用于治療內(nèi)分泌、胃腸或自體免疫性疾病的組合物和方法
【專利摘要】提供涉及使用分離、改造的重組細(xì)胞來(lái)直接或間接治療哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)疾病或紊亂的重組細(xì)胞和方法，所述疾病或紊亂例如內(nèi)分泌、胃腸或自體免疫性紊亂。提供含有信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞，其中：所述信號(hào)序列能夠調(diào)控宿主內(nèi)靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)或能夠調(diào)控靶核酸響應(yīng)環(huán)境刺激的信號(hào)依賴性表達(dá)，所述細(xì)胞源自腸或共生細(xì)菌，所述靶核酸編碼促進(jìn)宿主內(nèi)正常生理過(guò)程功能的哺乳動(dòng)物因子或有效預(yù)防宿主內(nèi)非感染性疾病的發(fā)作、建立或傳播。向所述宿主給予所述重組細(xì)胞以治療疾病或紊亂。
【專利說(shuō)明】用于治療內(nèi)分泌、胃腸或自體免疫性疾病的組合物和方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求共同待審的2010年10月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/393，618、2011年9月26日提交的系列號(hào)61/539，121的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，上述各申請(qǐng)通過(guò)引用全文納入本文。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開(kāi)發(fā)的聲明
[0004]不適用
1.【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明一般涉及用于治療內(nèi)分泌、胃腸或自體免疫性疾病的組合物和方法。
2.技術(shù)背景
[0006]糖尿病是以以下為表征的疾病:高血糖癥；改變脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白的代謝；增加血管疾病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病由于與年齡增長(zhǎng)和肥胖相關(guān)，是與日漸增的公眾健康問(wèn)題。
[0007]有兩種主要類型的糖尿病:1)1型，也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和2)11型，也稱為胰島素非依賴性或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)。這兩種糖尿病類型都?xì)w因于循環(huán)胰島素含量不足和外周組織對(duì)胰島素的響應(yīng)下降。
[0008]I型糖尿病源于身體無(wú)法產(chǎn)生胰島素，胰島素是“解鎖”身體細(xì)胞的激素，能使葡萄糖進(jìn)入并用作燃料。I型糖尿病的并發(fā)癥包括心臟病和中風(fēng)、視網(wǎng)膜病(眼部疾病)、腎臟疾病(腎病)、神經(jīng)病(神經(jīng)損 傷)，以及無(wú)法保持良好皮膚、足部和口腔健康。
[0009]II型糖尿病源于身體無(wú)法生成足夠胰島素或細(xì)胞無(wú)法使用由身體自然生成的胰島素。這種身體不能最優(yōu)使用胰島素的病癥被稱為胰島素抵抗。II型糖尿病通常伴隨高血壓，而這可能導(dǎo)致心臟病。在患有II型糖尿病、應(yīng)激、感染的患者中，藥物(例如皮質(zhì)類固醇)也會(huì)導(dǎo)致血糖水平的嚴(yán)重提高。伴隨脫水，II型糖尿病患者內(nèi)的嚴(yán)重血糖升高會(huì)導(dǎo)致血液滲透壓的增加(高滲狀態(tài))。這種病癥會(huì)導(dǎo)致昏迷。
[0010]胰島素通過(guò)刺激肌肉和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取和代謝來(lái)降低血液中的葡萄糖濃度。胰島素刺激葡萄糖在肝中以糖原形式儲(chǔ)存，在脂肪組織中以甘油三酯形式儲(chǔ)存。胰島素還促進(jìn)肌肉使用葡萄糖產(chǎn)生能量。因此，血液中胰島素水平不足，或?qū)σ葝u素敏感性的降低，會(huì)產(chǎn)生血液中過(guò)高水平的葡萄糖和甘油三酯。
[0011]未治療的糖尿病的早期癥狀與升高的血糖水平和尿液中的葡萄糖損失有關(guān)。尿液中高含量的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致尿液輸出增加，并引起脫水。脫水導(dǎo)致口渴和水消耗的增加。無(wú)法使用葡萄糖能量最終導(dǎo)致盡管食欲增加卻依然減重。一些未經(jīng)治療的糖尿病患者還抱怨疲勞、惡心和嘔吐。糖尿病患者傾向于發(fā)展出膀胱、皮膚和陰道區(qū)域的感染。血液中葡萄糖水平的波動(dòng)能導(dǎo)致視覺(jué)不清。異常升高的葡萄糖水平能導(dǎo)致嗜睡和昏迷(糖尿病昏迷)。
[0012]葡萄糖水平在正常水平和糖尿病水平之間的人患有葡萄糖耐量受損(IGT)。這種病癥也稱為糖尿病前期或胰島素抵抗綜合癥?；加蠭GT的人沒(méi)有糖尿病，而是有高于正常但尚未高到足以被診斷為糖尿病的血液葡萄糖水平。他們的身體制造越來(lái)越多的胰島素，但由于組織不對(duì)其響應(yīng)，所以他們的身體無(wú)法合適地使用糖。近期研究表明，IGT本身對(duì)于心臟病的發(fā)展而言可能是風(fēng)險(xiǎn)因素。估計(jì)患糖尿病前期的人的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)比血糖正常的人高1.5倍?；加刑悄虿〉娜说男难芗膊★L(fēng)險(xiǎn)增加2?4倍。
[0013]葡萄糖和甘油三酯的高血液水平導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜增厚，造成血管腔漸窄。所述血管病變產(chǎn)生多種病癥例如糖尿病性視網(wǎng)膜病，其會(huì)導(dǎo)致失明、冠心病、毛細(xì)血管間腎小球硬化癥、神經(jīng)病以及四肢的潰瘍形成和壞疽等。
[0014]葡萄糖血漿水平過(guò)度的毒性作用包括細(xì)胞和組織的糖基化。糖基化產(chǎn)物在組織中積累，并可最終形成交聯(lián)蛋白，所述交聯(lián)蛋白被稱為晚期糖基化終產(chǎn)物。非酶促糖基化可能直接導(dǎo)致血管基質(zhì)擴(kuò)張和糖尿病血管并發(fā)癥。例如，膠原糖基化導(dǎo)致過(guò)度交聯(lián)，造成血管動(dòng)脈粥樣硬化。并且，巨噬細(xì)胞對(duì)糖基化蛋白的攝取刺激這些細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子。所述細(xì)胞因子分別激活或誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的降解和增殖級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
[0015]血紅蛋白的糖基化提供了用于測(cè)定血糖狀態(tài)的完整指數(shù)的便利方法。糖基化蛋白的水平反映一段時(shí)間內(nèi)的葡萄糖水平，并且是被稱作血紅蛋白Al(HbAlc)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
[0016]HbAlc反映在前120天過(guò)程中的重均血糖水平；前30天中的血漿葡萄糖引起約50%的HbAlc實(shí)驗(yàn)終結(jié)果。對(duì)Alc的測(cè)試(也稱為HbAlc，糖血紅蛋白或糖化血紅蛋白)指示在最后數(shù)月中糖尿病被控制的程度。Alc越接近6%，對(duì)糖尿病的控制越好。Alc血糖每增加30mg/dl，Alc便增加1%，從而增加并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0017]高血糖癥的毒性作用的另一個(gè)解釋包括山梨醇的形成。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖通過(guò)酶醛糖還原酶還原為其相應(yīng)的糖醇、山梨醇；山梨醇的生成率由周圍葡萄糖濃度決定。因此，組織例如晶狀體、視網(wǎng)膜、動(dòng)脈壁和外周神經(jīng)的施旺(Schwann)細(xì)胞含有高濃度山梨醇。
[0018]高血糖癥還削弱神經(jīng)組織的功能，這是由于葡萄糖與肌醇競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致細(xì)胞濃度降低，并且最終改變神經(jīng)功 能和神經(jīng)病。
[0019]甘油三酯水平增加也是胰島素缺失的結(jié)果。高甘油三酯水平也與血管疾病相關(guān)。
[0020]因此，控制血糖和甘油三酯水平是所希望的治療目標(biāo)。已知許多口服抗高血糖
齊U。增加胰腺的胰島素輸出的藥物包括硫酰脲類(包括氯磺丙脲[Orinase?]、甲苯磺丁脲[Tolinase?]、格列本脲[Micronase?]、格列甲嗪[Glucotrol?]和格列美脲[Amaryl?])以及磺酰脲類(包括瑞格列耐[Prandin?]和那格列耐[Starlix?])。降低肝臟的葡萄糖生成量的藥物包括雙胍(包括甲福明二甲雙胍[Glucophage?])。增加細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性的藥物包括塞唑烷二酮類(包括曲格列酮[Resulin?]、吡格列酮[Ac+tos?]:和羅格列酮[Avandia?])。降低腸的碳水化合物吸收的藥物包括α葡萄糖苷酶抑制劑(包括阿卡波
糖[Precose?]和米格列醇[Glyset?])。吡格列酮和羅格列酮能夠改變糖尿病患者中的膽
固醇模式。HDL(或好膽固醇)為這些藥物加碼。阿卡波糖作用于腸，其效果為在其它部位作用的藥物(例如硫酰脲類)加碼。ACE抑制劑可以用來(lái)在患有高血壓或糖尿病的人中控制高血壓、治療心力衰竭和預(yù)防腎損傷。ACE抑制劑或ACE抑制劑和利尿劑(例如氫氯噻嗪)的組合產(chǎn)物市售可得。然而，這些治療都不理想，因?yàn)樗鼈冎惶峁┒唐谥委?，且伴隨許多副作用。[0021]控制血壓可以使心血管疾病(例如，心肌梗塞和中風(fēng))減少約33%?50%，能使微血管疾病(眼部、腎臟和神經(jīng)疾病)減少約33%。疾病控制中心(Center for DiseaseControl)已發(fā)現(xiàn)收縮血壓每降低10毫米汞柱(mm Hg)，與糖尿病相關(guān)的任何風(fēng)險(xiǎn)降低12%。增加對(duì)膽固醇和脂質(zhì)(例如HDL、LDL和甘油三酯)的控制能使心血管并發(fā)癥減少20%?50%。
[0022]在健康人內(nèi)，總膽固醇應(yīng)少于200mg/dl。高密度脂蛋白(HDL或“好膽固醇”)目標(biāo)水平是男性高于45mg/dl，女性高于55mg/dl，而低密度脂蛋白(LDL或“壞”膽固醇)應(yīng)保持低于100mg/dl。女性和男性的目標(biāo)甘油三酯水平是低于150mg/dl。
[0023]大約50%的糖尿病患者在患糖尿病10年后發(fā)展出一定程度的糖尿病性視網(wǎng)膜病，而80%的糖尿病患者在15年后患有視網(wǎng)膜病。在美國(guó)國(guó)立糖尿病、消化和腎臟疾病研究所(NIDDK)實(shí)施的研究(DCCT研究)中顯示，保持血糖水平盡可能接近正常水平減緩由糖尿病引起的眼部、腎臟和神經(jīng)疾病的發(fā)作和惡化。在糖尿病預(yù)防計(jì)劃(DPP)中，臨床實(shí)驗(yàn)研究了2型糖尿病。DPP研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)3年的研究顯示，飲食和鍛煉顯著減少IGT患者發(fā)展糖尿病的機(jī)會(huì)。給予甲福明二甲雙胍(GlucophageS)也減少風(fēng)險(xiǎn)，盡管不太顯著。
[0024]DCCT研究顯示HbAlc和平均血糖之間的關(guān)聯(lián)。DPP研究顯示HbAlc與不良結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)聞度相關(guān)。
[0025]在來(lái)自美國(guó)心臟協(xié)會(huì)第六次預(yù)防會(huì)議:糖尿病和心血管疾病的一系列報(bào)告中，報(bào)道了約三分之二糖尿病患者最終死于心臟或血管疾病。研究還顯示能通過(guò)控制個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)因子例如肥胖、高膽固醇和高血壓來(lái)減少與糖尿病相關(guān)聯(lián)的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加。
[0026]對(duì)患有糖尿病的人重要的是減少患并發(fā)癥例如心血管疾病、視網(wǎng)膜病、腎臟疾病和神經(jīng)病的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)糖尿病重要的還有降低總膽固醇和甘油三酯水平，以減少心血管并發(fā)癥。減少這些可能的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于患IGT(糖尿病前期)的人也是重要的。
[0027]因此，如果可以 控制血糖水平，則可降低并發(fā)癥例如心血管疾病、視網(wǎng)膜病、腎臟疾病和神經(jīng)病的風(fēng)險(xiǎn)，或延遲所述并發(fā)癥的發(fā)作。若能降低總膽固醇和甘油三酯的水平，則能減少心血管并發(fā)癥。
[0028]第2部分或本申請(qǐng)的任何其它部分中的任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定，不應(yīng)視作認(rèn)可所述參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的在先技術(shù)。
3.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]提供重組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子，其中:
[0030]a.所述信號(hào)序列調(diào)控宿主內(nèi)靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)；
[0031]b.所述重組細(xì)胞獲自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌，和
[0032]c.所述信號(hào)序列是GLP-2、其片段或其類似物或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子，其中:
[0033]a.所述信號(hào)序列調(diào)控靶標(biāo)核酸在宿主中的信號(hào)依賴性表達(dá)，
[0034]b.所述重組細(xì)胞獲自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌，和
[0035]c.所述靶核酸編碼能夠使所述宿主的第一種細(xì)胞重編程為第二種細(xì)胞的哺乳動(dòng)物因子。
[0036]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主是哺乳動(dòng)物。[0037]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述第二個(gè)細(xì)胞是β樣細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、肝細(xì)胞或免疫應(yīng)答細(xì)胞。
[0038]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主的第一個(gè)細(xì)胞是腸表皮細(xì)胞。
[0039]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述第二個(gè)細(xì)胞是葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞。
[0040]在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述信號(hào)序列響應(yīng)環(huán)境刺激調(diào)控祀標(biāo)核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)。
[0041]在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述啟動(dòng)子是葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子。
[0042]在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述啟動(dòng)子可以是本領(lǐng)域已知的任何誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。
[0043]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列選自GLP-1、GIP、PDX-1及其一個(gè)或多個(gè)片段、其類似物及其組合。
[0044]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列選自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP_2、胰島素、生長(zhǎng)激素、促乳素、降鈣素、黃體生成激素、甲狀旁腺激素、促生長(zhǎng)素抑制素、促甲狀腺激素、血管活性腸多肽、三葉因子、細(xì)胞和組織修復(fù)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、采用反平行4 α螺旋束結(jié)構(gòu)的第I結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、IL-2、IL-3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-Y、ΕΡ0、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRUIFNa/β，第2結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、TNF-家族細(xì)胞因子、TNF a、TNFP、⑶40、CD27、FAS配體、IL-1-家族細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P、神經(jīng)生長(zhǎng)因子，包含短鏈α/β分子的第3結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、表皮生長(zhǎng)因子家族細(xì)胞因子、C-C或C-X-C趨化因子、胰島素相關(guān)細(xì)胞因子，四級(jí)結(jié)構(gòu)細(xì)胞因子、調(diào)蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、EGF、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié) 構(gòu)域、其一個(gè)或多個(gè)片段、其類似物及其組合。
[0045]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列和啟動(dòng)子在所述重組細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上編碼。
[0046]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞源自益生細(xì)菌。
[0047]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是選自埃希氏菌(Escherichia)、假單胞菌(Pseudomonas)、擬桿菌(Bacteroides)、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽抱桿菌(Bacillus)、變形桿菌(Proteus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒狀桿菌(Corynebacterium)的細(xì)菌。
[0048]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶核酸編碼哺乳動(dòng)物因子，該哺乳動(dòng)物因子能促進(jìn)宿主內(nèi)的所需生理過(guò)程功能，或能治療宿主內(nèi)非感染性疾病。
[0049]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述非感染性疾病選自自體免疫性疾病、癌癥、內(nèi)分泌疾病、胃腸疾病、癌癥及其組合。
[0050]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述非感染性疾病是糖尿病。
[0051]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述糖尿病是I型糖尿病、2型糖尿病或代謝綜合癥。
[0052]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述非感染性疾病選自克羅恩氏(Crohn’ s)病、肥胖、苯丙酮尿癥、槭樹(shù)糖漿尿病、組氨酸血癥、高血糖癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、冠心病、毛細(xì)血間腎小球硬化癥、腎病、神經(jīng)病、四肢潰瘍或壞疽、動(dòng)脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、高血壓、高蛋白血癥、蛋白尿癥、骨質(zhì)疏松、貧血、高脂蛋白血癥、酮酸中毒、高甘油三酯血癥、乳酸性酸中毒、心肌病、威爾遜(Wilson’ s)病、腦白質(zhì)病、巖藻糖苷病、癌癥、化療誘導(dǎo)的腹瀉、炎性腸病、心室和動(dòng)脈纖顫、手術(shù)后器官衰竭、腸易激綜合癥、間質(zhì)性膀胱炎/膀胱痛綜合癥、短腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎及其組合。
[0053]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥是胃腸癌、胃癌、膽囊癌、胃腸基質(zhì)腫瘤、肝癌、胰腺癌或結(jié)腸癌。
[0054]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物因子在腸損傷或手術(shù)后促進(jìn)所需生理過(guò)程功倉(cāng)泛。
[0055]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞能夠接觸腸絨毛而不吸收進(jìn)入所述宿主的全身循環(huán)。
[0056]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述啟動(dòng)子是fliC啟動(dòng)子。
[0058]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞還包含分泌標(biāo)簽(secretion tag)。
[0059]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分泌標(biāo)簽是fliC分泌標(biāo)簽。
[0060]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分泌標(biāo)簽是α -血溶素(HlyA)分泌標(biāo)簽。
[0061]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞還包含細(xì)胞穿透肽(CPP)序列。
[0062]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞表達(dá)信號(hào)序列為融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含由所述信號(hào)序列編碼的信號(hào)和由所述細(xì)胞穿透肽序列編碼的細(xì)胞穿透肽。
[0063]還提供一種用于治療宿主內(nèi)糖尿病的方法，所述方法包括向所述宿主給予重組細(xì)胞的步驟，其中所述重組細(xì)胞包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子，其中:
[0064]a.所述信號(hào)序列調(diào)控祀標(biāo)`核酸在宿主中的信號(hào)依賴性表達(dá)，
[0065]b.所述重組細(xì)胞獲自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌，和
[0066]c.所述靶標(biāo)核酸編碼能夠?qū)⑺鏊拗鞯牡谝粋€(gè)細(xì)胞重編程為第二個(gè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物因子。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)信號(hào)序列刺激疾病預(yù)防因子的表達(dá)或抑制糖尿病引發(fā)因子的表達(dá)。
[0068]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述糖尿病是I型糖尿病、2型糖尿病或代謝綜合癥。
[0069]在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述信號(hào)序列調(diào)控祀標(biāo)核酸響應(yīng)環(huán)境刺激的信號(hào)依賴性表達(dá)。
[0070]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述環(huán)境刺激物是葡萄糖。
[0071]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病預(yù)防因子包括胰島素。
[0072]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)核酸編碼促進(jìn)宿主內(nèi)血糖水平降低的哺乳動(dòng)物因子。
[0073]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)核酸編碼促進(jìn)宿主內(nèi)血液胰島素水平增加的哺乳動(dòng)物因子。
[0074]一種在哺乳動(dòng)物宿主中使腸細(xì)胞分化為其它細(xì)胞類型的方法，所述方法包括向所述宿主給予重組細(xì)胞的步驟，其中，所述重組細(xì)胞包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子，其中:
[0075]a.所述信號(hào)序列調(diào)控靶標(biāo)核酸在宿主中的信號(hào)依賴性表達(dá)，
[0076]b.所述重組細(xì)胞獲自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌，和
[0077]c.所述靶標(biāo)核酸編碼能夠使所述宿主的第一個(gè)細(xì)胞重編程為第二個(gè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物因子。
[0078]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述另一個(gè)細(xì)胞類型是β樣細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、肝細(xì)胞或免疫應(yīng)答細(xì)胞。
[0079]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述β樣細(xì)胞是葡萄糖響應(yīng)性細(xì)胞。
[0080]在另一個(gè)實(shí)施方式中，給予有效量的所述重組細(xì)胞。
[0081]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞的有效量是至少約104CFU/kg。
[0082]在另一個(gè)實(shí)施方式中，聯(lián)合給予所述重組細(xì)胞和具有協(xié)同作用的化合物。
[0083]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述具有協(xié)同作用的化合物選自DPP-4抑制劑、GLP-2、GLP-1激動(dòng)劑、二甲亞砜、胰島素、α-葡萄糖苷酶抑制劑、普蘭林肽、美格列奈、瑞格列奈、那格列奈、氯磺丙脲、甲福明二甲雙胍、磺脲、格列甲嗪、格列本脲、格列美脲、噻唑烷二酮類、其類似物、其片段及其組合物。
[0084]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列選自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP_2、胰島素、生長(zhǎng)激素、促乳素、降鈣素、黃體生成激素、甲狀旁腺激素、促生長(zhǎng)素抑制素、促甲狀腺激素、血管活性腸多肽、三葉因子 、細(xì)胞和組織修復(fù)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、采用反平行4 α螺旋束結(jié)構(gòu)的第I結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、IL-2、IL-3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-Y、ΕΡ0、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNa /β、第2結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、TNF-家族細(xì)胞因子、TNFa , TNFβ , CD40、CD27、FAS配體、IL-1-家族細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、包含短鏈α/β分子的第3結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、表皮生長(zhǎng)因子家族細(xì)胞因子、C-C或C-X-C趨化因子、胰島素相關(guān)細(xì)胞因子、第4結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、調(diào)蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、EGF、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域、其一個(gè)或多個(gè)片段、其類似物及其組合。
[0085]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列是GIP、GLP-1、GLP-2、Η)Χ_1、其片段、其類似物及其組合。
[0086]提供用于使宿主內(nèi)腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞的方法，所述方法包括給予包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞的步驟，其中，所述信號(hào)序列選自GLP-1、Gip、rox-1、其片段、其類似物及其組合。
[0087]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主是高血糖癥患者,且向所述高血糖癥宿主給予所述重組細(xì)胞會(huì)減少或消除對(duì)所述宿主治療性給予外源胰島素的需求。
[0088]4.附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0089]本文通過(guò)參考【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】本發(fā)明，在所述附圖中，類似的參考特征表示若干視圖中類似的部分。應(yīng)理解，在一些例子中可能夸張地或放大地顯示本發(fā)明的不同方面以便于理解本發(fā)明。
[0090]圖1顯示就研究構(gòu)建的質(zhì)粒。為研究來(lái)自大腸桿菌(E.coli)DH5a的P0/P1啟動(dòng)子，制備兩種質(zhì)粒(PFD1和pFD2)。pFDl編碼完整P0/P1區(qū)域以驅(qū)動(dòng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)。pFD2僅編碼EGFP上游啟動(dòng)子的PO區(qū)域。為就刺激Caco_2細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌測(cè)試重組細(xì)菌中促胰島素(insulinotropic)蛋白的分泌功效,構(gòu)建質(zhì)粒pFD-PDX、pFD-GLP 和 pFD-20。
[0091]圖2顯示PO和P0/P1對(duì)葡萄糖的響應(yīng)。利用EGFP表達(dá)來(lái)測(cè)量PO和/或PI啟動(dòng)子對(duì)不同介質(zhì)條件的響應(yīng)。Po=僅P0;P0+P1=P0加Pl側(cè)接區(qū)域；DH5 a =Iac操縱子對(duì)照。
[0092]圖3顯示大腸桿菌Nissle的重組促胰島素蛋白分泌。
[0093]圖4Α顯示Caco-2細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄-PCR，所述Caco_2細(xì)胞用來(lái)自大腸桿菌Nissle的過(guò)夜培養(yǎng)物的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基(CFM)孵育，所述大腸桿菌Nissle表達(dá)GLP-1 (G)、PDX-1-CPP (P)、GLP-1和TOX-l-CPP (GP)、或?qū)φ召|(zhì)粒(樣品表示為“ 20 ”)，或用合成的GLP-U氨基酸I?37;樣品表示為“37”)孵育，并后續(xù)用葡萄糖(“g”)或甘油刺激。
[0094]圖4B顯示受刺激Caco-2細(xì)胞的胰島素分泌的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。誤差棒代表至少三次實(shí)驗(yàn)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值來(lái)自斯氏T檢驗(yàn)(n=3)。
[0095]圖5顯示改造成分泌GLP-1、含有fliC啟動(dòng)子和分泌標(biāo)簽的Nissle的GLP-1分泌，與含有相同序列但不含PKD3染色體插入盒的攜帶質(zhì)粒菌株的GLP-1分泌的比較。
[0096]圖6顯示用改造成分泌GLP-1、含有fliC啟動(dòng)子和GLP-1分泌標(biāo)簽的Nissle處理的小鼠與用包含相同序列但不含PKD3染色體插入盒的攜帶質(zhì)粒菌株處理的小鼠間的葡萄糖水平體內(nèi)測(cè)試。
[0097]圖7顯示I型糖尿病鼠模型中血糖水平的降低。
[0098]圖8A-B描述顯示胰島素的小鼠腸切片的免疫組化。在實(shí)施例5的章節(jié)6.5所述實(shí)驗(yàn)?zāi)┪蔡幩烙帽磉_(dá)GLP-1 (A)的大腸桿菌Nisslel917和表達(dá)隨機(jī)肽(B)的大腸桿菌Nisslel917喂食的糖尿病小鼠。就胰島素存在染色(紅色)腸切片。在A中以箭頭指示高濃度的胰島素。
[0099]圖9A-E顯示在用Nissle-GLP-1、Nissle處理或不予處理之后對(duì)小鼠的檢測(cè)。檢測(cè)了 β細(xì)胞量(A)。監(jiān)測(cè)超過(guò)80天的小鼠隨機(jī)葡萄糖水平(B)和重量(C)。就葡萄糖注射后1.5小時(shí)而言每30分鐘檢測(cè)血液胰島素(D)，就葡萄糖注射后1.5小時(shí)而言每30分鐘檢測(cè)血糖(E)。
·[0100]圖10A-F顯示小鼠腸中包含胰島素的細(xì)胞口袋的相對(duì)頻率。小鼠腸的免疫染色顯示喂食Nissle-GLP-1的小鼠(A)內(nèi)有包含胰島素的細(xì)胞，而喂食Nissle的小鼠或?qū)φ招∈?B)內(nèi)沒(méi)有。細(xì)胞用針對(duì)代表性蛋白質(zhì)的抗體共染藍(lán)色，所述代表性蛋白質(zhì)來(lái)自以下4種細(xì)胞類型中每一種:潘納斯(paneth)細(xì)胞的NOD-2 (C)、杯狀細(xì)胞的黏液素_2 (MUC-2) (D)、吸收細(xì)胞的蔗糖異麥芽糖酶(SI) (E)，以及腸內(nèi)分泌細(xì)胞的嗜鉻素A (Chr-A) (F)。用針對(duì)來(lái)自所述四種類型腸細(xì)胞中每一種的代表性蛋白的抗體共染表明，這些細(xì)胞系與腸內(nèi)分泌細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。
[0101]圖1lA顯示也喂食Nissle和Nissle GLP-1的健康小鼠(未經(jīng)STZ處理)中隨著時(shí)間的血糖水平。
[0102]圖1lB顯示也喂食Nissle和Nissle GLP-1的健康小鼠(未經(jīng)STZ處理)中隨著時(shí)間的重量變化。
[0103]圖12顯示在喂食Nissle、表達(dá)來(lái)自質(zhì)粒的GLP-1或Nissle-GLP-Ι的小鼠品系糞便中的Nissle存活性檢測(cè)。
[0104]圖13顯示在使用含假質(zhì)粒Nissle、含來(lái)自相同質(zhì)粒的GLP-1 (1-37)的Nissle或不予處理或無(wú)STZ(對(duì)照)進(jìn)行Nissle處理后的隨機(jī)血糖水平。
[0105]圖14顯示非肥胖糖尿病(NOD)小鼠在對(duì)NOD小鼠一天兩次喂食Nissle、染色體表達(dá)GLP-1 (1-37)的Nissle或不予處理之后的空腹血糖水平。小鼠在臨檢測(cè)血糖之前禁食4小時(shí)。時(shí)間表示處理開(kāi)始后的天數(shù)。
[0106]圖15顯示操作所述重組細(xì)胞的可能方法。左:腔B中在黏膜M內(nèi)側(cè)和上側(cè)含有細(xì)菌的正常腸隱窩。腸內(nèi)分泌細(xì)胞(E)分泌激素進(jìn)入固有層(LP)和脈管系統(tǒng)V。右:本文實(shí)施方式的重組細(xì)胞(EB)分泌GLP-1 (從EB出現(xiàn)的點(diǎn))進(jìn)入所述腸腺以使早期腸內(nèi)分泌細(xì)胞重編程為胰島素分泌細(xì)胞(RE)。然后在響應(yīng)葡萄糖時(shí)分泌胰島素(Ins，標(biāo)星)進(jìn)入血流。
[0107]圖16A-D顯示在小鼠腸上部中的細(xì)菌分泌GLP-1。在60天的過(guò)程中，每天兩次對(duì)小鼠喂食分泌自大腸桿菌Nisslel917 (Nissle-GLP-Ι)的GLP-1 (1-37)。a，小鼠腸上部切片的免疫熒光顯示GLP-1結(jié)合腸黏膜。白色箭頭指示來(lái)自腸內(nèi)分泌細(xì)胞的GLP-1表達(dá)?；疑^指示細(xì)菌分泌的GLP-1結(jié)合上皮細(xì)胞。b，喂食表達(dá)假肽(Nissle)的大腸桿菌Nisslel917的小鼠不顯示黏膜GLP-1染色。白色箭頭指示腸內(nèi)分泌細(xì)胞。c，GLP-1結(jié)合(％覆蓋)通過(guò)圖像分析定量。值是取自至少3只小鼠圖像的平均值，而誤差棒代表I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。GLP-1=Nissle-GLP-1 ;Nissle=表達(dá)假肽的EcN。p值來(lái)自斯氏t檢驗(yàn)(n=3)。d,來(lái)自小鼠全腸的細(xì)菌計(jì)數(shù):高位腸道(未清洗)、大腸(較低GI，用PBS溫和清洗)或糞便計(jì)數(shù)。*糞便以每克糞便計(jì)數(shù)。值是三只小鼠的平均值，而誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0108]圖17A-D顯示STZ處理的小鼠內(nèi)I型糖尿病(TlDM)有所減少，a，在研究末期收集小鼠胰腺，并測(cè)定就胰島素染色的IHC切片的β細(xì)胞量。分析來(lái)自每組3只小鼠的圖像，顯示各組的平均β細(xì)胞量。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，P值來(lái)自斯氏t檢驗(yàn)(n=3)。如教材所述處理喂食Nissle的小鼠(Nissle)、喂食Nissle-GLP-1的小鼠(GLP-1)、不喂食細(xì)菌的小鼠(STZ)、未用STZ處理或喂食細(xì)菌的小鼠(對(duì)照)。b，在60天后檢測(cè)小鼠血糖水平。顯示在處理開(kāi)始(第O天)和60天后的平均值。顯示的值是至少4只小鼠的平均值。誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值來(lái)自斯氏t檢驗(yàn)(n=4)。C，在92天的過(guò)程中，對(duì)未用STZ處理的健康小鼠一天兩次喂食Nissle (Nissle)和Nissle-GLP-1 (GLP-1)。在相同時(shí)間段使用不喂食細(xì)菌的對(duì)照小鼠作為比較(對(duì)照)。顯示三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第0、57和92天)。P值來(lái)自斯氏t檢驗(yàn)(n=4)。d，在STZ消耗其β細(xì)胞團(tuán)塊之后用細(xì)菌處理60天后，小鼠接受葡萄糖耐受測(cè)試，其中，它們被禁食10小時(shí)，然后注射葡萄糖(25mg/kg體重)。每30分鐘檢測(cè)血液胰島素(上圖)和葡萄糖(下圖)水平，持續(xù)1.5小時(shí)。 =STZ-處理的未喂食細(xì)菌的小鼠； =STZ-處理的喂食Nissle的小鼠；□ =STZ-處理的喂食Nissle-GLP-1的小鼠；Λ =不給予STZ也不喂食細(xì)菌的對(duì)照小鼠。值是各處理的平均值。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(η=4)。星號(hào)表示在斯氏t檢驗(yàn)(n=4)中，僅STZ處理的小鼠( )和喂食Nissle-GLP-1的小鼠(□)之間在ρ〈.05⑷、p〈.01 (**)和p〈.001 (林*)水平的顯著性。
[0109]圖18Α-Η顯示喂食Nissle和Nissle-GLP-l的小鼠內(nèi)的β細(xì)胞和上皮細(xì)胞標(biāo)志物。將來(lái)自 STZ 處理小鼠(a、b、e-f)和喂食 Nissle (a、c)或 Nissle-GLP-1 (b、d、e_f)的健康小鼠(c，d)的腸切片免疫染色為綠色，用于顯示胰島素(a-h)存在，共染藍(lán)色的是核酸(0八卩1，&-11)，紅色的是^?-1(&-(1)、0^4&、0、溶菌酶(Lys，g)或蔗糖異麥芽糖酶(SI，h)。圖e-f中，向右的箭頭指示表達(dá)胰島素的重編程細(xì)胞。圖b中向左的箭頭和圖d中的所有箭頭指示表達(dá)胰島素的細(xì)胞。圖e和f中向左和向下的箭頭指示表達(dá)ChrA而不是胰島素的細(xì)胞。圖g中向上的箭頭指示表達(dá)Lys的潘納斯(paneth)細(xì)胞。圖h中向左和向上的箭頭指示SI。圖b、e和f中插圖是其所出現(xiàn)圖像內(nèi)生成胰島素的細(xì)胞的較高放大倍數(shù)圖。圖a、e和h的比例尺=25 μ m;所有其它圖中的比例尺=100 μ m。A=自熒光。
[0110]圖19顯示改造的共生細(xì)菌的GLP-1分泌。上圖，顯示用于通過(guò)染色體插入將大腸桿菌Nisslel917轉(zhuǎn)化入GLP-1分泌細(xì)胞系的盒示意圖。所述盒包括fliC的5’未翻譯區(qū)域，然后是6個(gè)組氨酸標(biāo)簽、腸激酶位點(diǎn)(EK)、融合細(xì)胞穿透肽(CPP)的GLP-1 (1-37)和用于染色體插入的pKD3區(qū)域。下圖，Western印跡顯示來(lái)自染色體修飾的Nissle (染色體)或來(lái)自攜帶質(zhì)粒上所述盒的Nissle (質(zhì)粒)的分泌(M)或細(xì)胞團(tuán)(C)內(nèi)的GLP-1量。
[0111]圖20A-B顯示TlDM實(shí)驗(yàn)的小鼠重量水平。a，在喂食Nissle (Nissle)、Nissle-GLP-1(GLP-1)或不用細(xì)菌喂食(STZ)60天后檢測(cè)STZ處理的小鼠重量。未用STZ處理且未喂食細(xì)菌的小鼠作為對(duì)照(對(duì)照)。顯示在處理開(kāi)始(第O天)和60天后的平均值。顯示的值是至少4只小鼠的平均值。誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。b，C57BL/6雌鼠(6?8周齡)一天兩次喂食NiSSle、NiSSle-GLP-l或不喂食細(xì)菌。重量按指示測(cè)量。值是5只小鼠的平均值。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)。
[0112]圖21顯示NOD小鼠血糖水平。NOD小鼠一天兩次用Nissle(Nissle)、Nissle-GLP-1(GLP-1)喂食或不用細(xì)菌喂食(對(duì)照)，持續(xù)46天。開(kāi)始每天喂食后，在第
11、21、30和46天檢測(cè)空腹血糖。值是每組小鼠在特定天的的平均值。誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，P值來(lái)自第46天數(shù)據(jù)的斯氏t檢驗(yàn)(n=2)。
[0113]圖22顯示NOD小鼠重量。NOD小鼠一天兩次用Nissle (Nissle)、Nissle-GLP-1(GLP-1)喂食或不用細(xì)菌喂食(對(duì)照)，持續(xù)46天。開(kāi)始每天喂食后，在第
11、21、30和46天喂食后檢測(cè)小鼠重量。值是每組小鼠在特定天的平均值。誤差棒代表I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
[0114]5.發(fā)明詳述
[0115]提供具有經(jīng)改造信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的遺傳工程改造微生物(例如，細(xì)菌)。提供使用經(jīng)改造微生物(或源自其的重組細(xì)胞)以表達(dá)生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子或改善疾病或紊亂的生物復(fù)合物的方法。還提供改造成分泌胰高血糖素樣肽I (GLP-1)、PDX, GIF或胰高血糖素樣肽2(GLP-2)或其片段、類似物或組合的共生細(xì)菌菌株。還提供使用所述改造細(xì)菌菌株來(lái)改善高血糖癥和/或糖尿病(DM )以及其它疾病的方法。
[0116]還提供使用改造成分泌胰高血糖素樣肽I (GLP-1)、PDX, GIF、其片段、其類似物或其組合的共生細(xì)菌菌株來(lái)使腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞的方法。提供使用改造成分泌胰高血糖素樣肽2(GLP-2)的共生細(xì)菌菌株來(lái)增強(qiáng)腸功能、腸上皮表面損傷例如炎性發(fā)作、外科手術(shù)等后再生，并促進(jìn)所述腸道內(nèi)膜痊愈的方法。
[0117]為了清楚說(shuō)明而非限制本公開(kāi)，將本發(fā)明分為以下小章節(jié)詳細(xì)描述。
[0118]5.1.術(shù)語(yǔ)
[0119]在描述本組合物和方法之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述的具體方法、組合物、或方法論，因?yàn)樗鼈兛勺兓＿€應(yīng)理解，本說(shuō)明中所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體形式或?qū)嵤┓绞剑也灰庠谙薅ū景l(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書(shū)限定。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。雖然與本文所述類似或等同的任何方法和材料也能用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明的實(shí)施方式，但描述了優(yōu)選的方法、裝置和材料。所有本文中提到的出版物通過(guò)引用全文納入本文。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些公開(kāi)內(nèi)容。
[0120]還必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書(shū)所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義，除非文中另有明確說(shuō)明。因此，例如，提及“重組細(xì)胞”指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種重組細(xì)胞和其等同物，等等。
[0121]本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”指與所用數(shù)字相比在數(shù)值上增加或減少10%。因此，約50%指在45%?55%范圍內(nèi)。
[0122]“給予”在與治療劑聯(lián)用時(shí)，指將治療劑直接給予靶組織之內(nèi)或之上，或?qū)⒅委焺┙o予患者，由此所述治療劑正面影響其靶向組織。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)“給予”在與重組細(xì)胞聯(lián)用時(shí)，可以包括但不限于口服給予，將重組細(xì)胞提供至靶標(biāo)組織之內(nèi)或之上；通過(guò)例如靜脈內(nèi)注射將重組細(xì)胞系統(tǒng)性提供給患者，由此所述治療劑到達(dá)所述靶組織；將重組細(xì)胞以其編碼序列形式給予所述靶組織(例如，通過(guò)所謂基因治療技術(shù))。
[0123]“給予”組合物可以通過(guò)口服、注射、局部給予或與其它已知技術(shù)聯(lián)用的任何方法來(lái)完成。
[0124]本文所用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”或“宿主”或“對(duì)象”包括但不限于人類和非人類脊椎動(dòng)物，例如野生、家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物。優(yōu)選地，所述術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”或“宿主”或“對(duì)象”指哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選指人。
[0125]使用術(shù)語(yǔ)“改善”以表達(dá)本發(fā)明改變所提供、應(yīng)用或給予的組織的外觀、形式、特性和/或物理屬性。所述形式上的改變可以通過(guò)任何以下形式單獨(dú)或聯(lián)合來(lái)證明:腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胰島素分泌細(xì)胞、治療信號(hào)的分泌、靶標(biāo)核酸的表達(dá)、或靶標(biāo)疾病癥狀的緩解、預(yù)防或減少，所述目標(biāo)疾病例如癌癥、自體免疫、內(nèi)分泌或心血管疾病。
[0126]所述術(shù)語(yǔ)“抑制”包括給予本發(fā)明的重組細(xì)胞以防止所述癥狀的發(fā)作、減輕所述綜合癥或消除所述疾病、病癥或紊亂。
[0127]“藥學(xué)上可接受的”指必須與制劑中其它成分相容的運(yùn)載體、稀釋劑或者賦形劑，
且對(duì)接受者沒(méi)有毒害作用。
[0128]本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療劑”指用于治療、對(duì)抗、緩解、預(yù)防或改善患者不需要的病癥或疾病的試劑。本發(fā)明的實(shí)施方式部分涉及治療糖尿病，或增加胰島素生成，或治療癌癥或自體免疫、內(nèi)分泌或心血管疾病 。
[0129]組合物的“治療有效量”或“有效量”是計(jì)算成達(dá)到所需效果的預(yù)定量，所需效果即是預(yù)防、緩解或減少癌癥或自體免疫、內(nèi)分泌或心血管疾病的癥狀。通過(guò)本方法的預(yù)期活性包括合適的醫(yī)學(xué)治療和/或預(yù)防性治療。如本發(fā)明所述給予以獲得治療和/或預(yù)防效果的重組細(xì)胞特定劑量當(dāng)然視情況的具體情形而定，所述具體環(huán)境包括例如，給予的編碼蛋白、給藥途徑和治療病癥。所述重組細(xì)胞可以在廣泛劑量范圍內(nèi)有效。然而，應(yīng)理解，所給予的有效量將由醫(yī)師視相關(guān)情形而定，所述相關(guān)情形包括待治療病癥、待給予的編碼蛋白選擇以及給藥途徑的選擇，從而上述劑量范圍不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明重組細(xì)胞的治療有效量通常是，在以生理上可耐受的賦形劑組合物形式給予時(shí)，足夠達(dá)到有效全身濃度或組織局部濃度的量。
[0130]本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”、“治療的”、或“處理”指治療性處理和預(yù)防性或防止措施，其中所述目的是防止或減緩(緩解)不良生理病癥、紊亂或疾病，或獲得有益或所需的臨床結(jié)果。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”還包括預(yù)防不希望的生理病癥、紊亂或疾病的發(fā)作、建立和傳播。為了本公開(kāi)的目的，有益或所需臨床結(jié)果包括但不限于，緩解癥狀；減少所述病癥、紊亂或疾病的程度；使所述病癥、紊亂或疾病的狀態(tài)穩(wěn)定(即，不惡化)；使所述病癥、紊亂或疾病的發(fā)作延遲或減緩進(jìn)展；減輕所述病癥、紊亂或疾病狀態(tài)；和緩和(部分或總體)，不論是否可檢測(cè)，或提高或改善所述病癥、紊亂或疾病。治療包括引發(fā)臨床顯著反應(yīng)而不引起過(guò)高水平的副作用。治療也包括與不接受治療的預(yù)期生存相比延長(zhǎng)生存。[0131]一般而言，所述術(shù)語(yǔ)“組織”指類似專門(mén)細(xì)胞的任何聚集，其聯(lián)合行使某一特定功倉(cāng)泛。
[0132]5.2.GLP-1、PDX-1、GIP 和 GLP-2
[0133]三種蛋白即GLP-1 (胰高血糖素樣肽1)、PDX_1(胰腺和十二指腸同源框基因I)和胃抑制性多肽(GIP)能刺激腸上皮細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖(GIP和GLP-1)或無(wú)關(guān)葡萄糖水平地(PDX-1)合成胰島素。本領(lǐng)域已知第四種蛋白GLP-2在胃腸(GI)道內(nèi)有許多作用。
[0134]GLP-1
[0135]胰高血糖素樣肽I (GLP-1)源自高血糖素原基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。GLP-1的體內(nèi)主要來(lái)源是分泌GLP-1作為腸激素的腸L細(xì)胞。GLP-1 (1-37)是GLP-1的細(xì)胞內(nèi)前體，剪切自高血糖素原，且最前的六個(gè)氨基酸后續(xù)從N末端脫去，以形成生物活性肽。GLP-1的主要生物活性形式有=GLP-1 (7-37)和優(yōu)勢(shì)循環(huán)活性形式GLP-1 (7-36)酰胺。GLP-1由遠(yuǎn)端小腸的腸上皮響應(yīng)葡萄糖和其它營(yíng)養(yǎng)物而分泌。其半衰期很短，并且其在引流所述腸黏膜的血管中被二肽酰肽酶IV(DPP-4)降解。GLP-1通過(guò)結(jié)合膜受體GLP-1R而激活胰腺β細(xì)胞合成胰島素，從而可以成為治療I型和2型糖尿病的治療劑。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，注射了 GLP-1的腸上皮細(xì)胞可成為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞，并且后續(xù)外科移植GLP-1體外刺激的上皮細(xì)胞進(jìn)入宿主會(huì)導(dǎo)致所述宿主內(nèi)糖尿病的逆轉(zhuǎn)。如本文公開(kāi)的，認(rèn)為生物失活形式GLP-1 (1-37)能使腸細(xì)胞重編程成為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞。
[0136]GIP
[0137]GIP (也稱作葡萄糖依賴性促胰島素肽)，誘導(dǎo)胰島素分泌，且主要可由十二指腸中葡萄糖的血清高滲透壓刺激。GIP也被認(rèn)為在通過(guò)刺激脂肪細(xì)胞中的脂蛋白酯酶活性對(duì)脂肪酸代謝具有顯著作用。GIP源自由所述GIP基因編碼的153個(gè)氨基酸的前蛋白，并作為有生物活性的42個(gè)氨基酸的肽循環(huán)。其由在十二指腸黏膜內(nèi)和胃腸道空腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的K細(xì)胞合成。與所有內(nèi)分泌激素相似，`其由血液運(yùn)輸。胃抑制性多肽受體是在胰腺內(nèi)的β細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的七次跨膜蛋白。
[0138]PDX-1
[0139]此外，轉(zhuǎn)錄活化劑rox-1刺激β細(xì)胞和腸上皮的胰島素分裂。補(bǔ)充的腸細(xì)菌作為“益生菌”可廣泛獲得，并一般被食品和藥品管理局視作安全的。使用共生菌株體內(nèi)表達(dá)重組基因的潛在優(yōu)勢(shì)包括其與所述宿主的相容性(特別是所述宿主的免疫系統(tǒng))、其在腸內(nèi)可控的持續(xù)性及其口服給藥的能力。已報(bào)道各種重組細(xì)胞因子和抗原在動(dòng)物模型內(nèi)的共生細(xì)菌表達(dá)。
[0140]過(guò)去十年中，使干細(xì)胞重編程為β細(xì)胞或具有分泌胰島素潛力的細(xì)胞已成為若干研究的主題。人們主要致力于體外生成用于移植的干細(xì)胞以及使胰腺或其它組織特異性干細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)換為β細(xì)胞。不希望受理論約束，相信失活形式的胰高血糖素樣肽I (GLP-1 (1-37))可激活發(fā)育并通過(guò)Notch信號(hào)通路使成人腸干細(xì)胞成為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞。體外孵育胚胎空腸(E14.5)和GLP-1并通過(guò)手術(shù)移植進(jìn)入成年糖尿病大鼠能夠逆轉(zhuǎn)STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病(TlDM);但成年上皮細(xì)胞分化(從腸隱窩發(fā)生)并不產(chǎn)生顯著數(shù)量的胰島素生成細(xì)胞，從而大量分化為具有β樣功能的細(xì)胞看來(lái)需要發(fā)育中胎兒(前Ε17)的增殖和假?gòu)?fù)層細(xì)胞。
[0141]GLP-2[0142]全長(zhǎng)胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)是33個(gè)氨基酸的肽，與GLP-1共分泌自小腸和大腸中的腸內(nèi)分泌細(xì)胞。類似于GLP-1，活性形式的GLP-2 (1-33)由蛋白酶DPPIV剪切成失活形式的GLP-2 (3-33)。本領(lǐng)域已知GLP-2在胃腸(GI)道內(nèi)有許多作用，包括刺激小腸和大腸內(nèi)的黏膜生長(zhǎng)，抑制腸上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞凋亡，刺激腸上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和GLUT-2表達(dá)，增加營(yíng)養(yǎng)吸收，抑制胃排空和胃酸分泌，減少腸穿透性，刺激腸血流通，以及使腸平滑肌放松(10/3/2011訪問(wèn)的www.RlucaRon.com)。GLP-2在GI道外部也起作用，包括刺激大鼠星形細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞增殖(胰高血糖素樣肽2刺激培養(yǎng)的大鼠星形細(xì)胞增殖，EurJBiochem.2003Jul; 270 (14): 3001-9 ;引用自 10/3/2011 訪問(wèn)的 www.glucagon, com)。盡管血漿蛋白在給予嚙齒動(dòng)物或人GLP-2后不變化，但是GLP-2的藥理學(xué)水平(比常規(guī)水平高約10倍)與正常人宿主的禁食和餐后狀態(tài)的胰高血糖素循環(huán)水平增加相關(guān)(胰高血糖素樣肽2刺激胰高血糖素分泌,增強(qiáng)脂質(zhì)吸收,抑制人胃酸分泌！Gastroenterology.2006Jan;130 (I):44-54 ;引用自10/3/2011訪問(wèn)的www.glucagon, com)。不希望受理論限制,相信GLP-2刺激腸內(nèi)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖。
[0143]5.3.重組細(xì)胞
[0144]本文描述的實(shí)施方式一般涉及分離的、改造的重組細(xì)胞在直接或間接治療內(nèi)分泌、心血管或自體免疫性疾病中的應(yīng)用。
[0145]實(shí)施方式可涉及包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列能夠被所述重組細(xì)胞表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可導(dǎo)致治療性蛋白質(zhì)分泌至所述重組細(xì)胞的胞質(zhì)外。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列能夠調(diào)控靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列能夠響應(yīng)環(huán)境刺激而調(diào)控祀核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列和啟動(dòng)子在所述重組細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上編碼。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列和啟動(dòng)子在所述重組細(xì)胞的核酸上編碼。
[0146]在另一些實(shí)施方式中,所述信號(hào)序列可調(diào)控祀核酸的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可響應(yīng)環(huán)境刺激調(diào)控靶核酸的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可以是GIP、GLP-1、PDX-1、其片段、其類似物或其組合。在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)信號(hào)序列能夠刺激疾病預(yù)防因子表達(dá)或抑制疾病引發(fā)因子的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)境刺激可以是葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，所述疾病預(yù)防因子可以包括胰島素。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞的給予不會(huì)導(dǎo)致健康對(duì)象內(nèi)的血液胰島素水平增高。
[0147]在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可包括胰高血糖素樣肽I(GLP-1)或其片段或類似物。在一些實(shí)施方式中，GLP-1可包括GLP-1 (1-37) ,GLP-1 (7-37) ,GLP-1 (7-36)酰胺或其組合。GLP-1的類似物是本領(lǐng)域已知的，將在下文中描述。如上所述，GLP-1源自高血糖素原基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。GLP-1的體內(nèi)主要來(lái)源是分泌GLP-1作為腸激素的腸L細(xì)胞。GLP-1的生物活性形式有:GLP-1-(6-37)、GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7_36) NH2。這些肽由高血糖素原分子的選擇性剪切造成。在某些實(shí)施方式中，還可使用長(zhǎng)度為4-7、7-10、10-13、13-16、16-19、19-22、22-25、25-28、28-31、31-34 或 34-37 個(gè)氨基酸的 GLP-1 片段。
[0148]在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可包括胰高血糖素樣肽2(GLP_2)或其片段或類似物。在一些實(shí)施方式中GLP-2可包括GLP-2 (1-33)、GLP_2 (3-33)或能夠刺激疾病預(yù)防因子表達(dá)或抑制疾病引發(fā)因子表達(dá)的任何其它片段或類似物。GLP-2的類似物是本領(lǐng)域已知的，將在下文中描述。在循環(huán)中，GLP-2以兩種分子形式GLP-2(l-33)和GLP-2 (3_33)存在。類似于GLP-1，活性形式GLP-2 (1-33)由蛋白酶DPPIV剪切成失活形式GLP-2 (3_33)。已顯示GLP-2在胃腸功能(消化、吸收、蠕動(dòng)、上皮生長(zhǎng)和血液流動(dòng))和骨再吸收的調(diào)節(jié)中起重要作用。因此，GLP-2或其類似物也許具有治療疾病(例如克羅恩氏病和骨質(zhì)疏松癥)的治療潛力。在某些實(shí)施方式中，還可使用長(zhǎng)度為4-7、7-10、10-13、13-16、16-19、19-22、22-25、25-28、28-31 或 31-33 個(gè)氨基酸的 GLP-2 片段。
[0149]在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是任何可轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可源自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可源自益生細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是選自各種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性家族的細(xì)菌，包括但不限于，埃希氏菌(Escherichia)、假單胞菌(Pseudomonas)、擬桿菌(Bacteroides)、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽抱桿菌(Bacillus)、變形桿菌(Proteus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒狀桿菌(Corynebacterium)。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是大腸桿菌菌株。在特定的實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是大腸桿菌Nissle或乳桿菌。
[0150]在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)核酸編碼可促進(jìn)宿主中正常生理過(guò)程功能的哺乳動(dòng)物因子，或者對(duì)預(yù)防非感染性疾病在所述宿主內(nèi)發(fā)作、建立或傳播方面有效。在一些實(shí)施方式中，所述宿主內(nèi)的非感染性疾病包括自體免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病、癌癥、心血管疾病或其組合。在一些實(shí)施方式中，所述非感染性疾病可包括糖尿病。在一些實(shí)施方式中，所述非感染性疾病可包括I型糖尿病。在一些實(shí)施方式中，所述非感染性疾病可包括2型糖尿病。
[0151]提供用于遞送生物活性化合物至腸上部腔(絨毛)側(cè)的方法。所述方法可包括提供生存于腸道且分泌生物活性化合物的共生細(xì)菌。所述方法避免手術(shù)的潛在缺陷或血流中的降解是來(lái)自腸中繁殖的共生細(xì)菌的分泌信號(hào)。
[0152]該方法允許信號(hào)連續(xù)表達(dá)或響應(yīng)局部刺激表達(dá)，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)腸黏膜而不是血液。實(shí)施方式可涉及包·含信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列能夠被所述重組細(xì)胞表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可導(dǎo)致治療性蛋白質(zhì)分泌至所述重組細(xì)胞的胞質(zhì)外。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列能夠調(diào)控靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列能夠響應(yīng)環(huán)境刺激而調(diào)控靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列和啟動(dòng)子在所述重組細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上編碼。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列和啟動(dòng)子在所述重組細(xì)胞的核酸上編碼。
[0153]在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是任何可轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是腸細(xì)菌或共生細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是益生細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是選自埃希氏菌(Escherichia)、假單胞菌(Pseudomonas)、擬桿菌(Bacteroides)、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽抱桿菌(Bacillus)、變形桿菌(Proteus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒狀桿菌(Corynebacterium)的細(xì)菌。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是大腸桿菌菌株。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可以是大腸桿菌Nissle。在一些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)核酸編碼促進(jìn)宿主中正常生理過(guò)程功能的哺乳動(dòng)物因子，或者對(duì)預(yù)防非感染性疾病在所述宿主內(nèi)發(fā)作、建立或傳播方面有效。在一些實(shí)施方式中，所述宿主內(nèi)的非感染性疾病包括癌癥、或自體免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病、心血管疾病或其組合。在一些實(shí)施方式中，所述非感染性疾病可包括糖尿病。在一些實(shí)施方式中，所述非感染性疾病可包括I型糖尿病。在一些實(shí)施方式中，所述非感染性疾病可包括2型糖尿病。
[0154]在一些實(shí)施方式中，重組細(xì)胞包含啟動(dòng)子和信號(hào)序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子。
[0155]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可包括GLP-1或其片段或類似物。在一些實(shí)施方式中，GLP-1的類似物可以選自他司魯泰(taspoglutide)、艾塞那肽(exenatide)、醋酸艾塞那肽(exendin-4)、利拉魯肽(Iiraglutide)、阿必魯泰(albiglutide)、(Val8)GLP_l、NN9924、CJC-1131、AVE010、LY548806、美國(guó)專利號(hào) 5，545，618 描述的類似物等。
[0156]在其它實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可包括胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)或其類似物。GLP-2是33個(gè)氨基酸的肽，與GLP-1共分泌自小腸和大腸中的腸內(nèi)分泌細(xì)胞。盡管血漿葡萄糖在給予嚙齒類動(dòng)物或人GLP-2后不變化，GLP-2的藥理學(xué)水平(比常規(guī)水平高約10倍)與胰高血糖素在正常人對(duì)象內(nèi)的禁食和餐后狀態(tài)中胰高血糖素的循環(huán)水平增加相關(guān)。GLP-2還以小腸和結(jié)腸的生長(zhǎng)因子形式起作用。所述信號(hào)序列是GLP-2的本文所公開(kāi)方法可用于治療疾病例如I型和2型糖尿病、肥胖相關(guān)糖尿病、化療誘導(dǎo)的腹瀉；炎性腸病、心室和心房纖顫、手術(shù)后器官衰竭、腸易激綜合癥、間質(zhì)性膀胱炎/膀胱痛綜合癥、短腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎、代謝綜合癥、克羅恩氏病、骨質(zhì)疏松癥，或可用于在任何類型的腸手術(shù)之后治療宿主。
[0157]GLP-2的類似物是本領(lǐng)域熟知的。在一些實(shí)施方式中，GLP-2的類似物選自脊椎動(dòng)物中天然出現(xiàn)的GLP-2和GLP-2的自然出現(xiàn)形式的類似物，GLP-2類似物引起促腸生長(zhǎng)效果且相對(duì)于給定脊椎動(dòng)物GLP-2在結(jié)構(gòu)上有變化，這是通過(guò)添加、刪除、替代至少一個(gè)氨基酸，或通過(guò)納入帶有保護(hù)基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。GLP-2的其它類似物描述于美國(guó)專利號(hào)5，834，428,5, 994，500，其通 過(guò)引用全文納入本文。
[0158]所述GLP-2的多種脊椎動(dòng)物形式包括例如大鼠GLP-2及其同源物，包括公牛GLP-2、豬GLP-2、八齒鼠GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、倉(cāng)鼠GLP-2、人GLP-2、虹鱒魚(yú)GLP-2和雞GLP-2，所述多種GLP-2的序列已被許多作者報(bào)道，包括Buhl等，J.Biol.Chem., 1988, 263(18):8621 ；Nishi 和 Steiner, Mol.Endocrinol., 1990, 4:1192-8 ；以及Irwin 和 Wong, Mol.Endocrinol.，1995,9(3): 267-77。脊椎動(dòng)物 GLP-2 的類似物可以使用肽化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成，并按照本文提供的指南評(píng)價(jià)其促腸生長(zhǎng)活性。本發(fā)明特別優(yōu)選的類似物是基于人GLP-2序列的那些類似物，所述人GLP-2序列如下:
[0159]His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-1le-Leu-Asp-Asn-Leu-AIa-Ala-Arg-Asp-Phe-1le-Asn-Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys-1le-Thr-Asp(SEQ ID NO:1)
[0160]其中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可由其它氨基酸殘基保守性取代，只要所述類似物仍保持促腸生長(zhǎng)活性，例如小腸生長(zhǎng)、胰島生長(zhǎng)和/或在脊椎動(dòng)物內(nèi)增加隱窩/絨毛高度。任何天然出現(xiàn)的GLP-2中保守取代優(yōu)選人GLP-2序列，定義為與以下五組內(nèi)的任意組交換:
[0161]1.Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
[0162]I1.Asn> Asp> Glu> Gln[0163]II1.His、Arg、Lys
[0164]IV.Met、Leu、He、Val、Cys
[0165]V.Phe> Tyr> Trp0
[0166]包括任何脊椎動(dòng)物GLP-2序列中氨基酸的非保守取代，前提是所述非保守取代出現(xiàn)在分離自不同物種的GLP-2中已知不同的氨基酸位置。非保守殘基位置通過(guò)比對(duì)所有已知脊椎動(dòng)物GLP-2序列即可簡(jiǎn)單測(cè)定(參見(jiàn)例如Buhl等，J.Biol.Chem.，1988，263(18):8621 ;Nishi 和 Steiner, Mol.Endocrinol.，1990，4:1192-8)。在一些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物中變化且可被非保守殘基取代的氨基酸位置可以是13、16、19、20、27和28位。脊椎動(dòng)物中變化且還可被非保守殘基取代的其它氨基酸殘基出現(xiàn)于2、5、7、8、9、
10、12、17、21、22、23、24、26、29、30、31、32和33位?；蛘撸潜Ｊ厝〈梢栽谌魏挝恢眠M(jìn)行，其中丙氨酸掃描突變顯示對(duì)于用丙氨酸取代氨基酸殘基的突變有一些耐受性并不破壞所有促腸生長(zhǎng)活性。丙氨酸掃描突變技術(shù)由Cunningham和Wells, Science, 1989, 244:1081描述，其通過(guò)引用全文納入本文。由于大多數(shù)GLP-2序列僅由約33個(gè)氨基酸構(gòu)成(人GLP-2中已在四個(gè)位置出現(xiàn))，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地按照下文實(shí)施例指導(dǎo)在各個(gè)剩余位置檢測(cè)丙氨酸類似物的促腸生長(zhǎng)作用。
[0167]通過(guò)比對(duì)脊椎動(dòng)物GLP-2的已知序列，已構(gòu)建出一個(gè)通式，所述通式考慮了這些GLP-2種類間顯著的序列同源性，以及已知種間不同的殘基。該式可用于指導(dǎo)選擇用于取代、添加、刪除或通過(guò)添加氨基酸保護(hù)基團(tuán)修飾的特定優(yōu)選非保守殘基。因此，與本發(fā)明的其中一個(gè)方面一致，本發(fā)明所包括脊椎動(dòng)物GLP-2的具體類似物是符合下面所示通式(SEQID NO:2)的那些脊椎動(dòng)物GLP-2和GLP-2類似物:
[0168]Rl-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-AsnThr-aa1-Leu-Asp-aa2-Leu-Ala-aa3-aa4 -Asp-Phe-1Ie-Asn-Trp-Leu-aa5-aa6-Thr-Lys-1Ie-Thr-Asp-[X]n-R2(SEQ ID NO:2)
[0169]其中，aa代表任何氨基酸殘基,aal至aa6是已知在獲自不同物種的多種GLP-2序列間不同的那些殘基位置，并且:
[0170]X是選自組III的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基，例如Arg、Lys或Arg-Arg
[0171]Y是選自組III的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基，例如Arg、Lys或Arg-Arg
[0172]m是O或 I;
[0173]η是O或 I;
[0174]Rl是H或N末端保護(hù)基團(tuán)；和
[0175]R2是OH或C末端保護(hù)基團(tuán)。
[0176]在本發(fā)明的若干實(shí)施方式中，aal至aa6定義如下:
[0177]Aal 選自組 IV:
[0178]aa2選自組I或組II;
[0179]aa3 選自組 I;
[0180]aa4 選自組 III;
[0181]aa5 選自組 IV ;
[0182]aa6選自組II或組III。
[0183]在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，aal至aa6選自已知在分離自不同物種的GLP-2中位置上出現(xiàn)的殘基，如下:
[0184]aal 是 Ile 或 Val;
[0185]aa2 是 Asn 或 Ser ；
[0186]aa3 是 Ala 或 Thr ;
[0187]aa4 是 Lys 或 Arg ；
[0188]aa5 是 Ile 或 Leu ;和
[0189]aa6 是 Gln 或 His。
[0190]人或大鼠的GLP-2僅在第19位氨基酸殘基上彼此不同。人序列中，該殘基是丙氨酸；在大鼠GLP-2中，第19位是蘇氨酸。因此，本發(fā)明包括的特定GLP-2或GLP-2類似物在第19位有可變殘基。在本發(fā)明的這些實(shí)施方式中，GLP-2肽符合下面所示的SEQ ID NO: 3:[0191 ] Rl-[Y]rn-Hi s-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-AsnThr-1Ie-Leu-Asp-A sn-Leu-Ala-aa3-Arg-Asp-Phe-1Ie-Asn-Trp-Leu-1Ie-Gln-Thr-Lys-1Ie-Thr-Asp-[X]n-R2(SEQ ID NO:3)
[0192]其中，aa3、Y、m、X、n、Rl和 R2 如上定義。
[0193]在其它實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可包含分泌肽或其類似物、片段或部分，包括但不限于GLP-1、PDX-U GIP、GLP-2、胰島素、生長(zhǎng)激素、促乳素、降鈣素、黃體生成激素、甲狀旁腺激素、促生長(zhǎng)素抑制素、促甲狀腺激素、血管活性腸多肽、三葉因子、細(xì)胞和組織修復(fù)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，采用反平行4α螺旋束結(jié)構(gòu)的第I結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子例如 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、GM-CSF,M-CSF、SCF、IFN- y、ΕΡ0、G-CSF, LIF、OSM、CNTF、GH、PRL 或 IFN α / β，通常與細(xì)胞表面相關(guān)的形成對(duì)稱同源三聚體且其亞基采用就某些病毒包被蛋白所述β膠狀輥構(gòu)型的第2結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子，例如TNF細(xì)胞因子家族，例如TNFa、TNFP、⑶40、⑶27或FAS配體，IL-1細(xì)胞因子家族、成纖維生長(zhǎng)因子家族、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P和神經(jīng)生長(zhǎng)因子，第3結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子，包括作為大型跨膜前體分子生成的各在胞外區(qū)域含有至少一個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域的短鏈α/β分子，例如上皮生長(zhǎng)因子家族細(xì)胞因子、以其所含氨基酸序列圍繞保守半胱氨酸殘基分組為特征的趨化因子(C-C或C-X-C趨化因子亞組)或胰島素相關(guān)細(xì)胞因子，顯示嵌合體結(jié)構(gòu)的第4結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子，例如由不同結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的調(diào)蛋白或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，所述結(jié)構(gòu)域例如EGF、免疫球蛋白樣和三環(huán)結(jié)構(gòu)域。這些分泌肽的生物活性類似物、片段和部分是本領(lǐng)域已知的。
[0194]在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子可以是葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子可以是fliC啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞還可包含分泌標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，所述分泌標(biāo)簽可以是fliC分泌標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，所述分泌標(biāo)簽可以是a-血溶素(HlyA)分泌標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞還可包含細(xì)胞穿透肽(CPP)序列。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞能夠表達(dá)所述信號(hào)序列為融合蛋白，所述融合蛋白包含由所述信號(hào)序列編碼的信號(hào)和由所述細(xì)胞穿透肽序列編碼的細(xì)胞穿透肽。
[0195]5.4.治療方法
[0196]提供治療疾病或紊亂的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法可包括向有病癥的宿主給予所述細(xì)胞，所述細(xì)胞有效刺激疾病預(yù)防因子表達(dá)或抑制疾病引發(fā)因子表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述疾病可以是自體免疫性疾病、癌癥、內(nèi)分泌疾病、代謝疾病、心血管疾病或其組合。
[0197]在一些實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂可以是(或包括)糖尿病(包括但不限于I型和2型糖尿病以及肥胖相關(guān)的糖尿病)、肥胖、代謝綜合癥、克羅恩氏病、苯丙酮尿癥、槭樹(shù)糖漿尿病、組氨酸血癥、高血糖癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、冠心病、毛細(xì)管間腎小球硬化癥、腎病、神經(jīng)病、四肢潰瘍或壞疽、動(dòng)脈粥樣硬化、高端固醇血癥、高血壓、高蛋白血癥、蛋白尿癥、骨質(zhì)疏松、貧血、高脂蛋白血癥、酮酸中毒、高甘油三酯血癥、乳酸性酸中毒、心肌病、威爾遜病、腦白質(zhì)病、巖藻糖苷病以及癌癥，例如胃腸癌、胃癌、膽囊癌、胃腸基質(zhì)腫瘤、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、化療誘導(dǎo)的腹瀉；炎性腸病、心室和心房纖顫、手術(shù)后器官衰竭、腸易激綜合癥、膀胱炎/膀胱痛綜合癥、短腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎或骨質(zhì)疏松癥。
[0198]本文公開(kāi)的方法還可用于在任何類型的腸手術(shù)后治療宿主。
[0199]如本文公開(kāi)方法所述待給予細(xì)胞的有效(或“治療上有效的”)量可以利用本領(lǐng)域已知的方法確定。所述有效量可以取決于所述不希望的生理狀況或疾病的程度、給藥途徑和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。例如，在不同的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞的有效量可以是至少約104CFU/kg，至少約105CFU/kg，至少約106CFU/kg或至少約107CFU/kg。在其它實(shí)施方式中，所述細(xì)胞的有效量是約IO4?1014CFU/kg、109?1012CFU/kg或101°?10nCFU/kg宿主體重。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞的有效量是約IX 101C1、2X 101C1、3X 101C1、4X 10'5X 101C1、6X 101C1、7X 101C1、8X 101C1、9X 101。或 10 X 1010CFU/kg 宿主體重。
[0200]例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述有效量可以如下計(jì)算。假設(shè)希望以約4.0 X IO11CFU/g的益生補(bǔ)充形式(若市售可得)給予8X101(lCFU/kg的量，并假設(shè)人體重范圍是兒童25kg?成人75kg,這意味著每日劑量是5?15g/d。然而，如果定殖效率比Ra0.S等人報(bào)道的高 2 個(gè)數(shù)量級(jí)(參見(jiàn) Rao, S.等.Toward a live microbial microbicide forHIV:Commensal bacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide (用于 HIV的活微生物殺微生物劑:分泌HIV融合抑制劑肽的共生細(xì)菌)；Proc Natl Acad SciUSA102, 11993-11998(2005))，那么所述劑量為50?150mg/d。在其它實(shí)施方式中，所述劑量是 10 ?100、100 ?200、 200 ?300、300 ?400、400 ?500、500 ?600、600 ?700、700 ?800,800 ?900、900 ?1000 或 1000 ?2000mg/d。
[0201]還提供用于將腸上皮細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法可包括給予包含啟動(dòng)子和信號(hào)序列的重組細(xì)胞的步驟。實(shí)施方式可以涉及通過(guò)給予包含啟動(dòng)子和信號(hào)序列的重組細(xì)胞來(lái)治療糖尿病的方法。在另一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可調(diào)控靶核酸的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可響應(yīng)環(huán)境刺激調(diào)控靶核酸的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列可以是GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、其片段、其類似物或其組合。在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)信號(hào)序列能夠刺激疾病預(yù)防因子表達(dá)或抑制疾病引發(fā)因子的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)境刺激可以是葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，所述疾病預(yù)防因子可以包括胰島素。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞的給予不會(huì)導(dǎo)致健康宿主內(nèi)的血液胰島素水平增高。
[0202]還提供用于降低血糖水平的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法可包括向需要的宿主給予有效量的重組細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法降低血糖水平使宿主具有血糖量正常的血糖水平。在一些實(shí)施方式中，所述方法在治療30天后使血糖水平降低約20%?約80%，約30%?約70%，或約40%?約60%。在所述宿主是高血糖癥患者的一些實(shí)施方式中，給予所述重組細(xì)胞減少或消除所述宿主對(duì)治療性給予外源胰島素的需求。在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞響應(yīng)所述宿主內(nèi)的葡萄糖水平。例如，在所述宿主葡萄糖水平僅略微升高的一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞發(fā)揮作用以僅降低葡萄糖水平，從而其達(dá)到血糖正常水平且不導(dǎo)致血糖不足。
[0203]還提供用于提高血液胰島素水平的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括向需要的宿主給予有效量的重組細(xì)胞。在些些實(shí)施方式中，所述提高血液胰島素水平的方法使所述宿主擁有血糖正常水平。在一些實(shí)施方式中，所述方法響應(yīng)葡萄糖提高血液胰島素水平。在一些實(shí)施方式中，所述方法在治療30天后使血液胰島素水平增加約20%?約80%，約30%?約70%，或約40%?約60%。
[0204]還提供用于重編程(或分化)腸細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞，例如，腸內(nèi)分泌細(xì)胞、潘納斯(paneth)細(xì)胞、吸收型腸上皮細(xì)胞或杯狀細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括向腸細(xì)胞給予或定位有效量的重組細(xì)胞。所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。所述方法還可包括向需要的宿主或患者給予所述重編程、分化或預(yù)處理的腸細(xì)胞。所述方法還可包括向需要的宿主或患者內(nèi)移植所述重編程、分化或預(yù)處理的腸細(xì)胞。
[0205]還提供用于重編程腸上皮細(xì)胞的方法。所述方法可相對(duì)更傳統(tǒng)的病毒介導(dǎo)方法有若干益處。不希望受理論限制，通過(guò)使用共生細(xì)菌來(lái)遞送GLP-1，舉例而言，可以避免GLP-1在引流腸黏膜的血管系統(tǒng)中被酶降解。GLP-1可從腔側(cè)直接穿透至腸隱窩而不暴露于血液。在所述腸隱窩中，腸干細(xì)胞發(fā)育成為4種腸上皮細(xì)胞。一種類型的腸上皮細(xì)胞即腸內(nèi)分泌細(xì)胞，分泌激素進(jìn)入脈管系統(tǒng)。不希望受理論限制，認(rèn)為腸內(nèi)分泌細(xì)胞在細(xì)菌分泌的GLP-1存在下成為胰島素分泌細(xì)胞。可以開(kāi)發(fā)所述細(xì)菌系使腸干細(xì)胞分化成為若干不同類型的細(xì)胞，基本替代可能在身體其它部位缺失的功能。示例包括β細(xì)胞外部(例如，a細(xì)胞)的其它胰腺功能，并甚至可能是甲狀腺、肝細(xì)胞或免疫響應(yīng)性功能。
[0206]在某些實(shí)施方式中，本文`公開(kāi)的重編程細(xì)胞的方法可以在體外使用以重編程細(xì)胞并使所述細(xì)胞增殖。隨后可以利用本領(lǐng)域已知的方法收獲所述重編程的細(xì)胞并將其給予(或植入)所述宿主。
[0207]5.5.診斷方法和應(yīng)用
[0208]在一些實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可與其它治療性化合物聯(lián)合給予。在具體的實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可與具有協(xié)同作用的化合物聯(lián)合給予。在其它實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞可與以下物質(zhì)共同給予:DPP-4抑制劑、GLP-2、GLP-1激動(dòng)劑、二甲亞砜、胰島素、α-葡萄糖苷酶抑制劑、普蘭林肽、美格列奈、瑞格列奈、那格列奈、氯磺丙脲、甲福明二甲雙胍、磺脲、格列甲嗪、格列本脲、格列美脲、噻唑烷二酮類、其片段、其類似物或其組合。DPP-4抑制劑的例子包括西他列汀、維格列汀、沙格列汀、利拉利汀、度格列汀、吉格列汀、阿格列汀、黃連素等。
[0209]例如，在一些方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如上定義的重組細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑，或有效量的含有如上所定義重組細(xì)胞的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物還可包含一種或多種穩(wěn)定劑。
[0210]在使用共生細(xì)菌的本文所公開(kāi)方法的實(shí)施方式中，額外的優(yōu)勢(shì)是，所述共生細(xì)菌作為益生菌通過(guò)至少100年的應(yīng)用已建立了安全性，這是病毒介導(dǎo)方法中所缺乏的。此外，如果需要，通過(guò)普通抗生素可容易地?fù)p毀共生細(xì)菌。使用共生細(xì)菌的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，它們能配備反饋環(huán)，使其準(zhǔn)確控制GLP-1分泌與特定腔信號(hào)(例如葡萄糖或IL-8) —致。此外，已顯示應(yīng)用GLP-1使腸上皮細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖，其對(duì)腸上皮細(xì)胞的胰島素劑量的控制大體上與健康個(gè)體中β細(xì)胞介導(dǎo)的胰島素控制方式相同。最后，使用共生細(xì)胞重編程腸上皮細(xì)胞可最終產(chǎn)生對(duì)I型、2型糖尿病和代謝綜合癥的簡(jiǎn)單、口服給藥且有效的治療。
[0211]5.6.給藥途徑和配制
[0212]本發(fā)明的重組細(xì)胞可以傳統(tǒng)方式通過(guò)使其保持活性的任何途徑給予。使所述重組細(xì)胞保持活性的有效途徑可以利用本領(lǐng)域已知的方法確定。所述重組細(xì)胞可以通過(guò)全身、局部或口服給予。例如，給藥途徑可以是但不限于胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮、口服、含服或經(jīng)眼途徑或陰道內(nèi)，通過(guò)吸入、積存注射或移植給藥。因此，本文所公開(kāi)用于所述重組細(xì)胞的給藥模型(單獨(dú)使用或與其它藥物聯(lián)用)可以是但不限于，舌下、可注射(包括短效的、長(zhǎng)效的、植入的、珠或團(tuán)粒形式經(jīng)皮下或肌肉內(nèi)注射)，或通過(guò)使用陰道乳膏、栓劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、直腸栓劑、子宮內(nèi)裝置和經(jīng)皮形式例如貼片或乳膏。
[0213]給藥的特 定模型將取決于所給指示。特定給藥途徑和劑量方案的選擇由臨床醫(yī)師根據(jù)臨床臨床已知方法來(lái)調(diào)整或滴定測(cè)量，以獲得最優(yōu)臨床響應(yīng)。待給予的重組細(xì)胞量是治療有效的量。用于給藥的劑量取決于接受治療的宿主的特征，例如，治療的具體動(dòng)物、年齡、體重、健康狀況、并行治療的類型(若有)，以及治療的頻率,這些可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，由臨床醫(yī)師)簡(jiǎn)單地確定。包含所述重組細(xì)胞和合適運(yùn)載體的藥學(xué)制劑可以是含有有效量所述重組細(xì)胞的以下劑型:固體劑型，包括但不限于，片劑、膠囊、扁囊劑、粒料、丸劑、粉劑和粒劑；局部劑型，包括但不限于溶液、粉劑、流體乳液、流體混懸液、半固體、軟膏、糊劑、乳膏、凝膠和膠凍，以及泡沫劑；胃腸外劑型，包括但不限于溶液、混懸液、乳劑、干粉。本領(lǐng)域也已知，所述活性成分可含在有藥學(xué)上可接受的稀釋劑、填充劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑、疏水載劑、水溶性載劑、乳化劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、保濕劑、增溶劑、防腐劑等的制劑中。本領(lǐng)域已知給藥方式和方法，并且技術(shù)人員可參考各種藥學(xué)參考文獻(xiàn)尋求指導(dǎo)。例如，可以查閱Modern Pharmaceutics (《現(xiàn)代藥劑學(xué)》)，Banker和Rhodes編，馬塞爾.德克爾公司(Marcel Dekker, Inc.) (1979)；以及Goodman&Gilman, s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics (《古德曼吉爾曼治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》)，第6版,紐約的麥克米蘭出版有限公司(MacMillan Publishing C0.)(1980),以及 Remington’s:The Science and Practice of Pharmacy (《雷明頓:藥物科學(xué)和實(shí)踐》)，第21版，馬里蘭州巴爾的摩市的利平科特.威廉姆斯.威爾金斯(Lippincottffilliams&ffilkins)公司。
[0214]所述重組細(xì)胞可以配制用于通過(guò)注射的胃腸外給藥，例如，通過(guò)推注注射或連續(xù)輸注。所述重組細(xì)胞可以通過(guò)皮下連續(xù)輸注約15分鐘?約24小時(shí)給藥。用于注射的制劑可以是單位劑型，例如，裝在安瓿或多劑量容器中，添加有防腐劑。該組合物可以是諸如油性或水性載劑中的懸浮液、溶液或乳劑的形式，可含有配方試劑，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
[0215]對(duì)于口服給藥，所述重組細(xì)胞可以通過(guò)組合這些重組細(xì)胞和本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受運(yùn)載體而容易地配制。[0216]所述載劑能使本發(fā)明重組細(xì)胞配制為例如片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、混懸液等，所述制劑由待治療的患者口服咽下。可通過(guò)以下方法獲得口服用途的藥物制劑:加入固體賦形劑，任選地研磨所得混合物，并在加入合適的輔助劑(如果需要)后加工該顆?；旌衔?，以獲得片劑或糖衣丸芯體。合適的賦形劑包括但不限于填充劑如糖(包括但不限于乳糖，蔗糖，甘露醇和山梨醇)；纖維素制劑(包括但不限于玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。需要的話，可加入崩解劑，例如但不限于交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽如藻酸鈉。
[0217]糖衣劑芯體能具有合適包衣。出于這種目的，可使用濃縮糖溶液，其可任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蝾伭霞尤肫瑒┗蛱且聞┌轮?，用于鑒別或表征活性重組細(xì)胞劑量的不同組合。
[0218]可口服使用的藥物制劑包括但不限于明膠制成的推入適配(push-fit)膠囊，以及明膠和增塑劑如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。推入適配膠囊可含有活性成分，該活性成分可與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉和/或潤(rùn)滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性重組細(xì)胞可溶解或懸浮于合適液體如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可加入穩(wěn)定劑。所有的口服給予制劑的劑量應(yīng)該適合該給藥方式。
[0219]就含服給藥而言，該組合物可采用例如常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。
[0220]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述制劑是控釋制劑。美國(guó)專利8，007，777 (Borek等，2011年8月30日)公開(kāi)了益生菌的控釋制劑的本領(lǐng)域已知示例。所述制劑可包含親水劑、電解劑和多糖，并且可以是用于口服遞送至腸系統(tǒng)的單層芯片劑形式。
[0221]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，噴霧干燥所述重組細(xì)胞并將所述干燥細(xì)胞用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法包封。優(yōu)選使所述細(xì)胞在包封前完全干燥。
[0222]其它優(yōu)選的給藥途徑和制劑可由技術(shù)人員通過(guò)參考標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)參考文獻(xiàn)的指導(dǎo)來(lái)確定。例如，Remington，s:The Science and Practice of Pharmacy (《雷明頓:藥物科學(xué)與實(shí)踐》)，第21版，馬里蘭州巴爾的摩市的利平科特.威廉姆斯.威爾金斯公司(2006)，第45?47章，，Chapters45-47,公開(kāi)了可以用于本文所公開(kāi)重組細(xì)胞和方法的合適口服固體劑型，藥學(xué)劑型的包衣以及延長(zhǎng)釋放和靶向藥物遞送系統(tǒng)。
[0223]就吸入給藥而言，使用合適推進(jìn)劑(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體)以加壓包裝或噴霧器中氣溶膠噴霧的形式常規(guī)遞送本發(fā)明使用的重組細(xì)胞。在加壓氣溶膠的情況下，可通過(guò)提供閥門(mén)遞送計(jì)量用量來(lái)以確定劑量單位。用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(例如，由明膠組成)可配制成含有所述重組細(xì)胞和合適粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0224]本發(fā)明的重組細(xì)胞也可配制成直腸組合物，例如栓劑或滯留灌腸劑，例如含有常規(guī)栓劑基料，如可可油或其他甘油酯。
[0225]除前述制劑外，所述重組細(xì)胞也可配制成長(zhǎng)效制劑。這種長(zhǎng)效制劑可通過(guò)植入(例如皮下或肌肉內(nèi)植入)或肌肉內(nèi)注射給藥。積存注射可以給藥約I?約6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。因此，例如，所述重組細(xì)胞也可用合適的聚合物材料或疏水材料(例如，溶于可接受油的乳劑)或離子交換樹(shù)脂配制，或者配制成微溶性衍生物(例如，微溶性鹽)。[0226]在經(jīng)皮給藥中，例如可將本發(fā)明的重組細(xì)胞施加至膏藥或可通過(guò)提供給生物體的經(jīng)皮治療系統(tǒng)應(yīng)用。
[0227]所述重組細(xì)胞的藥物組合物也能包括合適的固體或凝膠體相運(yùn)載體或賦形劑。所述運(yùn)載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素、衍生物、明膠和聚合物(例如，聚乙二醇)。
[0228]所述重組細(xì)胞還能與其它活性成分聯(lián)合給藥，所述活性成分例如佐劑、蛋白酶抑制劑或其它相容的藥物或重組細(xì)胞，其中觀察到所述聯(lián)合是所希望的或有利于達(dá)到本文所述方法的所需效果。
[0229]在一些實(shí)施方式中，所述崩解劑成分包括交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聚維酮、褐藻酸、海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、離子交換樹(shù)脂、基于食物酸和堿性碳酸鹽成分的泡騰系統(tǒng)、粘土、滑石、淀粉、預(yù)膠化淀粉、羥乙酸淀粉鈉、纖維素絮體、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、硅酸鈣、金屬碳酸鹽、碳酸氫鈉、檸檬酸鈣、或磷酸鈣中的一種或多種。
[0230]在一些實(shí)施方式中，所述稀釋成分包括甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糊精、山梨糖醇、木糖醇、粉末狀纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥乙基纖維素、淀粉、羧甲基淀粉鈉、預(yù)膠化淀粉、磷酸鈣、金屬碳酸鹽、金屬氧化物或金屬鋁硅酸鹽中的一種或多種。
[0231]在一些實(shí)施方式中，可選潤(rùn)滑劑成分(存在時(shí))包括硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、硬脂酰醇富馬酸鈉、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、甘油二十二烷酸酯、礦物油、植物油、石蠟、亮氨酸、硅石、硅酸、滑石、丙二醇脂肪酸酯、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇、聚丙二醇、聚亞烷基二醇、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙氧基化植物油或氯化鈉中的一種或多種。
·[0232]通過(guò)說(shuō)明的方式，而非限制性方式提供以下實(shí)施例。
6.實(shí)施例
[0233]6.1.實(shí)施例1:大腸桿菌Nissle中的GLP-1組成型表達(dá)
[0234]該實(shí)施例顯示大腸桿菌Nissle中的GLP-1組成型表達(dá)。
[0235]質(zhì)粒構(gòu)建:所有克隆使用前述技術(shù)進(jìn)行(Sambrook, J.和Russell.D.W.Molecularcloning:a laboratory manual (《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》).第三版，紐約冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)實(shí)出版社(Cold Spring Harbor Laboraory Press) ;2001年)。圖1顯示該研究中所用質(zhì)粒的示意圖。為研究來(lái)自大腸桿菌DH5a的P0/P1啟動(dòng)子，制備兩種質(zhì)粒(pFDl和pFD2)。pFDl編碼完整P0/P1區(qū)域以驅(qū)動(dòng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)。pFD2僅編碼EGFP上游啟動(dòng)子的PO區(qū)域。為就刺激Caco-2細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌測(cè)試重組細(xì)菌的促胰島素蛋白的分泌功效，如本文所述構(gòu)建質(zhì)粒pFD-PDX、pFD-GLP和pFD_20。圖2顯示PO和P0/P1對(duì)葡萄糖的響應(yīng)。利用EGFP表達(dá)來(lái)測(cè)量PO和/或Pl啟動(dòng)子對(duì)不同介質(zhì)條件的響應(yīng)。Po=僅PO ；P0+P1=P0加Pl側(cè)接區(qū)域；DH5 a =Iac操縱子對(duì)照。為了測(cè)試所述葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子系統(tǒng)響應(yīng)葡萄糖生成重組蛋白的功效，將來(lái)自大腸桿菌DH5 α的兩種長(zhǎng)度的葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子區(qū)TA克隆進(jìn)入pGlow-GFP下游，并與GFP同框(結(jié)果示于圖2)。所述由PO啟動(dòng)子或覆蓋PO和Pl啟動(dòng)子的區(qū)域組成的2個(gè)構(gòu)建體(Ryu，S.和Garges，S.Promoter Switch in the Escherichia coli Pts Operon(大腸桿菌Pts操縱子中的啟動(dòng)子開(kāi)關(guān)).Journal of Biological Chemistry269, 4767-4772 (1994))與所述 GFP 起始區(qū)域同框且在其上游。簡(jiǎn)而言之，將來(lái)自大腸桿菌DH5a基因組DNA的PO區(qū)克隆至pGLOW-GFP (力口利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen))，以制備(pFD2)。將P0/P1區(qū)克隆至pGLOW-GFP,以制備pFDl。為了在Nissle中表達(dá)哺乳動(dòng)物PDX-1基因。如下所述構(gòu)建質(zhì)粒pFD-PDX。使用兩輪高保真PCR(加利福尼亞州拉霍亞的司查塔基公司(Stratagene))獲得表達(dá)盒6XHis-Xpress-EK-PDX-l-CPP。通過(guò)高保真PCR從DH5 α獲得全長(zhǎng)FLIC。將這兩個(gè)片段克隆進(jìn)入 pBluescript-KS 以生成 6XHiS-Xpress-EK-PDX-l-CPP_FLIC。然后，將所述6XHiS-Xpress-EK-PDX-l-CPP-FLIC 片段克隆到 pGLOW-PO_GFP 內(nèi)以生成載體(pFD-PDX)，所述載體使用大腸桿菌的PO啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)6XHiS-Xpress-EK-PDX-l-CPP-FLIC表達(dá)。
[0236]為在大腸桿菌Nissle中組成型表達(dá)蛋白GLP-1，如下所述構(gòu)建質(zhì)粒pFD_GLP。合成制備(IDT，愛(ài)荷華州科拉爾維爾市)序列6XHiS-Xpress-EK-GLP-l (1-37)。通過(guò)高保真PCR 將該片段插入 pBluescript-KS,以制備 pBluescript-GLP。
[0237]使用高保真PCR 將 pKS104 的 5’ UTR-FLIC20 序列克隆至 pBluescript-GLP 內(nèi)，生成 pBluescipt-20-GLP。該所得載體包含以下序列 5’ UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK-GLP_l(1-37)。通過(guò)高保真PCR將該序列克隆至pKS121內(nèi)(含有FLIC的3’UTR)以獲得構(gòu)建體:5，UTR-FLIC20-6XHis-Xprcss-EK-GLP-l(1-37)-3，UTR。
[0238]為獲得ρΠ)-20，使用高保真PCR克隆來(lái)自pH)-GLP的5’ UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK序列。將所述PCR片段克隆至pKS121內(nèi)以獲得構(gòu)建體:5，UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK。從芬蘭赫爾辛基大學(xué)的 Benita Westerlund-Wikstroni實(shí)驗(yàn)室獲得PKS104和pKS121。然而，pKS104和pKS121的序列也可以從市售來(lái)源獲得，或使用常規(guī)方法直接從基因組獲得(例如，從GenBank下載的序列，http://www.ncb1.nlm.nih.rov/Renbank)并使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建。
[0239]6.2.實(shí)施例2:改造大腸桿菌以分泌GLP-1或TOX-l-CPP [0240]大腸桿菌Nisslel917(非處方益生菌，在下文中稱作Nissle)改造成在f IiC啟動(dòng)子控制下分泌GLP-1(氨基酸I?37)或在葡萄糖響應(yīng)性元件控制下分泌I3DX-1-CPP JDX-1作為與細(xì)胞穿透肽(CPP)的融合體分泌，以促進(jìn)快速進(jìn)入所述分泌后的上皮細(xì)胞。PDX-1在葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子元件的控制下分泌，幾乎沒(méi)有觀察到所述啟動(dòng)子元件的泄露表達(dá)。細(xì)胞生長(zhǎng)6?8h，標(biāo)準(zhǔn)化至600nm的光密度(1)，并離心。圖3顯示Nissle上清和Nissle細(xì)胞團(tuán)中分泌蛋白GLP-1 (上方印跡)和I3DX-1-CPP (下方印跡)的Western印跡。參考圖3，裂解所述團(tuán)塊，并測(cè)定各個(gè)蛋白的量(“C”部分)。保存上清并對(duì)其作類似分析(“M”部分)。對(duì)于表達(dá)rox-1-cpp的細(xì)胞，比較生長(zhǎng)于含葡萄糖(0.4%)或甘油三酯(0.4%)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞。使用表達(dá)空質(zhì)粒(20)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。從這些數(shù)據(jù)明顯可見(jiàn)，兩種蛋白都有分泌。
[0241]6.3.實(shí)施例3:改造成分泌GLP-1或TOX-1-CPP的大腸桿菌Nissle的胰島素分泌誘導(dǎo)
[0242]該實(shí)施例顯示改造成分泌GLP-1或I3DX-1-CPP的大腸桿菌Nissle的胰島素分泌誘導(dǎo)
[0243]為測(cè)試改造的Nissle菌株是否能誘導(dǎo)人上皮細(xì)胞分泌胰島素，用來(lái)自表達(dá)PDX-1-CPP.GLP-1或20個(gè)氨基酸序列標(biāo)簽(作為陰性對(duì)照)的Nissle菌株過(guò)夜培養(yǎng)物的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基(CFM)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞。所述過(guò)夜培養(yǎng)物在無(wú)葡萄糖的F-12K培養(yǎng)基(弗吉尼亞州馬納薩斯的Mediatech)(除了 PDX-1菌株，該菌株需要葡萄糖來(lái)生成Η)Χ_1)中生長(zhǎng)。在無(wú)葡萄糖的新鮮F-12K培養(yǎng)基和來(lái)自Nissle過(guò)夜培養(yǎng)物的CFM的1:1混合物中培養(yǎng)所述 Caco-2 細(xì)胞 16 小時(shí)(所述 Nissle 分泌 PDX-1-CPP ( “P”)、GLP_1( “G”)、20 個(gè)氨基酸序列標(biāo)簽(“20”)或PDX-1-CPPCFM和GLP-1CFM的1:1組合物(“GP”))，然后移去培養(yǎng)基，所述Caco-2細(xì)胞在含葡萄糖(0.4%)或甘油三酯(0.4%)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)。在葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)后，分析各樣品的胰島素分泌和轉(zhuǎn)錄。作為陽(yáng)性對(duì)照，Caco-2細(xì)胞在新鮮F-12K培養(yǎng)基(無(wú)葡萄糖)中孵育相同16小時(shí)的時(shí)間段從而取得GLP-1 (氨基酸1_37)，然后用葡萄糖(0.4%)或甘油三酯(0.4%)培養(yǎng)2小時(shí)。
[0244]轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都指示，用GLP-1和H)X-1-CPP共同或單獨(dú)來(lái)源的CFM孵育的人上皮細(xì)胞經(jīng)刺激生成胰島素(圖4A-B)。采用GLP-1 (氨基酸1_37)CFM孵育一直觀察到最大胰島素生成。不論H)X-1-CPPCFM是單獨(dú)添加還是與GLP-1 —起添力口，rox-l-cpp CFM都刺激葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌。GLP-1-和TOX-1-介導(dǎo)的胰島素分泌都響應(yīng)葡萄糖而發(fā)生。用來(lái)自20個(gè)氨基酸序列標(biāo)簽的CFM過(guò)夜培養(yǎng)的陰性對(duì)照上皮細(xì)胞不顯示葡萄糖響應(yīng)性胰島素生成(圖4A-B)。I3DX-1-CPP處理導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞中葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌(圖4A-B)是意料之外的。
[0245]就IO6?IO9CFU mL范圍的Nissle存活力水平而言,估計(jì)血液中的胰島素水平為164fmol/L?164pmol/L。成人非糖尿病患者得到的餐后血清胰島素濃度高達(dá)400pmol/L，未優(yōu)化的改造細(xì)菌能夠刺激與正常代謝所需至少相同數(shù)量級(jí)的胰島素釋放。
[0246]6.4.實(shí)施例4:使腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞
[0247]該實(shí)施例顯示使腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞。
[0248]使用前述fliC啟動(dòng)子和分泌標(biāo)簽改造Nissle使其分泌GLP-1 (1-37)。
[0249]圖5中顯示插入Nissl e的盒。
[0250]在該菌株培養(yǎng)中驗(yàn)證GLP-1的分泌，并與攜帶含有相同序列但不帶pKD3染色體插入盒(圖5)的質(zhì)粒的菌株分泌作比較。Nissle-GLP-1的分泌量是攜帶質(zhì)粒菌株的約一半，而體內(nèi)測(cè)試顯示在用任一菌株處理的小鼠之間的葡萄糖水平?jīng)]有顯著差異(圖6)。因此，在這些研究中使用Nissle-GLP-1替代攜帶質(zhì)粒上GLP-1的菌株。喂食Nissle-GLP-Ι的小鼠顯示重組蛋白的顯著體內(nèi)表達(dá)(由組氨酸標(biāo)簽染色測(cè)定)(圖5)。
[0251]為研究簡(jiǎn)單口服給藥改造成分泌GLP-1的人共生細(xì)菌菌株是否能夠通過(guò)使腸細(xì)胞重編程成為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌型細(xì)胞來(lái)改善I型糖尿病小鼠模型中的高血糖癥，每天用改造成分泌GLP-1 (1-37)的共生細(xì)菌(Nissle-GLP-Ι)喂食經(jīng)鏈脲霉素(鏈佐星，Zanosar?) (STZ)處理的小鼠。Nissle-GLP-Ι在葡萄糖耐量測(cè)試中顯著降低小鼠血糖水平，并顯著增加了胰島素水平。用Nissle-GLP-Ι喂食的健康(非糖尿病)小鼠的血糖水平或重量沒(méi)有變化。用Nissle-GLP-1處理的小鼠的腸上部絨毛中發(fā)展出了胰島素分泌細(xì)胞。胰島素分泌細(xì)胞與嗜鉻粒蛋白A(Chr-A)的免疫共染色顯示細(xì)菌介導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞重編程為“β_樣”細(xì)胞。這些結(jié)果證明，用于治療或改善I型糖尿病的方法(所述方法包括給予改造成分泌GLP-1的人共生細(xì)菌菌株)能夠以花費(fèi)很低的口服方式實(shí)行。
[0252]6.5.實(shí)施例5:用表達(dá)GLP-1的大腸桿菌Nisslel917細(xì)菌處理鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠[0253]該實(shí)施例描述用表達(dá)GLP-1的大腸桿菌Nisslel917細(xì)菌處理鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的示范性方法。
[0254]對(duì)鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)患糖尿病的6?8周齡雄性小鼠(C57B6)喂食表達(dá)帶有細(xì)胞穿透肽的GLP-1 (STZ+GLP)或表達(dá)20個(gè)氨基酸序列(STZ-載體)的大腸桿菌Nisslel917細(xì)菌。“對(duì)照”小鼠不用STZ處理。根據(jù)圖7，在STZ處理之后且在用Nissle細(xì)菌喂食STZ處理的小鼠之前，“Nissle前”檢測(cè)顯示血糖水平顯著升高。所有細(xì)菌喂食在30天后停止。在細(xì)菌喂食起始的60天后再次檢測(cè)血糖(“60天”)。值代表4只小鼠的平均值。誤差棒代表I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，P值來(lái)自斯氏t檢驗(yàn)(n=4)。結(jié)果顯示喂食GLP-1分泌型細(xì)菌的糖尿病小鼠在處理30天后恢復(fù)至血糖正常水平。令人意外的是，這些小鼠在未受任何處理的額外二十天中保持血糖正常水平。
[0255]這些小鼠的解剖和免疫組化指示，它們的腸組織中有高胰島素水平(相比于僅喂食分泌隨機(jī)肽序列的共生細(xì)菌的對(duì)照)(圖8A-B)。參見(jiàn)圖8A，高濃度胰島素以箭頭表示。
[0256]6.6.實(shí)施例6:用表達(dá)GLP-1的大腸桿菌Nisslel917細(xì)菌處理I型糖尿病小鼠
[0257]該實(shí)施例描述用表達(dá)GLP-1的大腸桿菌Nisslel917細(xì)菌處理I型糖尿病小鼠的示范性方法。
[0258]為測(cè)定Nissle-GLP-Ι對(duì)I型糖尿病(TlDM)的作用，建立TlDM的STZ小鼠模型。用高劑量的STZ處理C57BL/6J (B6)雄性小鼠，然后，高血糖癥發(fā)作(隨機(jī)葡萄糖水平>350mg/dL)的小鼠用Nissle-GLP-UNissle喂食或不予處理。共生細(xì)菌的喂食一天實(shí)行兩次，間隔約8h。作為正常血糖量對(duì)照，一組小鼠不接受STZ處理也不喂食共生細(xì)菌(對(duì)照)。監(jiān)控超過(guò)80天的小鼠隨機(jī)葡萄糖水平(圖9B)和重量(圖9C)。檢測(cè)β細(xì)胞量(圖9Α)。單獨(dú)Nissle喂食相較于不給予共生細(xì)菌的STZ處理小鼠對(duì)隨機(jī)血糖水平無(wú)顯著影響(圖9Β)。然而，喂食Nissle-GLP-1的小鼠在開(kāi)始喂食16天內(nèi)顯示顯著較低的隨機(jī)血糖水平。
[0259]本研究中任何小鼠的體重間`沒(méi)有顯著差異，在所述80天時(shí)間段間的任何小鼠都無(wú)顯著增重。
[0260]在共生細(xì)菌處理89天后，對(duì)小鼠實(shí)行葡萄糖耐量測(cè)試。使它們禁食10h，然后用葡萄糖1.P注射。葡萄糖注射后的1.5h每30分鐘檢測(cè)血液胰島素和葡萄糖水平(分別示于圖9D和9E)。在0.5和1.5h，顯示Nissle-GLP-Ι喂食小鼠和僅STZ處理小鼠之間胰島素水平的顯著差異。在任何時(shí)間點(diǎn)，Nissle GlP-1喂食小鼠和未接受任何處理的對(duì)照小鼠之間的胰島素水平無(wú)顯著差異(圖9D)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，所有4組小鼠間的血糖水平有顯著差異。在所述葡萄糖耐量測(cè)試中，顯示Nissle-GLP-1喂食小鼠的血糖水平低于僅STZ處理小鼠血糖水平的50% ;但其血糖水平為不予STZ處理的對(duì)照小鼠的兩倍(圖E)。有趣的是，盡管在葡萄糖注射之前(時(shí)間=O)Nissle處理小鼠與STZ處理小鼠在血糖水平方面無(wú)顯著差異，葡萄糖注射后lh，顯示Nissle處理小鼠的血糖水平比STZ處理小鼠低約33%。
[0261]就胰島素是否存在對(duì)小鼠的腸進(jìn)行免疫染色(圖10A-F)。在用Nissle-GLP-Ι處理的小鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)含胰島素的細(xì)胞口袋，但本研究中所用的任何其它小鼠皆無(wú)此發(fā)現(xiàn)。顯示這些口袋的相對(duì)頻率(圖10A-B)。就總上皮細(xì)胞量的百分比而言，估計(jì)所述口袋所含的量低于1%(圖10B)。STZ能有效引起期望的TlDM反應(yīng)，STZ處理小鼠的β細(xì)胞量顯著較低(圖9Α)，而其血液葡萄糖和胰島素水平也與TlDM —致(圖9Β、D、Ε)。所有STZ處理小鼠的β細(xì)胞量等量減少指示，Nissle-GLP-1喂食小鼠中胰島素增加或較低血糖的機(jī)制不是胰腺β細(xì)胞再生。
[0262]為測(cè)定哪種類型的腸上皮細(xì)胞(潘納斯(paneth)細(xì)胞、吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞或腸內(nèi)分泌細(xì)胞)可能已被重編程而成為含胰島素的細(xì)胞，用針對(duì)來(lái)自所述4種細(xì)胞類型中每一種的代表性蛋白的抗體將細(xì)胞共染藍(lán)色，所述代表性蛋白分別是:潘納斯(paneth)細(xì)胞的N0D-2、杯狀細(xì)胞的黏液素-2(MUC-2)、吸收細(xì)胞的蔗糖異麥芽糖酶(SI)以及腸內(nèi)分泌細(xì)胞的嗜鉻素A(Chr-A)。NOD-2、MUC-2或SI未見(jiàn)重疊染色(分別示于圖10C、D和E)。然而，Chr-A出現(xiàn)了胰島素的重疊染色(圖10F)。小鼠腸的免疫染色顯示喂食Nissle-GLP-1的小鼠(圖10A)內(nèi)有包含胰島素的細(xì)胞，而喂食Nissle的小鼠或?qū)φ招∈?圖10B)內(nèi)無(wú)包含胰島素的細(xì)胞。用針對(duì)來(lái)自所述四種類型腸細(xì)胞中每一種的代表性蛋白的抗體共染提示，這些細(xì)胞系與腸內(nèi)分泌細(xì)胞相關(guān)聯(lián)(圖10F)。預(yù)期該結(jié)果，因?yàn)橄蜓悍置诩に厥悄c內(nèi)分泌細(xì)胞而非其它三種細(xì)胞類型的正常功能。也給健康小鼠(未經(jīng)STZ處理)喂食Nissle和Nissle-GLP-1，然而它們的血糖水平與沒(méi)有喂食共生細(xì)菌的那些健康小鼠無(wú)顯著差異(圖11A-B)。這些結(jié)果指示，在處理和未處理的健康小鼠(對(duì)照)之間94天時(shí)間過(guò)程中的隨機(jī)小鼠血糖水平?jīng)]有顯著變化(圖11A)。在這段時(shí)間中，小鼠重量也沒(méi)有差異(圖11B)。考慮指示喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠血糖或體重?zé)o變化的數(shù)據(jù)(圖11)和指示Nissle-GLP-1能顯著減低血糖水平的數(shù)據(jù)，總體情況便是針對(duì)糖尿病的有效且安全的潛在治療之一:其是葡萄糖響應(yīng)，胰島素動(dòng)力學(xué)與非糖尿病系統(tǒng)相似(圖9D)。BP,Nissle-GLP-1喂食小鼠內(nèi)胰島素水平變化發(fā)生的時(shí)間與健康小鼠相同，盡管程度較小。
[0263]這些數(shù)據(jù)表明，給糖尿病小鼠喂食Nissle-GLP-Ι可導(dǎo)致葡萄糖響應(yīng)性胰島素生成，使血糖水平顯著降低。不希望受理論限制，胰島素分泌的機(jī)制似乎來(lái)自重編程的腸細(xì)胞口袋。這些口袋除了胰島素外還表達(dá)Chr-A，表明它們來(lái)自腸內(nèi)分泌細(xì)胞。當(dāng)結(jié)合來(lái)自喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠的結(jié)果來(lái)考慮時(shí)，所述證據(jù)表明即使向非糖尿病給予該處理也是安全的。
[0264]6.7.實(shí)施例7:GLP-1在 染色體修飾的大腸桿菌Nissle與含質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle中的表達(dá)
[0265]該實(shí)施例描述GLP-1在經(jīng)染色體修飾與含質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle中表達(dá)的比較
[0266]改造細(xì)菌從而維持GLP-1表達(dá)無(wú)需選擇壓力。在菌株比較中，發(fā)現(xiàn)來(lái)自染色體修飾的Nissle的分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中的GLP-1相對(duì)濃度少于分泌自質(zhì)粒中表達(dá)GLP-1的Nissle。然而明顯地,在體內(nèi)，染色體中表達(dá)GLP-1的Nissle和質(zhì)粒中表達(dá)GLP-1的Nissle同樣有效(圖5)。細(xì)菌培養(yǎng)物中GLP-1的分泌量和體內(nèi)降低的血糖水平間缺乏相關(guān)性的原因可能有幾種。在喂食Nissle、質(zhì)粒中表達(dá)GLP-1的Nissle或Nissle-GLP-Ι的各菌株的小鼠腸內(nèi)Nissle存活力檢測(cè)顯示沒(méi)有差異(圖12)。GLP-1在腸黏膜內(nèi)的穩(wěn)定性可能已經(jīng)受到黏膜蛋白酶的影響，導(dǎo)致有效轉(zhuǎn)運(yùn)遠(yuǎn)低于分泌速率。也有可能是小鼠腸內(nèi)不太理想的生長(zhǎng)條件(pH、營(yíng)養(yǎng)物等)(Nissle是人益生菌)導(dǎo)致任一菌株的基因表達(dá)不太理想。
[0267]葡萄糖響應(yīng)測(cè)試中的胰島素分泌動(dòng)力學(xué)顯示Nissle-GLP-Ι喂食小鼠與對(duì)照小鼠類似(圖9D);盡管所有用STZ處理的小鼠中的血糖降低有所延遲(圖9E)。然而，喂食Nissle的小鼠顯示與對(duì)照小鼠相同的動(dòng)力學(xué)。該結(jié)果是意料之外的，并可通過(guò)其它機(jī)制解釋。同樣意料之外的是，在葡萄糖響應(yīng)測(cè)試中喂食Nissle的小鼠與僅STZ處理的小鼠相比血糖降低更快(圖9E)。這提示單一 Nissle的保護(hù)水平。雖然該保護(hù)作用在隨機(jī)葡萄糖水平中不明顯，其似乎使血糖峰作用減少。由于葡萄糖是1.P.注射的，可以排除腸葡萄糖的細(xì)菌消耗是可能機(jī)制。
[0268]6.8.實(shí)施例8:喂食Nissle對(duì)血糖水平的影響
[0269]該實(shí)施例證明喂食Nissle對(duì)小鼠內(nèi)血糖水平的影響。
[0270]在實(shí)驗(yàn)起始，用STZ喂食小鼠5天(40mg/kg體重)(STZ處理于“STZ終止”處結(jié)束)。在隨機(jī)血糖水平持續(xù)高于300mg/dL發(fā)生后，對(duì)小鼠開(kāi)始Nissle處理，包括用自表達(dá)假質(zhì)粒的Nissle (STZ+載體)、從相同質(zhì)粒表達(dá)GLP-1 (1-37)的Nissle (STZ+GLP)處理或不處理也不采用STZ (對(duì)照)。喂食在時(shí)間線上標(biāo)記為“Nissle開(kāi)始”。Nissle每天喂食兩次，直至區(qū)分“Nissle停止”標(biāo)記的時(shí)間。小鼠在這一點(diǎn)基本上被擱置(在常規(guī)照料之外)直至區(qū)分“Nissle —次”的時(shí)間。在那個(gè)點(diǎn)上，檢測(cè)血糖水平并給小鼠喂食一次Nissle。然后，擱置小鼠，直至檢測(cè)血糖的最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。參見(jiàn)圖13。顯示平均值(n=3)，誤差棒代表I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0271]給非肥胖糖 尿病(NOD)小鼠每天喂食兩次單獨(dú)Nissle、染色體表達(dá)GLP-1 (1-37)的Nissle或不予處理。小鼠在剛要檢測(cè)血糖之前禁食4小時(shí)。參考圖14，時(shí)間表示處理開(kāi)始后的天數(shù)。顯示平均值(η至少=3)，誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值來(lái)自斯氏t檢驗(yàn)。
[0272]圖15顯示操作所述重組細(xì)胞的可能方法。左:腔B中在黏膜M內(nèi)側(cè)和上側(cè)含有細(xì)菌的正常腸隱窩。腸內(nèi)分泌細(xì)胞(E)分泌激素進(jìn)入固有層(LP)和脈管系統(tǒng)V。右:本文實(shí)施方式的重組細(xì)胞(EB)分泌GLP-1 (從EB出現(xiàn)的點(diǎn))進(jìn)入所述腸腺以使早期腸內(nèi)分泌細(xì)胞重編程為胰島素分泌細(xì)胞(RE)。然后在響應(yīng)葡萄糖時(shí)分泌胰島素(Ins，標(biāo)星)進(jìn)入血流。
[0273]不希望受理論限制，認(rèn)為使用重組共生菌株以及簡(jiǎn)單的口服劑量給藥、無(wú)顯著背景表達(dá)和葡萄糖響應(yīng)性，可通過(guò)替代宿主胰島合成來(lái)顯著減少或甚至消除對(duì)胰島素注射的需求，并能協(xié)助減少由糖尿病顯示的長(zhǎng)期并發(fā)癥。
[0274]6.9.實(shí)施例9:用于GLP-1研究的原始及新構(gòu)建體序列
[0275]根據(jù)本文公開(kāi)的方法可以使用以下構(gòu)建體。
[0276]用于實(shí)施例1-11的原始Nissle-GLP-Ι構(gòu)律體
[0277](FliC 啟云力子)—Flic2Q-6xhis-xpress-EK 位-glp-l (1-37) -cpp
[0278]atggcacaagtcattaataccaacagcctctcgctgatcactcaaaataatatcaacaagATGCATCATCATCATCATCACGGATCCGATCTGTACGACGATGACGATAAGCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAtgcggtggcggttacggccgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcTAA(SEQ ID NO:4)
[0279]其中:FliC20:
[0280]ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATA TCAACAAG (SEQ IDNO:5)
[0281]6XHis:ATGCATCATCATCATCATCACGGArCC(SEQ ID NO:6)
[0282]Xpress:GATCTGTAC
[0283]EK 位:GACGATGACGATAAG(SEQ ID NO:7)
[0284]GLPl(1-37):
[0285]CACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGG CCGAGGA(SEQ ID NO:8)[0286]CPP:TGCGGTGGCGGTTACGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGCCGTCGCTAA(SEQ ID NO:9)
[0287]可用的另一個(gè)啟動(dòng)子Nissle-GLP-1構(gòu)律體
[0288]LPP 啟動(dòng)子一-5’ UTR-Flic20-6xhis-xpress-EK 位-GLP-1 (1-37)-CPP—3’ UTR
[0289]TGCATGCATccatcaaaaaaataTTCTCAacataaaaaactttgtgtAATACTCAGGGTTGACGGCGATTGAGCCGACGGGTGGAAACCCAATACGTAATCAACGACTTGCAATATAGGATAACGAATCatggcacaagtcattaataccaacagcctctcgctgatcactcaaaataatatcaacaagctcgagCATCATCATCATCATCACGGATCCGATCTGTACGACGATGACGATAAGCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAtgcggtggcggttacggccgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcTAATCGTCGTAAACTGATTAACTGAGACTGACGGCAACGCCAAATTGCCTGATGCGCTGCGCTTATCAGGCCTACAAGGTGAATTGCAATTTATTGAATTTGCACATTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGCCGCATCCGGCAACATGAATGGTAATTTGTCAGCAACGTGCTTCCCCGCCAACGGCGGGGTTTTTTCTGCCCGCAATTTACCGATAACCCCCAAATAACCCCTCATTTCACCCACTAATCGTCCGATTAAAAACCCTGCAGAAACGGATAATCATGCCGATAACTCATATAACGC(SEQ ID NO:10)
[0290]其中:
[0291]LPP 啟動(dòng)子:
[0292]TGCATGCATCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATAC T(SEQ ID NO:11) [0293]5，UTR:
[0294]CAGGGTTGACGGCGATTGAGCCGACGGGTGGAAACCCAATACGTAATCAACGACTTGCAATATAGGATAACGAATC(SEQ ID NO:12)
[0295]FliC20:
[0296]ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATA TCAACAAG (SEQ IDNO:13)
[0297]6XHis:ATGCATCATCATCATCATCACGGArCC(SEQ ID NO:14)
[0298]Xpress:GATCTGTAC
[0299]EK 位:GACGATGACGATAAG(SEQ ID NO:15)
[0300]GLPl(1-37):
[0301]CACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGG CCGAGGA(SEQ ID NO:16)
[0302]CPP:TGCGGTGGCGGTTACGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGCCGTCGCTAA(SEQ ID NO:17) [0303]3， UTR:TCGTCGTAAACTGATTAACTGAGACTGACGGCAACGCCAAATTGCCTGATGCGCTGCGCTTATCAGGCCTACAAGGTGAATTGCAATTTATTGAATTTGCACATTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGCCGCATCCGGCAACATGAATGGTAATTTGTCAGCAACGTGCTTCCCCGCCAACGGCGGGGTTTTTTCTGCCCGCAATTTACCGATAACCCCCAAATAACCCCTCATTTCACCCACTAATCGTCCGATTAAAAACCCTGCAGAAACGGATAATCATGCCGATAACTCATATAACGC(SEQ ID NO:18)
[0304]乳桿菌構(gòu)律體
[0305]TAA-SLPAP-RBS-ATG-USP45-LEISS-6XHIS-EK-GLP(l-37)-CPP-TAA-TAA-TERM667
[0306]TAACCCGGGGGGAGTATAACAGAAACCTTAAGGCCCGACCGCTTGACAAGGGCGCGTGAGGTTTTTACGATAGCGCCGGATGCGGGGAAAAAGGGCTCCTTTTGGGGGGTTTTCCCCGCACCGGGCGGACCTGGGCGGAGagGAAACGcgGCAACTCGCCCGTCTCGGGTTCCCGCCCACGACCCTTAAGGAGGTGTGAGGCATATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGATACTAATTCTGATTTGGAAATATCGTCGACTTGTGATGCTCATCATCATCATCATCACGACGATGACGATAAGCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAtgcggtggcggttacggccgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcTAAtaaAAATAACAAAAAGAGTATGAGTTTTTGCTCATACTCTTTTTGTTATTT(SEQ ID NO:19)
[0307]其中:
[0308]TAA-SLPAP-RBS:
[0309]TAACCCGGGGGGAGTATAACAGAAACCTTAAGGCCCGACCGCTTGACAAGGGCGCGTGAGGTTTTTACGATAGCGCCGGATGCGGGGAAAAAGGGCTCCTTTTGGGGGGTTTTCCCCGCACCGGGCGGACCTGGGCGGAGAGGAAACGCGGCAACTCGCCCGTCTCGGGTTCCCGCCCACGACCCTTAAGGAGGTGTGAGGCAT (SEQ ID NO:20)
[0310]ATG-USP45:ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGATACTAATTCTGAT(SEQ ID NO:21)
[0311 ] LEISS:TTGGAAATATCGTCGACTTGTGATGCT(SEQ ID NO:22)
[0312]6XHIS: CATCATCATCATCATCAC(SEQIDNO:23)
[0313]EK 位:GACGATGACGATAAG(SEQ ID NO:24)
[0314]GLP-1 (1-37):
[0315]CACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGG CCGAGGA(SEQ ID NO:25)
[0316]CPP:
[0317]TGCGGTGGCGGTTACGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGCCGTCGCTAATAAT AA(SEQ ID NO:26)
[0318]TERM667:
[0319]AAATAACAAAAAGAGTATGAGTTTTTGCTCATACTCTTTTTGTTATTT(SEQ ID NO:27)
[0320]6.10.實(shí)施例10:共生細(xì)菌分泌型GLP-1重編程腸細(xì)胞以降低糖尿病小鼠的高血糖
[0321]給糖尿病小鼠經(jīng)腸喂食細(xì)菌分泌型GLP-1能導(dǎo)致葡萄糖響應(yīng)性胰島素生成，顯著降低血糖水平。胰島素分泌的機(jī)制似乎來(lái)自重編程的腸細(xì)胞。這些細(xì)胞與大多數(shù)胰腺β細(xì)胞的差異在于所述細(xì)胞除表達(dá)胰島素外幾乎不表達(dá)PDX-1且僅有一些表達(dá)ChrA。
[0322]引言
[0323]胰高血糖素樣肽I (GLP-1)刺激小鼠腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為胰島素分泌型細(xì)胞。我們研究用改造成分泌GLP-1的人共生細(xì)菌菌株簡(jiǎn)單口服給藥是否能通過(guò)使腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞來(lái)改善I型糖尿病(TlDM)小鼠模型內(nèi)的高血糖癥。每天給糖尿病小鼠喂食改造成分泌GLP-1的共生細(xì)菌(Nissle-GLP-1)。Nissle-GLP-1喂食的小鼠顯示胰島素水平顯著增加，且明顯更具葡萄糖耐受性。這些小鼠在腸上部?jī)?nèi)發(fā)展出胰島素生成型細(xì)胞，其在數(shù)量上足夠替代82%的健康小鼠內(nèi)所發(fā)現(xiàn)胰腺β細(xì)胞。令人吃驚的是，重編程細(xì)胞內(nèi)的PDX-1表達(dá)低于周圍上皮細(xì)胞。而且，所述重編程細(xì)胞的亞組對(duì)嗜鉻粒蛋白A(ChrA，腸內(nèi)分泌細(xì)胞和β細(xì)胞標(biāo)志物)共同染色。喂食Nissle-GLP-1的健康(非糖尿病)小鼠相較于對(duì)照小鼠顯示相似的重編程細(xì)胞，但在血糖水平和體重增長(zhǎng)上(甚至處理超過(guò)90天)沒(méi)有可區(qū)別的變化。這些結(jié)果指示對(duì)TlDM的潛在口服治療并引入細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以介導(dǎo)腸細(xì)胞命運(yùn)的概念。[0324]使非β細(xì)胞重編程為β細(xì)胞或具有胰島素分泌潛力的細(xì)胞已成為過(guò)去十年中若干研究的主題。研究集中于許多領(lǐng)域，包括由胰細(xì)胞(腺泡細(xì)胞等)和肝細(xì)胞系體外生成β細(xì)胞以用于移植，以及使胰或其它組織特異性細(xì)胞轉(zhuǎn)體內(nèi)換成β細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)先前認(rèn)為不具活性的胰高血糖素樣肽I的一種形式(GLP-l(l-37))能通過(guò)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激大鼠腸上皮細(xì)胞成為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞(Suzuki，A.，Nakauchi，H.和Taniguchi, H.Glucagon-like peptidel(1-37)converts intestinal epithelial cellsinto insulin-producing cells (胰高血糖素樣肽I (1-37)使腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為胰島素生成型細(xì)胞).Proc Natl Acad Sci USA100，5034-5039 (2003))，證明所述后一種方式的潛力。Suzuki報(bào)道，其母親大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)(1.p.)注射GLP-1的大鼠胚胎在胚胎期10.5(E10.5)發(fā)育會(huì)在其腸上部中顯示一些胰島素生成型細(xì)胞。成年大鼠(10周齡)在每日注射GLP-1九天時(shí)具有一些(盡管少得多)腸胰島素生成型細(xì)胞。這表明具有未分化腸上皮的大鼠(大鼠中的分化于E15后出現(xiàn))能夠使腸細(xì)胞分化成為“β樣”細(xì)胞。該研究還證明用GLP-1體外孵育并手術(shù)植入成年糖尿病大鼠的胚胎空腸(Ε14.5)能使STZ誘導(dǎo)的TlDM逆轉(zhuǎn)。該作者總結(jié)，成年腸上皮細(xì)胞分化(發(fā)生自腸隱窩)可能不會(huì)產(chǎn)生顯著數(shù)量的胰島素生成型細(xì)胞，從而大量分化成具有β樣功能的細(xì)胞可能需要發(fā)育中胎兒(前Ε17)的增殖和假?gòu)?fù)層細(xì)胞。
[0325]所述Suzuki的工作證明介導(dǎo)腸細(xì)胞重編程的生物活性化合物在不采用手術(shù)的遞送中的困難。GLP-1本身在血液中的半衰期僅有數(shù)分鐘。該短暫半衰期可能已成為成年大鼠中較低重編程率的原因，其中GLP-1必須在循環(huán)中存活足夠長(zhǎng)的時(shí)間以到達(dá)腸腺。一種遞送生物活性化合物至腸上部腔(絨毛)側(cè)從而避免手術(shù)潛在缺陷或在血流中降解的方法是從腸居共生細(xì)菌分泌信號(hào)。該方法允許信號(hào)連續(xù)表達(dá)或響應(yīng)局部刺激表達(dá)，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)腸黏膜而不是血液。
[0326]改造的共生細(xì)菌能遞送GLP-1 (1-37)至人腸細(xì)胞并刺激葡萄糖響應(yīng)性胰島素體夕卜分泌(Duan, F.，Curtis, K.L.和March, J.C.Secretion of insulinotropic proteins bycommensal bacteria:rewiring the gut to treat diabetes (由共生細(xì)菌分泌促膜島素蛋白質(zhì):使腸重新排布以治療糖尿病).Appl Environ Microbiol74, 7437-7438 (2008))。在所述工作中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Nissl el917 (EcN)以響應(yīng)外源誘導(dǎo)子而從質(zhì)粒分泌GLP-1 (1-37)。在該研究中，我們測(cè)試了染色體修飾成組成性分泌GLP-1 (1-37)的EcN(Nissle-GLP-1)是否能使TlDM小鼠模型內(nèi)的血糖正?；謴?fù)。我們的目的是通過(guò)每天喂食Nissle-GLP-1使小鼠腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞。我們還檢測(cè)了 β細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物的共表達(dá)以測(cè)定重編程的程度以及重編程細(xì)胞譜系。
[0327]使用fliC啟動(dòng)子、細(xì)胞穿透肽(CPP)和分泌標(biāo)簽改造EcN以分泌GLP-1 (1-37)(圖19，上圖)。在該菌株培養(yǎng)中驗(yàn)證GLP-1的分泌，并與攜帶含有相同序列但不帶pKD3染色體插入盒(圖19，下圖)的質(zhì)粒的菌株分泌作比較。Nissle-GLP-1的分泌量是含質(zhì)粒菌株的大約50%。因此，我們?cè)隗w內(nèi)研究中使用Nissle-GLP-1而不是含質(zhì)粒菌株，因?yàn)樵摦a(chǎn)量差異不視作顯著，而且我們不想在這些實(shí)驗(yàn)中包括用于質(zhì)粒維持的選擇壓力。免疫熒光(IF)顯示喂食Nissle-GLP-1的小鼠的腸上部對(duì)GLP-1染色呈陽(yáng)性，而喂食表達(dá)“假”肽的EcN(Nissle)的小鼠不顯示相似染色(圖16a、b)。為了保護(hù)黏膜層，冷凍而不是在多聚甲醛中固定腸切片。圖像分析指示喂食Nissle-GLP-Ι的小鼠中的GLP-1染色顯著高于喂食Nissle的小鼠(圖16c)。
[0328]我們檢測(cè)了喂食Nissle-GLP-1或Nissle的小鼠的腸和糞便內(nèi)的細(xì)菌計(jì)數(shù)。喂食Nissle-GLP-Ι和Nissle的小鼠的腸和糞便細(xì)菌計(jì)數(shù)相同(圖16d)，指示觀察到的Nissle-GLP-Ι喂食小鼠部分的GLP-1增加可能來(lái)自重組GLP-1表達(dá)而不是由EcN源性菌株的存在所帶來(lái)的內(nèi)源性GLP-1生成。為測(cè)定大腸而非糞便中的菌落，小心地刮擦胃腸(GI)道下部切片并沖洗以去除糞便。對(duì)剩余細(xì)菌計(jì)數(shù)。我們得到的小腸和糞便內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)沒(méi)有其它報(bào)道的高，然而這可能歸因于不同的小鼠飼養(yǎng)方式和交替的抗生素預(yù)處理。
[0329]我們測(cè)試了 Nissle-GLP-Ι是否能使藥物誘導(dǎo)TlDM小鼠模型和基因型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型內(nèi)的正常血糖恢復(fù)(來(lái)自NOD模型的結(jié)果總結(jié)于章節(jié)6.11 (實(shí)施例11))。對(duì)于藥物誘導(dǎo)的TlDM模型，連續(xù)5天用高劑量(40或50mg/kg體重)鏈脲霉素(STZ)注射C57BL/6J(B6)雄性小鼠。隨著高血糖癥(禁食葡萄糖水平>250mg/dL)發(fā)生，給小鼠喂食Nissle-GLP-1、Nissle或不予處理。共生細(xì)菌的喂食一天實(shí)行兩次，間隔約8h。作為血糖正常對(duì)照，一組小鼠不接受STZ處理也不喂食共生細(xì)菌(對(duì)照)。在超過(guò)60天過(guò)程中監(jiān)測(cè)血糖水平和體重。
[0330]胰腺形態(tài)測(cè)定分析顯示，STZ處理的小鼠相較于對(duì)照小鼠具有顯著減少的β細(xì)胞量(圖17a)。單獨(dú)Nissle喂食相較于不給予共生細(xì)菌的STZ處理小鼠對(duì)血糖水平無(wú)顯著影響(圖17b)。然而，喂食Nissle-GLP-1的小鼠在喂食開(kāi)始60天后顯示顯著較低(p=.000017)的血糖水平(圖17b)。喂食Nissle-GLP-1的小鼠的血糖水平與血糖正常對(duì)照無(wú)顯著差異(p=.46)。此外，在本研究的60天時(shí)間段中任何小鼠的體重都沒(méi)有顯著變化(圖20A-B)。所有喂食STZ的小鼠中β細(xì)胞量等同減少，排除了喂食Nissle-GLP-1的小鼠的血糖水平降低是β細(xì)胞再生的結(jié)果的可能性。
[0331]也給健康的未經(jīng)STZ處理的小鼠喂食Nissle和Nissle-GLP-Ι，然而它們的血糖水平與沒(méi)有喂食共生細(xì)菌的那些健康小鼠無(wú)顯著差異(圖17c)。在處理和未處理的健康小鼠(對(duì)照)之間92天時(shí)間段中 的小鼠血糖水平?jīng)]有顯著變化(圖17c)。在相同時(shí)間段中，小鼠體重變化也沒(méi)有差異(圖20A-B)。
[0332]在共生細(xì)菌處理60天后，對(duì)所有小鼠組實(shí)行葡萄糖耐量測(cè)試。所述小鼠在用葡萄糖1.p.注射(25g/kg體重)之前被禁食10小時(shí)。在葡萄糖注射后1.5小時(shí)內(nèi)每30分鐘檢測(cè)血液胰島素和葡萄糖水平(圖17d)。盡管在0.5和1.5小時(shí)，顯示Nissle-GLP-1喂食小鼠和僅STZ處理組間胰島素水平的顯著差異，在任何時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有檢測(cè)到Nissle GLP-1喂食小鼠和沒(méi)有接受處理的對(duì)照小鼠間胰島素水平的顯著差異(圖17d)。整個(gè)葡萄糖耐量測(cè)試中，所有4組小鼠間的血糖水平有顯著差異。整個(gè)葡萄糖耐量測(cè)試中，顯示Nissle-GLP-1喂食小鼠的血糖水平低于僅STZ處理小鼠的血糖水平的50% ;但其血糖水平為不給予STZ處理的對(duì)照小鼠的兩倍(圖17d)。Nissle-GLP-1喂食小鼠的血糖水平盡管高于血糖正常對(duì)照，但其在整個(gè)葡萄糖耐量測(cè)試中沒(méi)有超過(guò)275mg/dL(相比于僅STZ處理小鼠的600mg/dL)。有趣的是，盡管Nissle處理小鼠與STZ處理小鼠在在基底水平的(時(shí)間=0)血糖水平方面沒(méi)有顯示顯著的差異，在葡萄糖注射后I小時(shí)，顯示Nissle處理小鼠的血糖水平比STZ處理小鼠低約33%。雖然該保護(hù)作用在未注射高水平葡萄糖的小鼠中不明顯，但是Nissle似乎能在某種程度上改善血糖峰的作用。鑒于葡萄糖是1.P.注射的，可以排除腔內(nèi)葡萄糖的細(xì)菌消耗是可能機(jī)制。為解釋該觀察，需要進(jìn)一步研究。[0333]處理60天后(隨后進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試)，固定小鼠小腸切片并對(duì)其進(jìn)行不同標(biāo)志物的免疫熒光探測(cè)。在用Nissle-GLP-Ι處理小鼠的小腸中發(fā)現(xiàn)含胰島素的細(xì)胞口袋，但沒(méi)有在本研究所用的任何其它組內(nèi)發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象(圖18a-d)。從圖像分析估計(jì)胰島素生成細(xì)胞的相對(duì)頻率是總體小腸細(xì)胞量的約0.013%(±0.002%)(或I個(gè)/10，000個(gè)上皮細(xì)胞)。如對(duì)本研究中所有小鼠所預(yù)期，在腸上部顯示PDX-1生成(圖18a-d中的紅色染色)。然而，用Nissle-GLP-1處理的小鼠內(nèi)的胰島素生成細(xì)胞對(duì)I3DX-1沒(méi)有高水平染色，甚至似乎具有比周圍細(xì)胞(圖18b和d)或來(lái)自對(duì)照的胰腺β細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)少的PDX-1表達(dá)。雖然這是一個(gè)有趣的結(jié)果，其仍為這些細(xì)胞具有β細(xì)胞樣功能的提供可能性，因?yàn)橐阎嬖讦录?xì)胞群中rox-1/胰島素分泌的異質(zhì)性。
[0334]在更加長(zhǎng)期的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，其中給健康(非糖尿病)小鼠喂食Nissle和Nissle-GLP-Ι，同樣對(duì)腸實(shí)行染色以檢測(cè)重編程細(xì)胞的存在。在喂食Nissle-GLP-Ι的健康小鼠中觀察胰島素染色，而胰島素生成細(xì)胞內(nèi)的I3DX-1表達(dá)仍低于周圍細(xì)胞(圖18d)。喂食Nissle的健康小鼠不顯示重編程細(xì)胞(圖18c)。
[0335]為了更好理解所述重編程細(xì)胞的生理學(xué)，我們對(duì)小鼠腸切片中的嗜鉻粒蛋白A(ChrA)和胰島素共同染色。ChrA由神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和分泌顆粒中的胰島β細(xì)胞常規(guī)表達(dá)。在一些情況中，胰島素染色與ChrA染色(紅色)重疊(圖18e)，而在約80%觀察到的胰島素生成細(xì)胞中，ChrA并不定位于同一細(xì)胞(圖18f)。圖18e和f顯示正常腸內(nèi)分泌細(xì)胞(ChrA陽(yáng)性，無(wú)胰島素染色)、胰島素生成(胰島素染色)細(xì)胞。胰島素生成細(xì)胞附近存在普通腸內(nèi)分泌細(xì)胞表明，除了一些腸內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)換為胰島素生成細(xì)胞以夕卜，整體動(dòng)物內(nèi)保留了腸內(nèi)分泌功能。我們沒(méi)有觀察到就溶菌酶而言的胰島素共定位(圖18g)，表明所述重編程細(xì)胞不是潘納斯(Paneth)細(xì)胞。胰島素和蔗糖酶異麥芽糖酶(SI)的共表達(dá)(圖18h)指示重編程細(xì)胞保持其吸收能力。
[0336]所述指示喂食Nissle-GLP-Ι的健康小鼠的血糖(圖17c)或體重(圖20A-B)無(wú)變化的數(shù)據(jù)，以及指示Nissle-GLP-Ι能顯著降低兩種嚙齒類TlDM模型血糖水平(圖17b和21)的數(shù)據(jù)表明該方法能是有效且安全的糖尿病療法:其是葡萄糖響應(yīng)性，具有與非糖尿病系統(tǒng)相似的胰島素動(dòng)力學(xué)(圖17`d)，S卩，Nissle-GLP-1喂食小鼠的胰島素水平變化發(fā)生時(shí)間與健康小鼠相同，盡管其血清胰島素水平較低。對(duì)本研究中達(dá)到的重編程效率的評(píng)估(細(xì)節(jié)示于下文的“對(duì)重編程細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算和估計(jì)”)指示重編程細(xì)胞的數(shù)量約為健康小鼠胰腺中β細(xì)胞數(shù)量的82%。該數(shù)字可能解釋了小鼠為何能夠在日常狀態(tài)下顯示標(biāo)準(zhǔn)化血糖水平，但在更有挑戰(zhàn)性的葡萄糖耐量測(cè)試條件下稍低于健康小鼠血糖對(duì)照。人患者需要日常消耗以達(dá)到本文關(guān)于小鼠所得相同結(jié)果的細(xì)菌量估計(jì)是以市場(chǎng)現(xiàn)有的非處方益生菌制劑形式每天給予5?15g所述細(xì)菌量。然而，若定殖數(shù)較高，日常攝入應(yīng)低至50mg。
[0337]使用該方法的考量可能會(huì)引起針對(duì)腸內(nèi)新生β樣細(xì)胞的免疫應(yīng)答。該情況很有可能發(fā)生，正如其在其它再生方法中那樣。然而，這些細(xì)胞的生理學(xué)(幾乎不表達(dá)ChrA，且PDX-1表達(dá)相對(duì)較低)與β細(xì)胞不同，因此這些細(xì)胞可能不被免疫系統(tǒng)檢測(cè)到。此外，如果患者待采用分泌GLP-1的細(xì)菌如本研究中的小鼠那樣基于每天治療，胰島素分泌細(xì)胞的永久性再生可能會(huì)使血糖持續(xù)地減少，盡管新形成β樣細(xì)胞會(huì)被免疫破壞。考慮到人上皮細(xì)胞大約每?jī)商旄乱淮我约爸甘旧踔猎?6天之后NOD小鼠中具有保護(hù)作用的數(shù)據(jù)(N0D小鼠顯示對(duì)胰腺β細(xì)胞的免疫破壞)，仍可能沒(méi)有免疫系統(tǒng)針對(duì)腸上部?jī)?nèi)重編程細(xì)胞的顯著響應(yīng)。然而，若有這樣的攻擊，可能造成黏膜表面的永久炎癥。需要更多的研究來(lái)確定該方法的免疫學(xué)效應(yīng)。
[0338]我們從本文所示的這些數(shù)據(jù)得出結(jié)論，給糖尿病小鼠喂食Nissle-GLP-Ι可導(dǎo)致葡萄糖響應(yīng)性胰島素生成，使血糖水平顯著降低。盡管需要更多的表征，但是胰島素分泌的機(jī)制似乎來(lái)自重編程的腸細(xì)胞。這些細(xì)胞與大多數(shù)胰腺β細(xì)胞的差異在于所述細(xì)胞除表達(dá)胰島素外幾乎不表達(dá)I3DX-1且它們中僅有一些表達(dá)ChrA。鑒于喂食不刺激β細(xì)胞分泌胰島素的無(wú)活性形式GLP-1的小鼠和喂食Nissle-GLP-1的小鼠與僅喂食Nissle或不喂食細(xì)菌的小鼠的胰腺胰島素生成水平相同，該方法不太可能引起來(lái)自剩余β細(xì)胞的胰島素生成增加。當(dāng)結(jié)合來(lái)自喂食Nissle-GLP-Ι的健康小鼠的結(jié)果來(lái)考慮時(shí)，所述證據(jù)表明即使向非糖尿病給予該處理也是安全的。進(jìn)一步工作將更加嚴(yán)密地檢測(cè)所述胰島素生成細(xì)胞的生理學(xué)，以及所述治療的詳細(xì)的長(zhǎng)期藥物代謝動(dòng)力學(xué)。
[0339]材料和方法
[0340]質(zhì)粒構(gòu)建
[0341]除非另有說(shuō)明，所述有化學(xué)品和試劑都購(gòu)自VWR國(guó)際有限公司(VWRInternational)(賓夕法尼亞州西切斯特)。所有克隆使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(Sambrook, J.和 Russell.D.W.Molecular cloning: a laboratory manual (《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》).第三版，冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)實(shí)出版社；2001年)。構(gòu)建用于在fliC啟動(dòng)子控制下表達(dá)融合細(xì)胞穿透肽(CPP)的glp-l(l-37)的質(zhì)粒以生成前述的pFD-GLP (Duan，F(xiàn).和March，J.C.1nterrupting Vibrio cholerae infection of human epithelial cells withengineered commensal bacterial signaling(用改造的共生細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷人上皮細(xì)胞的霍亂弧菌感染).Biotechnol BioenglOl (I): 128-34.(2008))。合成制備(IDT，愛(ài)荷華州科拉爾維爾市)序列6XHis-EK-glp-l (1-37)-CPP。通過(guò)高保真PCR(司查塔基公司(Strategene))將該片段插入pBluescript-KS以生成pBluescript-GLP。該所得載體包含以下序列5’ UTR-Flic20-6XHis-EK-glp-l (1-37)-CPP0通過(guò)高保真PCR將該序列克隆至PKS121 內(nèi)(含有 fIiC 的 3’UTR)以獲得構(gòu)建體:5’UTR-Flic20-6XHis_EK-glp-l (1-37)-CPP-3’UTR。為獲得pFD-載體，使用高保真PCR克隆來(lái)自pFD-GLP的5’ UTR-FLIC20-6XHis_EK序列。將所述PCR片段克隆至pKS121內(nèi)以獲得構(gòu)建體:5’ UTR-Flic20-6XHis-EK-3’ UTR。PKS104和pKS121由芬蘭赫爾辛基大學(xué)的Benita Westerlund-Wikstr^m實(shí)驗(yàn)室友情饋贈(zèng)。
[0342]使用已建立方法制備pFD-GLPC構(gòu)建體以用于在天然fliC啟動(dòng)子控制下染色體插入 glp-1(1-37)-CPP(Datsenko, K.A.和 Wanner, B.L.0ne-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products (使用 PCR 產(chǎn)物使大腸桿菌 K-12 染色體基因一步法失活).Proc Natl Acad Sci USA97, 6640-6645 (2000))。所述構(gòu)建體的示意圖以及克隆步驟和所用引物的詳細(xì)解釋如下。簡(jiǎn)言之，使用一步失活法在Nissle染色體中插入Flic20-6XHis-EK-glp-l (1-37)-CPP基因以替代fliC啟動(dòng)子區(qū)下游的fliC。敲除Nissle染色體中的fliD基因。該技術(shù)使用三種質(zhì)粒，pKD3 (賦予氯霉素抗性)、pKD4 (賦予卡那霉素抗性)和pKD46 (賦予氨節(jié)青霉素抗性)(Datsenko, K.A.和 Wanner, B.L.0ne-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K-12using PCR products (使用PCR產(chǎn)物使大腸桿菌K-12中的染色體基因一步失活).Proc Natl Acad Sci USA97, 6640-6645 (2000))。染色體插入之后的所得菌株稱作Nissle-GLP-1。
[0343]Western 印跡
[0344]大腸桿菌Nisslel917 (EcN)獲自如上所述的目前市售可得益生菌Mutaflor?(Duan, F.和 March, J.C.1nterrupting Vibrio cholerae infection of humanepithelial cells with engineered commensal bacterial signaling(改造的共生細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷人上皮細(xì)胞的霍亂弧菌感染).Biotechnol BioenglOl (I): 128-34.(2008))。含pFD-載體、pFD-GLP的EcN和具有來(lái)自pFD-GLPC的染色體插入的Nissle在LB中于37° C以225rpm振蕩24小時(shí)。24小時(shí)后，離心所有細(xì)菌。過(guò)濾上清(0.2 μ m，PALL生命科學(xué)公司(PALL Life Science)) 0將無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至與LB相同的0D600，然后添加10ng/mL亮抑肽酶、0.04mMPMSF和5ng/mL抑肽酶以抑制蛋白酶。用10%三氯乙酸(TCA，VWR)使澄清上清(14mL)在冰上沉淀30分鐘，然后將所述團(tuán)課在冰冷乙醇/乙醚(1:1)中洗滌兩次。使所得上清團(tuán)塊在真空下干燥，溶解于50 μ L樣品緩沖液(2%SDS、50mM Tris (pH6.8)、20%甘油、10%巰基乙醇、溴酚藍(lán))并在95° C沸煮5分鐘。使用含蛋白酶抑制劑的500 μ LBugBusterMaster Mix(10ng/mL亮抑肽酶、200 μ MPMSF和5ng/mL抑肽酶)，所得細(xì)胞團(tuán)(來(lái)自14mL培養(yǎng)物)通過(guò)溫和潤(rùn)旋重懸于室溫BugBuster Master Mix。細(xì)胞懸液在振蕩平臺(tái)(康涅狄格州布里斯托市的VWR)以慢速設(shè)定于室溫下孵育10?20分鐘。向各樣品添加125 μ L5X樣品緩沖液，然后在95° C沸煮10分鐘。為了估測(cè)GLP-1表達(dá)和分泌的量，使用western印跡的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。簡(jiǎn)言之，將50 μ L樣品加樣至聚丙烯酰胺膠上，并印跡至Imm0bil0n-PSQ轉(zhuǎn)移膜上(密理博公司(Millipore)，馬塞諸塞州比爾瑞卡)。膜用1: 1，000的小鼠抗His (GE醫(yī)療保健公司(GE health)，新澤西州皮斯卡特維)檢測(cè)。所述膜用HRP偶聯(lián)的抗小鼠IgG (阿莫山生物科學(xué)公司(Amersham Biosciences),賓夕法尼亞州匹茲堡)孵育,用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(皮爾斯公司(Pierce)，伊利諾斯州洛克福德)顯影，并曝光至X射線膠片上(菲尼克斯公司(Phoenix)，北卡羅來(lái)納州坎德勒)。
[0345]小鼠定殖實(shí)驗(yàn)
[0346]本研究使用的所有小鼠購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(緬因州巴港)，并于康奈爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的東校區(qū)研究機(jī)構(gòu)(ECRF)中飼養(yǎng)。研究按照康奈爾大學(xué)IACUC批準(zhǔn)的方法實(shí)施。
[0347]STZ 模型
[0348]在使用之前，鏈脲霉素(STZ)(西格瑪公司(Sigma)，密蘇里州圣路易斯)直接溶解于冰上冷卻的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH4.2)。連續(xù)5天每天對(duì)四組6?8周齡的C57BL/6J(B6)雄性小鼠腹膜內(nèi)注射40或50mg/kg體重的STZ，以誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。使用接受檸檬酸鈉的另一組小鼠作為對(duì)照。在最后一次注射之后三天，通過(guò)Breeze?: 2血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(拜爾健康護(hù)理有限責(zé)任公司(Bayer Healthcare LLC),印第安納州米沙沃卡)使用Bayer Breeze血糖測(cè)試條(拜爾健康護(hù)理有限責(zé)任公司(Bayer Healthcare LLC),印第安納州米沙沃卡)測(cè)定動(dòng)物的血糖水平。每3天監(jiān)測(cè)血糖水平直至達(dá)到糖尿病葡萄糖水平(>250mg/dL)。本研究中不使用沒(méi)有達(dá)到糖尿病血糖水平的STZ處理小鼠。
[0349]在建立高血糖癥之后，向小鼠提供氯霉素處理的(lg/L)飲用水18小時(shí)，以除去兼性存留的細(xì)菌。采用pFD-GLPC修飾染色體的Nissle菌株(Nissle-GLP-Ι)在氯霉素存在下從LB培養(yǎng)基中1:500稀釋的過(guò)夜培養(yǎng)物生長(zhǎng)至OD6tltl=I。通過(guò)以IOOOXg離心3分鐘收集細(xì)菌。所得沉淀重新溶解于200 μ L含1%蔗糖的無(wú)菌LB。經(jīng)氯霉素處理后，以50 μ L/25g體重給小鼠喂食含1%蔗糖的LB，所述LB含109CFU/mL(0D_=20)的盧里亞(Luria)肉湯所培養(yǎng)單獨(dú)Nissle菌株(Nissle或Nissle-GLP-l)。喂食的細(xì)菌體積根據(jù)小鼠體重標(biāo)準(zhǔn)化。所有喂食Nissle菌株的小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中喂食兩次Nissle/天。每7?10天檢測(cè)小鼠的體重和葡萄糖水平。在大多數(shù)情況中，測(cè)試禁食葡萄糖水平。隔開(kāi)這些檢測(cè)彼此，以使小鼠壓力水平最低化。
[0350]葡萄糖耐量測(cè)試和ELISA
[0351]使小鼠禁食10小時(shí)，稱重，并使用肝素化的微量血細(xì)胞壓積毛細(xì)管(Micro-Hematocrit Capillary Tube)(費(fèi)舍爾公司(Fisher),賓夕法尼亞州)從尾靜脈收集血液樣品。然后，以25mg/kg體重腹膜內(nèi)注射葡萄糖，并在0.5、1、1.5小時(shí)取血樣。使用Breeze? 2血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)量血漿葡萄糖。使用大鼠/小鼠胰島素ELISA試劑盒(密理博公司(Millipore)，馬薩諸塞州)，按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)測(cè)量血漿胰島素。
[0352]細(xì)菌計(jì)數(shù)
[0353]給6?8周齡的 C57BL/6J(B6)雄性小鼠提供含氯霉素(lg/L)的飲用水18小時(shí)，以去除兼性留存的細(xì)菌。Nissle菌株(Nissle和Nissle-GLP-Ι)的過(guò)夜培養(yǎng)物以1:500在LB培養(yǎng)基中稀釋，并生長(zhǎng)至0D600=1。通過(guò)以IOOOXg離心3分鐘收集細(xì)菌。所得團(tuán)塊在含1%蔗糖的無(wú)菌LB中重懸至0D600=20。在氯霉素處理之后，通過(guò)口服管飼法以50 μ L/25g體重給小鼠喂食含濃縮重懸物的帶1%蔗糖LB(每天兩次，所得劑量為IO9CFU/動(dòng)物)。在喂食20天后，將小鼠轉(zhuǎn)移至新籠3天。從所述新籠中收集糞便，并對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。解剖來(lái)自各處理的至少三只小鼠，并移出其胃腸(GI)道。將胃腸(GI)道切成兩端(GI小腸上部和GI大腸下部)。沿一側(cè)打開(kāi)所述GI下部，溫和刮擦移除糞便并用IXPBS沖洗。所述GI上部在稱重前不沖洗或刮擦。分別稱重所述上部和下部GI道，然后在4mL新鮮LB培養(yǎng)基中均質(zhì)化。將均質(zhì)化的組織置于MacConkey瓊脂板上，所述板含有連續(xù)稀釋的相應(yīng)抗生素。板在37° C過(guò)夜孵育，計(jì)數(shù)其菌落。
[0354]免疫組化
[0355]本研究中使用的所有經(jīng)處理小鼠都按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序使用C02實(shí)施安樂(lè)死。將在葡萄糖耐量測(cè)試后處死的小鼠腸和胰腺組織在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，然后用IXPBS沖洗三次，并浸泡在70%乙醇中。然后解剖固定的組織。
[0356]在脫石蠟后，固定的組織切片在IHC-Tek?表位修復(fù)溶液(IHC World公司，馬里蘭州伍德斯托克)中汽蒸，然后在含0.5%過(guò)氧化氫(費(fèi)舍爾公司(Fisher)，賓夕法尼亞州匹茲堡)的甲醇中浸泡10分鐘，以封阻內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。在0.0lMPBS(pH7.2)中洗滌后，于濕度箱中室溫施加10%常規(guī)封閉山羊血清(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亞州卡爾斯巴德)30分鐘。將在PBS+1 X酪蛋白(維克多公司(Vector)，加利福尼亞州柏林格姆)中1:50稀釋的兔抗胰島素(H-86,圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology))施加至封閉的樣品，然后在濕度箱內(nèi)37° C孵育1.5小時(shí)。在PBS中洗滌4次后，將在PBS中1:200稀釋的生物素化第二抗體山羊抗兔(維克多公司(Vector))施加至樣品，在濕度箱內(nèi)室溫孵育20分鐘。樣品與鏈霉素過(guò)氧化物酶(英杰公司(Invitrogen))在濕度箱內(nèi)室溫孵育20分鐘，然后用PBS洗滌3次。樣品與AEC色原/底物溶液(chromogen/substratesolution)(英杰公司(Invitrogen))在室溫孵育。顯色在普通光學(xué)顯微鏡下監(jiān)測(cè)約5?15分鐘。使用蒸餾水沖洗來(lái)終止反應(yīng)。
[0357]—些腸組織和胰腺用蘇木精(費(fèi)舍爾公司(Fisher))復(fù)染30秒，然后在自來(lái)水中沖洗5分鐘。使用水性熒光封片劑(費(fèi)舍爾公司(Fisher))封固樣品。用彩色相機(jī)在普通光學(xué)顯微鏡(萊卡公司(Leica),伊利諾斯州班諾克本)下拍照。通過(guò)ImageJ軟件(NIH-NCBI)分析染色的胰腺組織圖片，以依照紅色顯色估計(jì)β細(xì)胞覆蓋率。
[0358]免疫熒光
[0359]石蠟免疫熒光法——胰島素、roX-1、ChrA、溶菌酶和SI
[0360]使喂食Nissle菌株(Nissle和Nissle-GLP-l) 60天后處死的小鼠腸和胰腺組織在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，然后用I XPBS洗滌三次，并浸泡在70%乙醇中。然后解剖固定的組織。脫石蠟后，在0.0lM檸檬酸鹽緩沖液中汽蒸固定的組織切片。在0.0lM PBS(pH7.2)中洗滌后，于濕度箱中室溫施加10%常規(guī)封閉驢血清(加利福尼亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)) I小時(shí)。將以1:50稀釋的兔抗胰島素(加利福尼亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology),加利福尼亞州)和在PBS+1X酪蛋白(維克多公司(Vector)，加利福尼亞州柏林格姆)中1:500稀釋的山羊抗roX-Ι (阿柏堪穆公司(Abeam)，馬薩諸塞州劍橋)、1:50稀釋的抗山羊ChrA、抗山羊溶菌酶或抗山羊蔗糖酶異麥芽糖酶(SI)(加利福尼亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology))施加至封閉的樣品，然后在濕度箱中4° C孵育過(guò)夜。在PBS中洗滌4次后，將在PBS中1:200稀釋的突光色素偶聯(lián)第二抗體Alexa Fluor? 488驢抗兔IgG和Alexa Fluor? 555驢抗山羊IgG(英杰公司(Invitrogen))施加至樣品并在濕度箱中室溫孵育1.5小時(shí)。
[0361]在PBS中洗漆3次后，使樣品與300nM DAPI染色溶液(英杰公司(Invitrogen))孵育3分鐘。然后，使用ProLong?, glod抗衰減試劑(英杰公司(Invitrogen))封固樣品。使用就各熒光團(tuán)合適的激發(fā)波長(zhǎng)直接檢測(cè)樣品。用ZeiSS710共聚焦顯微鏡(蔡司公司(Zeiss),德國(guó)耶拿)拍 照。
[0362]冷凍切片免疫熒光——Glp-1
[0363]收獲喂食Nissle菌株10天的小鼠的腸和胰腺，在OCT化合物中速凍，并實(shí)施冷凍切片(8μΜ)。使切片空氣干燥I小時(shí)，然后在冰冷丙酮中固定5分鐘?？諝飧稍镞^(guò)夜后，切片在PBST (0.05%吐溫(Tween))中清洗3次。下列操作方案修改自Μ.0.Μ?試劑盒染色方法(維克多公司(Vector))。用0.1%曲通(Triton) X-100透化細(xì)胞15分鐘，然后在PBS中清洗兩次。含有10%常規(guī)驢血清(加利福尼亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa CruzBiotechnology))的Μ.0.M.?Ig封閉試劑工作溶液在濕度箱中室溫應(yīng)用I小時(shí)。切片在PBS中清洗2次，每次2分鐘。組織切片在M.0.M."稀釋劑工作溶液中孵育5分鐘。然后，樣品與M.0.M.?稀釋劑1:100中稀釋的兔抗GLP-1 (1-19)(阿柏堪穆公司(Abcam))在37。C孵育30分鐘，然后室溫孵育30分鐘。在PBST中清洗2次，然后在PBS中清洗4次后，將PBS中1:200稀釋的突光色素偶聯(lián)第二抗體Alexa Fluor? 488驢抗兔IgG和Alexa Fluor? 555驢抗山羊IgG(英杰公司(Invitrogen))在濕度箱中室溫應(yīng)用于樣品I小時(shí)。后續(xù)在PBST中清洗3次之后，樣品在300nM DAPI染色溶液(英杰公司(Invitrogen))中孵育3分鐘。樣品在PBS中沖洗3次,并使用ProLong? glod抗衰減試劑(英杰公司(Invitrogen))封固。使用就各熒光團(tuán)合適的激發(fā)波長(zhǎng)直接檢測(cè)樣品。使用ZeiSS710共聚焦顯微鏡拍照。[0364]計(jì)算并估測(cè)重編程細(xì)胞數(shù)
[0365]用于測(cè)定喂食Nissle-GLP-Ι的小鼠內(nèi)的重編程細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算
[0366]假定每只小鼠I X IO6 個(gè) β 細(xì)胞(Bock, T., Svenstrup, K., Pakkenberg,
B.和 Buschard, K.Unbiased estimation of total beta-cell number and meanbeta-cell volume in rodent pancreas (卩齒齒類動(dòng)物胰腺中的總β細(xì)胞數(shù)量和平均β細(xì)胞量的無(wú)偏估測(cè)).Apmisl07，791-799 (1999))和腸上部中1.9Χ IO7個(gè)細(xì)胞/cm2 (Cheng, H.和 Bjerknes,M.Cell production in mouse intestinal epitheliummeasured by stathmokinetic flow cytometry and Coulter particle counting (通過(guò)分裂靜止流式細(xì)胞術(shù)和庫(kù)爾特顆粒計(jì)數(shù)檢測(cè)小鼠腸上皮內(nèi)的細(xì)胞生成).AnatRec207, 427-434，do1:10.1002/ar.1092070305 (1983))，我們用估測(cè)的小鼠腸上部表面積(十二指腸 + 空腸，332.4cm2,參見(jiàn) Casteleyn, C，Rekecki, A., Van der Aa, A., Simoens, P.和 Van den Broeck, ff.Surface area assessment of the murine intestinal tractas a prerequisite for oral dose translation from mouse to man(鼠腸道表面積估測(cè)作為從小鼠到人的口服劑量轉(zhuǎn)換的先決條件).Lab Anim44, 176-183，do1: 10.1258/la.2009.009112(2010))乘以估計(jì)的重編程細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(0.00013)，單位為細(xì)胞/cm2，得出在健康小鼠中，估測(cè)重組細(xì)胞約為β細(xì)胞數(shù)的82%。
[0367]基于小鼠實(shí)驗(yàn)的估測(cè)劑量的計(jì)算
[0368]在該實(shí)施例報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，我們以IO9CfVmL每天對(duì)小鼠喂食兩次。這等同于8 X IO10CFUAg小鼠體重。鑒于4.0X 10nCFU/g的益生菌補(bǔ)充形式市售可得，且假定人體重范圍是兒童25kg?成人75kg,這意味著每日劑量是5?15g/d。然而,如果定殖效率比Ra0.S等人報(bào)道的高出2個(gè)數(shù)量級(jí)(參見(jiàn)Rao, S.等.Toward a live microbial microbicidefor HIV: Commensal bacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide (用于HIV的活微生物殺微生物劑:分泌HIV融合抑制劑肽的共生細(xì)菌)；Proc Natl Acad SciUSA102, 11993-11998(2005) )，那么所述劑量為 50 ?150mg/d。
[0369]6.11.實(shí)施例11:向非肥胖糖尿病(NOD)小鼠喂食分泌GLP-1的共生細(xì)菌的效果
[0370]該實(shí)施例證明向遺傳所致糖尿病小鼠(非肥胖糖尿病，N0D)喂食分泌GLP-1 (1-37)的共生細(xì)菌的效果。我們給NOD小鼠喂食表達(dá)假肽的大腸桿菌Nisslel917 (Nissle)、分泌 GLP-1 (1-37)的 Nissle (Nissle-GLP-Ι)或不含細(xì)菌的培養(yǎng)基46天。結(jié)果顯示，相比于僅喂食培養(yǎng)基(p=0.0003)或喂食Nissle的的對(duì)照NOD小鼠(P=.0008)，喂食Nissle-GLP-1的小鼠內(nèi)血糖水平顯著降低。此外，觀察到Nissle-GLP-1小鼠的尿液輸出低很多。Nissle喂食小鼠相較于僅喂食培養(yǎng)基的小鼠也顯示顯著較低的血糖水平(P=0.01)。
[0371]本研究中，Nissle喂食小鼠和對(duì)照小鼠明顯不健康，且其常規(guī)血糖水平高于400mg/dL，而Nissle-GLP-Ι喂食小鼠(也顯示不健康)的血糖水平在46天期間處于160?250mg/dL范圍內(nèi)。
[0372]引言
[0373]鑒于本研究的標(biāo)準(zhǔn)模式生物之一是I型糖尿病(TlDM)，所述NOD小鼠帶有遺傳缺陷，所述遺傳缺陷導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞以及全身的其它內(nèi)分泌系統(tǒng)的破壞。該脫靶作用使得將其對(duì)于研究TlDM不太理想，因?yàn)槠涑齌lDM樣病理學(xué)之外還帶有其它全身性病理學(xué)。盡管有此限制，其在本領(lǐng)域中仍被認(rèn)為是早期證明概念工作的充分模型。
[0374]就該實(shí)施例而言，研究使用共生細(xì)菌遞送肽GLP-1 (1-37)至腸上皮細(xì)胞對(duì)NOD小鼠內(nèi)血糖水平的影響。
[0375]實(shí)驗(yàn)方法
[0376]依照康奈爾大學(xué)IA⑶C批準(zhǔn)的方法處理用于這些實(shí)驗(yàn)的NOD雌性小鼠(N0D/ShiLtJ小鼠)。所有小鼠飼養(yǎng)在康奈爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的東校區(qū)研究機(jī)構(gòu)(ECRF)。所有小鼠購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(緬因州巴港)。通過(guò)Breeze?:2血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(印第安納州米沙沃爾的拜爾健康護(hù)理有限責(zé)任公司(Bayer Healthcare LLC))使用Bayer Breeze?血糖測(cè)試條(拜爾健康護(hù)理公司(Bayer Healthcare))監(jiān)測(cè)三組6周齡NOD/ShiLtJ雌性小鼠(n=5)的血糖水平。每5?7天檢測(cè)血糖水平直至達(dá)到糖尿病葡萄糖水平(>250mg/dL)。到達(dá)糖尿病血糖水平需要12?14周。未能達(dá)到高血糖癥血糖水平的小鼠被處以安樂(lè)死。
[0377]在建立高血糖癥之后，向所有小鼠提供氯霉素(lg/L)飲用水18小時(shí)，以除去共生存留的細(xì)菌。使來(lái)自過(guò)夜培養(yǎng)物并在LB培養(yǎng)基中1:500稀釋的Nissle菌株(Nissle、Nissle-GLP-1)生長(zhǎng)至0D600=1。通過(guò)以IOOOXg離心3分鐘收集細(xì)菌。將所得團(tuán)塊重新溶解于200 μ L含1%蔗糖的無(wú)菌LB。氯霉素處理后，小鼠通過(guò)口服管飼法以50 μ L/25g體重喂食含IO9CFU (0D600=20)的Nissle'Nissle-GLP-l或無(wú)細(xì)菌(僅有蔗糖的無(wú)菌培養(yǎng)基)的帶1%蔗糖LB。向小鼠喂食不含添加劑的單一菌株。一旦管飼法開(kāi)始，從小鼠籠中移去氯霉素處理的水。通過(guò)管飼法一天兩次喂食Nissle菌株或含蔗糖的無(wú)菌培養(yǎng)基46天。在細(xì)菌喂食開(kāi)始后的第11、21、30和46天檢測(cè)小鼠體重和血糖。
[0378]結(jié)果
[0379]一天兩次用Nissle-GLP-1、Nissle喂食或不用細(xì)菌口服喂食NOD小鼠46天。表I顯示實(shí)驗(yàn)中小鼠的存活和糖尿病`發(fā)作數(shù)據(jù)。所有處理各由5只小鼠開(kāi)始。除了喂食Nissle-GLP-1的小鼠，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到所有小鼠分泌高水平尿液。喂食Nissle-GLP-Ι的小鼠確實(shí)顯示尿液輸出水平提高，但沒(méi)有達(dá)到其它小鼠的程度。
[0380]在開(kāi)始喂食Nissle菌株之前，被認(rèn)為是高血糖癥陽(yáng)性的所有小鼠顯示血糖水平高于500mg/dL。每次實(shí)驗(yàn)中的平均小鼠禁食(6h)血糖水平示于圖21。喂食Nissle和Nissle-GLP-1的小鼠的血糖水平相較于對(duì)照小鼠都顯著降低。46天后，Nissle喂食相較于對(duì)照顯示出顯著效果(P=.01)，并且Nissle-GLP-Ι具有更顯著的效果(p=.0003)。Nissle-GLP-1和Nissle間也有顯著差異(p=.0008)。所有對(duì)比采用斯氏雙尾t檢驗(yàn)(n=4、3或2，參見(jiàn)表I)進(jìn)行(假定等方差)。
[0381]在不同處理間或?qū)嶒?yàn)過(guò)程的處理中，在小鼠體重方面沒(méi)有顯著差異。所有小鼠的重量普遍隨著時(shí)間減少(圖22)。
[0382]結(jié)論
[0383]這些數(shù)據(jù)指示，Nissle和Nissle-GLP-Ι都能顯著降低NOD小鼠內(nèi)的血糖水平。然而，這些數(shù)據(jù)來(lái)自非常小的小鼠組。到46天時(shí)，各組僅存2只小鼠。也就是說(shuō)，Nissle-GLP-1組中小鼠的血糖水平還遠(yuǎn)低于其它兩組，指示NOD小鼠針對(duì)任何重編程細(xì)胞可能激發(fā)的任何免疫應(yīng)答在該時(shí)間范圍內(nèi)沒(méi)有效果。
[0384]表1:該實(shí)施例的小鼠存活情況
[0385]表1:小鼠存活
【權(quán)利要求】
1.一種含有信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞，其中: a.所述信號(hào)序列調(diào)控宿主內(nèi)靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)； b.所述重組細(xì)胞獲自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌，和 c.所述信號(hào)序列是GLP-2、其片段或其類似物或其組合。
2.一種含有信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞，其中: a.所述信號(hào)序列調(diào)控宿主中靶核酸的信號(hào)依賴性表達(dá)； b.所述重組細(xì)胞獲自腸細(xì)菌或共生細(xì)菌，和 c.所述靶標(biāo)核酸編碼能夠使所述宿主的第一種細(xì)胞重編程為第二種細(xì)胞的哺乳動(dòng)物因子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述宿主是哺乳動(dòng)物。
4.如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述第二種細(xì)胞是β樣細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、肝細(xì)胞或免疫響應(yīng)性細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述宿主的第一種細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述第二種細(xì)胞是葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述信號(hào)序列調(diào)控靶核酸響應(yīng)環(huán)境刺激的信號(hào)依賴性表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子是葡萄糖響應(yīng)性啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述信號(hào)序列選自GLP-1、GIP、PDX-1、其一種或多種片段、其類似物或其組合。
10.如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述信號(hào)序列選自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、胰島素、生長(zhǎng)激素、促乳素、降鈣素、黃體生成激素、甲狀旁腺激素、促生長(zhǎng)素抑制素、促甲狀腺激素、血管活性腸多肽、三葉因子、細(xì)胞和組織修復(fù)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、采用反平行4 α螺旋束結(jié)構(gòu)的第I結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、IL-2、IL-3、IL_4、IL-5、IL-6、IL-7、IL9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM_CSF、M_CSF、SCF、IFN-y、EPO、G_CSF、LIF、OSM、CNTF, GH、PRL, IFNa /β、第2結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、TNF-家族細(xì)胞因子、TNFa、TNF3、⑶40、⑶27、FAS配體、IL-1-家族細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、包含短鏈α/β分子的第3結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、表皮生長(zhǎng)因子家族細(xì)胞因子、C-C或C-X-C趨化因子、胰島素相關(guān)細(xì)胞因子、第4結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、調(diào)蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、EGF、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域、其一個(gè)或多個(gè)片段、其類似物及其組合。
11.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述信號(hào)序列和所述啟動(dòng)子在所述重組細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上編碼。
12.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞源自益生菌。
13.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是選自埃希氏菌(Escherichia)、假單胞菌(Pseudomonas)、擬桿菌(Bacteroides)、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽抱桿菌(Bacillus)、變形桿菌(Proteus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒狀桿菌(Corynebacterium)的細(xì)菌。
14.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述靶核酸編碼哺乳動(dòng)物因子，所述哺乳動(dòng)物因子能促進(jìn)宿主內(nèi)所需生理過(guò)程功能，或能治療宿主內(nèi)非感染性疾病。
15.如權(quán)利要求14所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述非感染性疾病選自自體免疫性疾病、癌癥、內(nèi)分泌疾病、胃腸疾病、癌癥及其組合。
16.如權(quán)利要求14所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述非感染性疾病是糖尿病。
17.如權(quán)利要求16所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述糖尿病是I型糖尿病、2型糖尿病或代謝綜合癥。
18.如權(quán)利要求14所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述非感染性疾病選自克羅恩氏病、肥胖、苯丙酮尿癥、槭樹(shù)糖漿尿病、組氨酸血癥、高血糖癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、冠心病、毛細(xì)血間腎小球硬化癥、腎病、神經(jīng)病、四肢潰瘍或壞疽、動(dòng)脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、高血壓、高蛋白血癥、蛋白尿癥、骨質(zhì)疏松、貧血、高脂蛋白血癥、酮酸中毒、高甘油三酯血癥、乳酸性酸中毒、心肌病、威爾遜病、腦白質(zhì)病、巖藻糖苷病、癌癥、化療誘導(dǎo)的腹瀉、炎性腸病、心室和心房纖顫、手術(shù)后器官衰竭、腸易激綜合癥、間質(zhì)性膀胱炎/膀胱痛綜合癥、短腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎及其組合。
19.如權(quán)利要求18所述的重組細(xì)胞,其特征在于，所述癌癥是胃腸癌、胃癌、膽囊癌、胃腸基質(zhì)腫瘤、肝癌、胰腺癌或結(jié)腸癌。
20.如權(quán)利要求14所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物因子在腸損傷或手術(shù)后促進(jìn)所需生理過(guò)程功能。
21.如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞能夠到達(dá)腸絨毛但不被吸收進(jìn)入宿主全身循環(huán)。
22.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。
23.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子是fliC啟動(dòng)子。
24.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞還包括分泌標(biāo)簽。
25.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述分泌標(biāo)簽是fliC分泌標(biāo)簽。
26.如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述分泌標(biāo)簽是α-溶血素(HlyA)分泌標(biāo)簽。
27.如權(quán)利要求1所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞還包含細(xì)胞穿透肽(CPP)序列。
28.如權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞表達(dá)信號(hào)序列為融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含由所述信號(hào)序列編碼的信號(hào)和由所述細(xì)胞穿透肽序列編碼的細(xì)胞穿透肽。
29.一種治療宿主內(nèi)糖尿病的方法，所述方法包括對(duì)所述宿主給予如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞的步驟。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶信號(hào)序列刺激疾病預(yù)防因子表達(dá)或抑制糖尿病引發(fā)因子的表達(dá)。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述糖尿病是I型糖尿病、2型糖尿病或代謝綜合癥。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)序列調(diào)控靶核酸響應(yīng)環(huán)境刺激的信號(hào)依賴性表達(dá)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述環(huán)境刺激是葡萄糖。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述疾病預(yù)防因子包括胰島素。
35.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶核酸編碼促進(jìn)宿主內(nèi)血糖水平降低的哺乳動(dòng)物因子。
36.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶核酸編碼促進(jìn)宿主內(nèi)血液胰島素水平增加的哺乳動(dòng)物因子。
37.一種使哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)腸細(xì)胞分化成為另一種細(xì)胞類型的方法，所述方法包括對(duì)所述宿主給予如權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞的步驟。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述另一種細(xì)胞類型是β樣細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、肝細(xì)胞或免疫響應(yīng)性細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述β樣細(xì)胞是葡萄糖響應(yīng)性細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求29或37中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，給予有效量的所述重組細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求29或37中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述重組細(xì)胞的有效量是至少約 104CFU/kg。
42.如權(quán)利要求29或37中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述重組細(xì)胞與具有協(xié)同作用的化合物聯(lián)合給予 。
43.如權(quán)利要求29或37中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述具有協(xié)同作用的化合物選自DPP-4抑制劑、GLP-2、GLP-1激動(dòng)劑、二甲亞砜、胰島素、α -葡萄糖苷酶抑制劑、普蘭林肽、美格列奈、瑞格列奈、那格列奈、氯磺丙脲、甲福明二甲雙胍、磺脲、格列甲嗪、格列本脲、格列美脲、噻唑烷二酮類、其類似物、其片段及其組合。
44.如權(quán)利要求29或37中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述信號(hào)序列選自GLP-1、PDX-U GIP、GLP-2、胰島素、生長(zhǎng)激素、促乳素、降鈣素、黃體生成激素、甲狀旁腺激素、促生長(zhǎng)素抑制素、促甲狀腺激素、血管活性腸多肽、三葉因子、細(xì)胞和組織修復(fù)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、采用反平行4 α螺旋束結(jié)構(gòu)的第I結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、IL-2、IL_3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、GM-CSF, M-CSF, SCF、IFN-Y、EPO, G-CSF, LIF、OSM、CNTF, GH、PRL, IFN a / β、第 2 結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、TNF-家族細(xì)胞因子、TNFa、TNF0、⑶40、⑶27、FAS配體、IL-1-家族細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、包含短鏈α/β分子的第3結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、表皮生長(zhǎng)因子家族細(xì)胞因子、C-C或C-X-C趨化因子、胰島素相關(guān)細(xì)胞因子、第4結(jié)構(gòu)組細(xì)胞因子、調(diào)蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、EGF、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域、其一個(gè)或多個(gè)片段、其類似物及其組合。
45.如權(quán)利要求29或37中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)序列是GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、其片段、其類似物及其組合。
46.一種使宿主內(nèi)腸細(xì)胞重編程為葡萄糖響應(yīng)性胰島素分泌細(xì)胞的方法，所述方法包括給予包含信號(hào)序列和啟動(dòng)子的重組細(xì)胞的步驟，其中，所述信號(hào)序列選自GLP-1、GIP、rox-1、其片段、其類似物及其組合。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述宿主是高血糖癥患者，從而向所述高血糖癥宿主給予所 述重組細(xì)胞減少或消除對(duì)所述宿主治療性給予外源胰島素的需求。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103429742SQ201180060265
【公開(kāi)日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月15日
【發(fā)明者】J·C·馬奇, 段發(fā)平 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)