片段的二價(jià)片段；(iii)VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)抗體單臂VL和VH結(jié)構(gòu)城組成的Fv片段；(V)VH 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的 dAb 片段(Ward et al., (1989)Nature 341:544-546);以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)城VL和VH由獨(dú)立的基因編碼，但是它們可利用重組方法以合成連接體連接在一起，合成連接體使它們能夠被制成其中VL和VH區(qū)成對形成一價(jià)分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird etal.(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。這種單鏈抗體也預(yù)期包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。也包括其他形式的單鏈抗體例如雙體。雙體是雙價(jià)、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)在單一多肽鏈上，但是采用太短而不能允許同一鏈上的所述兩個結(jié)構(gòu)域成對的連接體，由此迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域成對，而產(chǎn)生2個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如Holliger,P.，et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.，et al.(1994)Structure 2:1121-1123)。進(jìn)而,抗體或其抗原結(jié)合部分可以成為所述抗體或其抗原結(jié)合部分與一個或多個其他蛋白或肽通過共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合形成的更大免疫粘附分子的一部分。這樣的免疫粘附分子的實(shí)例包括利用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)制成四聚scFv分子(Kipriyanov, S.M., et al.(1995) Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)以及利用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C端多組氨酸標(biāo)記制成雙價(jià)生物素化scFv分子(Kipriyanov，
S.M.,et al.(1994)Mol.1mmunol.31:1047-1058)。可采用常規(guī)技術(shù)例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體，由完整抗體制備諸如Fab和F(ab’)2片段的抗體部分。而且如本文所述，可采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。優(yōu)選的抗原結(jié)合部分是完整結(jié)構(gòu)域或成對的完整結(jié)構(gòu)域。0X40/0X40-配體(0X40受體)/ (0X40L)是對于T細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞因子產(chǎn)生和記憶細(xì)胞生成來說很關(guān)鍵的一對共刺激分子。在體外實(shí)驗(yàn)中早就證實(shí)經(jīng)由CD4+T細(xì)胞上的0X40的信號傳導(dǎo)導(dǎo)致TH2發(fā)育但不導(dǎo)致THl發(fā)育。這些結(jié)果得到體內(nèi)研究的支持，其顯示阻斷0X40/0X40L相互作用防止TH2介導(dǎo)的變態(tài)免疫相應(yīng)的誘導(dǎo)和維持。然而，阻斷0X40/0X40L相互作用改善或防止THl介導(dǎo)的疾病。而且，施用溶解的0X40L或?qū)?X40L轉(zhuǎn)基因至腫瘤中顯示顯著增強(qiáng)小鼠中的抗腫瘤免疫性。最近的研究也顯示0X40/0X40L可在促進(jìn)CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)中起作用。如本文所討論的，0X40信號傳導(dǎo)阻斷CD4+CD25+天然存在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制性功能并且0X40/0X40L對在外周免疫性對比耐受性的整體調(diào)控上起到關(guān)鍵作用。術(shù)語“ Kabat編號”、“ Kabat定義”和“ Kabat標(biāo)記”在本文中可互換使用。本領(lǐng)域公知的這些術(shù)語是指將比抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的其他氨基酸殘基更易變(即超變)的氨基酸殘基編號的系統(tǒng)(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad, Sc1.190:382-391 和 Kabat, E.A., et a l.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and HumanServices, NIH Publication N0.91-3242)。術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體,例如利用轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(在以下部分II中進(jìn)一步介紹)、從重組組合人抗體文庫分離的抗體(在以下部分III中進(jìn)一步介紹)、從人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如(Taylor, L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或者涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有人種系免疫球蛋白序列來源的可變區(qū)和恒定區(qū)(參見 Kabat, E.A., et al.(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication N0.91-3242)?！胺蛛x的抗體”包括基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如基本不含特異性結(jié)合非h0X40抗原的抗體的特異性結(jié)合h0X40的分離抗體)。特異性結(jié)合h0X40的分離抗體可結(jié)合其他物種的0X40分子。此外，分離抗體可基本不含其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語“活性”包括各種活性，例如抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和性例如結(jié)合0X40抗原的抗人0X40抗體和/或抗體的活化效價(jià)例如其與h0X40受體的結(jié)合活化h0X40的生物活性的抗0X40抗體或人L/0X40細(xì)胞測定中結(jié)合的受體的活化。本文使用的術(shù)語“K.”預(yù)期是指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。本文使用的術(shù)語“Kd”預(yù)期是指特定抗體抗原相互作用的解離常數(shù)。
術(shù)語“表面等離子體共振”包括允許例如采用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia BiosensorAB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)通過檢測生物傳感器基質(zhì)中的蛋白濃度改變而分析實(shí)時生物特異性作用的光學(xué)現(xiàn)象。關(guān)于其進(jìn)一步的介紹參見實(shí)施例5和Jonsson，U., et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26 ；Jonsson, U., et al.(1991)Biotechniques11:620-627 ；Johnsson,B., et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131 和 Johnnson, B., etal.(1991)Anal.Biochem.198:268_277。術(shù)語“載體”包括能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一個核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保|(zhì)粒是另外的DNA節(jié)段可連接入其中的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中另外的DNA節(jié)段可連接入病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細(xì)胞時整合入宿主細(xì)胞的基因組中，由此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠控制與其可操做地連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或者簡稱為“表達(dá)載體”)。一般來說，重組DNA技術(shù)中表達(dá)載體的應(yīng)用通常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可交互使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明預(yù)期包括這些其他形式的表達(dá)載體，例如具有同等功能的病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱為“宿主細(xì)胞”)包括重組表達(dá)載體已經(jīng)引入其中的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是這些術(shù)語不僅指特定對象的細(xì)胞，而且也指這種細(xì)胞的子代細(xì)胞。因?yàn)橥蛔兓颦h(huán)境的影響連續(xù)傳代時可能發(fā)生某些改變，所以這樣的子代細(xì)胞可能事實(shí)上與親代細(xì)胞不完全相同，但是仍然包括在本文使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。術(shù)語“單克隆抗體”(單克隆抗體)是指從基本上同源的抗體的群獲得的抗體或類似抗體的群并且不被解釋為需要通過任何特殊的方法生產(chǎn)抗體，包括但不限于，單克隆抗體可通過由Kohler和Milstein (Nature, 256:495-497,1975)最初描述的雜交瘤方法或通過重組DNA方法制得。術(shù)語“嵌合抗體”(或“嵌合的免疫球蛋白”)是指包含與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源的重鏈和/或輕鏈而所述鏈的其余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體中的相應(yīng)片段相同或同源的分子以及這些抗體的片段，條件是它們表現(xiàn)出所期望的生物學(xué)活性(Cabilly et al.(1984)，infra ；Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81:6851)。術(shù)語“人源化抗體”是指包含來自非人(例如，小鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。人源化抗體可包括不會顯著改變其結(jié)合和/或生物學(xué)活性的保守氨基酸取代或來自相同或不同物種的非天然殘基。這些抗體是包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于絕大部分來說，人源化抗體是人類免疫球蛋白(接受抗體)，其中來自接受者的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自具有所期望的性質(zhì)的非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、駱駝、牛、山羊或兔的CDR的殘基代替。而且人源化抗體可包含在接受抗體或引進(jìn)的CDR中都不存在的殘基或框架序列?？蛇M(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步將抗體表現(xiàn)精細(xì)化和最大化。因此，通常人源化抗體將包含至少一個以及在一個方面兩個可變結(jié)構(gòu)域的全部或基本上全部，其中超變環(huán)的全部或基本上全部相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些而FR區(qū)的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的一部分。(參見例如Cabilly et al.，U.S.Pat.N0.4, 816, 567 ；Cabilly et al., European Patent N0.0, 125, 023B1 ；Boss et al.,U.S.Pat.N0.4, 816, 397 ；Boss et al., European Patent N0.0, 120, 694B1 ；Neuberger,M.S.et al., WO 86/01533 ；Neuberger, M.S.et al., European Patent N0.0, 194, 276 BI ；Winter, U.S.Pat.N0.5, 225, 539 ；ffinter, European Patent N0.0, 239, 400 BI ；Padlan,E.A.et al.,European Patent Application N0.0, 519, 596 Al ；Queen et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol 86:10029-10033)。本文所描述和要求的抗體中的每一個可以是指，單數(shù)或復(fù)數(shù)形式，如:“抗0X40抗體；” “抗h0X40抗體；” “抗h0X40單克隆抗體；” “抗人0X40抗體；” “抗人0X40mAb ； ” “抗h0X40 mAb” “h0X40特異性單克隆抗體；” “抗0X40L抗體；” “抗h0X40L抗體;” “抗人0X40L抗體；” “人0X40特異性抗體；” “人0X40特異性單克隆抗體；” “人0X40特異性抗體；” “抗人0X40特異性抗體；” “抗人0X40特異性單克隆抗體；” “h_0X40特異性抗體；” “h-0X40特異性單克隆抗體；” “h0X40agonistic抗體；” “h0X40拮抗劑“和/或其其他相似變體。如通過引用并入本文的美國專利申請第11/659,266號題目為“Methods toTreat Disease States by Influencing the singalling of OX—40-Receptors and HighThroughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof，，中所公開的，其公開了 0X40L的功能是反向調(diào)節(jié) 由免疫抑制劑Dex和vit D3、IC0SL或不成熟的DC所誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞的生成。這一發(fā)現(xiàn)證明0X40L增強(qiáng)免疫性并且打破免疫耐受性的一般機(jī)制。使用免疫組織學(xué)分析(圖1)、細(xì)胞內(nèi)染色(圖2)和細(xì)胞分選(圖3)，我們已經(jīng)顯示產(chǎn)生IC0S+IL-10和產(chǎn)生COS-TGF- β -的Treg浸潤人FL組織。這些FL來源的F0XP3+Treg可強(qiáng)烈抑制響應(yīng)于0040_配體預(yù)活化的自體淋巴瘤細(xì)胞的浸潤F0XP3_CD4+CD25_腫瘤的T細(xì)胞的增殖(圖4)。ICOS+Treg的抑制活性可被中和抗IL-10抗體部分阻斷，證實(shí)FL中產(chǎn)生ICOS+IL-1O的Treg的作用。在圖2的實(shí)驗(yàn)中，腫瘤細(xì)胞和PBMC從具有治療前的初始診斷的7個患者獲得。也從7個健康供體獲得PBMC用于比較。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占整個⑶4+T細(xì)胞的百分比通過⑶4+CD25+⑶127ffiF0XP3+Treg的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來確定。圖2A提供Treg的代表性FACS分析而圖2B顯示所有供體的Treg的百分比。還發(fā)現(xiàn)的是0X40L抑制Dex和vit D3誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從⑶4+T細(xì)胞的生成。已知的是免疫抑制性藥物Dex和vit D3的組合持續(xù)誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為Trl細(xì)胞。為了證實(shí)0X40L是否可抑制Trl細(xì)胞的生成和功能，將初始⑶4+T細(xì)胞與抗⑶3以及抗⑶28單克隆抗體在0X40L轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞存在或不存在的情況下在四種不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天，所述培養(yǎng)條件包括:Trl (Dex 和 vit D3) ； (2) THl (IL-12) ； (3) TH2 (IL-4)或(4)中性的(僅培養(yǎng)基)(圖5A)。通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和ELISA分析經(jīng)由已預(yù)處理的T細(xì)胞的IL-1O產(chǎn)生。在圖5A的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。將初始⑶4+T細(xì)胞與抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體在IL-2存在的情況下在親本L細(xì)胞或0X40L-L細(xì)胞上與所顯示的重組細(xì)胞因子或試劑一起培養(yǎng)7天。在每個點(diǎn)印跡概況中指示各個產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比。所述結(jié)果顯示0X40L抑制不同極化信號誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從初始CD4+T細(xì)胞生成。如圖5A中所示，在中性或THl或TH2條件下培養(yǎng)的初始⑶4+T細(xì)胞生成2%至4%的Trl細(xì)胞。在采用Dex加上vit D3的培養(yǎng)中生成超過15%的Trl細(xì)胞。在所有培養(yǎng)條件下，加入0X40L完全阻斷Tr I細(xì)胞的生成，而促進(jìn)產(chǎn)生TNF- α的T細(xì)胞的生成。這些數(shù)據(jù)通過ELISA數(shù)據(jù)(圖5Β)證實(shí)。在圖5Β的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA測量用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之后上清液中經(jīng)由初始⑶4+細(xì)胞的細(xì)胞因子生產(chǎn)。將初始CD4+T細(xì)胞與抗CD3和抗CD28單克隆抗體在IL-2存在的情況下在親本L細(xì)胞或0X40L-L細(xì)胞上與所指示的重組細(xì)胞因子或試劑一起培養(yǎng)7天。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土四個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(SEM)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。結(jié)果顯示0X40L抑制不同極化信號誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從初始⑶4+T細(xì)胞生成。

用Trl條件(Dex加上vit D3)預(yù)處理的初始⑶4+T細(xì)胞是無變應(yīng)性的并且具有抑制初始CD4+T細(xì)胞響應(yīng)于抗CD3和抗CD28單克隆抗體的增殖的能力(圖5C)。在圖5C的實(shí)驗(yàn)中，通過[3H]胸腺嘧啶核苷摻入測量T細(xì)胞中的抑制性功能。所指示的T細(xì)胞群的混合物通過抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激。誤差條代表三個孔的SEM。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用相同的Trl條件預(yù)處理的初始CD4+T細(xì)胞在0X40L存在的情況下強(qiáng)烈增殖并且未能抑制響應(yīng)于抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體的初始⑶4+T細(xì)胞的增殖。數(shù)據(jù)顯示0X40L阻斷功能性Trl細(xì)胞從Dex和vit D3誘導(dǎo)的初始⑶4+T細(xì)胞生成。發(fā)現(xiàn)Trl細(xì)胞可從記憶⑶4+CD45RATD45R0+T細(xì)胞生成而0X40L可抑制Trl細(xì)胞從記憶⑶4+T細(xì)胞生成。將記憶⑶4+CD45RATD45R0+T細(xì)胞與抗⑶3加上抗⑶28單克隆抗體在轉(zhuǎn)染0X40L的L細(xì)胞Trl條件(Dex加上vit D3)存在或不存在的條件下培養(yǎng)7天。在圖6A的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了 CD4+記憶T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。將記憶⑶4+⑶45R0+⑶25_記憶T細(xì)胞與抗⑶3、抗⑶28單克隆抗體和IL-2 —起在親本L細(xì)胞或0X40L-L細(xì)胞上在Dex加上vit D3存在或不存在的情況下培養(yǎng)7天。在每個點(diǎn)印跡概況中指示各個產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比。所述結(jié)果顯示0X40L抑制Dex加上vitD3條件下Trl細(xì)胞從記憶⑶4+T細(xì)胞生成。圖6A顯示大量的Trl細(xì)胞(> 20% )在采用Dex加上vit D3的培養(yǎng)中從⑶4+記憶T細(xì)胞生成。加入0X40L完全阻斷Trl細(xì)胞的生成并且促進(jìn)產(chǎn)生TNF- α的細(xì)胞從記憶⑶4+Τ細(xì)胞生成。通過IL-10ELISA分析(圖6Β)證實(shí)了 Dex加上vit D3促進(jìn)從記憶CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的能力并且這一能力可被0X40L抑制。在圖6B的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之后測量上清液中經(jīng)由記憶⑶4+T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土四個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)SEM。結(jié)果顯示0X40L在采用Dex加上vit D3的條件下抑制Trl細(xì)胞從記憶⑶4+T細(xì)胞生成。還發(fā)現(xiàn)0X40L抑制Trl細(xì)胞的生成而其他的TNF家族成員(GITR1和4-1BBL)并沒有。在TNF超家族中，0X40L、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體-配體(GITRl)和4-1BB-配體(4-1BBL)具有對T細(xì)胞的共刺激功能。為了證實(shí)0X40L在Trl細(xì)胞的抑制中是否是唯一的，將初始⑶4+T細(xì)胞用抗⑶3加上抗⑶28單克隆抗體以及Dex加上vit D3與親本L細(xì)胞或用0X40L、GITR1或4-1BBL轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞一起培養(yǎng)7天。盡管0X40L、GITR1和4-1BBL都促進(jìn)產(chǎn)生TNF- α的細(xì)胞的生成，但僅0X40L抑制Trl細(xì)胞的生成(圖7Α和7Β)。在圖7Α的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。將初始⑶4+Τ細(xì)胞與抗⑶3、抗⑶28單克隆抗體和IL-2 —起在親本L細(xì)胞、0X40L-L細(xì)胞、GITRl-L細(xì)胞或4-1BBL-L細(xì)胞上在Dex加上vit D3存在的情況下培養(yǎng)7天。在每個點(diǎn)印跡概況中指示各個產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比。所述結(jié)果顯示0X40L抑制Trl細(xì)胞生成而GITRl和4-1BBL都不抑制。在圖7Β的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之后測量上清液中初始⑶4+細(xì)胞的IL-10。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土四個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。所述結(jié)果顯示0X40L抑制Trl細(xì)胞生成而GITRl和4-1BBL都不抑制。0X40L、GITRl和4-1BBL都促進(jìn)整體T細(xì)胞數(shù)目的擴(kuò)張(圖7C)。在圖7C的實(shí)驗(yàn)中，將可見T細(xì)胞的數(shù)目計(jì)數(shù)。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土四個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，圖7A、7B和7C的結(jié)果顯示0X40L抑制Trl細(xì)胞生成而GITRl和4-1BBL都不抑制。這些數(shù)據(jù)表明在已知共刺激T細(xì)胞的TNF超家族的三個成員中，0X40L在抑制Trl細(xì)胞生成上具有新的并且獨(dú)特的功能。還發(fā)現(xiàn)0X40L抑制ICOSL或不成熟DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞生成。ICOS和CD28代表T細(xì)胞上表達(dá)的⑶28家族的兩個正向共刺激受體。通過激動型抗體或ICOSL的經(jīng)由ICOS的信號傳導(dǎo)已經(jīng)顯示促進(jìn)⑶4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。為了研究0X40L是否可抑制ICOS誘導(dǎo)經(jīng)由⑶4+T細(xì)胞的IL-10生產(chǎn)的能力，將初始和記憶⑶4+T細(xì)胞與抗⑶3 —起在ICOSL轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞或ICOSL轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞存在的情況下在0X40L存在的情況下培養(yǎng)7天。

在圖8A的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。將初始⑶4+T細(xì)胞在用抗⑶3單克隆抗體預(yù)包被的親本L細(xì)胞、ICOSL-L細(xì)胞和L細(xì)胞的混合物或ICOSL-L細(xì)胞和0X40L-L細(xì)胞的混合物上培養(yǎng)7天。在每個點(diǎn)印跡概況中指示各個產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比。所述結(jié)果顯示0X40L抑制ICOSL誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從初始⑶4+T細(xì)胞的生成。在圖8B的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA測量在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之后上清液中初始⑶4+細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。將初始⑶4+T細(xì)胞在用抗⑶3單克隆抗體預(yù)包被的親本L細(xì)胞、ICOSL-L細(xì)胞和L細(xì)胞的混合物或ICOSL-L細(xì)胞和0X40L-L細(xì)胞的混合物上培養(yǎng)7天。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。所述結(jié)果顯示0X40L抑制ICOSL誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從初始⑶4+T細(xì)胞的生成。在圖8C的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了記憶⑶4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。將記憶⑶4+T細(xì)胞在用抗⑶3單克隆抗體預(yù)包被的親本L細(xì)胞、ICOSL-L細(xì)胞和L細(xì)胞的混合物或ICOSL-L細(xì)胞和0X40L-L細(xì)胞的混合物上培養(yǎng)7天。在每個點(diǎn)印跡概況中指示各個產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比。所述結(jié)果顯示0X40L抑制ICOSL誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從記憶⑶4+T細(xì)胞的生成。在圖8D的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA測量在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之后上清液中記憶⑶4+細(xì)胞的IL-1O產(chǎn)生。將記憶⑶4+T細(xì)胞在用抗⑶3單克隆抗體預(yù)包被的親本L細(xì)胞、ICOSL-L細(xì)胞和L細(xì)胞的混合物或ICOSL-L細(xì)胞和0X40L-L細(xì)胞的混合物上培養(yǎng)7天。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。所述結(jié)果顯示0X40L抑制ICOSL誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從記憶⑶4+T細(xì)胞的生成。圖8A、8B、8C和8D的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ICOSL顯著促進(jìn)Trl細(xì)胞從初始和記憶CD4+T細(xì)胞的生成。加入0X40L完全抑制Trl細(xì)胞從初始和記憶⑶4+T細(xì)胞的生成而強(qiáng)烈促進(jìn)生產(chǎn)TNF-α的細(xì)胞的生成。已知的是不成熟的DC或用IFN- α或IL-10處理的DC可誘導(dǎo)初始⑶4+Τ細(xì)胞分化為Trl細(xì)胞。已經(jīng)研究0X40L是否可以抑制DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞的生成。如圖8Ε中所示，不成熟的DC或用IFN-α或IL-10處理的DC都誘導(dǎo)來自初始⑶4+Τ細(xì)胞的超過10%的Trl細(xì)胞的生成。通過比較，由⑶40L活化的DC誘導(dǎo)強(qiáng)烈的THl響應(yīng)，伴隨著約3% Trl細(xì)胞的生成。在DC-T細(xì)胞培養(yǎng)物中加入重組的0X40L完全抑制由不成熟的DC或用IFN-α或IL-10處理的DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞的生成。此外，0X40L同樣抑制由⑶40L活化的成熟DC誘導(dǎo)的其余數(shù)目的Trl細(xì)胞的生成。在圖8Ε的實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了 CD4+初始T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分析。將初始CD4+T細(xì)胞在可溶重組0X40L存在或不存在的條件下與不成熟的DC或用IFN- α、IL-10和⑶40L培養(yǎng)的DC —起培養(yǎng)7天。在每個點(diǎn)印跡概況中指示各個產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比。所述結(jié)果顯示0X40L抑制DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從⑶4+Τ細(xì)胞的生成。通過ELISA數(shù)據(jù)(圖8F)證實(shí)0X40L抑制DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞生成的能力。在圖8F的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之后測量上清液中經(jīng)由初始⑶4+細(xì)胞的IL-10生產(chǎn)。將初始⑶4+T細(xì)胞在可溶重組0X40L存在或不存在的條件下與不成熟的DC或用IFN-α、IL-10和⑶40L培養(yǎng)的DC —起培養(yǎng)7天。將數(shù)據(jù)顯示為平均值土三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。所述結(jié)果顯示0X40L抑制DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞從⑶4+Τ細(xì)胞的生成。因此，這些數(shù)據(jù)證明0X40L可抑制ICOSL和DC提供的更多生理信號誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞生成。 之前已經(jīng)表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的區(qū)域內(nèi)高度表達(dá)并且該B細(xì)胞參與將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞募集至淋巴瘤的區(qū)域中。研究了影響0X40受體的信號傳導(dǎo)(例如通過0X40L)是否能夠提供抗B細(xì)胞淋巴瘤的治療。冷藏保存的來自B細(xì)胞淋巴瘤患者的樣品被用于評估0X40L停止Trl細(xì)胞的能力。所用的樣品是從未受到任何治療的脾樣品獲得的濾泡性淋巴瘤。將細(xì)胞解凍，400Χ IO6冷凍細(xì)胞產(chǎn)生127Χ IO6活細(xì)胞和33.9Χ IO6死細(xì)胞(79%活力)。通過FACS染色確定足夠數(shù)目的⑶25+細(xì)胞。在圖9的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA確定產(chǎn)生IC0S+IL-10的Treg的IL-10分泌。將Treg細(xì)胞在兩種不同條件下培養(yǎng)。在條件I中，將⑶25+/IC0S+細(xì)胞與抗⑶3 —起在IL-2(900y Ι/ml)存在的條件下在親本L細(xì)胞或0X40L-L細(xì)胞上與抗ICOS抗體一起培養(yǎng)3-6天。在條件2中，將⑶25+/IC0S+細(xì)胞與抗CD3在ICOS-L-L細(xì)胞或0X40L-L和ICOS-L-L細(xì)胞的混合物上的IL-2 (900 μ I/ml)存在的條件下培養(yǎng)3-6天。通過ELISA測量上清液中的細(xì)胞因子生產(chǎn)。所述結(jié)果顯示0X40L顯著抑制Treg細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，0X40L具有抑制由免疫抑制性藥物Dex加上vitD3、IC0SL，或DC誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞的生成和功能的能力的發(fā)現(xiàn)使得0X40L在不同形式的CD4-或CD8介導(dǎo)的免疫響應(yīng)中促進(jìn)免疫性并打破耐受性的新機(jī)制更受矚目。0X40L在IL-12誘導(dǎo)的THl或IL-4誘導(dǎo)的TH2響應(yīng)期間抑制Trl細(xì)胞生成的能力表明0X40L可控制THl或TH2介導(dǎo)的免疫響應(yīng)的等級。而且0X40L抑制Trl細(xì)胞生成的能力似乎是0X40L的獨(dú)有特性，因?yàn)槠渌麅蓚€TNF家族成員GITRl和4-1BBL不具有這一功能特性。而且，0X40L抑制經(jīng)由Treg細(xì)胞的IL-1O產(chǎn)生的能力將0X40L鑒定為對B細(xì)胞淋巴瘤和其他癌癥的有力治療。已經(jīng)鑒定促進(jìn)Trl細(xì)胞生成的許多分子，包括IL-10、IFN-α、ICOSL和免疫抑制化合物例如Dex加上vit D3。0X40L代表不僅從初始⑶4+Τ細(xì)胞還有從記憶⑶4+Τ細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成Trl細(xì)胞的有力抑制劑。0X40/0X40L的這一新特性可解釋最近的顯示0X40信號傳導(dǎo)允許無變應(yīng)性的自體反應(yīng)T細(xì)胞獲得效應(yīng)子細(xì)胞功能的報(bào)道。靶向0X40/0X40L因此為人類變應(yīng)性和自身免疫疾病的提供了治療并且也為人傳染性疾病和癌癥提供了對治療的開發(fā)，所述癌癥包括但不限于黑色素瘤，腦癌，骨癌，白血病，淋巴瘤，上皮細(xì)胞來源的瘤樣病變(上皮癌)例如基底細(xì)胞癌，腺癌，胃腸道癌例如唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌和胃癌，結(jié)腸癌，肝癌，膀胱癌，胰腺癌，卵巢癌，子宮頸癌，肺癌，乳腺癌和皮膚癌例如鱗狀細(xì)胞和基底細(xì)胞癌，前列腺癌，腎細(xì)胞癌和其它已知的癌癥?？赏ㄟ^本文描述的抗體和方法預(yù)防或治療的疾病或病況包括癌癥的預(yù)防或治療，所述癌癥例如皮膚性T-細(xì)胞白血病、頭部和頸部腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、高級別膠質(zhì)瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、黑色素瘤、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、白血病、骨髓增生異常綜合征(前白血病病況)和多發(fā)性骨髓瘤。通常，任何癌癥的轉(zhuǎn)移都可用本文描述的化合物和方法預(yù)防或治療?？贵w也可被用于預(yù)防或治療增生性血管生成病況，包括毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、靜脈血管瘤、成血管細(xì)胞瘤。其他病癥、疾病或病況包括病毒疾病，其中的一些傳統(tǒng)上被認(rèn)為是“不可治療的”?？贵w例如也可被用于將單個病原體的株分類。研究人員可使用本文描述的抗體鑒定并追蹤有機(jī)體中特定的細(xì)胞或分子。通常術(shù)語“癌癥”和“癌的”是指或描述通常由不受調(diào)控的細(xì)胞生長所表征的哺乳動物中的生理學(xué)病況。更具體地，可使用本文描述的抗體中的任一種或多種或其變體治療或預(yù)防的癌癥包括但不限于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤和白血病。這些癌癥的更具體的實(shí)例包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌)，腹膜的癌，肝細(xì)胞癌，胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃腸道癌和胃腸道間質(zhì)癌)，胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，子宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌或腎臟癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)和各種類型的頭部和頸部腫瘤，黑色素瘤，淺表擴(kuò)散性黑色素瘤，惡性雀斑樣痣黑色素瘤，肢端雀斑樣痣黑色素瘤，結(jié)節(jié)性黑色素瘤以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴細(xì)胞(SL)NHL ;中等級/濾泡性NHL ;中等級彌漫性NHL ;高等級免疫母細(xì)胞性NHL ;高等級淋巴母細(xì)胞性NHL ;高等級小無裂細(xì)胞NHL ;大腫塊NHL ;套細(xì)胞淋巴瘤；AIDS相關(guān)淋巴瘤和巨球蛋白血癥)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，多毛細(xì)胞白血病，慢性粒細(xì)胞白血病和移植后淋巴組織增生癥(PTLD)以及與瘢痣病有關(guān)的異常血管增生，水腫(例如與腦腫瘤相關(guān))和梅格斯綜合征。 本文提供治療或預(yù)防免疫病癥的方法。這些方法包括向需要這些治療的受治療者施用有效量的所述抗體。在一些實(shí)施方案中，所述免疫病癥是米那一病癥或自身免疫病癥。所述病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎性腸病，多發(fā)性硬化癥，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在一些實(shí)施方案中，所述病癥是與病毒、子君或其他感染劑有關(guān)的疾病。
而且，本文描述的抗體和方法可被用于預(yù)防或治療炎性疾病和病況例如骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和自身免疫疾病例如狼瘡和混合自身免疫疾病。例如，本文描述的抗體可被用于治療各種自身免疫疾病和炎性疾病，其包括向需要其的受治療者施用治療上有效的量的所述抗體的步驟，其中所述自身免疫疾病和炎性疾病是下列疾病中的任一種或多種:胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、糖尿病、多發(fā)性硬化、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、急性播散性腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無力癥、甲狀腺炎、橋本病、原發(fā)性粘液水腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、艾迪生病、過早絕經(jīng)、男性不育癥、青少年糖尿病、肺出血腎炎綜合征、尋常型天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、晶狀體源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性白細(xì)胞減少、原發(fā)性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎Hb_、隱源性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、硬皮病、韋格內(nèi)氏肉芽腫、多/皮肌炎、盤狀LE、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克隆氏病、牛皮癬、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂抗體綜合征、再生障礙性貧血、自身免疫性肝炎、腹腔疾病、格雷夫斯病、格-巴二氏綜合征(GBS)、特發(fā)性血小板減少性紫癜、眼球陣攣肌陣攣綜合征(OMS)、視神經(jīng)炎、ORd’ s thyroiditis、天皰瘡、多關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、賴特綜合征、多發(fā)性大動脈炎、顳動脈炎、溫抗體型自身免疫性溶血性貧血、韋格納肉芽腫、普禿、白塞病、查加斯病、慢性疲勞綜合征、家族性自主神經(jīng)機(jī)能異常、子宮內(nèi)膜異位癥、化膿性汗腺炎、間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、結(jié)節(jié)病、硬皮病、潰瘍性結(jié)腸炎、白癜風(fēng)、外陰痛、炎癥性皮膚病、過敏性接觸性皮炎、幽門螺桿菌(H.pylory)胃炎、慢性鼻腔炎性疾病、動脈粥樣硬化和移植物抗宿主病。更特別地，“自身免疫疾病”如本文所用的是產(chǎn)生自并直接抗個體自身組織或器官的疾病或病癥或其共分離或表現(xiàn)或從其產(chǎn)生的病況。自身免疫疾病可以指由具有對正常身體組織和抗原起反應(yīng)的抗體的B細(xì)胞的產(chǎn)生導(dǎo)致或加重的病況。同樣，自身免疫疾病是可引起對來自自身抗原(例如核抗原)的表位特異性的自身抗體分泌的疾病?？捎杀疚拿枋龅目贵w中的任一種或多種治療和/或預(yù)防的自身免疫疾病或病癥包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎例如急性關(guān)節(jié)炎、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性免疫性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、斯提耳病、椎關(guān)節(jié)炎和幼年發(fā)作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、arthritis chronica progrediente、變形性關(guān)節(jié)炎、Polyarthritis chronica primaria、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎)，炎性過度增生性皮膚病，銀屑病例如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰型銀屑病和指甲銀屑病，特應(yīng)性包括特應(yīng)性疾病例如花粉熱和喬布綜合征，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎、錢幣狀皮炎、脂溢性皮炎、非特異性皮炎、原發(fā)刺激性接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎，X連鎖高IgM血癥，過敏性眼內(nèi)炎性疾病，蕁麻疹例如慢性變應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹包括慢性自身免疫性蕁麻疹，肌炎，多發(fā)性肌炎/皮肌炎，幼年型皮肌炎，中毒性表皮壞死松解癥，硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)，硬化癥例如系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性硬化癥(MS)(諸如脊髓-視覺MS，原發(fā)性進(jìn)行性MS (PPMS)和硬化和復(fù)發(fā)緩解型MS (RRMS))、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化癥、共濟(jì)失調(diào)硬化癥，視神經(jīng)脊髓炎(NMO)，炎性腸病(IBD)(例如克羅恩病，自身免疫介導(dǎo)的胃腸道疾病，大腸炎諸如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、潰瘍性結(jié)腸炎(colitisulcerosa)、微小性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎以及和自身免疫性炎癥性腸道疾病)，腸道炎癥，壞疽性膿皮病，結(jié)節(jié)性紅斑，原發(fā)性硬化性膽管炎，呼吸窘迫綜合征包括成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎，葡萄膜全部或部分炎癥，虹膜炎，脈絡(luò)膜炎，自身免疫性血液疾病，類風(fēng)濕性脊柱炎，類風(fēng)濕性滑膜炎，遺傳性血管性水腫,腦神經(jīng)損傷例如腦膜炎、妊娠皰疹、妊娠性類天皰瘡、搔癢癥，自身免疫性卵巢功能早衰，由于自身免疫性病況的突發(fā)性聽力損失，IgE介導(dǎo)的疾病例如過敏反應(yīng)以及過敏性和特發(fā)性鼻炎，腦炎例如Rasmussen腦炎以及邊緣和/或腦干腦炎,葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和不具有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)例如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜-或膜性增生性GN(MPGN)包括I型和II型和迅速進(jìn)行性GN，增生性腎炎，自身免疫性多腺體內(nèi)分泌衰竭，龜頭炎包括漿細(xì)胞性局限性龜頭炎、龜頭包皮炎，心性環(huán)狀紅斑，持久性色素異 常性紅斑，eythema multiform，環(huán)狀肉芽腫，光澤苔癬，硬化萎縮苔癬，單純慢性苔癬，小棘苔癬，扁平苔癬，層狀魚鱗病，表皮松解性角化過度，惡化前角化病，壞疽性膿皮病，變應(yīng)性病況和反應(yīng)，變應(yīng)性反應(yīng)，濕疹包括變應(yīng)性或特發(fā)性濕疹、干性濕疹、汗皰和水泡性掌跖濕疹，哮喘例如哮喘支氣管炎、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥響應(yīng)的病癥，針對外來抗原的免疫反應(yīng)例如妊娠期間胎兒的ABO血型，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，狼瘡包括狼瘡性腎炎、狼瘡性腦炎、小兒狼瘡、非腎性狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡和盤狀紅斑狼瘡、脫發(fā)性狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)例如表皮SLE或亞急性表皮SLE，新生兒狼瘡綜合征(NLE)和播散性紅斑狼瘡，幼年發(fā)病型糖尿病(I型)包括小兒胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，成人發(fā)病型糖尿病(類型II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特發(fā)性尿崩癥，糖尿病性視網(wǎng)膜病，糖尿病性腎病，糖尿病性大動脈紊亂，細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的與急性和遲發(fā)性超敏感性相關(guān)的免疫響應(yīng)，結(jié)核，結(jié)節(jié)病，肉芽腫包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納肉芽腫，粒細(xì)胞缺乏，血管炎包括脈管炎、大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(Takayasu)動脈炎)、中等血管血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動脈炎/結(jié)節(jié)性動脈周圍炎)、顯微鏡下多動脈炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚脈管炎、高敏感性脈管炎、壞死性血管炎例如系統(tǒng)性壞死性血管炎以及ANCA相關(guān)性血管炎例如C丘-施二氏血管炎或綜合征(CSS)和ANCA相關(guān)性小血管血管炎，顳動脈炎，再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，Coombs陽性貧血，戴-布二氏貧血，溶血性貧血或免疫溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血(anemia perniciosa),阿狄森氏病,純紅細(xì)胞性貧血或發(fā)育不良(PRCA),凝血因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性白血球減少癥，全血細(xì)胞減少，白細(xì)胞減少，涉及白細(xì)胞血球滲出的疾病，CNS炎性疾病，阿爾茨海默氏病，帕金森病，多臟器損傷綜合征例如敗血癥、外傷或出血繼發(fā)的那些，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，白塞病/綜合征，Castleman綜合征,古德帕斯丘綜合征,雷諾綜合征，干燥綜合征，斯-約二氏綜合征，類天皰瘡例如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡，天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉性天皰瘡、天皰瘡粘膜性類天皰瘡和紅斑性天皰瘡)，自身免疫性多內(nèi)分泌病，萊特病或綜合征，熱損傷，先兆子癇，免疫復(fù)合物病癥例如免疫復(fù)合物性腎炎，抗體介導(dǎo)的腎炎，多發(fā)性神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病例如IgM型多發(fā)性神經(jīng)病或IgM抗體介導(dǎo)的神經(jīng)病變，血小板減少(例如如心肌梗死患者所發(fā)展的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血后紫癜(PTP)、肝素誘發(fā)的血小板減少癥和自身免疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥例如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，鞏膜炎例如特發(fā)性角膜鞏膜炎、鞏膜外層炎，睪丸和卵巢的自身免疫性疾病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺功能減退，甲狀旁腺功能減退，自身免疫性內(nèi)分泌疾病包括甲狀腺炎例如自身免疫性甲狀腺炎，橋本病，慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎，自身免疫性甲狀腺疾病，特發(fā)性甲狀腺功能減退，Grave' s病，多腺體綜合征例如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌綜合征)，瘤外綜合征包括神經(jīng)系統(tǒng)瘤外綜合征例如蘭伯特-伊頓肌無力綜合征或伊頓-蘭伯特綜合征，僵人或僵人綜合征，腦脊髓炎例如變應(yīng)性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或變應(yīng)性腦脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，重癥肌無力例如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力、小腦變性、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、眼陣攣或眼球陣攣肌陣攣綜合征(OMS)和感覺神經(jīng)病變，多灶性運(yùn)動神經(jīng)病，席漢綜合征，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，類狼瘡肝炎，巨細(xì)胞性肝炎，慢性活動性肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎，淋巴間質(zhì)性肺炎(LIP)，梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)對比NSIP，格-巴二氏綜合征，貝格爾病(IgA腎病)，特發(fā)性型IgA腎病，線性IgA皮膚病，急性熱性嗜中性白細(xì)胞皮膚病，角質(zhì)層下膿皰皮膚病，瞬時性棘層松解性皮膚病，肝硬化例如嗜原發(fā)性膽汁性肝硬變和肺硬變，自身免疫性腸病綜合征，腹部或腹腔病，口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)，難治性口炎性腹灣(refractory sprue),特發(fā)性口炎性腹灣，冷球蛋白血癥，肌萎縮側(cè)索硬化(ALS;Lou Gehrig病)，冠狀動脈疾病，自身免疫性耳病例如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性聽力損失，多軟骨炎例如難治愈的或復(fù)發(fā)的或復(fù)發(fā)性多軟骨炎，肺泡蛋白沉積癥，柯根綜合征/非梅毒性間質(zhì)性角膜炎，貝耳麻痹，Sweet病/綜合征，自身免疫性酒渣鼻，帶狀皰疹相關(guān)疼痛，淀粉樣變性，非癌性淋巴細(xì)胞增多，原發(fā)淋巴細(xì)胞增多包括單克隆的B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如，良性單克隆性丙種球蛋白病和意義未定的單克隆丙種球蛋白病，MGUS)，周圍神經(jīng)病變，瘤外綜合征，離子通道病例如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌肉失常、耳聾、失明、周期性麻痹和CNS的離子通道病，自閉癥，炎性肌病，局灶性或節(jié)段性或局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FS GS)，內(nèi)分泌性眼病，葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫性肝臟疾病，纖維肌痛，多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭，施密特綜合征，腎上腺炎，胃萎縮，早老性癡呆癥，脫髓鞘性疾病例如自身免疫性脫髓鞘性疾病和慢性炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)病，德雷斯勒綜合征，alopecia greata,全秀，CREST綜合征(|丐質(zhì)沉著、雷諾氏現(xiàn)象、食管運(yùn)動功能障礙、指端硬化和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥)，男性和女性的自身免疫性不育例如由于抗精子抗體，混合結(jié)締組織病，恰加斯病，風(fēng)濕熱，習(xí)慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形性紅斑，心臟切開術(shù)后綜合征，柯興氏綜合征，養(yǎng)鳥人肺，變應(yīng)性肉芽腫血管炎，良性淋巴細(xì)胞性血管炎，阿爾波特綜合征，肺泡炎例如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎，間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風(fēng)病，寄生蟲病例如利什曼病、kypanosomiasis、血吸蟲病、蛔蟲病、曲霉病，Sampter綜合征、卡普蘭綜合征,登革熱，心內(nèi)膜炎，心內(nèi)膜纖維化，彌漫性間質(zhì)性肺纖維化，肺間質(zhì)纖維化，肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，囊性纖維化，眼內(nèi)炎，持久隆起性紅斑，胎兒溶血癥，嗜酸性筋膜炎，舒爾曼綜合征、費(fèi)耳提綜合征，絲蟲病，睫狀體炎例如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(急性或慢性)或Fuch睫狀體炎，亨-舍二氏紫癜，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染SCID，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，?？刹《靖腥荆瑪⊙Y，內(nèi)毒素血癥，胰腺炎，甲狀腺毒癥，細(xì)小病毒感染，風(fēng)疹病毒感染，疫苗接種后綜合征，先天性風(fēng)疹感染，EB病毒感染，腮腺炎，埃文氏綜合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆舞蹈病，鏈球菌感染后性腎炎，血栓閉塞性血管炎，甲狀腺毒癥，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細(xì)胞多肌痛，慢性過敏性肺炎，干燥性角結(jié)膜炎，流行性角結(jié)膜炎，特發(fā)性腎炎綜合征，微小病變性腎病，良性家族性和缺血再灌注損傷，移植器官再灌注，視網(wǎng)膜自身免疫，關(guān)節(jié)發(fā)炎，支氣管炎，慢性呼吸道梗阻/肺疾病，硅肺病，口瘡，口瘡性口炎，動脈硬化疾病，aspemiogenese,自身免疫性溶血，伯克氏病，冷球蛋白血癥，杜普伊特倫攣縮，endophthalmia phacoanaphylactica, enteritis allergica,麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑，特發(fā)性貝耳麻痹，慢性疲勞綜合征，febris rheumatica, Hamman-Rich病,感覺神經(jīng)性聽力損失，haemoglobinuria paroxysmatica,性腺機(jī)倉泛減退，ileitis regionalis,白細(xì)胞減少，傳染性單核細(xì)胞增多癥，橫貫性脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液性水腫，腎病，ophthalmiasymphatica,肉芽腫性睪丸炎,胰腺炎,多神經(jīng)根炎,壞疽性膿皮癥，Quervain甲狀腺炎,獲得性脾萎縮，非惡性胸腺瘤，白癜風(fēng)，中毒性休克綜合征，食物中毒，涉及T細(xì)胞浸潤的病況，白細(xì)胞粘附缺陷，細(xì)胞因子和丁淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)，涉及白細(xì)胞血細(xì)胞滲出的疾病，多器官損傷綜合征，抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，變應(yīng)性神經(jīng)炎，自身免疫性多內(nèi)分泌病，卵巢炎，原發(fā)性粘液性水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風(fēng)濕性疾病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌腺病衰竭，自身免疫性多腺體綜合征I型，成年發(fā)作的特發(fā)性甲狀旁腺功能減退(AOIH)，心肌病例如擴(kuò)張型心肌病，后天性大皰性表皮松解(EBA)，血色素沉積癥，心肌炎，腎病綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎，化膿性或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩骨、額骨、上頜骨或蝴蝶骨鼻竇炎，嗜曙紅細(xì)胞相關(guān)疾病例如嗜曙紅細(xì)胞增多、肺浸潤嗜曙紅細(xì)胞增多、嗜酸細(xì)胞增多性肌痛綜合征、呂弗勒綜合征、慢性嗜酸性肺炎、熱帶肺嗜酸性粒細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉腫或包含嗜酸性粒細(xì)胞的肉芽腫，過敏癥，血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎，多內(nèi)分泌自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜，鞏膜外層，慢性皮膚粘膜念珠菌病，布魯頓綜合征，嬰兒的瞬態(tài)低丙種球蛋白血癥，維-奧二氏綜合征，毛細(xì)血管擴(kuò)張運(yùn)動失調(diào)綜合征，血管擴(kuò)張，與膠原病相關(guān)的自身免疫 性疾病，風(fēng)濕病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病,淋巴結(jié)炎，降低血壓反應(yīng),血管功能障礙，組織損傷，心血管局部缺血，痛覺過敏，腎缺血，腦缺血和疾病伴隨的血管形成，變應(yīng)性超敏感癥，腎小球腎炎，再灌注損傷，缺血性再灌注障礙，心肌或其他組織的再灌注損傷，淋巴瘤氣管支氣管炎，炎癥性皮膚病，具有急性炎癥元件的皮膚病，多器官功能衰竭，大皰性疾病，腎皮質(zhì)壞死，急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，眼和眼眶炎性疾病，粒細(xì)胞輸血相關(guān)的綜合征，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性，發(fā)作性睡病，急性嚴(yán)重的炎癥，慢性頑固性炎癥，腎盂炎，動脈內(nèi)增生，消化性潰瘍，心瓣炎和子宮內(nèi)膜異位癥。本文描述的抗體可具有多種學(xué)術(shù)、醫(yī)藥和商業(yè)用途。所述抗體可被用于不同類型的診斷測試，例如體外或體內(nèi)檢測各種各樣的疾病或者藥品(藥物)、毒素或其他蛋白包括激素的存在。本文描述的抗體可用于測試疾病，例如在患者的血清或血液中。所述疾病可包括0X40相關(guān)疾病或與0X40不相關(guān)的疾病或適應(yīng)癥，包括各種癌癥、炎性或自身免疫性疾病。抗體也可用于癌癥的放射免疫檢測和放射免疫治療而某些新的測試方法可使用所描述的抗體以僅靶向特定細(xì)胞類型即癌癥的細(xì)胞膜。本文描述的抗體可被制成試劑盒或其他診斷包的一部分。像這樣，本文提供了制造用于與本文的預(yù)處理方法一起使用的診斷試劑盒或物品。診斷試劑盒可包含下列中的任一種或多種:拮抗物/抗體/藥物參照材料；正對照中和抗體(優(yōu)選地獼猴的山羊)；蛋白A+G柱(例如蛋白A/G柱)；去脂試劑；免疫球蛋白親和純化緩沖劑(例如結(jié)合、洗脫和中和緩沖劑)；補(bǔ)體血清；細(xì)胞的測定稀釋劑；制造商說明書或文獻(xiàn)；小瓶冷凍細(xì)胞(例如WIL2細(xì)胞)；細(xì)胞標(biāo)記試劑(例如CELL TITER GL0.RTM.)等。以實(shí)例的方式，診斷試劑盒可包括但不限于:(a)去脂試劑；(b)用于免疫球蛋白的親和純化的緩沖劑(例如結(jié)合和洗脫緩沖劑)和(c)制造商手冊，其指導(dǎo)診斷試劑盒的使用者在對來自自身免疫性疾病或癌癥受治療者的生物學(xué)樣品進(jìn)行細(xì)胞基礎(chǔ)的生物測定(例如中和抗體測定)之前使用試劑盒預(yù)處理所述樣品(例如以避免血清干擾的問題)的。診斷試劑盒任選還包含下列中的任一種或多種:藥物參照材料、正對照中和抗體、補(bǔ)體血清，細(xì)胞的測定稀釋劑和細(xì)胞標(biāo)記試劑等。本文描述的抗體和其他發(fā)現(xiàn)同樣提供了高通量的篩選方法。更特別地并如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可能得到篩選與0X40受體結(jié)合并抑制Trl細(xì)胞生成和功能或促進(jìn)Trl細(xì)胞的生成和功能的拮抗型或激動型單克隆抗體或小分子的高通量方法。在一個這樣的方法中，將具有生產(chǎn)IL-10的能力的人T細(xì)胞系(SU-DHL-1)用人0X40基因(SU0X40)轉(zhuǎn)染。將100，000個3加乂40細(xì)胞與100，000個小鼠的成纖維細(xì)胞(L細(xì)胞)或100，000個表達(dá)人0X40-配體(0X40-配體L細(xì)胞)的小鼠成纖維細(xì)胞在96孔板中一起培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后，收集培養(yǎng)上清液用以通過IL-10特異性ELISA測量IL-10。在代表性的實(shí)驗(yàn)中，在0X40-配體不存在的情況下培養(yǎng)的100，000個SU0X40細(xì)胞生產(chǎn)高達(dá)6，000pg/ml IL-10。在0X40-配體存在的情況下，100, 000個SU0X40細(xì)胞產(chǎn)生少于1，000pg/ml IL-10。這一培養(yǎng)方法可被用于篩選，除了別的之外，阻斷0X40-配體抑制經(jīng)由SU0X40細(xì)胞的IL-10生產(chǎn)的能力的拮抗型單克隆抗體或小分子。可選擇地，這一培養(yǎng)方法可通過用對0X40特異性的可能的激動型單克隆抗體或小分子替換表達(dá)0X40-配體的L細(xì)胞來修飾以確定，除了別的之夕卜，它們抑制經(jīng)由SU0X40細(xì)胞的IL-10生產(chǎn)的能力。本文描述的 抗0X40抗體可被用作測定或在用于檢測或測量在有機(jī)體或有機(jī)樣品中發(fā)現(xiàn)的藥物或其他分子的活性的測定中使用。它們也可以用于定量測定以測量樣品中物質(zhì)的量。生物測定和免疫測定是可使用這些抗體的許多不同專用生物化學(xué)測定之中。本文教導(dǎo)的抗0X40抗體可被用于其他測定中以測量過程例如酶活性、抗體捕獲、干細(xì)胞活性和
競爭性蛋白結(jié)合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，表達(dá)人GITRl、0X40L、4-1BBL、ICOSL的L細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)生成。簡單地說，人GITRl (Accession#NM_005092)、0X40L (Accession#NM_003326)、4-lBBL(Accession#NM_00381 1)、ICOSL(Accession#NM_015259)的全長編碼序列用從HSV-1刺激的PBMC制備的RNA通過RT-PCR擴(kuò)增。隨后，將cDNA克隆至MSCV基礎(chǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIGW2中并且所得到的質(zhì)粒通過限制性酶消化和DNA測序來證實(shí)。為了產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，每個載體與包裝構(gòu)建體pCL-gp (gag/pol)和pHCMV-VSVg(VSV糖蛋白被膜)在HEK293T細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染。兩天后，收集包含病毒的培養(yǎng)上清液并用于以moi 100感染⑶32L細(xì)胞。在這一條件下，有結(jié)果地轉(zhuǎn)導(dǎo)了 > 95%的細(xì)胞
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將分離的⑶14+單核細(xì)胞(純度> 94% )在IOOng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4 (均來自R&D)存在的情況下培養(yǎng)5天。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將獲得的不成熟的 DC 清洗并與 IFN-a (1000U/ml, PBLBiomedical Laboratories)、IL-10 (10ng/ml，R&D)和受輻照的CD40L轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞(DC與L細(xì)胞的比例4: I) 一起培養(yǎng)24h以獲得成熟DC。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的,使用⑶4+T細(xì)胞分離試劑盒II (Miltenyi Biotec)將初始⑶4+T細(xì)胞和記憶⑶4+T細(xì)胞(每個純度> 99% )從PBMC分離并且之后劑型細(xì)胞分選(D4+CD45RA+CD45R0TD25-部分作為初始T細(xì)胞而CD4+CD45RAXD45R0+CD25-部分作為記憶T細(xì)胞)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將4xl04個新鮮純化的同種異體的初始CD4+T細(xì)胞與不成熟或培養(yǎng)的DC(DC與T比例1: 10) —起在重組人0X40L(R&D，100ng/ml)存在或不存在的情況下在圓底96孔培養(yǎng)盤中共同培養(yǎng)7天。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將純化的 CD4+T 細(xì)胞也與 IL-12 (10ng/ml，R&D)、IL-4 (25ng/ml, R&D)或地塞米松(5xl(T8M，Life Technologies)和I α，25- 二羥維生素D3 (10_7Μ)的混合物在可溶抗CD28單克隆抗體(CD28.2，I μ g/ml)和IL-2 (50U/ml, R&D)存在的情況在48孔培養(yǎng)板中已經(jīng)用抗CD3單克隆抗體預(yù)處理的受輻照的CD32/0X40L-L細(xì)胞、CD32/GITR1-L細(xì)胞、CD32/4-1BBL-L細(xì)胞或親本CD32-L細(xì)胞上培養(yǎng)7天。在某些實(shí)驗(yàn)中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將CD4+T細(xì)胞在48孔培養(yǎng)板中用⑶3單克隆抗體(0.2 μ g/ml)預(yù)孵育的⑶32-L細(xì)胞、⑶32-L細(xì)胞和CD32/IC0SL-L細(xì)胞的混合物(比例1:1)或CD32/IC0SL-L細(xì)胞和CD32/0X40L-L細(xì)胞的混合物(比例1:1)上培養(yǎng)7天。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將RPMI 1640用于培養(yǎng)基并補(bǔ)充10% FCS、2mM L-谷酰胺、ImM丙酮酸鈉、青霉素G和鏈霉素。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，收集并清洗所培養(yǎng)的T細(xì)胞并且之后用結(jié)合板的抗CD3 (5 μ g/ml)和溶解的抗CD28 (2 μ g/ml)以IxlO6個細(xì)胞/ml的濃度再刺激24h。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，通過ELISA測量上清液中的IL-4、IL-10、TNF_a和IFN-α水平(所有試劑盒來自R&D)。對于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子生產(chǎn)，將培養(yǎng)的T細(xì)胞用50ng/ml of PMA加上2 μ g/ml伊屋諾霉素再刺激6h。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在最后2h加入布雷菲德菌素A (10 μ g/ml)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，使用FIX和PERM試劑盒(CALTAG)將細(xì)胞用PE-標(biāo)記的抗IL-4的單克隆抗體或TNF- a FITC-標(biāo)記的抗IFN- α的單克隆抗體和APC-標(biāo)記的抗IL-10 (所有都來自BD)染色。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，收集T細(xì)胞并重懸在含有EDTA的培養(yǎng)基中以分離簇。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將有活力的細(xì)胞通過死細(xì)胞的錐蟲藍(lán)排除計(jì)數(shù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，對于抑制性功能測定，在親本L細(xì)胞(B)或0X40L-L細(xì)胞(C)存在的情況下初始⑶4+T細(xì)胞(A)和通過抗⑶3單克隆抗體、抗⑶28單克隆抗體，IL-2、Dex和vitD3從初始⑶4+T細(xì)胞生成的Trl細(xì)胞，這三種細(xì)胞類型和它們1:1比例的混合物之后通過在5 μ g/ml抗⑶3單克隆抗體和I μ g/ml抗⑶28單克隆抗體存在的情況下培養(yǎng)來重刺激5天，之后通過[3H]胸腺嘧啶核苷摻入測定細(xì)胞增殖?？谷?X40特異性單克隆抗體的生成我們生成多種抗人0X40激動型小鼠單克隆抗體。抗體的抗原結(jié)合特異性通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)來證實(shí)(圖10-12)?？贵w的激動劑活性通過功能測定來證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn)20個0X40特異性抗體中的九個可阻斷維生素D3/地塞米松介導(dǎo)的來自⑶4+T細(xì)胞的Trl細(xì)胞生成(圖13)，增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞增殖(圖14)并抑制IC0S+CD4+CD25高F0XP3+Treg的IL-1O生產(chǎn)(圖16)。我們滴定所述抗體并且發(fā)現(xiàn)五種在以低至4ng/ml的濃度抑制Trl細(xì)胞生成上具
有有力活性。0X40 抗體抑制 CD4+CD25 高 F0XP3+Treg 功能0X40單克隆抗體中的某些抑制F0XP3+Treg的抑制性功能(圖17)。有力抑制來自Trl細(xì)胞和CD4+CD25*CD127T0XP3+Treg的IL-10生產(chǎn)的五種抗體中三種(119-8B、119-43、119-122、119-173B 和 106-222)在阻斷 CD4+CD25 高CD127_F0XP3+Treg 功能上是有力的(圖17)。然而，11種抗體中的兩種(119-33和120-140A)無抗IL-10生產(chǎn)的活性但阻斷 CD4+CD25 高FOXP3+Treg 功能(圖18)?？谷?X40單克隆抗體通過例如將6-8周大的BALB/c小鼠與用人0X40按照已知程序轉(zhuǎn)染的小鼠細(xì)胞系免疫進(jìn)行抗人0X40單克隆抗體的生成。建立并進(jìn)一步分析了分泌特異性染色0X40+細(xì)胞的單克隆抗體的雜交瘤克隆。我們設(shè)計(jì)全面篩選以檢測通過抑制Trl細(xì)胞的生成和功能觸發(fā)0X40信號傳導(dǎo)的那些克隆(激動型抗體)。進(jìn)一步純化這些克隆。抗h0X40的激動型抗體可被人源化并且單獨(dú)或與抗腫瘤疫苗或其他佐劑組合用于人類抗腫瘤治療的臨床程序。幾種不同的腫瘤類型可以作為這些抗體的靶，包括黑素瘤、淋巴瘤和乳腺癌。在另一個實(shí)施方案中，將6-8周大的BALB/c雌性小鼠用于足墊或皮下免疫。每個小鼠用由人0X40(L-0X40)轉(zhuǎn)染的5百萬個小鼠L細(xì)胞以3天的間隔注射6次。第六次注射之后三天，使用已有的程序?qū)⑿∈蟀矘匪啦⑶乙瞥倭馨徒Y(jié)(來自足墊免疫)或脾(來自皮下免疫)并且將細(xì)胞與SP2 .0骨髓瘤或NSO骨髓瘤細(xì)胞以I比I的比例融合以生成雜交瘤克隆。之后通過ELISA測定篩選分泌單克隆抗體的雜交瘤克隆的與L-h0X40細(xì)胞的結(jié)合特異性。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析進(jìn)一步確定與L-h0X40細(xì)胞結(jié)合但不與L親本細(xì)胞結(jié)合的雜交瘤在L-h0X40和SUPM2-h0X40細(xì)胞上的結(jié)合。在圖10的實(shí)驗(yàn)中，通過ELISA篩選抗L_h0X40對比L親本細(xì)胞的h0X40雜交瘤上清液。選擇了二十種h0X40特異性單克隆抗體。通過將細(xì)胞與溶于PBS的0.01%氯化鎂鈣混合將表達(dá)人0X40 (L-h0X40)的兩千萬細(xì)胞包被在96孔板上并在層流罩中干燥過夜。之后將板在使用前于-20°C冷凍至少一天。對于抗體結(jié)合測定，將冷凍的細(xì)胞用PBS再水化并用含有PBS加上0.05% Twen 20的清洗緩沖液清洗并且用溶于清洗緩沖液的2% BSA封閉。之后將調(diào)整的細(xì)胞用于結(jié)合0X40抗體上清液。之后用二級抗體抗小鼠IgG FC HRP檢測與細(xì)胞結(jié)合的抗體。h0X40特異性雜交瘤上清液識別表達(dá)0X40的L細(xì)胞但不識別親本L細(xì)胞。在圖11的實(shí)驗(yàn)中，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析篩選h0X40特異性單克隆抗體。相等數(shù)目(IOOk)的L細(xì)胞和L-h0X40在FACS緩沖液(I % FCS/2mM EDTA/PBS)中混合且與0.5 μ g的FPLC(Protein A HiTrap/Gentle Ag/Ab清洗緩沖液)純化抗體一起孵育。之后將細(xì)胞清洗并用二級抗體PE軛合的抗小鼠IgG染色。兩個峰指示抗h0X40單克隆抗體的陽性和陰性染色。單個峰表明沒有結(jié)合抗體或抗體的非特異性結(jié)合。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析證實(shí)二十種h0X40特異性單克隆抗體。在圖12的實(shí)驗(yàn)中，通過使用表達(dá)h0X40的SUPM2細(xì)胞(SUPM2_h0X40)證實(shí)h0X40單克隆抗體特異性。如圖11中將相等數(shù)目(look)的SUPM2和SUPM2-h0X40細(xì)胞在FACS緩沖液(l%FCS/2mM EDTA/PBS)中混合并用于h0X40單克隆抗體結(jié)合。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析每種抗體的結(jié)合特異性。兩個峰指示抗h0X40單克隆抗體的陽性和陰性染色，而單個峰表明沒有結(jié)合抗體或抗體的非特異性結(jié)合。證實(shí)了二十種h0X40特異性單克隆抗體。在圖13的實(shí)驗(yàn)中，我們尋求鑒定可抑制Trl細(xì)胞從由VitD3(10微摩爾mM)/Dex (50納M)、⑶32L/IC0SL和抗CD3/CD28 (0.2微克/ml)刺激的CD4+T細(xì)胞生成的人0X40特異性單克隆抗體。在細(xì)胞培養(yǎng)的第O天加入抗h0X40單克隆抗體并且在刺激7天后CD4+T細(xì)胞經(jīng)歷IL-10細(xì)胞內(nèi)染色以及之后的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。代表性的熒光活化細(xì)胞分選(FACS)數(shù)據(jù)示于A中而占所有抗h0X40單克隆抗體處理的Trl細(xì)胞的百分比示于B。使用從這一實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞，我們尋求鑒定刺激CD4+T細(xì)胞增殖(圖14，在刺激后第7天將細(xì)胞計(jì)數(shù))并抑制Trl從CD4+生成(圖13)的h0X40特異性單克隆抗體。為了鑒定這些h0X40單克隆抗體抑制Trl細(xì)胞從⑶4+T細(xì)胞生成的能力，如上文圖13的實(shí)驗(yàn)中所描述的生成并培養(yǎng)Trl細(xì)胞。代表性的FACS數(shù)據(jù)示于A而用九種抗h0X40單克隆抗體處理之后的Trl細(xì)胞的百分比示于B中。五種h0X40特異性單克隆抗體于4ng/ml濃度強(qiáng)烈抑制Trl細(xì)胞的生成(圖15)。在圖16A、16B和16C的實(shí)驗(yàn)中，將新鮮分選的IC0S+CD4+CD127_CD25*T細(xì)胞用抗CD3 (0.2 μ g/ml)(在CD32L/IC0SL細(xì)胞和CD32L/h0X40L細(xì)胞存在的情況下)或抗h0X40單克隆抗體或?qū)φ湛贵w刺激5天。之后將細(xì)胞計(jì)數(shù)并將5xl04個細(xì)胞用抗CD3/CD28再刺激24h并用Elisa試劑盒檢測上清液的IL-10分泌。我們鑒定抑制Trl從⑶4+T細(xì)胞生成也抑制IL-10從天然的ICOS+⑶4+⑶25ST細(xì)胞產(chǎn)生的h0X40特異性單克隆抗體。將新鮮分選的IC0S+IC0S-CD4+CD127-CD25sTreg與CFSE標(biāo)記的CD4+CD25低細(xì)胞在受輻照的單核細(xì)胞和抗⑶3 (0.3 μ g/ml)和抗h0X40mAb存在的情況下一起培養(yǎng)。培養(yǎng)3.5天之后，通過FACS通過細(xì)胞中CFSE的稀釋測定細(xì)胞增殖(圖16C)。圖17A和17B顯示抑制Trl細(xì)胞的生成并阻斷F0XP3+CD4+⑶25高Treg功能的抗h0X40單克隆抗體的鑒定。將新鮮分選的F0XP3+CD4+CD127-CD25高T細(xì)胞(3.5xl04)與CFSE標(biāo)記的CD4+CD251ow細(xì)胞(7xl04) 一起在受輻照的單核細(xì)胞(7xl04,6000rad)和0.3 μ g/ml抗⑶3以及各種濃度的抗h0X40單克隆抗體存在的情況下培養(yǎng)。培養(yǎng)3至4天后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析通過測定細(xì)胞中CFSE的稀釋測定細(xì)胞增殖。表示分裂的細(xì)胞的百分比。代表性的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析示于圖17A。6個單克隆抗體的數(shù)據(jù)示于圖17B。在圖18的實(shí)驗(yàn)中，將新鮮分選的F0XP3+CD4+CD127-CD25高T細(xì)胞(3.5xl04)與CFSE標(biāo)記的0)4+0)25<￡細(xì)胞(7xl04) 一起在受輻照的單核細(xì)胞(7xl04，6000rad)和0.3 μ g/ml抗⑶3以及各種濃度的0X40單克隆抗體存在的情況下培養(yǎng)。培養(yǎng)3至4天后，通過FACS通過測定細(xì)胞中CFSE的稀釋測定細(xì)胞增殖。數(shù)據(jù)代表兩個實(shí)驗(yàn)。我們鑒定不抑制Trl生成但封閉F0XP3+CD4+CD25 sTreg功能的抗h0X40單克隆抗體。 在圖19A和19B的實(shí)驗(yàn)中，將淋巴瘤來源的⑶4+⑶25ST細(xì)胞與從健康供體分離的CFSE標(biāo)記的⑶4+⑶251ow細(xì)胞(7x104) —起在受輻照的同種異體單核細(xì)胞(7xl04，6000rad)和0.3微克/ml抗⑶3和25 μ g/ml的抗h0X40單克隆抗體存在情況下培養(yǎng)。培養(yǎng)3至4天后，通過FACS通過測定細(xì)胞中CFSE的稀釋測定細(xì)胞增殖。代表性的FACS分析數(shù)據(jù)示于19A中而占所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)示于19B。我們發(fā)現(xiàn)h0X40激動型抗體阻斷淋巴瘤來源的 CD4+CD25 高Treg 功能。圖20顯示與人和恒河猴0X40特異性結(jié)合的激動型抗體的鑒定。恒河猴外周血單核細(xì)胞通過ficoll離心獲得。⑶4+T細(xì)胞通過⑶4微珠獲得。將⑶4+T細(xì)胞用10 μ g/ml的菜豆凝集素(PHA)刺激。刺激后兩天，將細(xì)胞用抗h0X40mAb染色之后用山羊抗小鼠IgG-APC和⑶69-PE染色。106-317作為陰性對照。顯示六種強(qiáng)烈活化T細(xì)胞增殖的抗h0X40 mAb可結(jié)合活化的恒河猴⑶4+T細(xì)胞。這些結(jié)果表明可在猴中測試這六種抗h0X40單克隆抗體的毒性。使用傳統(tǒng)融合程序獲得的500個抗人0X40陽性克隆中僅七個表現(xiàn)出促發(fā)0X40的特性，包括但不限于如表I中所公開的阻斷生成IL-10的Trl生成和nTreg抑制性功能的能力。表I List of 0X40特異性單克隆抗體的列表
權(quán)利要求
1.一種與0X40結(jié)合的分離的抗體，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)⑶Rl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； (c)包含氨基酸序列SEQID N0.3的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID N0.7的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變區(qū)⑶R2和(f)包含氨基酸序列SEQ ID N0.9的輕鏈可變區(qū)⑶R3。
2.一種與0X40結(jié)合的分離的抗體，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的重鏈可變區(qū)⑶Rl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID N0.15的重鏈可變區(qū)CDR3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID N0.19的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含氨基酸序列SEQ ID N0.20的輕鏈可變區(qū)CDR2和(f)包含氨基酸序列SEQ ID N0.21的輕鏈可變區(qū)⑶R3。
3.一種與0X40結(jié)合的包含氨基酸序列SEQ ID N0.7或19的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:7或19的氨基酸序列具有90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
4.一種與0X40結(jié)合的包含氨基酸序列SEQ ID N0.8或20的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:8或20的氨基 酸序列具有90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
5.一種與0X40結(jié)合的包含氨基酸序列SEQ ID N0.9或21的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:9或21的氨基酸序列具有90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
6.一種與0X40結(jié)合的包含氨基酸序列SEQ ID N0.1或13的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:1或13的氨基酸序列具有90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
7.一種與0X40結(jié)合的包含氨基酸序列SEQ ID N0.2或14的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:2或14的氨基酸序列具有90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
8.一種與0X40結(jié)合的包含氨基酸序列SEQ ID N0.3或15的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:3或15的氨基酸序列具有90百分比同源性的氨基酸序列的分離的抗體。
9.一種與0X40上的表位結(jié)合的分離的抗體，所述表位被具有包含SEQ ID N0.5或17的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID N0.11或23的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體，或與其具有至少90百分比同源性的氨基酸序列的抗體識別。
10.一種與0X40結(jié)合的分離的抗體，其包括具有包含SEQ ID NO:7或19、SEQ ID NO:8或20、SEQ ID NO:9或21的氨基酸序列的⑶R的輕鏈可變區(qū)，或與其具有至少90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
11.一種與0X40結(jié)合的分離的抗體，其包括具有包含SEQ ID N0:1或13、SEQ ID NO:2或14、SEQ ID NO:3或15的氨基酸序列的⑶R的重鏈可變區(qū)，或與其具有至少90百分比同源性的氨基酸序列的抗體。
12.編碼如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體的分離的核酸。
13.—種宿主細(xì)胞，其包含編碼如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體的核酸。
14.一種生產(chǎn)抗體的步驟，其包含培養(yǎng)如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其進(jìn)一步包含從所述宿主細(xì)胞回收所述抗體的步驟。
16.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體用作藥物。
17.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體用于治療自身免疫性疾病。
18.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體用于治療癌癥。
19.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體在藥物制備中的用途，其中所述藥物用于治療癌癥或自身免 疫性疾病。
全文摘要
公開了與OX40特異性結(jié)合的人抗體，優(yōu)選地重組的人抗體，人源化和嵌合的兩種。優(yōu)選的抗體具有對OX40受體的高親和性并且體外和體內(nèi)活化所述受體。所述抗體可以是全長抗體或其抗原結(jié)合部分。所述抗體或抗體部分被用于調(diào)節(jié)受體活性，例如在患有其中OX40活性是有害的病癥的人類受治療者中。提供用于表達(dá)所述重組人抗體的核酸、載體和宿主細(xì)胞，以及還提供了合成重組人抗體的方法。
文檔編號C12N15/13GK103221427SQ201180051223
公開日2013年7月24日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者劉勇軍, 鄔揭新, 勞拉·博韋爾, 鶴下直也, J·云·曹, 尚卡爾·庫馬爾 申請人:德克薩斯州立大學(xué)董事會