專利名稱：用于誘導多能性干細胞的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在多能性干細胞的誘導中使用的用于基因投遞的組合物及其用途。此夕卜，本發(fā)明涉及在多能性干細胞的誘導中使用的基因投遞載體。具體地，本發(fā)明涉及以特定的順序?qū)肓司幋a重編程因子的基因的仙臺病毒載體，包含這些載體的、供在多能性干細胞的誘導中使用的基因投遞用組合物，以及它們的用途。
背景技術(shù)：
自從由體細胞誘導多能干細胞(誘導的多能干細胞(iPS)細胞；又稱“人工多能干細胞”或“誘導多能性干細胞”)被報道以來(非專利文獻I)，已經(jīng)通過將重編程因子導入到多種哺乳動物細胞，包括人和小鼠細胞中來產(chǎn)生iPS細胞(非專利文獻I至9)。它們中的許多使用逆轉(zhuǎn)錄病毒來導入重編程因子。然而，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒具有由于整合入宿主基因組而致瘤的風險，它們的用途受到限制(非專利文獻3)。為了解決這個問題，人們已經(jīng)嘗試了利用腺病毒來誘導iPS細胞，但是只要使用DNA型載體，就不可能完全消除整合到基因組中的擔憂。此外，這些載體的iPS細胞誘導效率極低(非專利文獻10至13)。
為了解決這些問題，本發(fā)明人先前開發(fā)了一種利用RNA型病毒仙臺病毒載體來誘導iPS細胞的系統(tǒng)(專利文獻I)。利用仙臺病毒載體的iPS細胞誘導效率顯著高于使用其他載體的先前案例。由于仙臺病毒在其生命周期中不具有DNA期，它們沒有整合到宿主基因組中的擔憂，而且它們就安全性而言是極為優(yōu)越的。而且，所述載體在iPS細胞誘導后可以容易地去除。然而，利用仙臺病毒載體來進一步提聞iPS細胞誘導效率的技術(shù)尚屬未知。
現(xiàn)有技術(shù)文獻
[專利文獻]
[專利文獻I]國際公布TO2010/008054
[非專利文獻]
[非專利文獻 I]Takahashi, K.and Yamanaka, S.(2006)Celll26, 663-676
[非專利文獻 2]Maherali, N.et al., (2007)Cell Stem Celll, 55-70
[非專利文獻 3] Okita, K.et al.，(2007) Nature448, 313-317
[非專利文獻 4]Wernig，M.et al., (2007) Nature448, 318-324
[非專利文獻 5]Takahashi，K.et.al.，(2007)Celll31, 861-872
[非專利文獻 6]Yu, J.et al.，(2007) Science318, 1917-1920
[非專利文獻 7] Lowry, W.Ε.et al., (2008) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105, 2883-2888
[非專利文獻 8]Park, 1.H.et al.，(2008) Nature451, 141-146
[非專利文獻 9]Masaki，H.et al., (2008) Stem Cell Res.1，105-115
[非專利文獻 10] Stadtfeld, M.et al.，(2008) Science322, 945-949
[非專利文獻 11] Okita, K.et al., (2008) Science322, 949-953
[非專利文獻 12] Yu, J.et al.，(2009) Science324, 797-801
[非專利文獻 13]Zhou, ff.etal.，(2009) stem cells27, 2667-267
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的一個目的是提供在多能干細胞的誘導中使用的新的基因投遞用組合物及其用途。此外，本發(fā)明的一個目的是提供在多能干細胞的誘導中使用的新的基因投遞載體。具體地說，本發(fā)明的一個目的是提供以特定的順序組入有編碼重編程因子的、用于誘導多能干細胞的仙臺病毒載體，包含這些載體的在多能性干細胞的誘導中使用的基因投遞用組合物，及其用途。解決問題的手段本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用KLF基因、OCT基因和SOX基因(即重編程因子)位于仙臺病毒基因組上的仙臺病毒載 體，與使用各別的載體導入這三種基因時相比，可以以顯著更高的效率誘導iPS細胞。此外，發(fā)現(xiàn)當這種載體與表達MYC基因的載體組合使用時，與將KLF基因、OCT基因和SOX基因搭載到各別的仙臺病毒載體時相比，可以以顯著高的效率誘導iPS細胞?；蛘?，代替MYC基因表達載體，可以與表達Glisl基因(Maekawa etal.，Nature, 474:225-229，2011)的載體組合。尤其是，通過將KLF基因、OCT基因和SOX基因按此順序插入單一仙臺病毒載體，或者將OCT基因、SOX基因和KLF基因按此順序插入單一仙臺病毒載體，并使用該載體，能夠顯著提高iPS細胞誘導的效率。此外，當組合使用另外的具有插入到仙臺病毒L基因緊鄰上游的MYC基因的仙臺病毒載體時，iPS細胞集落以極高的速率(rate)出現(xiàn)，如

圖1所示(條件2)。此外，當使用將OCT基因、SOX基因和KLF基因按此順序插入單一仙臺病毒載體中而得到的載體時，還可以組合使用攜帶KLF基因的仙臺病毒載體。這樣，使用將KLF基因、OCT基因和SOX基因插入到單一仙臺病毒載體中而得到的載體，能夠顯著提高iPS細胞誘導的效率。具體地說，本發(fā)明涉及在多能干細胞的誘導中使用的新的基因投遞用組合物及其用途，以及基因投遞載體等，更具體地涉及各權(quán)利要求中描述的發(fā)明。由引用同一權(quán)利要求的多個權(quán)利要求中描述的兩項或更多項發(fā)明的任意組合所構(gòu)成的發(fā)明也是本申請意圖要求保護的發(fā)明。更具體地說，本發(fā)明涉及下述:[I] 一種供在用于多能干細胞誘導的基因投遞中使用的組合物，其包含仙臺病毒載體，所述載體中在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因；[2] [I]的組合物，其與插入有MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體組合使用；[3] [2]的組合物，其中MYC基因或Glisl基因插入到仙臺病毒L基因的緊鄰前方；[4] 一種在多能干細胞的誘導中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞的方法，其包括向細胞中導入仙臺病毒載體，所述載體中在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因；[5] [4]的方法，其還包括向細胞中導入插入有MYC基因或Glisl基因的另一仙臺病毒載體；
[6] [5]的方法，其中MYC基因或Glisl基因插入到仙臺病毒L基因的緊鄰前方；
[7] 一種仙臺病毒載體，其中在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因；
[8] 一種核酸，其編碼[7]的仙臺病毒載體的基因組或反基因組；
[9] 一種供在用于多能干細胞誘導的基因投遞中使用的試劑盒，其包含[7]的仙臺病毒載體以及插入有MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體；和
[10] [9]的試劑盒，其中所述MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒L基因的緊鄰前方。
本申請意圖涵蓋本申請描述的發(fā)明的任何事項及其任何組合。本申請還意圖涵蓋在這些發(fā)明中排除了任何本申請中描述的事項或其任何組合的發(fā)明。此外，本申請中描述的本發(fā)明的相關(guān)特定具體實施方案不但公開了這些實施方案，還公開了從本申請中公開的包含這些實施方案的上位發(fā)明中排除這些實施方案而得到的發(fā)明。
發(fā)明的效果
仙臺病毒不存在會整合到宿主基因組中的擔憂，因此它們是非常安全的載體。故而如果能夠利用這些載體以更高的效率誘導iPS細胞，則它們的實用將會極高。本發(fā)明使得人們能夠進一步提高仙臺病毒載體的iPS細胞誘導效率，同時實現(xiàn)了將多個重編程基因集成在單一仙臺病毒載體中，從而為iPS細胞的誘導操作的簡化和再現(xiàn)性的提高作出貢獻。附圖簡介
圖1顯示載體感染14日之后的細胞狀況。左邊的小圖顯示使用常規(guī)載體時的情況(條件11)，右邊小圖顯示使用本發(fā)明的載體的情況(條件2)。
圖2顯示了對載體感染21日后的細胞(BJ細胞)進行針對堿性磷酸酶的染色時的結(jié)果。當使用依次插入了 KLF4基因、0CT3/4基因和S0X2基因的仙臺病毒載體時，在所有的測試條件下(條件I至5)均檢測到了堿性磷酸酶陽性集落。此外，與使用以不同順序插入所述基因的仙臺病毒時(條件6至10)以及使用各別的仙臺病毒載體導入每種基因時(條件11)相比，堿性磷酸酶陽性 集落的出現(xiàn)頻率格外地高。尤其是，當組合使用在仙臺病毒L基因緊鄰前方或后方插入有c-MYC基因的另外的仙臺病毒載體時(條件2至4)，堿性磷酸酶集落的出現(xiàn)頻率顯著地高。
圖3顯示堿性磷酸酶染色的集落。在條件6、10和12下未檢測到堿性磷酸酶陽性集落。
圖4為顯示堿性磷酸酶陽性集落的誘導效率的圖。顯示了自BJ細胞誘導多能干細胞的效率。條件與圖3所示的相同。
圖5顯示了對載體感染27日后的細胞(MRC-5細胞)進行堿性磷酸酶染色時的結(jié)果。與常規(guī)方法(條件9)相比，人ES細胞樣集落當在搭載3種基因的條件下(條件I至8)，尤其是在MOI小于90的條件下(條件1-3和5-7)以顯著高的頻率出現(xiàn)。此外，當使用依次插入了 KLF4基因、0CT3/4基因和S0X2基因的仙臺病毒載體時，以顯著高效率誘導了堿性磷酸酶陽性集落。此外，當使用依次插入了 0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因的仙臺病毒載體時，與使用各別的仙臺病毒載體導入這些基因時相比，誘導堿性磷酸酶陽性集落的效率明顯更高。圖6是顯示堿性磷酸酶陽性集落誘導效率的圖。顯示了從MRC-5細胞誘導多能干細胞的效率。條件與圖5中所示一樣。圖7顯示了對載體感染后的細胞進行針對堿性磷酸酶的染色時的結(jié)果。圖8顯示了堿性磷酸酶陽性集落的誘導效率。圖9顯示了分析ES標志物基因的表達的結(jié)果。圖10顯示了分析ES標志物基因的表達的結(jié)果。圖11顯示了分析ES標志物基因的表達的結(jié)果。圖12顯示了分析iPS細胞克隆中ES標志物蛋白的表達的結(jié)果。圖13顯示了分析iPS細胞克隆中ES標志物蛋白的表達的結(jié)果。圖14顯示了分析iPS細胞克隆中ES標志物蛋白的表達的結(jié)果。圖15顯示了 iPS細胞克隆的胚狀體的形成。圖16顯示了 iPS細胞克隆的畸胎瘤的形成。圖17顯示了 iPS細胞克隆的畸胎瘤的形成。圖18顯示了 iPS細胞克隆的畸胎瘤的形成。圖19顯示了 i PS細胞克隆的核型分析的結(jié)果。圖20顯示了 0CT3/4啟動子的甲基化分析的結(jié)果。圖21顯示了自iPS細胞的載體去除。圖22顯示了自iPS細胞的載體天然丟失。發(fā)明的實施方式下面將詳細說明實施本發(fā)明的方式。本發(fā)明提供以特定順序組入了核重編程因子(KLF、0CT和S0X)基因的仙臺病毒載體，以及使用這些載體的用于在已分化細胞的重編程誘導中投遞重編程因子基因的方法，尤其是用于在從體細胞生成多能干細胞中投遞重編程因子基因的方法。具體地，所述方法包括將經(jīng)分化的細胞(如體細胞)接觸其中組入了至少三種編碼重編程因子的基因，即編碼KLF、OCT和SOX的基因依此次序，或者OCT基因、SOX基因和KLF基因依此次序，的仙臺病毒載體。更具體地說，本發(fā)明提供用于在細胞重編程中投遞重編程因子基因的方法，其中所述方法包括使用所述仙臺病毒載體將三種重編程因子基因?qū)胗行枰募毎校灰约肮┰谠摲椒ㄖ惺褂玫?、包含所述仙臺病毒載體的組合物。在本發(fā)明中，“多能干細胞”是指從胚泡期的動物胚胎的內(nèi)部細胞團塊制備的干細胞或者具有與這些細胞相似的表型的細胞。此外，本發(fā)明中誘導的多能干細胞是表達堿性磷酸酶(一種ES樣細胞的指示物)的細胞。此外，優(yōu)選地，當培養(yǎng)多能干細胞時，它們形成含有核容量比例高于細胞質(zhì)的細胞的扁平的集落?？蛇m宜地與滋養(yǎng)細胞(feeder) —起進行培養(yǎng)。此外，與MEF等經(jīng)培養(yǎng)的細胞在數(shù)周時間內(nèi)停止增殖相對的是，多能干細胞可以長時間傳代，這可以基于它們的增殖性在例如每三日一次傳代至少15次，優(yōu)選至少20次，至少25次、至少30次、至少35次、或至少40次時仍不喪失來加以確認。此外，多能干細胞優(yōu)選表達內(nèi)源0CT3/4或Nanog，或更優(yōu)選地，它們表達0CT3/4和Nanog 二者。此外，多能干細胞優(yōu)選表達TERT,并且顯示端粒酶活性(合成端粒重復序列的活性)。此外，多能干細胞優(yōu)選具有分化成三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層、和外胚層)的能力(例如在畸胎瘤形成和/或胚狀體形成的過程中)。更優(yōu)選地，多能干細胞當被移植到胚泡中時產(chǎn)生種系嵌合體。能夠種系轉(zhuǎn)播(germline transmission)的多能干細胞稱為種系能(germline-competent)多能干細胞。這些表型的確認可以通過已知方法進行(W02007/69666; Ichisaka T.et al.，Nature448(7151):313-7, 2007)。
此外，在本發(fā)明中，“(已)分化的”是指細胞的分化階段較之以前已經(jīng)進展，可指例如與多能干細胞相比更為分化，并包括仍然保有分化成多種細胞譜系(例如體性干細胞)的能力的狀態(tài)，以及終末分化的狀態(tài)。已分化的細胞是衍生自多能干細胞的細胞(除多能干細胞之外)。已分化的細胞可以是例如不具有分化成三胚層(內(nèi)胚層、中胚層、和外胚層)的能力的細胞。這樣的細胞除非經(jīng)過重編程，否則不會具有形成三胚層的能力。此夕卜，已分化的細胞可以是例如這樣的細胞，其無法生成自身所屬的胚層型之外的細胞。已分化的細胞可以是體細胞，并且例如它們可以是生殖細胞以外的細胞。
在本發(fā)明中，本發(fā)明中重編程(reprogramming)是指:使某細胞的分化狀態(tài)成為較之未分化的狀態(tài)，包括例如已分化的細胞脫分化，例如從不具有分化多能性的細胞誘導具有分化多能性的細胞、例如多能干細胞。此外，本發(fā)明中脫分化是指:使特定細胞成為更不成熟的(例如未分化的)狀態(tài)。脫分化也可以是指特定細胞返回其分化的最初狀態(tài)或中間狀態(tài)。此外，脫分化也可以是指從不能生成自身所屬的胚層類型以外的細胞的細胞變成能夠分化成其它胚層的細胞的變化。脫分化還包括例如，不具有三胚層分化能力的細胞獲得三胚層分化能力。此外，脫分化包括多能干細胞的生成。
此外，本發(fā)明中，體細胞是例如多能干細胞及生殖細胞以外的細胞。體細胞包括例如，構(gòu)成多細胞生物的細胞中的多能干細胞以外的細胞、及其培養(yǎng)細胞。體細胞包括例如體性干細胞和終末分化的細胞。
本發(fā)明中，病毒載體是具有病毒來源的基因組核酸，并能夠通過在該核酸中組入轉(zhuǎn)基因而表達該轉(zhuǎn)基因的載體。由于仙臺病毒載體是染色體非整合性病毒載體并在細胞質(zhì)中表達，不存在導入的基因會變得整合到宿主的染色體(核源染色體)中的風險。因此，所述載體是安全的，并且在重編程完成之后可以去除。在本發(fā)明中，仙臺病毒載體包括感染性病毒顆粒，以及病毒核心、病毒基因組和病毒蛋白質(zhì)的組合物，以及包含非感染性病毒顆粒等的復合物，它們是具有導入細胞中而表達加載的基因的能力的復合物。例如，在仙臺病毒中，由仙臺病毒基因組及與之結(jié)合的仙臺病毒蛋白質(zhì)(NP、P和L蛋白)構(gòu)成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)能夠在導入細胞后在細胞中表達轉(zhuǎn)基因(W000/70055)。針對細胞的導入可以使用轉(zhuǎn)染試劑等來適當 地進行。這樣的核糖核蛋白(RNP)也包括在本發(fā)明的仙臺病毒載體中。
仙臺病毒是單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)病毒，屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)(包括副粘病毒屬(Paramyxovirus),麻疫病毒屬，腿腺炎病毒屬,和肺病毒屬)，并含有單鏈負鏈(編碼病毒蛋白的有義鏈的反義鏈)RNA作為基因組。負鏈(minus-strand) RNA 又稱為負鏈(negative-strand) RNA。
單分子負鏈RNA病毒目除了副粘病毒(副粘病毒科病毒)之外還包括屬于如彈狀病毒科(包括水泡性病毒屬、狂犬病毒屬和短暫熱病毒屬屬等屬)，和纖絲病毒科等科的病毒(Virus, vol.57, N0.1:pp29-36, 2007; Annu.Rev.Genet.32, 123-162, 1998; Fieldsvirology fourthedition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340，2001;Microbiol.1mmunol.43, 613-624，1999;Field Virology,Thirdedition pp.1205-1241，1996)。仙臺病毒之外的其他副粘病毒科病毒的實例包括新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞病毒(RS病毒)、牛痕麻疫病毒(rinderpest virus)、痕熱病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1、I1、III型、屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等。其他例子包括仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1 (HPIV-1)，人副流感病毒_3 (HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，貓瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反芻動物瘟病毒(PDPR)，麻疫病毒(MV),牛痕麻疫病毒(RPV)，Hendra病毒(Hendra)，Nipah病毒(Nipah),人副流感病毒-2(HPIV-2)，猿副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒_4a (HPIV_4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更優(yōu)選地，例子包括選自下組的病毒:仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1 (HPIV-1)，人副流感病毒_3 (HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，貓瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反芻動物瘟病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV),牛痕麻疫病毒(RPV)，Hendra病毒(Hendra),和Nipah病毒(Nipah)。 仙臺病毒的核苷酸序列在數(shù)據(jù)庫中的登錄號的例子可見:NP基因為M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、和 X17218 ;P 基因為 M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、和 X17008 ;M 基因為 D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、和 X53056 ;F 基因為 D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152、和 X02131 ；HN 基因為 D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、和 X56131 ;L 基因為 D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、和X58886。由其他病毒編碼的病毒基因的例子包括:對于NP 基因(又稱 N 基因)有 CDV，AF014953; DMV，X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3，D10025 ；Mapuera, X85128;Mumps,D86172;MV, K01711;NDV,AF064091;PDPR, X74443;PDV,X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442;和 Tupaia, AF079780 ;對于 P 基因有 CDV, X51869;DMV, Z47758;HPIV-1, M74081;HPIV-3, X04721;HPIV-4a, M55975;HPIV-4b, M55976;Mumps, D86173;MV, M89920 ;NDV, M20302;PDV, X75960;RPV, X68311;SeV, M30202;SV5, AF052755;和 Tupaia, AF079780 ;對于 C 基因有 CDV, AFO14953; DMV, Z47758; HPIV-1.M74081; HPIV-3,D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796;和 Tupaia, AF079780 ;對于 M基因有CDV, M12669;DMV Z30087;HPIV-1, S38067;HPIV-2, M62734;HPIV-3, D00130;HPIV-4a, D1024I;HPIV-4b, D10242;Mumps, D86171;MV, ABO12948;NDV, AF089819;PDPR, Z47977;PDV, X75717;RPV, M34018;SeV, U31956;和 SV5, M32248 ;對于 F 基因有 CDV, M21849;DMV, AJ224704;HPN-1, M22347;HPIV-2, M60182;HPIV-3.X05303, HPIV-4a, D49821;HPIV-4b, D49822;Mumps, D86169;MV,AB003178;NDV, AF048763;PDPR, Z37017;PDV, AJ224706;RPV, M21514;SeV, D17334 ；和 SV5, AB021962 ;以及對于 HN(H 或 G 基因)有 CDV, AF112189;DMV, AJ224705;HPIV_1，U709498;HPIV-2.D000865;HPIV-3, AB012132;HPIV-4A, M34033;HPIV-4B, AB006954;Mumps, X99040;MV, K01711;NDV, AF204872;PDPR, Z81358;PDV, Z36979;RPV, AF132934;SeV, U06433;和SV-5, S76876。但是，對于所說的每種基因都已知有多種株系，而由于株系的差異可能存在由不同于上面例舉的那些的序列組成的基因。攜帶源自這些基因中的任意者的病毒基因的仙臺病毒可用作本發(fā)明的載體。例如，本發(fā)明的仙臺病毒載體包含與上述任意病毒基因的編碼序列具有90%或更高，優(yōu)選95%或更高，96%或更高，97%或更高，98%或更高，或99%或更高同一'I"生的核苷酸序列。此外，本發(fā)明的仙臺病毒載體包含例如編碼與上述任一病毒基因的編碼序列所編碼的氨基酸序列具有90%或更高，優(yōu)選95%或更高，96%或更高，97%或更高，98%或更高，或99%或更高同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，本發(fā)明的仙臺病毒載體包含例如編碼在上述任一病毒基因的編碼序列所編碼的氨基酸序列中具有10個或更少，優(yōu)選9個或更少，8個或更少，7個或更少，6個或更少，5個或更少，4個或更少，3個或更少，2個或更少，或I個氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列的核苷酸序列。
本說明書中記載的核苷酸序列和氨基酸序列等的數(shù)據(jù)庫登錄號所參考的序列例如參考本申請的申請日及優(yōu)先權(quán)日的序列，可以確定為本申請的申請日或者優(yōu)先權(quán)日的序列，優(yōu)選確定為本申請的申請日的序列。各個時間點上的序列可以通過參照數(shù)據(jù)庫的修訂歷史來加以確定。
本發(fā)明中使用的仙臺病毒載體可以是衍生物，所述衍生物包括具有修飾的病毒基因的病毒，以及化學修飾的病毒等，使得病毒導入基因的能力不受損。
此外，仙臺病毒可源自天然株系，野生型株系，突變株系，實驗室傳代的株系，以及人工構(gòu)建的株系等。一個例子是Z株系(Medical Journal of Osaka UniversityVol.6, N0.1, Marchl955pl-15)。即，這些病毒可以是與分離自自然界的病毒類似的結(jié)構(gòu)的病毒載體，或者通過基因重組人工修飾的病毒，只要能夠誘導期望的重編程。例如，它們在野生型病毒的任何基因中可能具有突變或缺失。此外，還可以使用不完整病毒如DI顆粒(J.Virol.68:8413-8417, 1994)。例如，可以優(yōu)選地使用在至少一個編碼病毒包膜蛋白或包殼蛋白的基因中具有突變或缺失的病毒。此類病毒為，例如，在感染細胞中能復制基因組但不能形成感染性病毒顆粒的病毒載體。由于不存在將感染擴散到周圍的擔憂，這樣的轉(zhuǎn)播缺陷病毒載體是高度安全的。例如，可以使用這樣的負鏈RNA病毒，其不含有至少一種編碼包膜蛋白(如F和/或HN或刺突蛋白，或其組合)的基因(W000/70055 和 W000/70070; Li, H.-0.et al.，J.Virol.74 (14): 6564-6569 (2000))。如果基因組RNA中編碼對于基因組復制而言必要的蛋白(例如，N、P和L蛋白)，則基因組可以在被感染的細胞中復制。為了產(chǎn)生缺陷型的病毒，例如，從外部向產(chǎn)生病毒的細胞供應缺陷型基因產(chǎn)物或能夠補全它的蛋白質(zhì)(W000/70055和TO00/70070;Li，H.-0.et al.，J.Virol.74(14):6564-6569 (2000))。此外，還已知在不完全`補全缺陷的病毒蛋白質(zhì)的條件下，以非感染病毒顆粒(VLP)的形式收集病毒載體的方法(W000/70070)。此外，當以RNP的形式(例如，含有N、L和P蛋白的RNP和基因組RNA)收集病毒載體時，可以在不補全包膜蛋白的條件下產(chǎn)生載體。
此外，還優(yōu)選使用攜帶突變病毒蛋白基因的載體。本發(fā)明尤其提供利用在病毒基因中有突變和/或缺失的仙臺病毒載體的重編程中基因投遞方法、重編程細胞的產(chǎn)生方法、組合物、以及試劑盒。例如，在包膜蛋白和包殼蛋白中已知有多種突變，包括減毒突變和溫度敏感突變。具有這些突變蛋白質(zhì)基因的仙臺病毒可以有利地在本發(fā)明中使用。在本發(fā)明中，理想地使用具有降低的細胞毒性的載體。細胞毒性可以例如通過對來自細胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放進行定量來加以測量。例如，可以使用與野生型相比具有顯著降低的細胞毒性的載體。關(guān)于細胞毒性降低的程度，例如可以使用這樣的載體:以MOI (感染復數(shù))3使之感染源自人的Hela細胞(ATCC CCL-2)或源自猴的CV-1細胞(ATCC CCL70)，培養(yǎng)3日后所得的培養(yǎng)基中的LDH釋放水平的相比于野生型顯著減少，例如減少20%或更多，25%或更多，30%或更多，35%或更多，40%或更多，或50%或更多者。此外，減少細胞毒性的突變還包括溫度敏感突變。溫度敏感突變是指與低溫(例如30°C至32°C )相比，顯著降低在病毒宿主的通常溫度(例如37°C至38°C )下的活性的突變。這樣的具有溫度敏感突變的蛋白質(zhì)是有用的，因為病毒能夠在容許溫度(低溫)下制備。具有本發(fā)明中有用的溫度敏感性突變的病毒載體當在37°C感染時，與在培養(yǎng)細胞中32°C感染時相比，顯示的生長速率或基因表達水平為例如1/2或更少，優(yōu)選1/3或更少，更優(yōu)選1/5或更少，更優(yōu)選1/10或更少，更優(yōu)選1/20或更少。本發(fā)明中使用的仙臺病毒載體可以是野生型，只要它不抑制重編程并且能夠通過誘導重編程因子所致的重編程或者支持重編程的誘導，并且優(yōu)選在至少一個，更優(yōu)選至少
2、3、4、5或更多個病毒基因中具有缺失或突變。缺失和突變可以任意組合并導入各個基因中。這里，突變可以是功能障礙型突變或溫度敏感型突變，并且是這樣的突變，其至少在37°C下與野生型相比將病毒增殖速率或任何攜帶的基因的表達水平降低至優(yōu)選1/2或更少，更優(yōu)選1/3或更少，更優(yōu)選1/5或更少，更優(yōu)選1/10或更少，且更優(yōu)選1/20或更少。使用這樣的修飾型病毒載體尤其對于多能干細胞的誘導而言可能是有用的。例如，在本文中優(yōu)選使用的仙臺病毒載體具有至少兩個缺失或突變的病毒基因。這樣的病毒包括那些缺失至少兩個病毒基因者、至少兩個病毒基因中具有突變者、以及在至少一個病毒基因中具有突變且缺失了至少一個病毒基因者。所述至少兩個被突變或缺失的病毒基因優(yōu)選為編碼構(gòu)成包膜的蛋白的基因。例如，具有F基因缺失、且進一步具有M和/或HN基因缺失或進一步在M和/或HN基因中有 突變(例如溫度敏感性突變)的載體是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。此外，例如F基因缺失、且M或HN基因也缺失、而余下的M和/或HN基因中具有突變(例如溫度敏感性突變)的載體，也是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。本發(fā)明中使用的載體更優(yōu)選具有至少3個缺失或突變的病毒基因(優(yōu)選至少3個編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因，F(xiàn)、HN、和M)。這樣的病毒載體包括:至少3個基因缺失的載體、至少3個基因中具有突變的載體、至少I個基因中有突變且至少2個基因缺失的載體、至少2個基因中有突變且至少I個基因缺失的載體。作為更優(yōu)選的實施方式的例子，缺失F基因、且M和HN基因也缺失或M和HN基因中還具有突變(例如溫度敏感性突變)的載體是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。此外，例如F基因缺失、且M或者HN基因也缺失、而余下的M或者HN基因中有突變(例如溫度敏感性突變)的載體，本發(fā)明中也是優(yōu)選的。這樣的突變型病毒可以根據(jù)已知方法制備。例如，仙臺病毒的M基因的溫度敏感性突變包括選自M蛋白質(zhì)中的69位(G69)、116位(Tl 16)和183位(A183)中的任意位點的氨基酸取代(Inoue, M.等，J.Virol.2003，77:3238-3246)。具有編碼突變M蛋白質(zhì)的基因組的病毒，其中仙臺病毒M蛋白質(zhì)中上述3個位點中的任一個位點、優(yōu)選任意2個位點的組合、更優(yōu)選全部3個位點上的氨基酸被其它氨基酸取代，是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。優(yōu)選的氨基酸突變是取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸，例如取代成 BL0SUM62 矩陣(Henikoff, S.and Henikoff, J.G.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915-10919)的分值為3以下、優(yōu)選2以下、更優(yōu)選I以下、甚至更優(yōu)選為O的氨基酸。具體地，可以將仙臺病毒M蛋白質(zhì)的G69、T116和A183分別取代成Glu(E)、Ala(A)和Ser(S)。此外，還可以利用與溫度敏感P253-505麻疹病毒株(Morikawa, Y.等，KitasatoArch.Exp.Med.1991:64; 15-30)的M蛋白質(zhì)的突變同源的突變。突變例如可以使用寡核苷酸等采用公知的突變方法來實施導入。
此外，HN基因的溫度敏感性突變包括任意選自仙臺病毒的HN蛋白質(zhì)的262位(A262)、264位(G264)和461位(K461)中的位點的氨基酸取代(Inoue，M.等，J.Virol.2003，77:3238-3246)。具有編碼這3個位點中的任何I個、優(yōu)選任意2個位點的組合、更優(yōu)選全部3個位點的氨基酸被取代成其它氨基酸的突變HN蛋白質(zhì)的基因組的病毒是本發(fā)明中優(yōu)選使用的。如上述，優(yōu)選的氨基酸取代是取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸。作為優(yōu)選的一個例子，將仙臺病毒HN蛋白質(zhì)的A262、G264和K461分別取代成Thr (T)、Arg (R)和Gly (G)。此外，例如，使用流行性腮腺炎病毒的溫度敏感性疫苗株Urabe AM9為參照,可突變HN蛋白質(zhì)的464以及468位的氨基酸(Wright, K.E.等，VirusRes.2000:67;49-57)。
此外，仙臺病毒可以在P基因和/或L基因中具有突變。這樣的突變的例子具體有=SeV P蛋白質(zhì)的86位的Glu (E86)的突變、以及SeV P蛋白質(zhì)的511位的Leu (L511)到其它氨基酸的取代。同上述，優(yōu)選的氨基酸取代是取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體的例子包括86位的氨基酸到Lys的取代、以及511位的氨基酸到Phe的取代。此外，L蛋白質(zhì)中的例子包括SeV L蛋白質(zhì)的1197位的Asn (NI 197)和/或1795位的Lys (K1795)到其它氨基酸的取代，且同上述，優(yōu)選的氨基酸是取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體的例子是1197位的氨基酸到Ser的取代、以及1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突變能夠 顯著提高持續(xù)感染性、2次粒子釋放的抑制或細胞毒性的抑制的效果。而且，通過組合包膜蛋白質(zhì)基因的突變和/或缺失，能夠急劇地提升這些效果。此外，對于L基因，例子包括SeV L蛋白質(zhì)的1214位的Tyr(Y1214)和/或1602位的Met (M1602)到其它氨基酸的取代，且同上述，優(yōu)選的氨基酸是取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體地可以示例出:1214位的氨基酸到Phe的取代、以及1602位的氨基酸到Leu的取代等。以上示例的突變可以任意組合。
例如，SeV M蛋白質(zhì)的至少69位的G、116位的T以及183位的A，SeV HN蛋白質(zhì)的至少262位的A、264位的G以及461位的K，SeV P蛋白質(zhì)的至少511位的L，SeV L蛋白質(zhì)的至少1197位的N以及1795位的K分別被取代成其它氨基酸，且F基因缺損或缺失的仙臺病毒載體；以及F基因缺損或缺失、且具有與上述的那些同樣或更低的細胞毒性和/或具有與上述的那些同樣或更高的溫度敏感性的仙臺病毒載體，在本發(fā)明中特別優(yōu)選用于表達核重編程因子。具體的取代實例包括:M蛋白質(zhì)的G69E、T116A以及A183S取代，HN蛋白質(zhì)的A262T、G264以及K461G的取代，P蛋白質(zhì)的L511F取代，以及L蛋白質(zhì)的N1197S和K1795E 取代。
L蛋白質(zhì)的突變包括選自SeV L蛋白質(zhì)的942位(Y942)、1361位(L1361)和1558位(L1558)中的任意位點的氨基酸到其它氨基酸的取代。同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體的例子包括942位的氨基酸到His的取代、1361位的氨基酸到Cys的取代、和1558位的氨基酸到Ile的取代。特別可以優(yōu)選使用至少942位或1558位發(fā)生了取代的L蛋白質(zhì)。例如，優(yōu)選除了 1558位以外、1361位也被取代成其它氨基酸的突變L蛋白質(zhì)。此外，還優(yōu)選除了 942位以外、1558位和/或1361位也被取代成其它氨基酸的突變L蛋白質(zhì)。這些突變能夠提高L蛋白質(zhì)的溫度敏感性。
P蛋白質(zhì)的突變的例子包括選自SeV P蛋白質(zhì)的433位(D433)、434位(R434)和437位(K437)中的任意位點的氨基酸到其它氨基酸的取代。同上述，氨基酸的取代優(yōu)選取代成側(cè)鏈的化學性質(zhì)不同的其它氨基酸。具體的示例包括:433位的氨基酸到Ala(A)的取代、434位的氨基酸到Ala(A)的取代、437位的氨基酸到Ala(A)的取代等。特別可以優(yōu)選使用上述3個位點全部發(fā)生取代的P蛋白質(zhì)。這些突變可以提高P蛋白質(zhì)的溫度敏感性。編碼SeV P蛋白質(zhì)的至少433位的D、434位的R和437位的K這3個位置被取代成其它氨基酸的突變P蛋白質(zhì)、和SeV L蛋白質(zhì)的至少1558位的L被取代的突變L蛋白質(zhì)(優(yōu)選至少1361位的L也被取代成其它氨基酸的突變L蛋白質(zhì))的F基因缺損或缺失的仙臺病毒載體；以及具有與上文所述的那些同樣或更低的細胞毒性和/或與之同樣或更高的溫度敏感性的F基因缺損或缺失的仙臺病毒載體優(yōu)選在本發(fā)明中使用。除了上述突變以外，各病毒蛋白質(zhì)中在其它氨基酸上(例如10個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下或I個氨基酸)上也可以具有突變。由于包含上述所示突變的載體顯示高的溫度敏感性，因此在重編程完成后，可通過將細胞在稍微的高溫(例如37.5 39°C、優(yōu)選38 39°C或38.5 39°C )下進行培養(yǎng)，簡便地將載體除去。更具體地，可優(yōu)選地使用具有例如下述突變的仙臺病毒載體(國際公布號W02010/008054):TS7:L(Y942H/L1361C/L1558I);TS12:P (D433A/R434A/K437A);TS13:P (D433A/R434A/K437A)，L(L1558I);TS14:P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C);和

TS15:P (D433A/R434A/K437A), L(L1361C/L1558I)。具體的載體可以為例如:其中M蛋白質(zhì)具有G69E、T116A以及A183S突變，HN蛋白質(zhì)具有A262T、G264以及K461G突變；P蛋白質(zhì)具有L511F突變，且L蛋白質(zhì)具有N1197S和K1795E突變的F基因缺失的仙臺病毒載體(例如Z株)；且通過向該載體中進一步導入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突變而產(chǎn)生的載體是更優(yōu)選的。具體地，例子包括SeV18+/TS F(TO2010/008054 和 TO2003/025570)和 SeV (PM)/TS Λ F，以及通過進一步向這些載體中導入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突變而產(chǎn)生的載體，但不限于此?！癟S Δ F，，意思是在M蛋白中攜帶G69E、Τ116Α和A183S突變，在HN蛋白中攜帶Α262Τ, G264,和K461G突變，P蛋白中攜帶L511F突變，以及L蛋白中攜帶N1197S和Κ1795Ε突變，以及缺失F基因。具體的，優(yōu)選的載體的例子包括SeV (PM) K0S/TS Δ F，SeV (PM) KOS/TS7 Δ F, SeV (PM) K0S/TS12 Δ F SeV (PM) 0SK/TS，但不限于此。在此情況下，MYC 基因可以使用 SeV (HNL) c-rMYC/TS12 Δ F，SeV (HNL) c-rMYC/TS13 Δ F，SeV (HNL) c-rMYC/TS15 Λ F 等來導入。此外，還可額外導入表達KLF基因的仙臺病毒載體。具體地，通過與按順序攜帶OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體組合可獲得有利的結(jié)果。KLF基因可以插入仙臺病毒載體N基因的上游(基因組上N基因的3’側(cè))。本文中描述的F基因缺失的載體和/或F基因突變的載體可以如期望地用作載體；一個具體的例子是SeV18+KLF4/TSAF，但不限于此。具體地，本發(fā)明還提供:[I] 一種供在用于多能干細胞誘導的基因投遞中使用的組合物，其包含在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體，其是與插入有KLF基因的另外的仙臺病毒載體組合使用的組合物；
[2] [I]的組合物，其與插入有MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體組合使用；
[3] [2]的組合物，其中所述MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒L基因的緊鄰前方；
[4] 一種在多能干細胞的誘導中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞的方法，其中所述方法包括向細胞中導入在仙臺病毒P基因緊鄰后方依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體，以及插入有KLF基因的另外的仙臺病毒載體；
[5] [4]的方法，其進一步包括向細胞中導入插入有MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體；
[6] [5]的方法，其中所述MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒L基因的緊鄰前方；
[7] 一種供在用于多能干細胞誘導的基因投遞中使用的試劑盒，其包含在仙臺病毒P基因緊鄰后方依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體，以及插入有KLF基因的另外的仙臺病毒載體；
[8] [7]的試劑盒，其包含插入有MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體；和
[9] [8]的試劑盒，其中所述MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒L基因的緊鄰前方。
載體的細胞毒性例如可以通過對從細胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)進行定量來測定。具體地，例如，以MOI3感染HeLa (ATCC CCL-2)或猴CV-1 (ATCC CCL70)，并測量培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)液中的LDH釋放量。釋放的LDH量越低，細胞毒性越低。此外，溫度敏感性可以通過測量病毒宿主的通常溫度(例如，37°C至38°C)下病毒增殖的速度或搭載的基因的表達水平來加以測定。與無突變者相比病毒擴增速度和/或搭載的基因的表達水平越低，則判斷為溫度敏感性越高。
此外，當使用包膜病毒時，可以使用這樣的病毒，其在包膜中含有與該病毒原本攜帶的包膜蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。例如，在制造病毒時，通過使病毒產(chǎn)生細胞表達希望的外源性包膜蛋白質(zhì)，能夠制造含該外源性包膜蛋白質(zhì)的病毒。這樣的蛋白質(zhì)沒有特殊限制，可以使用賦予對哺乳動物細胞的感染能力的希望的粘附因子、配體、受體等蛋白質(zhì)。具體實例包括水皰性口炎病毒(VSV)的G蛋白質(zhì)(VSV-G)。VSV-G蛋白質(zhì)可以來源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株(J.Virology39:519-528 (1981))來源的VSV-G蛋白，但不限于此。本發(fā)明中使用的仙臺病毒載體可以包含其它病毒來源的包膜蛋白質(zhì)任意組合。
攜帶有核重編程因子的重組仙臺病毒的重建可以利用公知方法進行。作為具體的規(guī)程，典型地，仙臺病毒可以通過下述步驟來制造:(a)在表達病毒粒子形成所必需的病毒蛋白質(zhì)(N、P、和L)的細胞中轉(zhuǎn)錄編碼仙臺病毒基因組RNA(負鏈)或其互補鏈(正鏈)的cDNA，和(b)回收含有生成的病毒的培養(yǎng)上清。粒子形成所必需的病毒蛋白質(zhì)可以由轉(zhuǎn)錄后的病毒基因組RNA表達，也可以從基因組RN A以外的來源反式供給它們。例如，可以將編碼N、P和L蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒導入細胞來供給。在基因組RNA中粒子形成所必需的病毒基因缺損的情況下，可在病毒產(chǎn)生細胞中另行表達那些病毒基因，以補全粒子的形成。為了在細胞內(nèi)表達病毒蛋白質(zhì)或RNA基因組，將編碼所述蛋白質(zhì)或基因組RNA的DNA連接在能夠在宿主細胞中發(fā)揮功能的適當啟動子的下游的載體導入宿主細胞。轉(zhuǎn)錄的基因組RNA在病毒蛋白質(zhì)的存在下得以復制，并形成感染性病毒粒子。在制造基因(如包膜蛋白質(zhì)的基因等)缺損的缺損型病毒時，可以在病毒產(chǎn)生細胞中表達缺損的蛋白質(zhì)、能夠補償那些蛋白質(zhì)或其功能的其它病毒蛋白質(zhì)、等等。例如，仙臺病毒的制造可以采用以下的公知方法來實施(W097/16539;W097/16538;W000/70055;W000/70070;W001/18223;W003/025570;W02005/071092;W02006/137517;WO2007/083644; W02008/007581; Hasan, Μ.K.等，J.Gen.Virol.78:2813-2820, 1997、Kato, A.等，1997，EMB0 J.16:578-587 以及 Yu, D.等，1997，Genes Cells2:457-466;Durbin, A.P.等，1997，Virology235:323-332; Whelan, S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:8388-8392; Schnel 1.M.J.等，1994，EMBO J.13: 4195-4203 ; Radecke, F.等，1995，EMB0 J.14:5773-5 784; Lawson, N.D.等，Pr o c.Na 11.Acad.Sc i.USA92:4477-4481; Garcin, D.等，1995，EMBO J.14:6087-6094; Kato, A.等，1996，GenesCellsl:569-579;Baron, M.D.與 Barrett, T.，1997, J.Virol.71:1265-1271;Bridgen, A.與Elliott, R.M., 1996, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:15400-15404; Tokusumi, T.等.VirusRes.2002:86; 33-38,Li, H.-0.等，J.Virol.2000:74; 6564-6569)。關(guān)于其它的 RNA 病毒的增殖方法和重組病毒的制造方法，可以參照病毒實驗學各論改訂第二版(々^ 7実験學各論、改訂二版)(國立預防衛(wèi)生研究所學友會編，丸善，1982)。

在上述的仙臺病毒中依次組入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者，或者依次組入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因。一般地，這些外源基因可以插入任何病毒基因(NP, P, M, F，HN,或L)的緊鄰前方(基因組上的3’側(cè))或緊鄰后方(基因組上的5’側(cè))。優(yōu)選地，在仙臺病毒P基因緊鄰后方，即在P基因的緊鄰下游(在負鏈RNA基因組上緊鄰5’側(cè))依次組入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或依次組入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因。例如，在前一順序中，轉(zhuǎn)錄起始信號(S序列)、轉(zhuǎn)錄終止信號(E序列)、以及間隔序列(居間序列(I序列)等)可以包含在P基因和KLF基因之間(在后一情況下，在P基因和OCT基因之間)；但不包含其他轉(zhuǎn)錄單位(例如編碼蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄單位)。由于仙臺病毒攜帶負鏈RNA作為基因組，與通常情況相反，3’側(cè)對應于基因組的上游，5’側(cè)對應于基因組的下游。當KLF基因、OCT基因和SOX基因以此順序定位于仙臺病毒基因組中時，在這三個基因中KLF基因位于最接近3’側(cè)的位置，而SOX基因位于最接近5’側(cè)的位置。由于負鏈RNA以反義方向編碼基因，KLF基因、OCT基因和SOX基因在基因組上是作為反義鏈而不是作為蛋白編碼鏈(有義鏈)編碼的。當仙臺病毒基因組進入細胞中，它使用該基因組作為模板產(chǎn)生反基因組RNA。反基因組是正鏈，而KLF基因、OCT基因和SOX基因作為蛋白編碼鏈(有義鏈)加載。在反基因組RNA中，KLF基因、OCT基因和SOX基因的定位使得在這三個基因中，KLF基因位于最接近5’側(cè)，而SOX基因位于最接近3’偵U。這三個基因優(yōu)選彼此相鄰(即這三個基因之間沒有其他的基因存在)。這三個基因中每一個都可以合適地被包夾在仙臺病毒S(起始)序列和E(終止)序列之間。S序列是起始轉(zhuǎn)錄的信號序列，E序列則終止轉(zhuǎn)錄。S序列和E序列之間的區(qū)域成為單個轉(zhuǎn)錄單位。當合適時，在特定基因的E序列和下一基因的S序列之間可以插入充當間隔物(居間序列)的序列。例如，可以有利地使用含有這樣的核酸的仙臺病毒載體，所述核酸具有如下組成:S-KLF基因-E-1-S-OCT基因-E-1-S-SOX基因-E(S，I,和E分別指S序列、I (居間，intervening)序列,和E序列)。仙臺病毒基因組上的P基因和KLF基因?qū)⒁韵率龇绞竭B接=P基因-E-1-S-KLF基因-，等等。
當OCT基因、SOX基因和KLF基因以此順序定位時，例如，可以有利地使用這樣的仙臺病毒載體，其基因組中含有具有S-OCT基因-E-1-S-SOX基因-E-1-S-KLF基因-E (S、I和E分別指S序列、I (居間)序列、和E序列)構(gòu)成的核酸。仙臺病毒基因組上的P基因和SOX基因?qū)⒁匀缦路绞竭B接:P基因-E-1-S-SOX基因-，等等。
可使用仙臺病毒的期望的S序列作為S序列，但可優(yōu)選使用例如 3’-UCCCWVUUWC-5’(W=A 或 U;V=A、C 或 G)序列(SEQ ID NO:1)。尤其是，3’ -UCCCAGUUUC-5’ (SEQ ID NO:2)、3’ -UCCCACUUAC-5’ (SEQ IDN0:3)、和3 ’ -UCCCACUUUC-5 ’ (SEQ ID NO: 4)是優(yōu)選的。當這些序列以編碼正鏈的DNA序列表示時，它分另O 為 5’ -AGGGTCAAAG-3’ (SEQ ID N0:5)、5’ -AGGGTGAATG-3’ (SEQ IDNO:6)、和5，-AGGGTGAAAG-3，(SEQ ID NO: 7) 仙臺病毒載體的E序列優(yōu)選為例如3’ -AUUCUUUUU-5’ (SEQ ID NO:8)(編碼正鏈的 DNA 為 5’ -TAAGAAAAA-3’ (SEQ ID N0:9))。I序列可以為例如任何三個堿基，具體可以使用3’ -GAA-5’ (正鏈DNA中為5’ -CTT-3’ )。
野生型仙臺病毒的基因組在3’的短前導區(qū)域之后，依次包含核殼(N)基因、磷(P)基因、基質(zhì)(M)基因、融合(F)基因、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因和大(L)基因、以及短的5’-后隨序列(trailer)區(qū)域。在仙臺病毒載體中也可以按照該順序配置病毒基因。與野生型病毒相當?shù)闹亟M載體以及各種突變型載體的制備是已知的。而且還顯示，使用沒有其包膜的單獨RNP也可能實現(xiàn)基因?qū)?W000/70055)。因此，可以使用仙臺病毒RNP作為病毒載體進行重編程。
仙臺病毒如果攜帶NP基因、P基因和L基因就足以作為載體發(fā)揮功能，它們可以在細胞中復制基因組并表達搭載的外源基因(KLF、OCT和S0X)。在攜帶NP基因、P基因和L基因這三個基因作為病毒基因的仙臺病毒中，KLF、0CT及SOX基因的組插入例如P基因和L基因之間。在含有M基因的載體中，KLF、0CT和SOX基因的組插入例如P基因和M基因之間(W097/16539)。當M基因缺失的仙臺病毒載體中包含F(xiàn)基因時，KLF、OCT和SOX基因的組插入P基因和F基因之間(W000/70070)。對于缺失M和F基因的仙臺病毒載體，插入的位置在P基因和HN基因之間；而對于缺失F、M和HN基因的仙臺病毒載體，插入的位置在P基因和L基因之間(W02003/025570，W02006/137517)。缺失病毒基因的載體由于非常安全所以是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用具有至少F基因缺失的載體。
上述的含有KLF、0CT及SOX基因的仙臺病毒可以適宜地單獨用于重編程中的基因投遞，但其更優(yōu)選用于還涉及MYC基因或Glisl基因?qū)氲闹鼐幊?。MYC基因或Glisl基因可以插入上述的含有KLF、0CT及SOX基因的仙臺病毒，但也可以插入別的載體后使用。當將MYC基因或Glisl基因插入別的載體時，可以使用如質(zhì)粒、病毒載體、以及非病毒載體(例如脂質(zhì)體)等期望的載體。病毒載體的例子包括腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但不限于此。更優(yōu)選的是，MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒載體。在本發(fā)明中，上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙臺病毒優(yōu)選與插入了 MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體組合使用。上述的仙臺病毒載體可以用作起始仙臺病毒載體來插入MYC基因或Glisl基因。
當將MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒基因組時，載體中的基因插入位置可以選擇期望的位點。例如，MYC基因或Glisl基因優(yōu)選位于靠負鏈RNA基因組的后方(5’側(cè))，例如，比負鏈RNA病毒基因組的中心更靠5’端(位置比位于中央的基因更靠5’端)。換言之，在位于基因組上的多個蛋白編碼序列中，其優(yōu)選位于距5’端比距3’端更近的位置(見實施例)。MYC基因或Glisl基因可以位于例如最5’側(cè)(即自5’端起的第一個位置)，或者自5’端起的第二或第三個位置。MYC基因或Glisl基因可以位于自基因組的5’端起的第二個位置，具體地，當L基因位于基因組最5’側(cè)，接著是HN基因時，其可位于HN基因和L基因之間(HN-L間)。具體地，優(yōu)選將MYC基因或Glisl基因插入仙臺病毒基因組中的L基因的緊鄰上游(3’偵彳，例如HN基因與L基因之間)，或者緊鄰下游(5，側(cè)，例如L基因與5’ -后隨序列之間)。仙臺病毒載體可以是例如這樣的F基因缺失仙臺病毒載體，其中M蛋白具有G69E、T116A和A183S突變，HN蛋白具有A262T，G264和K461G突變，P蛋白具有L511F突變，而L蛋白具有N1197S和K1795E突變(例如，Z株)；且通過向該載體中進一步導入TS7、TS12、TS13、TS14、或TSl突變而產(chǎn)生的載體是更優(yōu)選的。例子包括SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF，SeV(L)c-rMYC/TSΔF，SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF(W02010/008054;Fusakietal., ProcJpnAcadSer B PhysBiol Sc1.Vol.85，p348_362 (2009))，特別是優(yōu)選 SeV(HNL)c-rMYC/TS 15 Δ F,但不限于此。MYC基因，不僅包括野生型C-MYC還包括T58A突變體、N-MYC和L-MYC，能夠誘導多能干細胞(W02007/69666; Blelloch R.et al., Cell Stem Cell, 1:245-247，2007)。如此，由于可以通過各種方式選擇家族基因并使用，可以合適地選擇MYC家族基因來誘導重編程。此外，可以通過合適地導入不改變被編碼的氨基酸序列的沉默突變來替換MYC基因中的連續(xù)A或T核苷酸序列。例如，已發(fā)現(xiàn)仙臺病毒載體等RNA病毒載體表達的野生型c-MYC的量少。然而，通過向野生型c-MYC中導入選自a378g、tll22c、tll25c、all91g、和all94g中的一個或多個，優(yōu)選兩個或更多個，三個或更多個，或四個或更多個，或全部5個突變，可以從載體穩(wěn)定地高表達基因。在本發(fā)明中，例如，可以適當?shù)厥褂肳02010/008054的SEQ ID N0:45所示的修飾的c-MYC基因。

當適宜時，可以在上述的攜帶KLF、0CT和SOX基因的仙臺病毒載體和/或攜帶MYC基因的仙臺病毒載體中進一步搭載用于細胞重編程的基因等。此外，也可以將搭載了用于細胞重編程的基因等的其他載體與上述的仙臺病毒載體組合。要搭載的基因可以是從已分化的細胞誘導多能干細胞等各種干細胞的誘導中涉及的期望的基因。例如，可以搭載增加重編程效率的基因。本發(fā)明提供本發(fā)明的仙臺病毒載體用于在細胞重編程中導入基因的用途，以及這些載體用于在細胞中表達重編程因子以誘導這些細胞的重編程的用途。此外，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的仙臺病毒載體的、用于在細胞重編程中導入基因的作用劑(轉(zhuǎn)移劑、基因轉(zhuǎn)移劑)，以及含有這些載體的用于在細胞中表達重編程因子的作用劑。此外，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的仙臺病毒載體的、用于在細胞中表達重編程因子以誘導該細胞的重編程的作用劑。此外，當實施細胞的重編程時，本發(fā)明的載體還可以用于在這些細胞中表達期望的基因。本發(fā)明的仙臺病毒載體可以依照本發(fā)明來用于細胞重編程。重編程的誘導具體可以是多能干細胞的誘導。本發(fā)明可以用于醫(yī)學用途和非醫(yī)學用途，并可以在醫(yī)學和非醫(yī)學實施方案中使用。例如，本發(fā)明可以用于治療、手術(shù)、和/或診斷目的，或者非治療、非手術(shù)、和/或非診斷目的。
在本發(fā)明中，核重編程因子是指能夠單獨或與多個因子共同用于將某細胞的已分化狀態(tài)誘導至相對未分化的狀態(tài)的基因或其產(chǎn)物，包括例如用于誘導已分化的細胞脫分化的基因或其產(chǎn)物。本發(fā)明中，核重編程因子(a nuclear reprogramming factor)包括:核的重編程所必需的因子、和提高核重編程的效率的輔助性因子(輔助因子)。本發(fā)明中，可以使載體攜帶用于核重編程(nuclear reprogramming)的希望的基因。例如，可以進一步加載用于多能干細胞的制造的基因。具體地，作為用于誘導多能干細胞的核重編程因子，可以使用例如:在ES細胞、初期胚等中表達、但在分化的多種體細胞中不表達或表達降低的基因(ES細胞特異性基因等)。這樣的基因優(yōu)選是編碼轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白質(zhì)等的基因。鑒定核重編程基因的方法是已知的(W02005/80598)，實際上，已證明采用該方法鑒定出的基因顯示對于向多能干細胞的重編程(!^programming)是有用的(W02007/69666)。
作為這樣的基因的例子，可以列舉出:DPPA5(發(fā)育多能性相關(guān)5，ES細胞特異性基因 I(ESGl);登錄號 ΝΜ_001025290，NM_025274，XM_236761)、F-框蛋白15(Fbxl5，NM_152676，NM_015798)、Nanog (NM_024865, AB093574)、ECATl (ES 細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物 1;AB211062, AB211060)、ERAS (ES 細胞表達的 Ras; NM_181532, NM_181548)、■MT3L(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基轉(zhuǎn)移酶 3-樣；NM_013369, NM_019448)、ECAT8(AB211063, AB211061)、⑶F3(生長分化因子 3; NM_020634, NM_008108)、SOX 15 (SRY (性別決定區(qū) Y)-框 15; NM_006942, NM_009235)、DPPA4 (發(fā)育多能性相關(guān)4;NM_018189，NM_028610)、DPPA2(NM_138815，NM_028615)、FTHL17(運鐵蛋白，重鏈多肽-樣 17;NM_031894，NM_031261)、SALL4(sal_ 樣 4; NM_020436, NM_175303)、0CT3/4 (也稱 P0U5F1;NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178)、S0X2 (NM_003106, NM_011443, XM_574919), Rex-1 (ZFP42 (鋅指蛋白 42 同源物)；NM_1 M9OO, MLOO9556)、Utfl (未分化的胚胎細胞轉(zhuǎn)錄因子1;NM_003577，NM_009482)、TCL1A(T細胞白血病/淋巴瘤 1A;NM_021966，NM_009337)、DPPA3(也稱 Stella, NM_199286, NM_139218, XM_216263)、KLF4(Kruppel-樣因子 4;NM_004235，NM_010637)、聯(lián)蛋白 β 1(鈣粘蛋白-相關(guān)蛋白β 1;ΝΜ_001904, ΝΜ_007614;含 S33Y 突變體)、c_MYC (ΝΜ_002467, ΝΜ_010849;含 Τ58Α 突變體)、STAT3 (信號轉(zhuǎn)導者和轉(zhuǎn)錄活化者3; NM_139276, NM_213659)、GRB2 (結(jié)合于生長因子受體的蛋白 2 ;NM_002086，NM_008163)，Glisl 基因(Maekawa et al., Nature, 474:225-229, 2011;NM_147193，NM_147221)以及這些基因所屬家族的其它成員的基因等。這些基因?qū)爰毎麜r可誘導多能干細胞(W02007/69666)。因此，可以在依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的本發(fā)明的仙臺病毒載體中進一步搭載上述基因中尚未搭載于該載體中的基因，或者可以將搭載那些基因的其他載體與依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的本發(fā)明的仙臺病毒載體組合使用。這些基因可以分別組入不同的載體中，或者可以將多個基因一起組入單個載體中。此外，各個基因可以組入單獨一種載體中，或者可以將不同類型的載體(包括染色體整合型病毒載體和/或非病毒載體)與上述的本發(fā)明的依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體組合使用。此夕卜，各病毒載體可以分別包裝，而在使用時組合使用它們?；蛘?，可以將攜帶不同基因的多個病毒載體預先組合成試劑盒，或者混合成組合物。 此外，在細胞的重編程、特別是多能干細胞的制造中也優(yōu)選使用包含這些基因的任意組合(或全部)的I個或其以上的非整合型病毒載體、以及包含該載體的試劑盒或組合物。對于組合物的情況，載體可以適宜與可藥用的擔載體和/或媒介物組合，例如混合在滅菌水、pH緩沖液、生理鹽水、培養(yǎng)液等中。在這些體系中，還可以將核重編程基因的一部分或大部分替換成作為蛋白質(zhì)的其表達產(chǎn)物。更具體地，本發(fā)明的組合物和試劑盒也可以含有表達重編程因子的其他載體(染色體整合型病毒載體和/或非病毒載體)和/或誘導重編程的化合物、蛋白質(zhì)等，只要它們包括上述的依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體。重編程的必要因子可以全部由仙臺病毒載體表達，或者也可以僅一部分由仙臺病毒載體表達而其它部分由其它載體和/或化合物(例如蛋白質(zhì)或低分子化合物)供給。此外，本發(fā)明的經(jīng)重編程的細胞的制造方法并不限于全部的基因?qū)刖褂孟膳_病毒載體來進行的方法。更具體地說，本發(fā)明的方法只需使用依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的上述仙臺病毒載體，還包括組合使用表達重編程因子的其它載體(染色體整合型病毒載體和/或非病毒載體)和/或誘導重編程的化合物等。優(yōu)選地，它們與含有MYC基因或Glisl基因的上述仙臺病毒載體組合使用。
此外，當使用依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體時，與含有KLF基因的其他仙臺病毒載體組合是有用的。
本發(fā)明涉及用于細胞重編程中的組合物，其包含上述的依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因，或依次含有OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙臺病毒載體作為表達載體。此外，本發(fā)明涉及所述仙臺病毒載體在已分化的細胞的重編程中的用途。例如，本發(fā)明提供所述仙臺病毒載體在細胞重編程中將重編程因子基因(KLF、OCT和S0X)導入有此需要的細胞的用途。此外，本發(fā)明涉及在細胞重編程中導入這些基因的方法，其使用所述病毒載體來將這些基因?qū)胗写诵蛄械募毎１景l(fā)明還涉及包含上述病毒載體的、在細胞重編程中用于導入該基因的組合物、在細胞重編程中用于導入該基因的作用劑(在細胞重編程中用于導入該基因的轉(zhuǎn)移劑，以及用于在細胞重編程中導入基因的作用劑)。此外，本發(fā)明涉及所述病毒載體在制備用于在細胞重編程中向有需要的細胞導入所述基因的藥劑中的用途。本發(fā)明還提供包 含所述病毒載體的、供細胞重編程中使用的用于導入基因的作用劑(基因表達劑或表達載體)。此外，本發(fā)明提供包含所述病毒載體的、用于導入重編程基因的作用劑(基因表達劑或表達載體)。本發(fā)明還提供包含所述病毒載體的用于表達核重編程因子KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次OCT基因、SOX基因和KLF基因的作用劑(即核重編程基因轉(zhuǎn)移劑、核重編程基因表達載體)。此外，本發(fā)明還提供含有所述病毒載體的多能干細胞誘導劑以及多能干細胞誘導輔助劑。本發(fā)明還提供所述病毒載體用于已分化細胞的重編程的用途。本發(fā)明還提供所述病毒載體在制備用于已分化細胞的重編程的藥劑、試劑和/或醫(yī)藥中的用途。此外本發(fā)明還涉及所述病毒載體在制備用于向已分化細胞中導入核重編程因子(KLF基因、OCT基因、以及SOX基因)的作用劑中的用途。
這里，重編程可以是例如從已分化的細胞誘導多能干細胞。通過組入編碼用于重編程的因子的基因(KLF基因、OCT基因和SOX基因)來使用載體。編碼重編程因子的基因的例子包括編碼上述任一種因子的基因或如下所示的基因。
導入的因子(KLF基因、OCT基因、SOX基因等)可根據(jù)要重編程的細胞的來源來合適地選擇，且它們可來源于人類或其他哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豬，或靈長類例如猴。此夕卜，基因和蛋白質(zhì)序列并不一定必須是野生型序列，只要它們能夠誘導重編程，它們可以具有突變。使用突變體基因產(chǎn)生多能干細胞的例子是已知的(W02007/69666)。例如，編碼具有一個或少數(shù)個(例如數(shù)個，不超過3個、不超過5個、不超過10個、不超過15個、不超過20個或不超過25個)氨基酸添加、缺失、取代和/或插入，且能夠誘導重編程的氨基酸序列的基因可以在本發(fā)明中使用。此外，只要生物學活性(誘導重編程的能力)得以維持，可以使用例如在N末端和/或C末端缺失或添加一個至數(shù)個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸的多肽，取代了一個至數(shù)個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸的多肽等?？梢允褂玫淖凅w包括例如天然蛋白質(zhì)的片段、類似物和衍生物，以及天然蛋白質(zhì)與其他多肽的融合蛋白(例如添加有異源信號肽或抗體片段者)。具體地，包括這樣的多肽:其包含在野生型氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，并具有與野生型蛋白等同的生物學活性(例如誘導重編程的活性)。當使用野生型蛋白質(zhì)的片段時，通常，該片段含有野生型多肽(在分泌型蛋白的情況下為成熟形式)的70%以上、優(yōu)選80%以上、85%以上、更優(yōu)選90%以上、95%以上或98%以上的連續(xù)區(qū)域。
氨基酸序列的變體例如可以通過在編碼天然多肽的DNA中導入突變來制備(Walker and Gaastra, eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany, New York, 1983) ; KunkeI, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488-492，1985; Kunkel 等，Methods Enzymol.154:367-382, 1987;Sambrook 等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,N.Y.), 1989;U.S.Pat.N0.4，873，192)。關(guān)于進行氨基酸取代而不影響生物學活性的指導的例子包括Dayhoff等的報道(Dayhoff 等，收錄于 Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl.Biomed.Res.Found., Washington, D.C.), 1978)。
對于進行修飾的氨基酸的數(shù)目沒有特殊限制，但例如是天然的成熟型多肽的全部氨基酸的30%以下、優(yōu)選25%以下、更優(yōu)選20%以下、更優(yōu)選15%以下、更優(yōu)選10%以下、5%以下或3%以下，且為例如15個氨基酸以下、優(yōu)選10個氨基酸以下、更優(yōu)選8個氨基酸以下、更優(yōu)選5個氨基酸以下、更優(yōu)選3個氨基酸以下。在對氨基酸氨基酸進行取代時，通過取代成側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸可以期 待保持蛋白質(zhì)的活性。這樣的取代在本發(fā)明中稱作保守取代。保守取代的例子包括諸如下列各組中的氨基酸之間的取代等:堿性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等各組內(nèi)的氨基酸之間的取代等。此外，可以列舉出例如，BL0SUM62取代矩陣(S.HenikofTand J.G.Henikoff, Proc.Acad.Natl.Sc1.USA89:10915-10919，1992)中處于正值關(guān)系的氨基酸之間的取代。
經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間顯示高同源性。高同源性是指:具有例如70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上或96%以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215:403-410，1990)來確認。例如，可以在 NCBI (National Center forBiothchnology Information)的BLAST的網(wǎng)頁上，使用默認參數(shù)來進行檢索(AltschulS.F.等，Nature Genet.3:266-272，1993;Madden, T.L.等，Meth.Enzymol.266:131-141,1996 ; Altschul S.F.等，Nucleic Acids Res.25: 3389-3402，1997; Zhang J.MaddenT.L., Genome Res.7:649-656, 1997)。例如，通過進行2個序列的比較的Blast2序列程序(Tatiana A 等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.174:247-250，1999)，制作 2 個序列的比對，可以確定序列的同一性?？瘴缓湾e配類似對待，計算出例如相對于天然型細胞因子(分泌后的成熟型的形態(tài))的氨基酸序列全體的同一性的值。具體地，計算出野生型蛋白質(zhì)(若為分泌蛋白質(zhì)則為成熟型)的全部氨基酸數(shù)中的一致的氨基酸數(shù)的比例。
此外，基因可以導入沉默突變，使得所編碼的氨基酸序列不改變。特別是，在富含AT的基因中，將5個以上的連續(xù)的A或T核苷酸取代成G或C，而不改變所編碼的氨基酸序列，從而能夠穩(wěn)定地猶得基因的聞表達。
修飾蛋白質(zhì)或者用于重編程的蛋白質(zhì)的例子是與編碼野生型蛋白質(zhì)的基因的編碼區(qū)域的一部分或全部在嚴格條件下雜交的核酸所編碼的、具有與野生型蛋白質(zhì)等同的活性(誘導重編程的活性)的蛋白質(zhì)。在雜交中，例如，可以從包含野生型蛋白質(zhì)基因的編碼區(qū)域序列或其互補序列的核酸或作為雜交對象的核酸中的任何一方制備探針，并可以通過檢測其是否與另一方的核酸雜交來進行鑒定。嚴格雜交的條件例如是:在含5xSSC、7%(W/V) SDS> 100 μ g/ml變性鮭魚精DNA、5xDenhardt液(IxDenhardt溶液含0.2%聚乙烯基卩比咯烷酮、0.2%牛血清白蛋白以及0.2%Ficoll)的溶液中，于60°C、優(yōu)選65°C、更優(yōu)選68°C進行雜交，然后在與雜交相同的溫度下，于2xSSC中、優(yōu)選IxSSC中、更優(yōu)選0.5xSSC中、更優(yōu)選0.1xSSC中振蕩洗滌2小時的條件。
為了誘導細胞的重編程特別優(yōu)選的基因的例子通常包括:F_框蛋白15(Fbxl5，NM_152676，NM_015798)、Nanog (NM_024865, AB093574)、ERAS (ES 細胞表達的Ras;NM_181532,NM_181548), DPPA2 (NM_138815, NM_028615), 0CT3/4 (也稱 P0U5F1;NM_002701，NM_203289, NM_013633, NM_001009178)、S0X2(NM_003106, NM_011443, XM_574919)、TCLlA (T 細胞白血病 / 淋巴瘤 IA; NM_021966, NM_009337)、KLF4 (Kruppel-樣因子4;NM_004235，NM_010637)、聯(lián)蛋白 β 1(鈣聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白 betal;NM_001904, NM_007614;包括 S33Y 突變體)、c-MYC(NM_002467，NM_010849;包括 T58A 突變體)、以及 Glisl 基因(Maekawaet al., Nature, 474:225-229, 2011 ;NM_147193, NM_147221),以及這些基因所屬家族的其它成員的基因等 。有報導稱，在導入這些基因的情況下，顯示出誘導多能干細胞的形態(tài)的集落的比例高于導入4種基因(0CT3/4、S0X2、KLF4、和c_MYC)時的比例(W02007/69666)。因此，除了 KLF基因、OCT基因和SOX基因之外進一步攜帶上述基因中的任何一個或其組合的仙臺病毒載體，或本發(fā)明的攜帶KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙臺病毒載體與一個或多個攜帶上述任一種基因或其組合的仙臺病毒載體的組合在本發(fā)明中可以用于誘導細胞的重編程，特別是它們可以有利地用于誘導多能干細胞。各個病毒載體可以在使用時進行組合來使用。此外，也可以預先做成試劑盒，或者混合起來作為組合物。此外，本發(fā)明還包括:包含這些基因的任意組合(或全部)的、I個或其以上的染色體非整合型病毒載體，以及包含該載體的試劑盒或組合物。
優(yōu)選將用于表達KLF基因、OCT基因和SOX基因的本發(fā)明的載體組合，特別是與表達MYC和/或Glisl基因的載體組合(Takahashi，K.andYamanaka S.，Cel1126，663-676，2006 ; Lowry WE 等，Proc Natl Acad Sci U SA, 105 (8): 2883-8, 2008;Masaki, H.等，Stem Cell Res.1:105-115, 2008;Maekawa et al.,Nature, 474:225-229，2011 ;W02007/69666)。此處，SOX 蛋白質(zhì)、KLF 蛋白質(zhì)、MYC 蛋白質(zhì)和OCT蛋白質(zhì)、以及它們的基因是指分別屬于SOX家族、KLF家族、MYC家族和OCT家族的成員的蛋白質(zhì)和基因。有報告稱，通過進行調(diào)整使得分別表達I個以上的這4個家族的成員，可以從各種已分化的細胞誘導多能干細胞。例如，有報告稱，對于SOX家族的基因，使用S0X1、S0X2、S0X3、S0X15、S0X17中的任何一個基因，均可以誘導多能干細胞(W02007/69666)。此夕卜，對于KLF家族，使用KLF4或KLF2均能夠誘導多能干細胞(W02007/69666)。對于MYC家族，不僅是使用野生型c-MYC、使用T58A突變體或N-MYC、L-MYC也能夠誘導多能干細胞(W02007/69666; Blelloch R.等，Cell Stem Cell, 1:245-247，2007)。這樣，由于可以通過多種方式選擇家族的基因然后使用，可以適宜地選擇上述的4種家族基因來誘導重編程。
具體地，KLF家族包括 KLFl (匪_006563，ΝΜ_0 10635)、KLF2 (ΝΜ_0 1 62 70，NM_008452)、KLF4 (ΝΜ_004235, ΝΜ_0 1 0637)、和KLF5(NM_001730, NM_009769) ；MYC 家族包括 c_MYC(NM_002467, NM_010849,含T58A 突變體)、N-MYC(NM_005378, NM_008709)、和 L-MYC(NM_005376, NM_005806)；OCT 家族包括 OCTlA (麗_002697，NM_198934)、0CT3/4(NM_002701,麗_203289,NM_013633, NM_001009 I 78),和 0CT6 (ΝΜ_002699，NM_011141) ；S0X 家族包括 SOXl (NM_005986, NM_009233)、S0X2 (NM_003106, NM_011443, XM_574919)、S0X3 (NM_005634, NM_009237)、S0X7 (NM_03 I 439，NM_01 1 446)、S0X15(NM_006942, NM_009235)、SOX I 7(NM_022454，NM_0I I 44 I)、和S0X18 (NM_018419, NM_009236)。依照本發(fā)明的順序攜帶這些基因中的任一個的仙臺病毒載體，在本發(fā)明中可以用于誘導細胞的脫分化，特別優(yōu)選用于誘導多能干細胞。
MYC家族的基因?qū)τ诙嗄芨杉毎恼T導并非必需，僅使用除MYC家族基因以外的3個家族的基因也能夠誘導多能干細胞(Nakagawa M.等，Nat Biotechnol.26 (I):101-6, 2008; Wering M.等，Cell Stem Cell2 (I): 10-2，2008)。在不表達 MYC 基因的情況下，例如，使用p53siRNA和UTFl能夠使多能干細胞的誘導效率顯著地提高(Y.Zhao等，Cell Stem Cell, 3(5):475-479, 2008;N.Maherali, and K.Hochedlinger, Cell StemCell, 3(6):595-605, 2008)。此外，有報告稱，僅使用除KLF家族的基因之外的3個家族的基因也能夠誘導多能干細胞(Park IH等，Nature, 451 (7175):141-6, 2008)。此外，有報告稱，通過結(jié)合使用G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(BIX-01294;Kubicek，S.等，Mol.Cel 125，473-481，2007)，僅使用3個基因，即KLF基因、SOX基因和MYC基因就可以從胚胎
NPC誘導多能干細胞(Shi Y等，Cell Stem Cell, 2(6):525-8, 2008) 編碼各基因的病毒載體可以分別單獨制備。它們可以在使用時組合使用?？梢詫⑺鼈?nèi)我饨M合或全部組合在一起作為試劑盒，或者混合起來形成組合物。除了本發(fā)明的攜帶KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙臺病毒載體之外，本發(fā)明還涉及包含這三種基因和化合物之外的基因的任意組合(或全部)的I種或多種染色體非整合型病毒載體，以及包含這些載體的用于重編程的試劑盒或組合物。而且，還可以將該試劑盒中所含的一部分重組載體替換成具有相當功能的蛋白質(zhì)、合成化合物等。
在以上描述的基因的組合中，還可以進一步組合其它基因，來提高重編程的誘導效率。這樣的基因的例子包括TERT(NM_198253，NM_009354)和/或SV40 大 T 抗原(NC_001669.1，F(xiàn)iers, W.(05-11-1978)Nature273: (5658) 113-120)(Park IH.等，Nature, 451 (7175): 141-6，2008)?？梢赃M一步組合選自 HPV16E6、HPV16E7、和Bmil(NM_005180，NM_007552)中的I個或多個基因。此外，可以表達選自 Fbxl5(Mol Cell Biol.23(8):2699-708，2003)、Nanog(Cel1113:631-642，2003)、Eras (Nature423, 541-545，2003)、DPPA2 (Developmentl30:1673-1680，2003)、TCLlA (Developmentl30:1673-1680，2003)、以及 β-聯(lián)蛋白(Nat MedlO (I): 55-63，2004)中的基因的I個或任意組合。而且，可以組合選自ECATl (AB211062，AB211060)、DPPA5(NM_001025290，NM_025274, XM_236761)、DNMT3L (ΝΜ_013369, ΝΜ_019448)、ECAT8(AB211063, AB211061)、GDF3 (NM_0 20 6 3 4, NM_00 8 1 08 )、SOXl 5 (NM_00 69 42, NM_0 09 2 3 5 )、DPPA4 (NM_018189, NM_0286 I 0)、FTHL17(NM_031894，NM_031261)、SALL4 (NM_0 20436, NM_ 175303)、Rex-1 (NM_1 74900, NM_009 556)、Utfl (NM_003577, NM_009482)、DPPA3 (NM_199286, NM_139218, XM_21626 3)、STAT3(NM_139276，NM_213659)、和 GRB2(NM_002086, NM_008163)中的 I 個或多個基因。除了 KLF基因、OCT基因和SOX基因之外還包含NANOG基因(NM_024865, AB093574)和LIN28基因(NM_024674)的各基因的組合對于誘導多能干細胞是有用的(Yu J.etal.，Science, 318(5858):1917-20, 2007)。此外，優(yōu)選再與 MYC 基因組合(Liao J 等，Cell Res.18(5):600-3, 2008)。通過額外表達這些基因，可促進多能干細胞的誘導(W02007/69666)。在以成熟B細胞作為對象的情況下，例如，可以異處表達髓細胞轉(zhuǎn)錄因子C/EBP a (CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α ) (ΝΜ_004364)，或者抑制B細胞轉(zhuǎn)錄因子Pax5 (成對框5;NM_016734)的表達，來促進重編程(Hanna J, Cell.133 (2): 250-64，2008)。這些因子也可以使用本發(fā)明中的染色體非整合型病毒載體進行表達。而且，該試劑盒中所包含的一部分重組載體可以替換成具有相當功能的蛋白質(zhì)、合成化合物等。
此外，除了表達上述的因子以外，例如，通過與添加化合物組合，也能夠提高重編程的效率。例如，bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)和/或SCF(干細胞因子)可促進多能干細胞的誘導，而且能夠在多能干細胞的誘導中代替c-MYC的功能(W02007/69666)。此外，MAP激酶抑制劑(Η)98056)也可以用于建立更接近于ES細胞的多能干細胞等用途(W02007/69666)。此外，有報告稱DNA甲基化酶(Dnmt)抑制劑和/或組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑能夠改善多能干細胞的誘導效率(Huangfu D等，Nat Biotechnol.(在線發(fā)表 2008 年 6 月 22 日，do1:10.1038/nbtl418);Nat.Biotechnol.26，795-797 (2008))。例如，通過組合使用HDAC(VPA)，僅導入0CT4和S0X2這2個基因就能夠誘導多能干細胞(Huangfu, D.等，Nat Biotechnol.200826 (11): 1269-75)。本發(fā)明的載體可以用于與這些化合物的施用組合使用。作為Dnmt抑制劑，可以使用例如5-氮雜胞苷等；作為HDAC抑制齊U，可以使用例如N-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)、丙戊酸(VPA)等。此夕卜，在使用5-氮雜胞苷時，組合使用糖皮質(zhì)激素(地塞米松)可以提高效率。
為了重編程細胞，例如，(I)本發(fā)明的用于表達KLF基因、OCT基因和SOX基因的載體，(2) (I)的載體與用于表達MYC基因或Glisl基因的仙臺病毒載體的組合，(3)通過對(2)進一步加入用于表達NANOG基因的仙臺病毒載體以及用于表達LIN28的仙臺病毒載體而產(chǎn)生的組合，⑷通過對⑵的組合進一步添加一種或兩種分別單獨表達KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙臺病毒載體而產(chǎn)生的組合(例如，攜帶0CT3/4-S0X2-KLF4基因的SeV載體、攜帶MYC基因的載體，以及攜帶KLF基因的載體等的組合)，或者(5)(1)的載體與攜帶其他期望的如上所述的重編程因子的載體和/或期望的重編程誘導性化合物的組合等，可以導入細胞中。(I)的載體包括本發(fā)明的仙臺病毒載體，其依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次含有OCT基因、SOX基因和KFL基因。在組合并導入多個載體和/或化合物的情況下，導入優(yōu)選同時進行，具體地，優(yōu)選在添加最初的載體或化合物等后的48小時以內(nèi)、優(yōu)選36小時以內(nèi)、更優(yōu)選24小時以內(nèi)、18小時以內(nèi)、12小時以內(nèi)、10小時以內(nèi)、8小時以內(nèi)、6小時以內(nèi)、3小時以內(nèi)、2小時以內(nèi)或I小時以內(nèi)，將全部編碼重編程因子的載體和/或化合物添加完畢。載體的劑量可以適宜制備，且MOI為例如0.1或更多，優(yōu)選0.3或更多，0.5或更多，I或更多，2或更多，或3或更多，且100或更少，優(yōu)選90或更少，80或更少，70或更少，60或更少，50或更少，40或更少，30或更少，20或更少，10或更少，或5或更少。優(yōu)選以例如Μ0Ι0.3 100、更優(yōu)選Μ0Ι0.5 50、更優(yōu)選MOIl 40、更優(yōu)選MOIl 30、更優(yōu)選M0I2 30、例如M0I3 10進行感染。誘導出的多能干細胞形成與ES細胞十分相似的扁平集落，并表達堿性磷酸酶。此外，誘導出的多能干細胞可以表達未分化細胞標志物Nanog、0CT4和/或S0X2等。此外，誘導出的多能干細胞優(yōu)選表達TERT和/或顯示端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明還涉及表達堿性磷酸酶、優(yōu)選還表達未分化細胞標志物Nanog和/或TERT的細胞的制造方法，以及仙臺病毒載體在制作這些細胞和制造用于誘導這些細胞的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明，能夠從希望的細胞(包括成人皮膚細胞和新生兒周皮細胞)誘導出多能干細胞集落，例如至少對于某些細胞以0.03X10_5以上、0.1X10_5以上、0.3X10_5以上、0.5X10_5以上、0.8 X Kr5以上、或IXlO-5以上(例如I X 10_5 I X 10_3)的出現(xiàn)率，優(yōu)選以 1.5Χ1(Γ5 以上、1.7Χ1(Γ5 以上、2.0Χ1(Γ5 以上、2.5Χ1(Γ5 以上、3Χ1(Γ5 以上、4Χ1(Γ5以上、5Χ1(Γ5 以上、8Χ1(Γ5 以上、1Χ1(Γ4 以上、2Χ1(Γ4 以上、3Χ1(Γ4 以上、5Χ1(Γ4 以上、8Χ1(Γ4 以上、1Χ1(Γ3 以上、1.5Χ1(Γ3 以上、2Χ1(Γ3 以上、5X 10'I X 1(Γ2 以上、1.5Χ1(Γ2 以上、2Χ1(Γ2以上、2.5Χ Kr2以上、3Χ Kr2以上、4Χ1(Γ2以上、或5Χ1(Γ2以上的出現(xiàn)率誘導出多能干細胞的集落。此外，至少對于某些細胞，本發(fā)明的載體的多能干細胞集落出現(xiàn)的效率為例如與對照相比的1.5倍以上，優(yōu)選2倍`以上，2.5倍以上，三倍以上，3.5倍以上，4倍以上，4.5倍以上，或5倍以上，所述對照中KLF基因、OCT基因和SOX基因分別搭載到不同的仙臺病毒載體中。此外，至少對于某些細胞，本發(fā)明的依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因的載體的多能干細胞集落出現(xiàn)的效率為例如與對照相比的1.5倍以上，優(yōu)選2倍以上，
2.5倍以上，三倍以上，3.5倍以上，4倍以上，4.5倍以上，或5倍以上，所述對照中KLF基因、OCT基因和SOX基因以其他順序搭載到單一仙臺病毒載體中，例如以O(shè)CT基因、SOX基因和KLF基因的順序。當使用依次插入OCT基因、SOX基因和KLF基因的本發(fā)明的載體時，一個特征性的優(yōu)點是iPS細胞的快速生長(集落的快速生長)。對于作為誘導重編程的對象的經(jīng)分化的細胞，沒有特殊限制，可以使用希望的體細胞等。不僅可以從小鼠胚胎來源的細胞生成多能干細胞已證明是可能的，從采集自成體小鼠尾部的經(jīng)分化的細胞、或肝細胞和胃粘膜細胞生成也顯示是可行的，這提示該生成并非依賴于細胞類型或分化狀態(tài)(W02007/069666;Aoi T.等，Science [2008年2月14日網(wǎng)上發(fā)表];Science.2008; 321 (5889):699-702)。此外，對于人類，也已經(jīng)確認可以從成人的面部皮膚來源的成纖維細胞、成人滑膜細胞、新生兒周皮來源成纖維細胞、成人間充質(zhì)干細胞、成人手掌的皮膚細胞、胚胎細胞等多種多樣的細胞誘導多能干細胞(TakahashiK et al.(2007)Celll31:861-872;Park IH 等，Nature, 451 (7175): 141-6，2008)。 此夕卜，有報告稱，從胰臟β細胞、B淋巴細胞這樣的終末分化細胞同樣可以誘導多能干細胞(Stadtfeld M 等，Curr Biol.2008May21.[PubMed, PMID:18501604];CurrBiol.2008; 18 (12): 890-4; Hanna J.等，Cell.133 (2): 250-64，2008)。這些認識提示，多能干細胞的誘導不依賴于作為來源的細胞。本發(fā)明的方法可以適用于從這些希望的體細胞誘導多能干細胞的過程中。具體地，作為重編程的對象的已分化的細胞包括成纖維細胞、滑膜細胞、口腔或胃等的粘膜細胞、肝細胞、骨髓細胞、牙胚細胞、血細胞(例如淋巴細胞和白細胞)、以及其它希望的細胞。此外，細胞可以是來源于例如胚、胚胎、新生兒、小兒、成人或老年人的細胞。此外，對動物的來源沒有特殊限制，包括哺乳動物，例如人和非人靈長類(猴等)、小鼠、大鼠等嚙齒類和牛、豬、山羊等非嚙齒類。
可以從重編程完成后的細胞的集落適宜選擇出除去了載體的細胞。例如可以選擇自然除去載體的細胞。為此目的，例如可以使用對病毒載體特異性的抗體(例如抗HN抗體)進行負選擇。此外，在使用溫度敏感性載體時，通過在高溫(例如37.5 39°C、優(yōu)選38 39°C或38.5 39°C )下進行培養(yǎng)，可以簡便地除去載體。當使用SeV (PM)/TS Λ F，或向SeV(PM)/TS Λ F中導入了更多突變?nèi)鏣S7，TS12, TS13, TS14, TS15而得到的載體時，傳代導致載體的自然丟失。優(yōu)選載體的例子包括但不限于SeV(PM)K0S/TS12AF。此外，在此情況下，可以使用 SeV(HNL)c-rMYC/TS12AF、SeV (HNL) c_rMYC/TS13 Λ F、SeV (HNL) c-rMYC/TS15 AF等導入MYC基因。此外，通過不將MYC基因加載到攜帶有KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙臺病毒載體中，可 以在不使用與癌發(fā)生相關(guān)的MYC基因的同時有利地進行重編程。這一點有利的原因還在于可以從c-MYC、L-MYC、Glisl等中自由地選擇在KLF基因、OCT基因和SOX基因之外的第四種因子。
采用本發(fā)明的方法制造的細胞可用于導致分化成各種組織或細胞，并可用于希望的檢查、研究、診斷、試驗、治療等。例如，預期誘導出的干細胞可用于干細胞療法。例如，可以使用采集自患者的體細胞，誘導重編程(reprogramming),然后,將分化誘導所得的體性干細胞或其它體細胞移植給患者。對于細胞分化誘導的方法沒有特殊限制，例如，可以通過視黃酸處理、各種增殖因子-細胞因子處理、利用激素進行的處理來誘導分化。此外，所得細胞可以用于檢測希望的藥物、化合物的效果，由此可以實施藥物、化合物的篩選。實施例
下面，參照實施例具體描述本發(fā)明；然而本發(fā)明不應理解為限于實施例。并入本文中引證的所有文件及其他參考資料作為本說明書的一部分。
實施例1pSeV (PM) /TS Δ F 的構(gòu)建
下面顯示了在本發(fā)明中使用的攜帶外源基因的仙臺病毒載體的構(gòu)建。除非另有說明，所有實施例中均使用這些載體導入外源基因。在本發(fā)明中，“ (PM) ”指插入重編程基因到P基因和M基因之間，“ (HNL) ”指插入重編程基因到HN基因和L基因之間。此外，在本發(fā)明中，“TS”指M蛋白中具有G69E, Tl 16A和A183S突變，HN蛋白中具有A262T, G264和K461G突變，P蛋白中具有L511突變，且在L蛋白中具有N1197S和K1795E突變；“ AF”表示F基因缺失。下面，“SeV (PM) /TS Λ F”是指在M蛋白中具有G69E, Tl 16Α和A183S突變、HN蛋白中具有A262T, G264和K461G突變，P蛋白中具有L511F突變，且L蛋白中具有N1197S和K1795E突變的F基因缺失的仙臺病毒載體(Z株)。該載體在P基因的緊鄰下游(P基因和M基因之間)具有一個用于基因?qū)氲牟迦胛稽c(NotI位點)。但是，這些是示例性的，本發(fā)明不限于這些實例。pSeV (PM)/TS Λ F 如下構(gòu)建。實施 PCR(94。C3 分鐘，25 個[98。ClO秒，55 ° C15秒，72 ° C12分鐘]的循環(huán)，然后72 ° C7分鐘)使用LitmusSalINheIfrgPmutMtsHNts Δ F-GFP delGFP (國際公布號 TO2010/008054)作為模板，以及 PMNOT1-F(5’-GAMTTTCACCTAAGCGGCCGCMTGGCAGATATCTATAG-3’)(SEQ ID NO: 10)和PMNOT1-R(5，-CTATAGATATCTGCCATTGCGGCCGCTTAGGTGAAATTTC-3，) (SEQ IDNO: 11)。所得的大約 11-kbPCR產(chǎn)物用DpnI處理，然后將大腸桿菌DH5 α (ToYoBo編碼號DNA-903)用20 μ L的該反應液轉(zhuǎn)化。挑取6個大腸桿菌集落進行小提。通過NotI消化選出具有NotI序列的質(zhì)粒。然后通過測序選出具有正確序列的克隆。如此，得到Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNts (PM) _dF。然后，將 Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNts (PM)-dF 用 SalI 和 NheI 消化，將收集的片段(大約8kbp)連接于用Sall/Nhel消化在L基因中具有兩個突變的pSeV/Λ SalINheIfrgLmut質(zhì)粒(國際公布號W02003/025570)后收集到的片段(大約8kbp)。如此，得到pSeV (PM) /TSAF0該載體在P基因和M基因之間具有一個用于基因?qū)氲牟迦胛稽c(NotI位點)。實施例2用于制作攜帶KLF-0CT3/4-S0X2基因的SeV載體的質(zhì)粒的制備通過PCR擴增KLF4基因(95° C3分鐘，以及30個[98° ClO秒，55° C15秒，及72° C2分鐘]循環(huán)，然后72。C7分鐘)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目錄號 R010A) ；pSeV18+KLF4/TS Δ F (W02010/008054)作為模板；以及引物 Not1-KIF_4F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’)(SEQ ID NO: 12)和K0S_K0-R(5’-TCCGAAGCCAGGTGTCCCGCCATGGCGGCTGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTMGTTTTTCTTACTACGGTTAMAATGCCTC-3’)(SEQ ID NO: 13) PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN,目錄號28106)純化，并用100 μ I試劑盒附帶的 洗脫液洗脫。通過PCR擴增0CT3/4基因(95° C3分鐘，以及30個[98° ClO秒，55° C15秒，及72。C2分鐘]循環(huán)，然后72。C7分鐘)使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目錄號 R010A) ;pSeV18+0CT3/4/TS Δ F(W02010/008054)作為模板；以及引物 K0S-K0_F(5’-GAGGCATTTTTAACCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCC ACCTAACAGCCGCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGA-3’)(SEQ ID NO:14)和 KOS-OS-R(5’-CCGTCTCCATCATGTTGTACATGGCGGCGTGTTAGGTGAAATCTTTCA CCCTAAGTTTTTCTTATTCTACGGTCAGTTTGAATGCATGGG-3’ ) (SEQID NO:15).PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN,目錄號28106)純化，并用100 μ I試劑盒附帶的洗脫液洗脫。通過PCR擴增S0X2基因(95° C3分鐘，以及30個[98° ClO秒，55° C15秒，及72° C2分鐘]循環(huán)，然后72。C7分鐘)使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目錄號 R010A) ; pSeV18+S0X2/TS Δ F (W02010/008054)作為模板；以及引物 K0S-0S_F(5’-CCCATGCATTCMACTGACCGTAGAATAAGAAMACTTAGGGTGAAA GATTTCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAGACGG-3’)(SEQ ID NO:16)和 Not I S0X-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAC ATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’ ) (SEQ ID NO:17).PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN,目錄號28106)純化，并用100 μ I試劑盒附帶的洗脫液洗脫。
使用這些純化的PCR產(chǎn)物進行第二次PCR。使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TakaraBio,目錄號R010A)，并加入上述純化的KLF4基因PCR產(chǎn)物、0CT3/4基因PCR產(chǎn)物、和S0X2基因 PCR 產(chǎn)物各 I μ L。使用 Not1-KIF-4F(5’ -ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’)(SEQ ID NO:12)和 Not I S0X-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAC ATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’ ) (SEQ ID NO: 17)作為引物，實施PCR(95° C3分鐘，以及30個[98° ClO秒，55° C15秒，及72° C2分鐘]循環(huán)，然后72° C7分鐘)以進行擴增。
此外，作為另一條件，將上述的純化KLF4基因PCR產(chǎn)物、0CT3/4基因PCR產(chǎn)物、和S0X2基因PCR產(chǎn)物用H2O稀釋10倍，加入各稀釋液I μ L ;并使用Not1-KIF_4F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’)(SEQ ID NO:12)和Not I S0X-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAC ATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3，)(SEQ ID NO: 17)作為引物。實施 PCR(95。C3 分鐘，以及 30 個[98° ClO 秒，55° C15 秒，及72° C2分鐘]循環(huán)，然后72° C7分鐘)以進行擴增。
PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，目錄號28106)純化，并用50 μ I試劑盒附帶的洗脫液洗脫。該純化產(chǎn)物用NotI消化，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，切出大約3.6kbp的條帶，并使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，目錄號28706)實施純化。使用100 μ L試劑盒附帶的洗脫液進行洗脫。將包含KLF4基因、0CT3/4基因和S0X2基因的NotI片段克隆到pSeV (PM) /TS Δ F載體的NotI位點中，并通過測序選擇具有正確序列的克隆以獲得PSeV (PM) K0S/TS Δ F。
實施例3攜帶人KLF4-0CT3/4-S0X2基因的SeV載體的純化
在轉(zhuǎn)化前一天，將IO6個293T/17細胞接種到6孔板的每個孔中，在CO2培養(yǎng)箱中(5%C02條件下)37°C培養(yǎng)。使用15 μ L TransIT-LTl (Mirus)，用下述的混合物轉(zhuǎn)染293Τ/17細胞:
0.5 μ g pCAGGS-NP, 0.5 μ g pCAGGS_P4C (-)，2 μ g pCAGGS-L (TDK)，0.5 μ gPCAGGS-T7, 0.5μ g pCAGGS_F5R(TO2005/071085)，和 5.0 μ g上述的攜帶人轉(zhuǎn)錄因子的仙臺病毒載體質(zhì)粒PSeV(PM) K0S/TS Λ F。將細胞在CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)2天。然后，將IO6個表達仙臺病毒融合蛋白(F蛋白)的LLC-MK2/F/A細胞(Li，H.-0.et al., J.Virology74.6564-6569(2000) ;W000/70070)覆蓋到每個孔中經(jīng)轉(zhuǎn)染的293T/17細胞上。然后將細胞在CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)一天。次日，移除細胞培養(yǎng)基，并用Iml加有青霉素-鏈霉素的MEM(下面簡稱PS/MEM)洗滌細胞I次。向每個孔中加入Iml含2.5 μ g/ml胰蛋白酶的PS/MEM(下面簡稱為Try/PS/MEM)。將細胞在CO2培養(yǎng)箱中32°C培養(yǎng)2天。將細胞連續(xù)培養(yǎng)，每3_4天更換培養(yǎng)基，并在某些情況下用LLC-MK2/F/A細胞傳代。取一份培養(yǎng)上清液通過血細胞凝集測定來評估載體收集。當觀察到充分的血細胞凝集后回收培養(yǎng)上清液。使用QIAamp病毒RNA迷你試劑盒(QIAGEN，目錄號52906)從收集到的培養(yǎng)上清液提取RNA，然后對其進行以插入的轉(zhuǎn)錄因子的區(qū)域為目標的RT-PCR。通過測序確認獲得的RT-PCR產(chǎn)物是否具有正確的核苷酸序列。如此，獲得了 SeV (PM) KOSTS Λ F載體。
實施例4用于制作攜帶0CT3/4-S0X2-KLF4基因的SeV載體的質(zhì)粒的制備
通過PCR擴增0CT3/4基因(95° C3分鐘，以及30個[98° ClO秒，55° C15秒，及72。C2分鐘]循環(huán)，然后72。C7分鐘)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TakaraBio,目錄號 R010A) ; pSeV18+0CT3/4/TS Δ F (W02010/008054)作為模板；以及引物F6(5’-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’)(SEQ ID NO:18)和 OSK-OS-R(5’-GGCGGCGTGTTAGGTGGATGACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACG GTCAGTTTGAATGC-3，)(SEQ ID NO: 19)。PCR 產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，目錄號28106)純化，并用100 μ I試劑盒附帶的洗脫液洗脫。通過PCR 擴增 S0X2 基因 PCR(95。C3 分鐘，以及 30 個[98 ° ClO 秒，55° C15秒，及72° C2分鐘]循環(huán)，然后72° C7分鐘)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TakaraBio,目錄號 R010A) ；pSeV18+S0X2/TS Δ F (W02010/008054)作為模板；以及引物 OSK-OS-F (5’ -TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTCATCCACCTAACACGCCGCCA TGTACAACATGATGGAG-3’ )(SEQ ID NO:20)和 OSK-SK-R(5，-TGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACAT GTGTGAGAGGG-3’)(SEQ ID NO: 21)。PCR 產(chǎn)物用 Qiaquick PCR 純化試劑盒(QIAGEN,目錄號28106)純化，并用100 μ I試劑盒附帶的洗脫液洗脫。通過PCR擴增KLF4基因(95° C3分鐘，以及30個[98° ClO秒，55° C15秒，及72° C2分鐘]循環(huán)，然后72。C7分鐘)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目錄號 RO10A) ; pSeV18+KLF4/TS Δ F (W02010/008054)作為模板；以及引物 0SK_SK_F(5，-TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACACGCCGCC ATGGCTGTCAGCGACGC-3’ ) (SEQ IDNO:22)和 R199(5’-GATAACAGCACCTCCTCCCGACT-3’)(SEQ ID NO:23) PCR 產(chǎn)物用 QiaquickPCR純化試劑盒(QIAGEN,目錄號28106)純化，并用IOOul試劑盒附帶的洗脫液洗脫。使用這些純化的PCR產(chǎn)物進行第二次PCR。使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TakaraBio,目錄號R010A)，并加入上述純化的0CT3/4基因PCR產(chǎn)物、S0X2基因PCR產(chǎn)物和KLF4基因 PCR 產(chǎn)物各 I μ L0 使用 F6 (5，-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’) (SEQ ID NO: 18)，S0X2-R470(5，-ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG-3，)(SEQ ID NO:24)，或引物S0X2_F294(5，_AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3’)(SEQ ID NO:25)和 KLF4-R405(5，-CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC-3，)(SEQ ID N0:26) 作為引物，并實施 PCR(95° C3 分鐘，以及 30 個[98° ClO 秒，55° C30秒，和72° C4分鐘]循環(huán)，然后72° C7分鐘)來進行擴增。使用這些PCR產(chǎn)物和上述的純化KLF4基因PCR產(chǎn)物(各
0.5 μ L),并以 F6 (5，-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3，)(SEQ ID NO: 18)和R150(5’-AATGTATCGAAGGTGCTCAA-3’)(SEQ ID NO:26)作為引物，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目錄號R010A)實施PCR。切出大約3.6kbp的擴增條帶,使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，目錄號28706)進行純化。使用100 μ L該試劑盒附帶的洗脫液進行洗脫。將該含有0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因的PCR產(chǎn)物用NotI消化，并使用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，目錄號28106)純化。將該NotI片段克隆到PSeV (PM) /TS Δ F載體的NotI位點中，通過測序選出具有正確序列的克隆，以得到pSeV (PM)0SK/TSAF。實施例5攜帶人0CT3/4-S0X2-KLF4基因的SeV載體的制作在轉(zhuǎn)化前一天，將IO6個293T/17細胞接種到6孔板的每個孔中，在CO2培養(yǎng)箱中(5%C02條件下)37°C培養(yǎng)。使用15 μ L TransIT-LTl (Mirus)，用下述的混合物轉(zhuǎn)染293Τ/17細胞:
0.5 μ g pCAGGS-NP、0.5 μ g pCAGGS_P4C (-)、2 μ g pCAGGS-L (TDK)、0.5 μ gpCAGGS-T7、0.5μ g pCAGGS-F5R(W02005/071085)、和 5.0 μ g上述的攜帶人轉(zhuǎn)錄因子的仙臺病毒載體質(zhì)粒PSeV(PM) 0SK/TS Λ F。將細胞在CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)2天。然后，將IO6個表達仙臺病毒融合蛋白(F蛋白)的LLC-MK2/F/A細胞(Li，H.-0.et al., J.Virology74.6564-6569(2000) ;W000/70070)覆蓋到每個孔中經(jīng)轉(zhuǎn)染的293T/17細胞上。然后將細胞在CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)一天。次日，移出細胞培養(yǎng)基，并用Iml加有青霉素-鏈霉素的MEM(下面簡稱PS/MEM)洗滌細胞I次。向每個孔中加入Iml含2.5 μ g/ml胰蛋白酶的PS/MEM(下面簡稱為Try/PS/MEM)。將細胞在CO2培養(yǎng)箱中32°C培養(yǎng)2天。將細胞連續(xù)培養(yǎng)，每3_4天更換培養(yǎng)基，并在某些情況下用LLC-MK2/F/A細胞傳代。取一份培養(yǎng)上清液的通過血細胞凝集測定來評估載體收集。當觀察到充分的血細胞凝集后回收培養(yǎng)上清液。使用QIAmp病毒RNA迷你試劑盒(QIAGEN，目錄號52906)從收集到的培養(yǎng)上清液提取RNA，然后對其進行以插入的轉(zhuǎn)錄因子的區(qū)域為目標的RT-PCR。通過測序確認獲得的RT-PCR產(chǎn)物是否具有正確的核苷酸序列。如此，獲得了 SeV (PM) KOSTS Λ F載體。實施例6使用攜帶外源基因的仙臺病毒載體制作ES樣細胞將1.5x10s個人新生兒包皮來源的成纖維細胞(BJ) (ATCC (www.atcc.0rg)，CRL-2522)在含有 10%FBS (GIBC0-BRL)、青霉素(100u/mL)-鏈霉素(100 μ g/mL)(Nacalai Tesque,編碼號 26253-84)，和 10%FBS(Cell Culture Bioscience 目錄號171012)的 DMEM(GIBC0-BRL, 11995)(下稱 10%FBS/PS/DMEM)中在 5%C02 培養(yǎng)箱中 37。。培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，將下示的載體以M0I=3的濃度施用于上述的經(jīng)培養(yǎng)的細胞。條件I SeV (PM) K0S/TS Δ F 載體SeV18+c_rMYC/TSAF 載體(國際公布號 TO2010/008054)條件2SeV (PM) K0S/TS Δ F 載體SeV (HNL) c-rMYC/TS Λ F 載體(國際公布號 TO2010/008054)條件3SeV (PM) K0S/TS Δ F 載體SeV (L) c-rMYC/TS Δ F 載體(Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSc1.Vol.85，p348-362 (2009))條件4SeV (PM) K0S/TS Δ F 載體SeV(HNL)c-rMYC/TS15AF 載體(國際公布號 TO2010/008054)條件5SeV (PM) K0S/TS Λ F 載體條件6SeV (PM) 0SK/TS Λ F 載體SeV18+c-rMYC/TS Δ F 載體條件7
SeV (PM) 0SK/TS Λ F 載體
SeV (HNL) c-rMYC/TS Λ F 載體
條件8
SeV (PM) 0SK/TS Λ F 載體
SeV (L) c-rMYC/TS Λ F 載體
條件9
SeV (PM) 0SK/TS Λ F 載體
SeV (HNL) c-rMYC/TS 15 Λ F 載體
條件10
SeV (PM) 0SK/TS Λ F 載體
條件11
SeV18+0CT3/4/TSAF 載體(國際公布號 W02010/008054)
SeV18+S0X2/TSAF 載體(國際公布號 TO2010/008054)
SeV18+KLF4/TSAF 載體(國際公布號 TO2010/008054)
SeV(HNL)c_MYC/TS15AF 載體
條件12
無載體
在施用了上述載體后，每天用10%FBS/PS/DMEM更換培養(yǎng)基，并將細胞在5%C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。然后，用0.25%胰蛋白酶解離1.0xlO5個上述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，然后在明膠包被的六孔板中制備的1.25x10s個用絲裂霉素處理的滋養(yǎng)細胞(例如MEF)上培養(yǎng)。次日，將10%FBS/PS/DMEM更換為靈長類ES細胞培養(yǎng)基(ReproCell; RCHEMD001)(補充有4ng/mlbFGF)，并將細胞在5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每天或每兩天更換。培養(yǎng)基可以是滋養(yǎng)細胞條件化過的培養(yǎng)基。
感染14天后，即細胞在MEF上傳代7天后，相比于常規(guī)方法(條件11)，在搭載有3種基因的條件下(條件2、3和4)人ES樣細胞集落的出現(xiàn)效率明顯更高。圖1顯示了常規(guī)型和條件2的細胞狀態(tài)。從圖1所示的照片可見，能觀察到與誘導前的成纖維細胞(BJ)明顯不同的、而與人ES細胞所見類似的扁平的集落(Jikken Igaku(Experimental Medicine)Vol.26, N0.5 (suppl.) pp.35-40，2008)。
在感染第21 天，通過用 NBCT/BCIP (PIERCE;NBT/BCIP，1-步，#34042)染色來顯現(xiàn)ES細胞未分化標志物堿性磷酸酶的活性。與常規(guī)條件(上述的條件11)和OSK基因排列(0CT-S0X-KLF)相比，在使用KOS基因排列的載體(KLF-0CT-S0X)的條件2、3和4中觀察到大量的堿性磷酸酶陽性藍色染色集落(圖2和圖3)。這樣，發(fā)現(xiàn)在具有KOS基因排列(KLF-0CT-S0X)的載體中堿性磷酸酶陽性iPS樣細胞的誘導效率特別高(圖4)。
實施例7
將1.5x10s 個人胚胎來源的成纖維細胞(MRC-5) (ATCC(www.atcc.0rg)，CCL-171)在含有 10%FBS(GIBC0-BRL)、青霉素(100u/mL)-鏈霉素(100 μ g/mL)(NacalaiTesque,編碼號 26253-84)，和 10%FBS(Cell Culture Bioscience 目錄號 171012)的DMEM(GIBC0-BRL, 11995)(下稱 10%FBS/PS/DMEM)中在 5%C02 培養(yǎng)箱中 37°C培養(yǎng)過夜。
培養(yǎng)后，將載體在下示的條件下施用于上述的經(jīng)培養(yǎng)的細胞。
權(quán)利要求
1.一種供在用于多能干細胞誘導的基因投遞中使用的組合物，其包含仙臺病毒載體，所述載體中在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因。
2.權(quán)利要求1的組合物，其與插入有MYC基因或Glisl基因的另外的仙臺病毒載體組合使用。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述MYC基因或Glisl基因插入在仙臺病毒L基因的緊鄰前方。
4.一種用于在多能干細胞的誘導中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞的方法，其包括向細胞中導入仙臺病毒載體，所述載體中在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了 OCT基因、SOX基因和KLF基因。
5.權(quán)利要求4的方法，其還包括向細胞中導入插入有MYC基因或Glisl基因的另一仙臺病毒載體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中MYC基因或Glisl基因插入在仙臺病毒L基因的緊鄰前方。
7.一種仙臺病毒載體，其中在仙臺病毒P基因的緊鄰后方依次插入了 KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入OCT基因、SOX基因和KLF基因。
8.—種核酸，其編碼權(quán)利要求7的仙臺病毒載體的基因組或反基因組。
9.一種供在用于多能干細胞誘導的基因投遞中使用的試劑盒，其包含權(quán)利要求7的仙臺病毒載體以及插入有MYC基因或Glisl基因 的另外的仙臺病毒載體。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述MYC基因或Glisl基因插入在仙臺病毒L基因的緊鄰前方。
全文摘要
本發(fā)明提供以特定的順序?qū)肓司幋a用于誘導多能性干細胞的重編程因子的基因的仙臺病毒載體；包含這些載體的用于在多能性干細胞的誘導中使用的基因?qū)胗媒M合物，以及它們的用途。通過將KLF基因、OCT基因、以及SOX基因以一定的順序組入到一個仙臺病毒載體中，成功地提高了多能性干細胞的誘導效率。通過將多個重編程因子搭載到一個載體上，使得減少必需的載體數(shù)、進一步提高多能性干細胞的誘導效率成為可能。
文檔編號C12N15/09GK103189508SQ20118005263
公開日2013年7月3日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者伴浩志, 上田泰次, 房木野惠美, 佐伯晃一, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社