液滴中的碎片化的基因組dna的分析的制作方法
【專利摘要】分析基因組DNA的方法?？梢垣@得包含靶的基因組DNA?；蚪MDNA可以有意地被碎片化以產(chǎn)生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以對液滴進(jìn)行測定以確定靶的水平。在一些實(shí)施方案中，液滴可以包含每微升至少約5納克濃度的基因組DNA，液滴可以以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生，液滴可以具有每滴小于約10納升的平均體積，液滴可以以每秒大于約50納升的流速產(chǎn)生，或其任何組合。
【專利說明】液滴中的碎片化的基因組DNA的分析
[0001]優(yōu)先權(quán)申請的交叉引用
[0002]本申請要求享有下述在先申請的優(yōu)先權(quán):2010年11月I日提交的美國臨時專利申請系列號61/409，106 ;和2010年12月22日提交的美國臨時專利申請系列號12/976，827，在2011年9月8日以美國專利申請公布第2011/0217712A1號被公布。兩項(xiàng)專利申請基于所有目的在此通過引用全文并入本文。
[0003]額外資料的交叉引用
[0004]本申請基于所有目的在此通過引用全文并入下述資料:2006年5月9日授權(quán)的美國專利第7，041，481號；2010年7月8日公布的美國專利申請公布號2010/0173394A1 ；2011年9月29日公開的PCT專利申請?zhí)朤O2011/120024 ；以及Jos印hR.Lakowicz,PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (第二版，1999)。
[0005]
[0006]許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用依賴于核酸靶樣品的高通量測定。例如，在研究和臨床應(yīng)用中，使用靶特異性試劑的高通量遺傳測試可以為藥物發(fā)現(xiàn)、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和臨床診斷以及其他方面提供核酸靶的準(zhǔn)確且精確的量化。
[0007]乳液為革新靶的高通量測定帶來了相當(dāng)大的希望。乳化技術(shù)可以產(chǎn)生大量的用作生物化學(xué)反應(yīng)的獨(dú)立的反應(yīng)室的含水液滴。例如，含水樣品(如，20微升)可以被分配成液滴(如，20，000顆液滴，各一納升)以允許對每一顆液滴進(jìn)行靶的單獨(dú)測試。
[0008]含水液滴可以被懸浮在油中以產(chǎn)生油包水乳液(W/0)?？梢杂帽砻婊钚詣┓€(wěn)定乳液以減少加熱、冷卻和輸送期 間液滴的聚結(jié)，由此使得能夠進(jìn)行熱循環(huán)。因此，乳液已經(jīng)被用于進(jìn)行使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對液滴中的核酸靶分子的單拷貝擴(kuò)增。由于檢測到液滴中存在單個分子的祀的能力，因而使得能夠進(jìn)行數(shù)碼測定(digital assay)。
[0009]在示例性的基于液滴的數(shù)碼測定中，樣品被分配成有限稀釋的靶的一組液滴(即，一些液滴不包含靶分子)。如果靶分子被無規(guī)分布在液滴中，那么泊松分布描述了基于液滴中的給定平均靶濃度來準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)液滴中的0、1、2、3或更多個靶分子的幾率。相反，可以從在液滴中發(fā)現(xiàn)給定數(shù)目的分子的幾率計(jì)算液滴中(且因而在樣品中)的靶分子的濃度。
[0010]未發(fā)現(xiàn)靶分子的幾率和發(fā)現(xiàn)一個或多個靶分子的幾率的估計(jì)值可以在數(shù)碼測定中進(jìn)行測量。在二進(jìn)制方法中，每一顆液滴可以被測試以確定液滴是否是陽性的并包含至少一個靶分子，或是陰性的且不包含靶分子。在液滴中未發(fā)現(xiàn)靶分子的幾率可以通過所測試的液滴是陰性的比例(“陰性比例”)被近似得出，而發(fā)現(xiàn)至少一個靶分子的幾率通過所測試的液滴是陽性的比例(“陽性比例”)被近似得出。然后可以在泊松算法中利用陽性比例或陰性比例的值來計(jì)算液滴中靶的濃度。在其他情形中，數(shù)碼測定可以產(chǎn)生大于二進(jìn)制的數(shù)據(jù)。例如，測定可以測量每一顆液滴中存在多少個靶分子，且分辨率大于陰性(O)或陽性(> O)(如，O、I或> I個分子；0、1、2或> 2個分子；或類似的)。
[0011]為了在不同樣品的基于液滴的DNA測定中兼具高通量和準(zhǔn)確性，液滴應(yīng)該被快速產(chǎn)生且具有均勻的尺寸(即，單分散性的液滴)。然而，樣品組分可能干擾液滴與主體的樣品相分離的能力，尤其是當(dāng)提高了液滴產(chǎn)生的頻率時。因此，所形成的液滴的尺寸，或甚至完全形成液滴的能力可能從樣品到樣品是變化的，從而削弱了測定的可靠性。需要新的方法來提供以較高的產(chǎn)生頻率可靠而一致地產(chǎn)生液滴。
[0012]
[0013]本公開內(nèi)容提供了一種分析基因組DNA的方法?？梢垣@得包含靶的基因組DNA?；蚪MDNA可以有意地(volitionally)被碎片化以產(chǎn)生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生含有碎片化的DNA的含水液滴?？梢詫σ旱芜M(jìn)行數(shù)碼測定以確定靶的水平。在一些實(shí)施方案中，液滴可以包含每微升至少約5納克濃度的基因組DNA，液滴可以以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生，液滴可以具有每滴小于約10納升的平均體積，液滴可以以每秒大于約50納升的樣品流速產(chǎn)生，或其任何組合。
[0014]附圖簡沭
[0015]圖1是闡釋了根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面的分析基因組DNA的示例性方法的流程圖。
[0016]圖2是由液滴產(chǎn)生器在四種不同驅(qū)動壓力的每一種下處理三種不同樣品的照片得到的圖的矩陣。
[0017]圖3是不包含基因組DNA或包含被消化(EcoRI)或未被消化的基因組DNA (Raji或Coriell)的樣品的液滴體積作為液滴產(chǎn)生頻率的函數(shù)而繪制的圖。
[0018]圖4是圖3的樣品的液滴體積作為樣品流速的函數(shù)而繪制的圖。
[0019]圖5是圖3的樣品的最大延伸作為液滴產(chǎn)生頻率的函數(shù)而繪制的圖。
[0020]圖6是圖3的樣品的最大延伸作為樣品流速的函數(shù)而繪制的圖。
[0021]迸述
[0022]本公開內(nèi)容提供了一種分析基因組DNA的方法?？梢垣@得包含靶的基因組DNA?；蚪MDNA可以有意地被碎片化以產(chǎn)生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以對液滴進(jìn)行測定以確定靶的水平。在一些實(shí)施方案中，液滴可以包含每微升至少約5納克濃度的基因組DNA，液滴可以以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生，液滴可以具有每滴小于約10納升的平均體積，液滴可以以每秒大于約50納升的流速產(chǎn)生，或其任何組合。
[0023]如本文公開的，分析液滴中的基因組DNA的方法具有比基于液滴的其他方法相當(dāng)大的優(yōu)勢。優(yōu)勢可以包括以更高的頻率產(chǎn)生液滴、具有更高的單分散性、具有更大的DNA負(fù)載量和/或具有來自基因組DNA的顯著更弱的干擾。
[0024]在下面的部分中描述了本公開內(nèi)容的這些和其他方面:(I)基因組DNA分析的示例性方法的概述，(II)液滴產(chǎn)生測試的示例性數(shù)據(jù)以及(III)優(yōu)選的實(shí)施方案。
[0025]1.基因組DNA分析的示例性方法的概述
[0026]圖1顯示闡釋了分析基因組DNA的示例性方法20的流程圖。所呈現(xiàn)的步驟可以按照任何合適的順序且按照任何合適的組合進(jìn)行。
[0027]可以獲得基因組DNA，以22標(biāo)示。可以從任何合適的生物體獲得DNA，生物體諸如哺乳動物(如人類、小鼠、大鼠、猴等)、非哺乳動物的脊椎動物、無脊椎動物、酵母或真菌、植物、原生動物、細(xì)菌或類似物?？梢酝ㄟ^任何合適的方法獲得DNA，方法諸如市購、以禮物接受、通過從細(xì)胞或流體提取獲得、以臨床樣品接受或類似方法。DNA可以以相對高分子量的形式獲得，諸如具有至少約IO4UO5或IO6千道爾頓以及其他(如，具有至少約25、50、100,200,500或1000千堿基的平均長度)的分子量。
[0028]在產(chǎn)生液滴之前，可以碎片化基因組DNA，以24標(biāo)示。碎片化可以是意志行為，即有意地進(jìn)行的。碎片化通常包括顯著減小基因組DNA的分子量的任何程序，諸如通過切割或斷裂DNA鏈。碎片化可以將平均分子量和/或長度減小任何合適的量，諸如至少約5、10、20,50或100倍以及其他的。碎片化基因組DNA的示例性方法包括用限制酶(如，具有4、
5、6或8個核苷酸識別位點(diǎn)的酶、以及其他)消化。靶可以不包含限制酶的識別位點(diǎn)以避免靶分子的任何裂解。限制酶消化可以被進(jìn)行完全或可以是部分消化。可選擇地或另外，基因組DNA的含水樣品可以被加熱以碎片化DNA。碎片化DNA的示例性加熱可以在至少95°C的溫度下進(jìn)行至少約10、15、20或30分鐘以及其他時間。在其他情形中，DNA可以通過剪切、超聲處理、霧化、輻射或類似方法被碎片化。
[0029]基因組DNA可以包含靶，通常是待測試的所感興趣的序列?？梢赃M(jìn)行基因組DNA的碎片化而基本上不會破壞靶，這意味著通過碎片化方法，基因組DNA中不到一半的靶序列被破壞(如斷裂或切割)。
[0030]可以產(chǎn)生包含碎片化的DNA的液滴，以26標(biāo)示。液滴可以由一個或多個液滴產(chǎn)生器中的每一個按順序產(chǎn)生。碎片化的DNA可以穿過至少一個液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生液滴。通常，碎片化的DNA被布置在含水樣品中，且含水樣品與不混溶的連續(xù)相被穿過液滴產(chǎn)生器以形成包含碎片化的DNA且被布置在連續(xù)相中的含水液滴。液滴產(chǎn)生器和可能合適的乳液相的進(jìn)一步的方面描述在交叉引用下所列出的文獻(xiàn)中，這些文獻(xiàn)通過引用在此并入，尤其是2010年7月8日公布的美國專利申請公布號2010/0173394A1 ;2011年9月29日公布的PCT 專利申請?zhí)?W02011/120024。
[0031]液滴可以具有任何合適的尺寸。例如，液滴可以具有小于約lyL、100nL、10nL、lnL、100pL、10pL或IpL以及其他的平均體積?？蛇x擇地或另外，液滴可以具有大于約10fL、100fL、lpL、IOpL或IOOp L以及其他的平均體積。在一些情形中，液滴可以具有約IpL到IOOnLUpL到10nL、或0.1到IOnL以及其他的平均體積。液滴可以是單分散性的。
[0032]液滴可以包含任何合適濃度的碎片化的DNA。例如，碎片化的DNA可以以至少約
0.1、0.2、0.5、l、2、5、10、20、50ng/yL以及其他的濃度被布置在液滴中。在一些情形中，濃度可以是約0.1-50或0.2-20ng/ μ L。碎片化DNA允許更高的DNA負(fù)載量被結(jié)合到液滴中。碎片化的DNA可以以平均每顆液滴小于約2個基因組等價物存在。靶可以以平均每顆液滴小于約2個分子存在。
[0033]液滴可以以任何合適的液滴產(chǎn)生頻率形成，諸如至少約IO、20、50、100、200、500或1，OOOHz (液滴/秒)以及其他的。通常，液滴產(chǎn)生頻率與被產(chǎn)生的液滴的尺寸負(fù)相關(guān)，且較小的液滴允許較高的液滴產(chǎn)生頻率。
[0034]用于形成液滴(且包含碎片化的DNA)的含水樣品可以以任何合適的流速穿過液滴產(chǎn)生器和/或被轉(zhuǎn)化成液滴?？赡芎线m的示例性流速包括至少約1、5、10、20、50、100、200,500,1, 000,5, 000或10，OOOnL/秒以及其他的。通常，樣品流速與被產(chǎn)生的液滴的尺寸正相關(guān)，且較大的液滴允許較高的流速。
[0035]上面所列出的液滴體積、DNA濃度、液滴產(chǎn)生頻率以及流速的示例性值(或范圍)可以以任何合適的組合被組合。[0036]可以對液滴進(jìn)行測定，以28標(biāo)示。測定可以是檢測液滴中的單獨(dú)靶分子的數(shù)碼測定。數(shù)碼測定可以包括擴(kuò)增靶分子，諸如通過PCR或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及其他的。數(shù)碼測定還可以包括檢測來自液滴的熒光。測定還可以包括用泊松算法確定液滴中靶的水平(如濃度)。
[0037]11.液滴產(chǎn)生測試的示例性數(shù)據(jù)
[0038]此部分呈現(xiàn)了由采用或未采用碎片化的基因組DNA的液滴產(chǎn)生測試的示例性數(shù)據(jù)；參見圖2-6。
[0039]在微流體設(shè)備中的液滴產(chǎn)生可以取決于樣品行進(jìn)至液滴產(chǎn)生器的流速和產(chǎn)生液滴的頻率。在高流速時，樣品流可以噴射入不混溶的連續(xù)相中，不再產(chǎn)生液滴。在產(chǎn)生速率接近噴射限值時，在產(chǎn)生液滴之前，樣品開始延伸得更深入出口通道中。此延伸長度可以用于了解一組產(chǎn)生條件與噴射限值的接近度。
[0040]圖2顯示了由在四種不同的驅(qū)動壓力的每一種下且因而不同流速下處理三種不同的含水樣品32-36的液滴產(chǎn)生器30的照片得到的圖片的矩陣。三種樣品是(a)不包含DNA的對照樣品32 (無模板的PCR緩沖液)、(b)未被消化的且具有高分子量(MW)的人類基因組DNA的含水樣品34(Raji，18.75ng/yL)以及(c)已經(jīng)用限制酶消化且具有降低的分子量的人類基因組DNA的含水樣品36 (Raji, 18.75ng/ μ L)。四種驅(qū)動壓力(1、2、3和4)是施加在液滴產(chǎn)生器的下游的負(fù)(真空)壓力且以每平方英寸磅(psi)表示，且Ipsi等于約6.9千帕。真空水平可以控制樣品流速、總流速以及液滴產(chǎn)生頻率。
[0041]液滴產(chǎn)生器30可以通過包括樣品入口通道38、至少一個或至少一對油入口通道40、42以及出口通道44的通道網(wǎng)絡(luò)形成。入口通道38將含水樣品32、34或36的主體水相(bulk aqueous phase) 46輸送至液滴產(chǎn)生器。入口通道40、42將連續(xù)相48 (如，帶有表面活性劑的油)輸送至液滴產(chǎn)生器。出口通道44將連續(xù)相48中的液滴50輸送遠(yuǎn)離通道交匯點(diǎn)52。
[0042]上排顯示了不包含 基因組DNA的對照樣品32的液滴產(chǎn)生。液滴50是約InL且在不同真空水平下尺寸變化不大。
[0043]中排顯示了包含未消化的基因組DNA的樣品34的液滴產(chǎn)生。僅在所測試的最低的真空水平(Ipsi)下發(fā)生基因組DNA極大地?fù)p害液滴產(chǎn)生。即使在此最低水平，存在主體水相46大量延伸通過通道交匯點(diǎn)52,由箭頭54標(biāo)示,且液滴50較大。在較高的真空水平(如，Ipsi與2-4psi相比)和流速下，無液滴產(chǎn)生，原因是樣品流噴射進(jìn)入出口通道44中，由箭頭56標(biāo)示，不會破裂成液滴。因此，人類基因組DNA的存在可以強(qiáng)烈地干擾液滴產(chǎn)生，且可能要求使用較低的DNA濃度、流速和液滴產(chǎn)生頻率。因此，樣品處理可能相當(dāng)緩慢。此夕卜，乳液中的靶陽性液滴的頻率可能被顯著減少(由于較低的DNA濃度)，這將需要分析更多的液滴以獲得所確定的靶水平的同樣的置信度。
[0044]下排顯示了由含有與樣品34相同濃度(每單位體積的質(zhì)量)的基因組DNA的樣品36的液滴產(chǎn)生，但在DNA已經(jīng)用限制酶被消化成較短的碎片之后。在本文所顯示的壓力(和流速下)，呈碎片化形式的基因組DNA并未被檢測到損害液滴產(chǎn)生。樣品產(chǎn)生液滴50，這類似于缺乏DNA的對照樣品32。
[0045]進(jìn)行了另外的研究來定量測量產(chǎn)生真空、樣品流速、液滴產(chǎn)生頻率、出口通道中的速度、液滴尺寸以及液滴產(chǎn)生期間的最大樣品延伸之間的關(guān)系。所使用的含水樣品是Spectral Dye Buffer (與圖2中相同的對照樣品，但沒有DNA聚合酶)、Raji人類基因組 DNA(Loftstrand Laboratories)( “Raji”)和 19205 人類 DNA(Coriell Institute)(“Corell”)。DNA樣品是未消化的或用限制酶EcoRI消化過的。用在NEB#4緩沖液中的20U/ μ L濃度的EcoRI (New England biolabs)進(jìn)行DNA消化，且基因組DNA的最終濃度是200ng/y L。將混合物在37°C下溫育I小時，然后稀釋到不同的最終濃度。
[0046]圖 3-6 的圖顯示了由 Master Mix (無 DNA)、18.75ng/ μ L 的 EcoR1-消化的 RajiDNA、18.75ng/y L 的 EcoR1-消化的 Coriell 19205 DNA、18.75ng/μ L 的未消化的 Raji DNA以及18.75ng/ μ L的未消化的Coriell 19205DNA的樣品進(jìn)行的液滴產(chǎn)生試驗(yàn)的結(jié)果。圖3顯示了樣品的液滴體積作為液滴產(chǎn)生頻率的函數(shù)而繪制的圖。圖4顯示了樣品的液滴體積作為樣品流速的函數(shù)而繪制的圖。圖5顯示了樣品的最大延伸作為液滴產(chǎn)生頻率的函數(shù)而繪制的圖。圖6顯示了圖3的樣品的最大延伸作為樣品流速的函數(shù)而繪制的圖。
[0047]對于未消化的人類基因組DNA，在發(fā)生噴射之前，僅非常低的液滴產(chǎn)生頻率或樣品流速是可能的。例如，對于Coriell 19205 DNA，最大值是60Hz和83nL/秒。對于RajiDNA，最大值是120Hz和162nL/秒。然而，即使低于這些限值，所產(chǎn)生的液滴具有比不存在DNA時高的體積，且產(chǎn)生伴有長得多的樣品延伸進(jìn)入輸出通道中。
[0048]圖還顯示了對于相同濃度的消化過的DNA，DNA對液滴產(chǎn)生的影響是不可檢測到的。在所測試的任何流速或產(chǎn)生頻率下均未觀察到噴射或長樣品延伸，且液滴體積與不存在DNA的樣品的體積相同。
[0049]這些結(jié)果顯示了液滴產(chǎn)生在存在未消化的人類DNA時受到強(qiáng)烈損壞，但在用限制酶消化后沒有受到損壞。
[0050]II1.優(yōu)選的實(shí)施方案
[0051]此部分以一系列索引的段落描述了本公開內(nèi)容的優(yōu)選的實(shí)施方案。這些實(shí)施方案不應(yīng)該限制本公開內(nèi) 容的整個范圍。
[0052]A.一種分析基因組DNA的方法，包括:(i)獲得包含靶的基因組DNA ; (ii)有意地碎片化所述基因組DNA以產(chǎn)生碎片化的DNA ； (iii)使所述碎片化的DNA穿過至少一個液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生含有所述碎片化的DNA的含水液滴；以及(iv)對所述液滴進(jìn)行數(shù)碼測定以確定所述靶的水平。
[0053]B.段落A的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
[0054]C.段落A的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA。
[0055]D.段落A的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
[0056]E.段落A至D中任一段的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
[0057]F.段落A的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積且包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA。
[0058]G.段落A的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
[0059]H.段落A的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
[0060]1.段落F的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
[0061]J.段落F的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
[0062]K.段落G的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
[0063]L.段落H的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
[0064]M.段落L的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
[0065]N.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟包括用限制酶消化所述基因組DNA的步驟。
[0066]0.段落N的方法，其中所述限制酶以平均每千堿基小于約一次地切割所述基因組DNA。
[0067]P.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟包括剪切所述基因組DNA的步驟。
[0068]Q.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟包括超聲處理所述基因組DNA的步驟。
[0069]R.段落A至Q中任一段的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個拷貝的所述靶。
[0070]S.段落A至R中任一段的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個所述基因組DNA的基因組等價物。
[0071]T.段落A至S中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟基本上不破壞所述靶。
[0072]U.段落A至T中任一段的方法，其中所述進(jìn)行數(shù)碼測定的步驟包括擴(kuò)增所述液滴中的所述靶的步驟。
[0073]V.段落U的方法，其中所述靶通過PCR被擴(kuò)增。
[0074]W.段落A至V中任一段的方法，其中所述進(jìn)行數(shù)碼測定的步驟包括檢測來自所述液滴的熒光的步驟。
[0075]X.段落A至W中任一段的方法，其中所述進(jìn)行數(shù)碼測定的步驟包括用泊松算法確定所述靶的水平的步驟。
[0076]Y.段落A至X中任一段的方法，其中所述液滴具有約0.1到10納升的平均體積。
[0077]Z.一種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括:(i)獲得包含每微升至少約5ng濃度的DNA的樣品；(ii)有意地碎片化所述DNA以產(chǎn)生碎片化的DNA ；以及(iii)使所述樣品穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生且具有小于約10納升的平均體積。
[0078]Al.一種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括:(i)獲得包含基因組DNA的樣品；(ii)有意地碎片化所述DNA`以產(chǎn)生碎片化的DNA;以及(iii)使所述樣品穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生且具有小于約10納升的平均體積，其中所述基因組DNA的濃度為，如果所述穿過的步驟在不碎片化所述DNA的相同條件下采用所述基因組DNA進(jìn)行則干擾液滴產(chǎn)生。[0079]上面提出的公開內(nèi)容可以包括多項(xiàng)具有獨(dú)立功用的不同的發(fā)明。雖然本發(fā)明中的每一項(xiàng)已經(jīng)以其優(yōu)選的形式被公開，但是本文中所公開的且闡釋的其具體的實(shí)施方案并不被認(rèn)為是限制性的意義，原因是許多變化形式是可能的。本發(fā)明的主題包括本文公開的不同的要素、特征、功能和/或特性的所有新穎的且非顯而易見的組合和子組合。下面的權(quán)利要求特別指出被認(rèn)為是新穎的且非顯而易見的某些組合和子組合。在特征、功能、要素和/或特性的其他組合和子組合中體現(xiàn)的發(fā)明可以在要求此申請或相關(guān)申請的優(yōu)先權(quán)的申請中得到保護(hù)。這樣的權(quán)利要求，無論涉及不同的發(fā)明還是相同的發(fā)明，且無論比初始權(quán)利要求的范圍寬、窄、相等還是不同，也都被認(rèn)為包括在本公開內(nèi)容的發(fā)明主題內(nèi)。此外，用于所確認(rèn)的要素的序數(shù)標(biāo)志，諸如第一、第二或第三用于區(qū)分要素，且不表明這樣的要素的特定位置或順序，除非另 外具 體陳述。
【權(quán)利要求】
1.一種分析基因組DNA的方法，包括: 獲得包含靶的基因組DNA ； 有意地碎片化所述基因組DNA以產(chǎn)生碎片化的DNA ； 使所述碎片化的DNA穿過至少一個液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生含有所述碎片化的DNA的含水液滴；以及 對所述液滴進(jìn)行數(shù)碼測定以確定所述靶的水平。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組 DNA。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積且包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產(chǎn)生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產(chǎn)生。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟包括用限制酶消化所述基因組DNA的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述限制酶以平均每千堿基小于約一次地切割所述基因組DNA。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟包括剪切所述基因組DNA的步驟。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟包括超聲處理所述基因組DNA的步驟。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個拷貝的所述靶。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個所述基因組DNA的基因組等價物。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟基本上不破壞所述靶。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進(jìn)行數(shù)碼測定的步驟包括擴(kuò)增所述液滴中的所述靶的步驟。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述靶通過PCR被擴(kuò)增。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述進(jìn)行數(shù)碼測定的步驟包括檢測來自所述液滴的熒光的步驟。
24.如權(quán)利要求21到23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述進(jìn)行數(shù)碼測定的步驟包括用泊松算法確定所述靶的水平的步驟。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液滴具有約0.1到10納升的平均體積。
26.—種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括: 獲得包含每微升至少約5ng濃度的DNA的樣品； 有意地碎片化所述DNA以產(chǎn)生碎片化的DNA ；以及 使所述樣品穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生且具有小于約10納升的平均體積。
27.一種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括: 犾得包含基因組DNA的樣品； 有意地碎片化所述DNA以產(chǎn)生碎片化的DNA ；以及 使所述樣品穿過液滴產(chǎn)生器以產(chǎn)生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產(chǎn)生頻率被產(chǎn)生且具有小于約10納升的平均體積， 其中所述基因組DNA是以如果所述穿過的步驟在不碎片化所述DNA的相同條件下進(jìn)行則干擾液滴產(chǎn)生的濃度。
【文檔編號】C12Q1/68GK103443289SQ201180052831
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月1日
【發(fā)明者】凱文·D·奈斯, 艾米·L·海德森, 保羅·W·懷亞特 申請人:伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司