專利名稱：低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法及測(cè)定用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低密度脂蛋白(以下稱為“LDL”)中的膽固醇的測(cè)定方法及測(cè)定用試劑盒。
背景技術(shù)：
LDL是起到將肝臟中合成的膽固醇搬運(yùn)到周圍組織的作用的脂蛋白。已知LDL中的膽固醇(以下也稱“LDL膽固醇”)為動(dòng)脈硬化的原因物質(zhì)之一。因此，LDL膽固醇量從2008年4月起被追加為基于日本勞動(dòng)安全衛(wèi)生法的健康診斷的檢查項(xiàng)目。作為L(zhǎng)DL膽固醇的測(cè)定方法，例如有如下方法:通過(guò)超離心分離將LDL與其他脂蛋白(例如，高密度脂蛋白(以下也稱“HDL”)、超低密度脂蛋白(以下也稱“ VLDL”)等分離之后，使用酶僅測(cè)定LDL膽固醇的方法；以及通過(guò)電泳分離LDL之后，進(jìn)行脂質(zhì)的染色，測(cè)定其發(fā)色強(qiáng)度的方法等。但是，這些方法操作繁雜，難以處理多數(shù)待測(cè)體，因此難以在臨床檢查等中使用。因此，開(kāi)發(fā)了各種使用了酶的LDL膽固醇的測(cè)定方法。作為使用了酶的測(cè)定方法，有直接測(cè)定LDL 膽固醇本身的直接法、用第一反應(yīng)使源自LDL以外的脂蛋白的膽固醇反應(yīng)并將它們消去，用第二反應(yīng)使剩余的LDL膽固醇反應(yīng)并由此測(cè)定LDL膽固醇量的消去法等。更具體地，作為直接法，例如通過(guò)環(huán)糊精以及表面活性劑來(lái)提高酶針對(duì)LDL膽固醇的特異性并測(cè)定LDL膽固醇的方法(專利文獻(xiàn)I)。作為消去法，有通過(guò)聚陰離子和2價(jià)金屬離子來(lái)優(yōu)先使源自LDL以外的脂蛋白的膽固醇酶反應(yīng)之后，再測(cè)定LDL膽固醇的方法(專利文獻(xiàn)2);在使硫酸杯芳烴(硫酸力A 7 k >)或聚苯胺等與LDL膽固醇結(jié)合而形成可溶性復(fù)合體的狀態(tài)下使源自LDL以外的脂蛋白的膽固醇酶反應(yīng)之后，再測(cè)定LDL膽固醇的方法(專利文獻(xiàn)3)等。在含有胺的緩沖液中使源自LDL以外的脂蛋白的膽固醇酶反應(yīng)之后，測(cè)定LDL膽固醇的方法(專利文獻(xiàn)4)等。在先技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:特許第3091230號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:特許第3193634號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:特許第3822340號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:特許第3058602號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明提供一種能夠測(cè)定LDL膽固醇的新方法及用于測(cè)定的試劑盒。用于解決問(wèn)題的手段本發(fā)明涉及一種試樣中的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，包括:使表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于含有實(shí)施了高密度脂蛋白消去處理的試樣的反應(yīng)液中，以使低密度脂蛋白中的膽固醇酶反應(yīng)的步驟(I )，所述表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚，所述表面活性劑BI是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種，所述表面活性劑B2是選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚以及聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組的至少一種。本發(fā)明作為其他方式，涉及一種低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，其是在低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定中使用的試劑盒，包含:表面活性劑Al，所述表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚；表面活性劑BI，所述表面活性劑BI是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種；以及表面活性劑B2，所述表面活性劑B2是選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆 蘧基醚以及聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組的至少一種。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠提供LDL膽固醇的新的測(cè)定方法。


圖1是示出參考例I的結(jié)果的一個(gè)例子的曲線圖；圖2的A和B是示出參考例3的結(jié)果的一個(gè)例子的曲線圖；圖3的A和B是示出參考例4的結(jié)果的一個(gè)例子的曲線圖；圖4的A和B是實(shí)施例1的結(jié)果的一個(gè)例子的曲線圖；圖5的A C是示出實(shí)施例2的結(jié)果的一個(gè)例子的曲線圖；圖6的A和B是示出實(shí)施例3的測(cè)定值和現(xiàn)有方法的測(cè)定值的相關(guān)關(guān)系的一個(gè)例子的曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于如下見(jiàn)解:在上述的表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2存在的情況下，通過(guò)對(duì)至少含有LDL和VLDL的試樣、優(yōu)選含有LDL、VLDL和乳糜微粒(以下也稱“CM”)的試樣、更優(yōu)選的是實(shí)施了 HDL消去處理的生物體試樣進(jìn)行酶處理，由此能夠選擇性使LDL膽固醇酶反應(yīng)，因此能夠測(cè)定LDL膽固醇。根據(jù)本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法，雖然能夠測(cè)定LDL膽固醇的機(jī)理的詳細(xì)不清楚，但是可以如下所述地推測(cè)。即，在表面活性劑Al的存在下表面活性劑BI選擇性地使LDL增溶，在表面活性劑Al和表面活性劑BI的存在下表面活性劑B2抑制VLDL和CM等LDL之外的脂蛋白的增溶，因此能夠選擇性地使LDL膽固醇酶反應(yīng)。但是，本發(fā)明不限定于該機(jī)理。SP，本發(fā)明涉及:[I] 一種試樣中的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，包括:使表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于含有實(shí)施了 HDL消去處理的試樣的反應(yīng)液中，以使LDL中的膽固醇酶反應(yīng)的步驟(I)，其中，所述表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚，所述表面活性劑BI是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種，所述表面活性劑B2是選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚以及聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組的至少一種。[2]根據(jù)[I]所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，其中，所述HDL消去處理包括:將所述表面活性劑Al、表面活性劑A2以及試樣混合以使所述試樣中的HDL中的膽固醇酶反應(yīng)，所述表面活性劑A2是選自由HLB為18.0以上的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚以及聚氧乙烯肉豆蘧基醚組成的組的至少一種。[3]根據(jù)[I]或[2]所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，其中，所述步驟(I)包括:通過(guò)在含有實(shí)施了所述HDL消去處理的試樣的反應(yīng)液中添加表面活性劑B3，來(lái)使所述表面活性劑Al、所述表面活性劑B1、所述表面活性劑B2和所述表面活性劑B3存在于所述反應(yīng)液中，以使LDL中的膽固醇酶反應(yīng)，所述表面活性劑B3是聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽和烷基苯磺酸鹽中的至少一種。[4]根據(jù)[I]至[3]中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，所述聚氧化烯多環(huán)苯基醚是聚氧乙烯聚氧丙烯多環(huán)苯基醚。[5]根據(jù)[I]至[4]中任一項(xiàng)所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，其中，所述步驟(I)中的酶反應(yīng)包括:使試樣中的LDL與膽固醇脫氫酶以及膽固醇酯酶反應(yīng)。[6] 一種低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，是在LDL中的膽固醇的測(cè)定中使用的試劑盒，包含:表面活性劑Al，所述表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚；表面活性劑BI，所述表面活性劑BI是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種；以及表面活性劑B2，所述表面活性劑B2是選自由HLB為16. 9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚以及聚氧乙烯(35-40 )辛基苯基醚組成的組的至少一種。[7]根據(jù)[6]所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，還包含:表面活性劑A2，所述表面活性劑A2是選自由HLB為18.0以上的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、以及聚氧乙烯肉豆蘧基醚組成的組的至少一種。[8]根據(jù)[6]或[7]所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，還包含:表面活性劑B3，所述表面活性劑B3是聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽和烷基苯磺酸鹽中的至少一種。[9]根據(jù)[6]至[8]中任一項(xiàng)所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，還包含膽固醇測(cè)定用試劑。[10]根據(jù)[9]所述的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，其中，所述膽固醇測(cè)定用試劑含有膽固醇脫氫酶以及膽固醇酯酶。[11]根據(jù)[10]所述的試劑盒，具有:第I試劑，所述第I試劑含有所述膽固醇脫氫酶；第2試劑，所述第2試劑含有所述膽固醇酯酶、所述表面活性劑Al以及所述表面活性劑A2 ;以及第3試劑，所述第3試劑含有所述表面活性劑BI。本說(shuō)明書(shū)中“低密度脂蛋白(LDL)”包括比重為1.006 1.063的廣義的LDL、以及比重為1.019 1.063的狹義的LDL中的任一者。在本說(shuō)明書(shū)中“高密度脂蛋白(HDL)”是指比重為1.063 1.21的脂蛋白。在本說(shuō)明書(shū)中，作為試樣例如可舉出生物體試樣，具體而言是人和除人以外的哺乳動(dòng)物的體液和體成分。作為體液和體成分，雖然不限于這些，但是例如可舉出全血、血漿、血清、腦脊髓液、唾液、尿、汗、羊水、胰液、淚液、粘膜等，其中優(yōu)選全血、血漿、血清。另外,試樣可以直接使用也可以稀釋后使用，另外，也可以是通過(guò)離心分離等分離的樣品。在本說(shuō)明書(shū)中，“實(shí)施了高密度脂蛋白(HDL)消去處理的試樣”是指消去了源自HDL和/或HDL的膽固醇(以下也稱“HDL膽固醇”)的試樣，雖然不特別限定，但是，可以含有除去或分解了 HDL和/或HDL膽固醇的試樣。除去雖然不特別限定，但是可以包含通過(guò)酶反應(yīng)的除去等，例如，包括通過(guò)酶反應(yīng)從HDL中使膽固醇游離，并氧化/還原游離的膽固醇而產(chǎn)生膽留烯酮的除去方法。實(shí)施了 HDL消去處理的試樣優(yōu)選如下試樣:將表面活性劑Al及表面活性劑A2與試樣混合而溶解試樣中的HDL，并使HDL膽固醇進(jìn)行了酶反應(yīng)的試樣。因此，實(shí)施了 HDL消去處理的試樣優(yōu)選含有表面活性劑Al和表面活性劑A2，更優(yōu)選含有表面活性劑Al和表面活性劑A2、以及LDL和/或LDL膽固醇。另外，實(shí)施了 HDL消去處理的試樣更優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有HDL和/或HDL膽固醇。實(shí)質(zhì)上不含有HDL和/或HDL膽固醇是指，實(shí)施了 HDL消去處理的試樣中所含的HDL和/或HDL膽固醇的量在不影響通過(guò)本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定LDL中的膽固醇的范圍內(nèi)。本說(shuō)明書(shū)中“使LDL膽固醇酶反應(yīng)”是指，例如，包括使膽固醇和膽固醇測(cè)定用酶接觸，更優(yōu)選使膽固醇測(cè)定用酶和發(fā)色劑與膽固醇接觸。在本說(shuō)明書(shū)中，“HLB”是親水親油平衡(hydrophilic lipophilic balance)的縮寫(xiě)，例如可以使用Griffin式算出。另外，作為HLB，也可以使用表面活性劑的制造商的一覽表等中記載的值。[表面活性劑Al]表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚。從人血中存在的脂蛋白中更加選擇性地使HDL增溶的方面考慮，聚氧化烯多環(huán)苯基醚的HLB為12.5以下，雖然并不限定，但是優(yōu)選12.3以上且12.5以下，更優(yōu)選的是大約12.5。作為聚氧化烯多環(huán)苯基醚中的環(huán)苯基，雖然不限于這些，但是例如可以舉出:兩個(gè)以上位置被具有一個(gè)芳香環(huán)的取代基取代的苯基、一個(gè)或多個(gè)位置被具有兩個(gè)以上的芳香環(huán)的取代基取代的苯基等。作為具有一個(gè)芳香環(huán)的取代基，雖然不限于此，但是例如可以舉出芐基、1-(苯基)乙基等。作為具有兩個(gè)以上的芳香環(huán)的取代基，雖然不限于此，但是例如可舉出萘基等。作為聚氧化烯多環(huán)苯基醚中的聚氧化烯，雖不限于此，但是例如可舉出聚氧乙烯、聚氧丙烯以及聚氧丁烯等，其中尤其優(yōu)選聚合有不同聚氧化烯的聚氧化烯，更優(yōu)選的是聚氧乙烯和聚氧丙烯聚合的聚氧化烯。因此，作為聚氧化烯多環(huán)苯基醚，優(yōu)選聚氧乙烯聚氧丙烯多環(huán)苯基醚。聚氧乙烯和聚氧丙烯的聚合方式不特別限定，例如，可以是嵌段聚合、隨機(jī)聚合中的任一種。
作為HLB為12.5以下的聚氧乙烯聚氧丙烯多環(huán)苯基醚的具體例，雖然不限于此，但是可以舉出Newcol2608F (商品名，HLB: 12.5,日本乳化劑株式會(huì)社制)、Newcol707F (商品名，HLB:12.5，日本乳化劑株式會(huì)社制)等。[表面活性劑BI]
表面活性劑BI選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上
14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組。它們可以使用一種，也可以組合兩種以上使用。在表面活性劑BI中，聚氧乙烯多環(huán)苯基醚的HLB為12.6以上，從在表面活性劑Al存在的情況下與VLDL和CM相比LDL的增溶量(可溶化能)更高，更加選擇性地使LDL增溶的方面考慮，聚氧乙烯多環(huán)苯基醚的HLB優(yōu)選12.6 13.6，更優(yōu)選12.6 13.3，進(jìn)一步優(yōu)選12.6 13.2，進(jìn)一步更加優(yōu)選大約12.6。作為聚氧乙烯多環(huán)苯基醚中的多環(huán)苯基，雖然不限于此，但是例如可舉出:兩個(gè)以上的位置被具有一個(gè)芳香環(huán)的取代基取代的苯基、一個(gè)或多個(gè)位置被具有兩個(gè)以上的芳香環(huán)的取代基取代的苯基等。作為具有一個(gè)芳香環(huán)的取代基，雖然不限于此，但是例如可舉出芐基、1-(苯基)乙基等。作為具有兩個(gè)以上的芳香環(huán)的取代基，雖然不限于此，但是例如可舉出萘基等。作為聚氧化烯多環(huán)苯基醚中的聚氧化烯，雖然不限于此，但是例如可舉出聚氧乙烯、聚氧丙烯及聚氧丁烯等，其中尤其優(yōu)選不同聚氧化烯聚合的聚氧化烯，更優(yōu)選的是聚氧乙烯和聚氧丙烯聚合的聚氧化烯。因此，作為聚氧化烯多環(huán)苯基醚，優(yōu)選聚氧乙烯聚氧丙烯多環(huán)苯基醚。聚氧乙烯和聚氧丙烯的聚合方式不特別限定，例如可以是嵌段聚合、隨機(jī)聚合中的任一種。作為HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚，雖然不限于此，但是例如可舉出Newcol2609 (商品名，HLB:12.6，日本乳化劑株式會(huì)社制)、Newcol2614 (商品名，HLB:14.7，日本乳化劑株式會(huì)社制)、Newcol610 (商品名，HLB:13.8,日本乳化劑株式會(huì)社制)等。在表面活性劑BI中，聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的HLB為12.7以上且14.5以下，從在表面活性劑Al的存 在下與VLDL及CM相比LDL的增溶量更高，更加選擇性進(jìn)行LDL的增溶的方面考慮，聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的HLB優(yōu)選大約12.8。作為HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的具體例，雖然不限于此，但是可以舉出EMULGEN A60 (產(chǎn)品名，HLB:12.8，花王株式會(huì)社制)、EMULGEN A90(產(chǎn)品名，HLB:14.5，花王株式會(huì)社制)等。在表面活性劑BI中，聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚的HLB為12.0以上且14.5以下，從在表面活性劑Al的存在下與VLDL和CM相比LDL的增溶量更高，更加選擇性進(jìn)行LDL的增溶的方面考慮，聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚的HLB優(yōu)選大約12.7。作為HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚的具體例，可舉出BLAUNON TSP16 (商品名，HLB:12.7，青木油脂株式會(huì)社制)等。[表面活性劑B2]表面活性劑B2選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚和聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組。它們可以使用一種，也可以組合兩種以上使用。在表面活性劑B2中，聚氧乙烯月桂基醚聚氧乙烯的HLB為16.9以上，從在表面活性劑Al和表面活性劑BI的存在下抑制VLDL和CM的增溶，更加選擇性使LDL增溶的方面考慮，聚氧乙烯月桂基醚聚氧乙烯的HLB更優(yōu)選為16.9 18.4，更優(yōu)選為16.9 18.1，進(jìn)一步優(yōu)選為16.9 17.9，更進(jìn)一步優(yōu)選為大約16.9。作為HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚的聚合度，不特別限定，例如為23 50，更優(yōu)選為23 30。作為HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚聚氧乙烯的具體例，雖然不限于此，但是可以舉出EMULGEN123P (產(chǎn)品名，HLB:16.9，花王株式會(huì)社制)、EMULGEN130K (產(chǎn)品名，HLB:18.1，花王株式會(huì)社制)、EMULGEN150 (產(chǎn)品名，HLB:18.4，花王株式會(huì)社制)等。作為聚氧乙烯肉豆蘧基醚，例如，可以使用HLB為18.9的聚乙烯肉豆蘧基醚。作為聚氧乙烯肉豆蘧基醚的具體例，雖然不限于此，但是可以舉出EMULGEN4085 (商品名，HLB18.9，花王株式會(huì)社制)等。從在表面活性劑Al和表面活性劑BI的存在下抑制VLDL和CM的增溶，更加選擇性使LDL增溶的方面考慮，聚氧乙烯辛基苯基醚中的聚氧乙烯的平均聚合度為35 40，更優(yōu)選為大約40。作為聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚的具體例，雖然不限于此，但是可以舉出Triton (注冊(cè)商標(biāo))X_405 (商品名，聚合度:40，NACALAI TESQUE株式會(huì)社制)等。[表面活性劑B3]表面活性劑B3為聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽和烷基苯磺酸鹽中的至少一者。它們可以使用一種，也可以組合兩種以上使用。作為鹽，雖然不限于此，但是例如可舉出銨鹽、鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等。從在表面活性劑Al和表面活性劑BI的存在下，通過(guò)表面活性劑BI促進(jìn)LDL的增溶的速度的方面考慮，聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽中的聚氧乙烯的聚合度例如為I 10。作為聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽，雖然不限于此，但是例如可舉出聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉等。作為聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽，雖然不限于此，但是例如可舉出Emal20C(商品名、花王株式會(huì)社制)、Newcol2308SF (商品名，日本乳化劑株式會(huì)社制)、Newcol2320SN (商品名，日本乳化劑株式會(huì)社制)等。作為烷基苯磺酸鹽，雖然不限于此，但是可舉出十二烷基(月桂基)苯基硫酸鈉(Nacalai株式會(huì)社制等)等。

[表面活性劑A2]表面活性劑A2為選自由HLB為18.0以上的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚和聚氧乙烯肉豆蘧基醚組成的組。它們可以使用一種，也可以組合兩種以上使用。在表面活性劑A2中，聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的HLB為18.0以上，從通過(guò)表面活性劑Al抑制試樣中所含的HDL之外的脂蛋白的增溶的方面考慮，聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的HLB優(yōu)選18.0 19.0、更優(yōu)選的是大約18.0。作為HLB為18.0以上的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的具體例，雖然不限于此，但是可以舉出EMULGEN A500(產(chǎn)品名，HLB:18.0，花王株式會(huì)社制)等。在表面活性劑A2中，聚氧乙烯月桂基醚聚氧乙烯的HLB為16.9以上，從通過(guò)表面活性劑Al抑制試樣中所含的HDL之外的脂蛋白的增溶的方面考慮，優(yōu)選16.9 18.4，更優(yōu)選的是16.9 18.1，進(jìn)一步優(yōu)選16.9 17.9、更進(jìn)一步優(yōu)選大約16.9。作為HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚聚氧乙烯的聚合度，從通過(guò)表面活性劑Al抑制試樣中所含的HDL之外的脂蛋白的增溶的方面考慮，例如為23 50，更優(yōu)選為23 30。作為HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚聚氧乙烯的具體例，雖然不限于此，但是可舉出EMULGEN123P (產(chǎn)品名，HLB:16.9，花王株式會(huì)社制)、EMULGEN130K (產(chǎn)品名，HLB:18.1，花王株式會(huì)社制)、EMULGEN150 (產(chǎn)品名，HLB:18.4，花王株式會(huì)社制)等。
作為聚氧乙烯肉豆蘧基醚，雖然不限于此，但是例如可以使用HLB為18.9的聚乙烯肉豆蘧基醚。作為聚氧乙烯肉豆蘧基醚的具體例，雖然不限于此，但是可舉出EMULGEN4085 (商品名，HLB18.9，花王株式會(huì)社制)等。[膽固醇測(cè)定用試劑]膽固醇測(cè)定用試劑為用于膽固醇的測(cè)定的試劑，含有膽固醇測(cè)定用酶。膽固醇測(cè)定用酶是指用于膽固醇的測(cè)定的酶，雖然不限于此，但是例如可舉出膽固醇脫氫酶、膽固醇酯水解酶及輔酶等。膽固醇測(cè)定用酶可以使用公知的酶。另外，膽固醇測(cè)定用酶優(yōu)選組合使用膽固醇脫氫酶、膽固醇酯水解酶及輔酶。膽固醇脫氫酶和膽固醇酯水解酶的來(lái)源無(wú)特別限制，例如可以源自微生物、動(dòng)物或植物，另外，也可以是由基因操作制成的酶。另外，也可以經(jīng)化學(xué)修飾。作為膽固醇水解酶，只要是能夠水解膽固醇酯的酶即可，雖然不限于此，但是例如可舉出膽固醇酯酶、脂蛋 白酯酶等，其中尤其優(yōu)選膽固醇酯酶。膽固醇酯酶可以使用市售品，其來(lái)源不特別限定。另外，本發(fā)明中，也可以組合使用兩種以上的膽固醇水解酶。作為氧化型輔酶，雖然不限于此，但是例如可舉出煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)AtR MD、硫代NADP等。膽固醇測(cè)定用試劑除了膽固醇測(cè)定用酶之外，例如還可以含有還原型發(fā)色劑。作為還原型發(fā)色劑，例如可以使用通過(guò)黃遞酶的作用而形成色素的發(fā)色劑等。作為還原型發(fā)色劑，例如可舉出四唑化合物。作為四唑化合物，雖然不限于此，例如可舉出3- (4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-四唑溴(MTT)、2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4-二磺基苯基)-2!1-四唑單鈉鹽(131'-1)、2- (4-碘苯基)-3- (2，4-二硝基苯基)-5- (2，4-二磺基苯基)-2!1-四唑單鈉鹽(131'-3)等。[LDL膽固醇測(cè)定方法](第I方式的LDL膽固醇測(cè)定方法)本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法作為第I方式，包括:使表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于含有實(shí)施了 HDL消去處理的試樣的反應(yīng)液中，以使LDL中的膽固醇酶反應(yīng)的步驟(I)。以下，對(duì)第I方式的LDL膽固醇測(cè)定方法進(jìn)行說(shuō)明。在步驟(I)中，通過(guò)使表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于含有實(shí)施了 HDL消去處理的試樣的反應(yīng)液中，來(lái)使LDL中的膽固醇酶反應(yīng)，由此測(cè)定試樣中的LDL中的膽固醇。試樣使用實(shí)施了 HDL消去處理的試樣。作為HDL消去處理，例如可舉出將表面活性劑Al及表面活性劑A2與試樣混合并溶解所述試樣中的HDL，以使源自HDL的膽固醇酶反應(yīng)的方法等。反應(yīng)液中的表面活性劑BI的濃度不特別限定，例如為0.44 0.97重量％，從單獨(dú)使用，并且在表面活性劑Al存在下與VLDL和CM比較LDL的增溶量更高，更加選擇性地使LDL增溶的方面考慮，表面活性劑BI的濃度優(yōu)選0.62 0.79重量％。反應(yīng)液中的表面活性劑B2的濃度不特別限定，例如為0.01 0.04重量％，從在表面活性劑Al和表面活性劑BI的存在下抑制VLDL和CM的增溶，更加選擇性地使LDL增溶的方面考慮，優(yōu)選的是0.018
0.03重量％。反應(yīng)液中的表面活性劑BI和表面活性劑B2的重量％比率(B1:B2)不特別限定，例如為44:1 97:4，優(yōu)選的是31:1 79:3。
步驟(I)中，也可以包括向含有使HDL增溶并實(shí)施了對(duì)源自HDL的膽固醇的消去處理的試樣的反應(yīng)液中，添加表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2。在實(shí)施了 HDL消去處理的試樣含有與表面活性劑Al相同的表面活性劑的情況下，也可以不添加表面活性劑Al而直接將試樣中所含的表面活性劑作為表面活性劑Al使用，也可以在步驟(I)中進(jìn)一步添加表面活性劑Al。在實(shí)施了 HDL消去處理的試樣含有與表面活性劑B2相同的表面活性劑的情況下，也可以不添加表面活性劑B2而直接將試樣中所含的表面活性劑作為表面活性劑B2使用，也可以在步驟(I)中進(jìn)一步添加表面活性劑B2。在步驟(I)中，也可以向反應(yīng)液中添加膽固醇測(cè)定用試劑。膽固醇測(cè)定用試劑例如可以含有膽固醇脫氫酶、膽固醇水解酶等膽固醇測(cè)定用酶、輔酶和還原型發(fā)色劑、黃遞酶等。通過(guò)含有還原型發(fā)色劑、黃遞酶，由源自通過(guò)由還原型輔酶、黃遞酶介導(dǎo)的反應(yīng)而產(chǎn)生的還原型發(fā)色劑的色素，能夠在較長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的可見(jiàn)光下進(jìn)行檢測(cè)。膽固醇脫氫酶的濃度不特別限定 ，例如為1.74 4.35U/mL，從反應(yīng)液中的膽固醇濃度為0.012mM時(shí)，達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)的速度最大的方面考慮，優(yōu)選為2.9 4.35U/mL。反應(yīng)液中的膽固醇水解酶的濃度不特別限定，例如為0.19 0.58U/mL，從反應(yīng)液中的膽固醇的濃度為0.012mM時(shí)達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)的速度為最大的方面考慮，膽固醇水解酶的濃度優(yōu)選0.29 0.58U/mL。反應(yīng)液中的輔酶的濃度與上述膽固醇脫氫酶的濃度范圍相伴隨，例如為0.29 0.97mM,優(yōu)選為 0.73 0.97mM。反應(yīng)液中的黃遞酶的濃度不特別限定，例如為1.74 4.35U/mL，優(yōu)選為2.9
4.35U/mL。還原型發(fā)色劑的濃度例如為0.10 0.29mM，優(yōu)選為0.19 0.29mM。例如，為了保持反應(yīng)溶液中的緩沖能力,保持目標(biāo)pH,步驟(I)的反應(yīng)優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。作為在緩沖液中使用的緩沖劑，例如可舉出Good緩沖劑、磷酸緩沖劑、Tris緩沖劑等。作為Good緩沖劑，雖然不限于這些，但是例如可舉出N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-嗎啉乙磺酸(MES)、二(2-羥乙基)亞胺基三(羥甲基)甲烷(Bis_Tris)、N- (2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’- 二(2-乙磺酸)(PIPES)、N_ (2-乙酰氨基)-2_氨基乙磺酸(ACES )、3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、3-嗎啉基丙磺酸(MOPS )、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、2- (4- (2-羥乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸(HEPES)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N，N- 二(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-環(huán)己基-3-氨基-2-羥基丙磺酸(CAPS0)、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。濃度只要設(shè)置為能夠保持反應(yīng)溶液中的緩沖能力，保持目標(biāo)PH的濃度即可。反應(yīng)液中的pH可以考慮使用的酶的pH穩(wěn)定性、反應(yīng)最佳來(lái)適當(dāng)選擇。在本測(cè)定方法中，例如為6.5 10.0，優(yōu)選的是7.5 8.0。在步驟(I)中,優(yōu)選添加表面活性劑B3，并在表面活性劑Al、表面活性劑B1、表面活性劑B2和表面活性劑B3的存在下進(jìn)行酶反應(yīng)。由此，例如能夠促進(jìn)LDL的選擇性增溶，更好的是能夠進(jìn)一步抑制VLDL的影響。反應(yīng)液中的表面活性劑B3的濃度不特別限定，例如為0.03 0.07重量％，從進(jìn)一步促進(jìn)LDL的增溶的方面考慮，優(yōu)選的是0.04 0.06重量％。步驟(I)的反應(yīng)溫度不特別限定，測(cè)定人血液中成分、尤其是生化項(xiàng)目時(shí)的反應(yīng)溫度通常為37°C左右。反應(yīng)時(shí)間不特別限定，例如為180 300秒，本反應(yīng)體系中，從在人血中的LDL膽固醇為500mg/dL附近的濃度也能夠充分定量的方面考慮，優(yōu)選240 270秒。
LDL膽固醇的測(cè)定，例如可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液的吸光度來(lái)進(jìn)行。吸光度的測(cè)定例如也可以測(cè)定通過(guò)過(guò)氧化氫測(cè)定用試劑產(chǎn)生的色素的吸光度。(第2方式的LDL膽固醇測(cè)定方法)本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法作為第2方式，包括:通過(guò)將試樣、表面活性劑Al、表面活性劑A2和膽固醇測(cè)定用試劑混合并使試樣中的HDL中的膽固進(jìn)行醇酶反應(yīng)的步驟(i);以及使表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于步驟(i)后的反應(yīng)液中并通過(guò)使LDL中的膽固醇進(jìn)行酶反應(yīng)來(lái)測(cè)定所述試樣中的LDL中的膽固醇的步驟(ii)。通過(guò)本方式的LDL膽固醇測(cè)定方法，選擇性地使HDL膽固醇以及LDL膽固醇以此順序酶反應(yīng)以使能夠測(cè)定LDL膽固醇的機(jī)理的詳細(xì)雖不清楚，但如下所述地推測(cè)。S卩，上述表面活性劑Al相比于LDL、VLDL和CM等HDL以外的脂蛋白選擇性地使HDL增溶，并且上述表面活性劑A2在上述表面活性劑Al的存在下抑制上述HDL以外的脂蛋白的增溶，因此能夠選擇性地使HDL膽固醇酶反應(yīng)。另外，上述反應(yīng)之后，上述表面活性劑BI在上述反應(yīng)后的反應(yīng)液中相比于VLDL和CM等LDL以外的脂蛋白選擇性地使LDL增溶，同時(shí)上述表面活性劑B2在表面活性劑BI的存在下抑制LDL以外的脂蛋白的增溶，因此能夠選擇性地使LDL膽固醇酶反應(yīng)。另外，在使用與表面活性劑A2相同的表面活性劑作為表面活性劑B2的情況下，在步驟(ii)中不需要新添加表面活性劑B2。但是，本發(fā)明不限于該機(jī)理。以下，對(duì)第2方式 的LDL膽固醇測(cè)定方法進(jìn)行說(shuō)明。[步驟(i)]首先，在步驟(i)中，將試樣、表面活性劑Al、表面活性劑A2和膽固醇測(cè)定用試劑混合以使試樣中的HDL中的膽固醇酶反應(yīng)?；旌显嚇印⒈砻婊钚詣〢l、表面活性劑A2和膽固醇測(cè)定用試劑的順序不特別限定，可以預(yù)先混合試樣和膽固醇測(cè)定用試劑的一部分之后，再添加表面活性劑Al、表面活性劑A2和膽固醇測(cè)定用試劑的剩余部分，也可以同時(shí)混合試樣、表面活性劑Al、表面活性劑A2和膽固醇測(cè)定用試劑。步驟(i) (HDL消去步驟)的反應(yīng)液中的表面活性劑Al的濃度不特別限定，例如為0.22 0.30重量％，從更加選擇性地使HDL增溶的方面考慮，優(yōu)選0.22 0.28重量％。反應(yīng)液中的表面活性劑A2的濃度不特別限定，例如為0.02重量％以上，從抑制表面活性劑Al對(duì)HDL的增溶的影響，并抑制HDL以外的脂蛋白的增溶的方面考慮，優(yōu)選0.04 0.10重量％，更優(yōu)選0.06 0.09重量％。反應(yīng)液中的表面活性劑Al和表面活性劑A2的重量比(Al:A2)不特別限定，例如為11:1 15:1，從抑制表面活性劑Al對(duì)HDL的增溶的影響，并且抑制HDL以外的脂蛋白的增溶并選擇性地使HDL增溶的方面考慮，優(yōu)選10:2.4 10:3.7。膽固醇測(cè)定用試劑的組成、各成分的濃度與第I方式的步驟相同。另外，步驟(i)的反應(yīng)優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行以保持反應(yīng)溶液中的緩沖能力，并保持目標(biāo)pH,緩沖劑和pH與第I方式相同。步驟(i)的反應(yīng)溫度不特別限定，測(cè)定人血液中成分、尤其生化項(xiàng)目時(shí)的反應(yīng)溫度通常為37°C左右。反應(yīng)時(shí)間不特別限定，例如為200 270秒，在本反應(yīng)體系中，從人血中的HDL膽固醇在150mg/dL附近的濃度也能夠充分消去的方面考慮，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為240 270 秒。[步驟(ii)]
接著，在步驟(i i )中，通過(guò)使表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于步驟(i )后的反應(yīng)液中，來(lái)使LDL中的膽固醇酶反應(yīng)，由此測(cè)定試樣中的LDL中的膽固醇。在步驟(ii)中，也可以包括在步驟(i)后的反應(yīng)液中添加表面活性劑BI和表面活性劑B2。另外，在使用與表面活性劑A2相同的表面活性劑作為步驟(ii)的表面活性劑B2的情況下，可以在步驟(ii )中進(jìn)一步添加表面活性劑B2，也可以不進(jìn)一步添加而是直接將步驟(i)中使用的表面活性劑A2作為表面活性劑B2。反應(yīng)液中的表面活性劑BI和B2的濃度、表面活性劑BI和表面活性劑B2的重量％比率與第I方式的步驟(I)相同。反應(yīng)液中的表面活性劑Al和表面活性劑BI和表面活性劑B2間的重量％比率(A1:B1:B2)不特別限定，例如為19:44:1 25:97:4，優(yōu)選的是19:62:2 23:79:3。在步驟(ii)中，可以進(jìn)一步添加膽固醇測(cè)定用試劑，也可以不進(jìn)一步添加而是直接使用步驟(i)中使用的膽固醇測(cè)定用試劑。在步驟(i i )中，優(yōu)選向步驟(i )后的反應(yīng)液中進(jìn)一步添加表面活性劑B3，并在表面活性劑B1、表面活性劑B2和表面活性劑B3的存在下進(jìn)行酶反應(yīng)。由此例如能夠促進(jìn)LDL的選擇性增溶，更好的是能夠進(jìn)一步抑制VLDL的影響。反應(yīng)液中的表面活性劑B3的濃度與第I方式的步驟(I)相同。步驟(ii)中的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間與第I方式的步驟(I)相同。LDL膽固醇的測(cè)定例如能夠通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液的吸光度來(lái)進(jìn)行。吸光度的測(cè)定例如也可以測(cè)定由過(guò)氧化氫測(cè)定用試劑產(chǎn)生的色素的吸光度。[LDL膽固醇測(cè)定用試劑盒]本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定用試劑盒在一個(gè)方式中，是一種在LDL中的膽固醇的測(cè)定中使用的試劑盒，含有表面活性劑Al、表面活性劑BI以及表面活性劑B2 (以下也稱“本發(fā)明的試劑盒”)。本發(fā)明的試劑盒可以用于本發(fā)明的LDL膽固醇的測(cè)定方法。表面活性劑Al、表面活性劑BI以及表面活性劑B2與本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法中的相同。本發(fā)明的試劑盒也可以含有膽固醇測(cè)定用試劑。膽固醇測(cè)定用試劑與本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法中的相同。本發(fā)明的試劑盒也可以含有表面活性劑B3。表面活性劑B3與本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法中的相同。本發(fā)明的試劑盒也可以含有表面活性劑A2。表面活性劑A2與本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法中的相同。本發(fā)明的試劑盒在其他方式中，是一種在LDL中的膽固醇測(cè)定中使用的試劑盒，含有表面活性劑Al、表面活性劑A2以及表面活性劑BI。本方式的LDL膽固醇測(cè)定用試劑盒也可以含有表面活性劑B2，另外，也可以含有表面活性劑B3和膽固醇測(cè)定用試劑。表面活性劑Al、表面活性劑A2、表面活性劑B1、表面活性劑B2、表面活性劑B3以及膽固醇測(cè)定用試劑與本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法中的相同。作為本發(fā)明的試劑盒,例如可舉出2試劑系列的試劑盒、3試劑系列的試劑盒、4試劑系列的試劑盒等。在含有膽固醇脫氫酶的2試劑系列的試劑盒中， 膽固醇脫氫酶優(yōu)選僅包含在第I試劑中。膽固醇酯酶例如可以包含在第I試劑和第2試劑中的至少一者中，優(yōu)選僅包含在第2試劑中。表面活性劑Al和A2分別優(yōu)選僅包含在第I試劑中。表面活性劑B1、B2和B3優(yōu)選僅包含在第2試劑中。
在3試劑系列的試劑盒中，膽固醇脫氫酶、表面活性劑Al和A2例如也可以包含在作為優(yōu)先進(jìn)行第I反應(yīng)的試劑的組合的、第I試劑、第2試劑以及僅第I試劑中的至少一個(gè)組合中。膽固醇酯酶例如也可以包含在第I試劑、第2試劑和第3試劑以及它們中的至少一者中，優(yōu)選僅包含在優(yōu)先進(jìn)行第2反應(yīng)的試劑中。表面活性劑B1、B2和B3例如也可以包含在作為優(yōu)先進(jìn)行第2反應(yīng)的試劑的組合的、第2試劑、第3試劑以及僅第3試劑中的至少一個(gè)組合中。作為測(cè)定用試劑盒的優(yōu)選方式，可以舉出下述測(cè)定用試劑盒，其包括:含有膽固醇脫氫酶的第I試劑；含有膽固醇酯酶、表面活性劑Al和表面活性劑A2的第2試劑；以及含有表面活性劑BI的第3試劑。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包括記載了使用上述試劑來(lái)測(cè)定LDL膽固醇的方法等的使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的試劑盒也包括說(shuō)明書(shū)不是與本發(fā)明的測(cè)定試劑盒一同包裝而是在網(wǎng)絡(luò)上提供的情況。作為本發(fā)明的試劑盒，例如膽固醇測(cè)定用試劑、表面活性劑Al、表面活性劑A2和表面活性劑BI等也可以容納在試劑包中。試劑包例如優(yōu)選可一次性使用的盒形狀，更優(yōu)選具備兩種以上可配置上述試劑的槽。作為本發(fā)明的試劑盒，優(yōu)選上述第I試劑、第2試劑和第3試劑配置在單獨(dú)的槽中的試劑包。試劑包例如也可以還包括反應(yīng)槽、待測(cè)體槽、分注頭、反應(yīng)用光學(xué)池、廢棄槽等。通過(guò)使用這樣的試劑包，例如能夠更簡(jiǎn)便地實(shí)施本發(fā)明的LDL膽固醇測(cè)定方法，另外，也能夠極其容易地應(yīng)用于自動(dòng)化裝置。以下，使用參考例和實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。但是，本發(fā)明不被以下實(shí)施例限定性地解釋。此外，在以下實(shí)施例中使用以下的縮略語(yǔ)。CHDH:膽固醇脫氧酶(商品名:CHDH “Amano” 5、Amano Enzyme 制)Diaphorase:二氫硫辛酰胺脫氫酶(商品名:Diaphorase1、Unitika 制)BES:N，N-二(2-羥基乙基)-2_氨基乙磺酸(同仁化學(xué)制)CE:膽固醇酯酶(商品名:C0E_311、東洋紡制)MTT:3-(4, 5_ 二甲基噻唑_2)_2，5_ 二苯基四氮唑溴(同仁化學(xué)制)BSA:牛血清白蛋白(Sigma制)NAD:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(東方酵母制)實(shí)施例(參考例I)使用下述表I所示的試劑1-1 1-4和試劑2進(jìn)行試樣中的LDL膽固醇的測(cè)定。試樣采用了如下試樣:將從人血清通過(guò)超離心分離回收的VLDL和LDL添加到不含脂蛋白的人血清中，并將其用試劑1-3稀釋了 20倍(LDL濃度:83mg/dl，VLDL濃度:61mg/dL)。將90 μ L的試劑1_1、30 μ L的試劑1-2以及15 μ L的試劑1-4依次添加到試樣20 μ L中，在37°C下反應(yīng)240秒。接著，添加15 μ L含有下述表2所示的表面活性劑的試劑2，使用通用自動(dòng)分析裝置(商品名:BioMajeSty-8、日本電子社制)來(lái)測(cè)定吸光度，得到了LDL膽固醇測(cè)定值。其結(jié)果示于下述表2。
[表1]
權(quán)利要求
1.一種試樣中的低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，包括: 使表面活性劑Al、表面活性劑BI和表面活性劑B2存在于含有實(shí)施了高密度脂蛋白消去處理的試樣的反應(yīng)液中，以使低密度脂蛋白中的膽固醇酶反應(yīng)的步驟(I)， 所述表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚， 所述表面活性劑BI是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種， 所述表面活性劑B2是選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚以及聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其中， 所述高密度脂蛋白消去處理包括:將所述表面活性劑Al、表面活性劑A2以及試樣混合以使所述試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇酶反應(yīng)， 所述表面活性劑A2是選自由HLB為18.0以上的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚以及聚氧乙烯肉豆蘧基醚組成的組的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定方法，其中， 所述步驟(I)包括:通 過(guò)在含有實(shí)施了所述高密度脂蛋白消去處理的試樣的反應(yīng)液中添加表面活性劑B3，來(lái)使所述表面活性劑Al、所述表面活性劑B1、所述表面活性劑B2和所述表面活性劑B3存在于所述反應(yīng)液中，以使低密度脂蛋白中的膽固醇酶反應(yīng)， 所述表面活性劑B3是聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽和烷基苯磺酸鹽中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，所述聚氧化烯多環(huán)苯基醚是聚氧乙烯聚氧丙烯多環(huán)苯基醚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中， 所述步驟(I)中的酶反應(yīng)包括:使試樣中的低密度脂蛋白與膽固醇脫氫酶以及膽固醇酯酶反應(yīng)。
6.一種低密度脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定用試劑盒，包含: 表面活性劑Al，所述表面活性劑Al是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚； 表面活性劑BI，所述表面活性劑BI是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種；以及 表面活性劑B2，所述表面活性劑B2是選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚以及聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，還包含: 表面活性劑A2，所述表面活性劑A2是選自由HLB為18.0以上的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、以及聚氧乙烯肉豆蘧基醚組成的組的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，還包含: 表面活性劑B3，所述表面活性劑B3是聚氧乙烯烷基醚硫酸酯鹽和烷基苯磺酸鹽中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包含膽固醇測(cè)定用試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述膽固醇測(cè)定用試劑含有膽固醇脫氫酶以及膽固醇酯酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，具有: 第I試劑，所述第I試劑含有所述膽固醇脫氫酶； 第2試劑，所述第2試劑含有所述膽固醇酯酶、所述表面活性劑Al以及所述表面活性劑A2 ；以及 第3試劑，所述第3試劑含有 所述表面活性劑BI。
全文摘要
提供一種可簡(jiǎn)便且正確地測(cè)定LDL膽固醇的新的測(cè)定方法。一種試樣中的LDL膽固醇的測(cè)定方法，包括使表面活性劑A1、表面活性劑B1和表面活性劑B2存在于含有實(shí)施了HDL消去處理的試樣的反應(yīng)液中，以使LDL中的膽固醇酶反應(yīng)的步驟。表面活性劑A1是HLB為12.5以下的聚氧化烯多環(huán)苯基醚，表面活性劑B1是選自由HLB為12.6以上的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚、HLB為12.7以上且14.5以下的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚以及HLB為12.0以上且14.5以下的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚組成的組的至少一種，表面活性劑B2是選自由HLB為16.9以上的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯肉豆蔻基醚以及聚氧乙烯(35-40)辛基苯基醚組成的組的至少一種。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK103180457SQ20118005150
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者今井敏博, 濱隆志 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社