保護免受上呼吸道感染的非復(fù)制性益生菌微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非復(fù)制性益生菌微生物及其健康益處。例如，本發(fā)明涉及包含非復(fù)制性益生菌微生物的組合物，其用于治療或預(yù)防上呼吸道感染和/或其癥狀。本發(fā)明的實施方案提供了幫助父母保護其孩子免受此類上呼吸道感染的方法。
【專利說明】保護免受上呼吸道感染的非復(fù)制性益生菌微生物
[0001]本發(fā)明涉及非復(fù)制性益生菌微生物及其健康益處。例如，本發(fā)明涉及包含非復(fù)制性益生菌微生物的組合物，其用于治療或預(yù)防上呼吸道感染和/或其癥狀。本發(fā)明的實施方案提供了幫助父母保護其孩子免受此類上呼吸道感染的方法。
[0002]已知產(chǎn)生乳酸作為主要代謝成分的生物很長時間了。這些細菌可分別發(fā)現(xiàn)于乳或乳加工廠中，活的或腐爛的植物中，也可發(fā)現(xiàn)于人和動物的腸內(nèi)。在術(shù)語“乳酸菌”下概括的這些微生物代表了非常不同類的一組，并包含例如乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、片球菌屬(Pediococcus)等。 [0003]由于受益于在乳酸菌的發(fā)酵活動過程中產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物的低pH及抑制腐敗菌的生長的作用，所以乳酸菌已經(jīng)被用作發(fā)酵劑用于食品保藏。此外，乳酸菌也已經(jīng)被用于從乳制備多種不同的食品，如乳酪、酸奶和其他發(fā)酵乳制品。近來，乳酸菌已經(jīng)引起了很多關(guān)注，這是因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些菌株在攝取后顯示出對人和動物有價值的性質(zhì)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的特定菌株能夠寄居在腸粘膜上，并幫助維持人和動物的安康。
[0004]在這方面，EP0768375公開了雙歧桿菌屬的特定菌株，其能夠移植到腸內(nèi)微生物區(qū)系中并可以粘附腸細胞。據(jù)報道這些雙歧桿菌幫助免疫調(diào)節(jié)，能夠競爭性地排除病原菌粘附腸細胞，從而幫助維持個體的健康。
[0005]研究也已經(jīng)聚焦在乳酸菌作為益生菌劑的潛在用途上。認為益生菌是有生活力的微生物制劑，其通過保護腸內(nèi)的天然微生物區(qū)系而促進個體健康。認為益生菌附著到腸粘膜上，寄居在腸道內(nèi)并且也防止有害微生物附著其上。它們起作用的至關(guān)重要的前提在于它們必須以適當(dāng)且存活的形式到達腸粘膜并且在胃腸道上段不被破壞，尤其是不被胃中普遍的低pH影響所破壞。
[0006]同時，研究工作的部分目標(biāo)在于提供額外的益生菌菌株，其顯示出對人和/或動物，如寵物有益的新性質(zhì)。
[0007]例如，W02008042101提供了用于降低兒童中的呼吸系統(tǒng)疾病的方法，其包括:提供嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)的培養(yǎng)物；提供處于發(fā)展成呼吸系統(tǒng)疾病風(fēng)險的兒童；并且在一定條件下將嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)物施用于處于風(fēng)險的兒童，以使發(fā)展成呼吸系統(tǒng)疾病的風(fēng)險降低。
[0008]然而，將活的益生菌加入到產(chǎn)品中，以使它們直到消費時仍保持生活力不是容易的工作。特別是對于具有較長儲存時間的產(chǎn)品，這很難實現(xiàn)，并且可能需要額外的技術(shù)努力。
[0009]因此，期望的是得到這樣的組合物，其可以提供益生菌的益處，同時易于制備和儲存，而不會丟失活性。
[0010]本發(fā)明人旨在提供這樣的組合物，其幫助父母保護他們自身及其孩子免受上呼吸道感染。所述組合物應(yīng)易于制備并且即使產(chǎn)品可能會儲存較長時間，所述組合物的活性應(yīng)當(dāng)保持在高水平。該組合物應(yīng)允許安全地治療或預(yù)防上呼吸道感染，而無副作用。應(yīng)減少上呼吸道感染將持續(xù)的時間。還應(yīng)降低發(fā)生上呼吸道感染的風(fēng)險。[0011]因此，本發(fā)明的目標(biāo)是為本領(lǐng)域提供組合物，所述組合物處理了上文表述的一種或多種需要。
[0012]本發(fā)明人驚奇的看到通過獨立權(quán)利要求的主題能實現(xiàn)該目的。從屬權(quán)利要求進一步發(fā)展了本發(fā)明的思想。
[0013]因此，本發(fā)明涉及包含非復(fù)制性益生菌微生物的組合物，其用于預(yù)防或治療上呼吸道感染。
[0014]本發(fā)明還涉及非復(fù)制性益生菌微生物在制備這樣的組合物中的用途，所述組合物治療或預(yù)防上呼吸道感染。
[0015]本發(fā)明組合物可以在秋季和/或冬季期間施用。在此期間，患上呼吸道感染的概率特別高。
[0016]例如，可以在早晨施用組合物，以在這一天中增強身體針對上呼吸道感染的防御系統(tǒng)。
[0017]可以將本發(fā)明的組合物施用于人類或?qū)櫸?。寵物可以是例如狗或貓?br> [0018]兒童很可能患上呼吸道感染，因為例如在學(xué)校或者在幼兒園，他們與許多其他個體緊密接觸。
[0019]因此，可以將本發(fā)明組合物施用于兒童，例如施用于嬰兒或幼兒。
[0020]對于人而言，兒童至18歲。幼兒至12歲，而嬰兒是12個月以下的兒童。
[0021]“非復(fù)制性”益生 菌微生物包括已經(jīng)受到熱處理的益生菌。這包括滅活的、死的、無生活力的和/或以碎片如DNA、代謝物、胞質(zhì)化合物和/或細胞壁物質(zhì)存在的微生物。
[0022]“非復(fù)制性”指的是通過經(jīng)典的平板接種方法可以檢測的無生活力的細胞和/或菌落形成單位。在微生物書中概述了這些經(jīng)典的平板接種方法:James Monroe Jay, MartinJ.Loessnerj David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, SpringerScience, New York, N.Y.790p。通常地,存活細胞的缺失可以按照以下顯示:用不同濃度細菌制備物(“非復(fù)制”的樣品)接種并且在適合的條件(有氧和/或厭氧空氣中持續(xù)至少24小時)下培育后，在瓊脂平板上沒有可見的菌落或者在液體生長培養(yǎng)基中沒有增加的濁度。
[0023]為本發(fā)明的目的將益生菌定義為“對宿主的健康或者安康有有益作用的微生物細胞制劑或者微生物細胞組分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:howshould they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0024]使用非復(fù)制性益生菌微生物的可能性提供了幾個好處。在嚴重的免疫受損的嬰兒或幼兒中，在特殊的情況下由于患上菌血癥的潛在風(fēng)險，活的益生菌的使用受到限制?？梢詻]有任何問題地使用非復(fù)制性益生菌。
[0025]另外，非復(fù)制性益生菌微生物的提供在保留健康益處的同時允許熱重構(gòu)。
[0026]本發(fā)明的組合物是任何類型的組合物，其適合于對人或?qū)櫸锸┯谩Ｒ虼?，該組合物可以是食品、寵物食品、營養(yǎng)制品、食品補充劑、粉末營養(yǎng)組合物、食品添加劑或飲料。
[0027]上呼吸道感染可以選自鼻炎、鼻竇炎、鼻咽炎、咽炎、會厭炎、喉炎、喉氣管炎、氣管炎或其組合。
[0028]上呼吸道感染的癥狀可以選自咳嗽、咽喉痛、流鼻涕、鼻充血、頭痛、低熱、面部脹感(facial pressure)、打噴嚷及其組合。
[0029]由于上呼吸道感染通常與不適以及行為和注意力喪失相關(guān)，因此需要保護兒童免受此類感染。
[0030]本發(fā)明人驚奇的看到，例如在免疫增強效應(yīng)方面和/或在抗炎效應(yīng)方面，非復(fù)制性益生菌微生物比復(fù)制性益生菌微生物更有效。
[0031]此外，經(jīng)熱處理的非復(fù)制性Lal(NCC533，保藏號CNCM 1-1225)強烈地誘導(dǎo)防衛(wèi)素表達。防衛(wèi)素是人體中抗微生物肽的最重要類型中的一種。防衛(wèi)素由肺、皮膚、口腔、泌尿生殖道、呼吸道和胃腸道的上皮細胞產(chǎn)生。其中，有包括防衛(wèi)素UhBD1)和防衛(wèi)素2(hBD2)的防衛(wèi)素家族。例如，發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理的約氏乳桿菌(Lal，NCC533，保藏號CNCM 1-1225)比它的活的對應(yīng)物更強的上調(diào)hBDl。hBDl展示對廣譜細菌包括大腸桿菌和綠膿桿菌、幽門螺桿菌(H.pylori )的抗菌活性(Nuding, S.,等人.,2009, Microbes.1nfect.11:384-393)，同時也展示對酵母如白假絲酵母(0’Neil，D.A.2003，Mol.1mmunol40:445-450)的抗菌活性和對病毒(人免疫缺陷病毒)(Kota, S.Et al.，2008，J.Biol.Chem283:22417-22429)的抗病毒活性。因此，這些抗微生物多肽將增強黏膜屏障并且因此限制細菌的黏附和侵入。
[0032]因此，本發(fā)明的組合物可用于保護兒童免于上呼吸道感染。
[0033]特別地，本發(fā)明的組合物將允許父母保護他們的孩子免于上呼吸道感染。
[0034]本發(fā)明的組合物還可用于增強兒童對抗上呼吸道感染的能力。兒童的活躍的生活方式對其發(fā)育非常重要，但也涉及與許多可能的傳染源接觸。對不想要的感染的強防御機制將支持他們的安康。
[0035]因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物還可用于幫助兒童更少地發(fā)生上呼吸道感染。兒童發(fā)生上呼吸道感染的概率可以降低至少10%、至少25%、至少30%，或優(yōu)選至少50%。
[0036]本發(fā)明組合物的改善的抗炎性質(zhì)、改善的免疫增強效應(yīng)和/或通過本發(fā)明組合物上調(diào)的防衛(wèi)素表達將增強防御機 制，導(dǎo)致更少的上呼吸道感染。
[0037]本發(fā)明的組合物還可用于減少上呼吸道感染將持續(xù)的時間。例如，上呼吸道感染將持續(xù)的時間可以減少至少10%、至少25%、至少30%，或優(yōu)選地至少50%。
[0038]因此，本發(fā)明的非復(fù)制性益生菌代表了藥物的安全且天然的備選。
[0039]本發(fā)明的組合物可以進一步地包含益生元。在益生菌成為非復(fù)制性細菌之前益生元可以支持益生菌的生長。“益生元”指的是不能消化的食物物質(zhì)，其促進健康有益的微生物和/或益生菌在腸中的生長。益生元在胃中和/或腸的上段不被分解并且在攝食它們的人的胃腸道中不被吸收，但是它們被胃腸道微生物群和/或益生菌發(fā)酵。例如Glenn R.Gibson 和 Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulation of the Human ColonicMicrobiota:1ntroducing the Concept of Prebiotics, J.Nutr.1995125:1401-1412 中定義了益生元。
[0040]根據(jù)本發(fā)明可以使用的益生元沒有特別地限制并且包括促進益生菌或健康有益的微生物在腸中生長的所有食物物質(zhì)。優(yōu)選地，它們可以選自任選地包含果糖、半乳糖、甘露糖的寡糖；膳食纖維，特別是可溶性纖維、大豆纖維；菊粉或者它們的混合物。優(yōu)選的益生元是低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚異麥芽糖(MO)、低聚木糖(XOS)、低聚阿拉伯-木糖(AXOS)、低聚甘露糖(MOS)、大豆低聚糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳酮糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)低聚糖(PAO)、低聚麥芽糖、樹膠和/或其水解產(chǎn)物、果膠和/或其水解產(chǎn)物。例如，該組合物可以包含低聚果糖、菊粉或者它們的組合。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含任何有效量的非復(fù)制性益生菌微生物，例如相應(yīng)于約IO6至1012cfu/g干重的量的非復(fù)制性益生菌微生物。
[0042]本發(fā)明的組合物包含足夠至少部分產(chǎn)生健康益處的量的非復(fù)制性益生菌微生物。將足夠?qū)崿F(xiàn)該目的的量定義為“治療有效劑量”。用于該目的的有效量將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多因素如兒童的體重和一般健康狀況以及食品基質(zhì)的影響。
[0043]在預(yù)防應(yīng)用中，根據(jù)本發(fā)明的組合物以一定量施用給易感染病癥或者處在該病癥的風(fēng)險中的人，所述量足夠至少部分地降低患上這種病癥的風(fēng)險。這種量被定義為“預(yù)防有效劑量”。再次，該精確量取決于很多因素如兒童的健康狀況和體重以及食品基質(zhì)的影響。
[0044]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量。
[0045]一般本發(fā)明的組合物含有治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量的非復(fù)制性益生菌微生物。
[0046]通常，治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量在每日劑量約0.005mg -1OOOmg非復(fù)制性益生菌微生物范圍內(nèi)。
[0047]在數(shù)值的量方面，經(jīng)“短時間高溫”處理的非復(fù)制性益生菌微生物可以在組合物中以相應(yīng)于IO4至IO12當(dāng)量cfu/g干組合物的量存在。顯然，非復(fù)制微生物不形成菌落，因此，該術(shù)語將被理解為從IO4至1012cfu/g復(fù)制細菌得到的非復(fù)制微生物的量。該非復(fù)制微生物包括滅活的、無生活力的、死的或以碎片如DNA或細胞壁或胞質(zhì)化合物存在的微生物。換句話說，組合物包含的微生物的數(shù)量用該數(shù)量微生物的菌落形成能力(cfu)表述，就好像全部微生物是存活的，而不考慮事實上它們是非復(fù)制的如滅活的或者死的、碎片化的或者這些狀態(tài)的任一個或者全部的混合。
[0048]優(yōu)選地，非復(fù)制性 益生菌微生物以相當(dāng)于IO4至109cfu/g干組合物的量，更優(yōu)選地以相當(dāng)于IO5至109cfu/g干組合物的量存在。
[0049]益生菌可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法成為非復(fù)制性的。
[0050]使益生菌菌株成為非復(fù)制性益生菌的如今可得到的技術(shù)通常是熱處理、Y -照射、紫外線或者使用化學(xué)試劑(福爾馬林、多聚甲醛)。
[0051]優(yōu)選地使用在食品工業(yè)中工業(yè)環(huán)境下相對容易應(yīng)用的技術(shù)來使益生菌成為非復(fù)制性益生菌。
[0052]今天市場上包含益生菌的大部分產(chǎn)品在它們的生產(chǎn)中是經(jīng)熱處理的。因此，方便的是能對益生菌與生產(chǎn)的產(chǎn)品一起進行熱處理或者至少以相似的方式處理，同時益生菌保留或者改進它們的有益性質(zhì)或者甚至獲得對于消費者新的有益性質(zhì)。
[0053]然而，在文獻中通過熱處理失活益生菌微生物通常與益生菌活性的至少部分損失相關(guān)聯(lián)。
[0054]本發(fā)明現(xiàn)在人驚奇的發(fā)現(xiàn)，例如通過熱處理使益生菌微生物成為非復(fù)制性益生菌不會導(dǎo)致益生菌健康益處的損失，而是相反-可以增強現(xiàn)存的健康益處并且甚至產(chǎn)生新的健康益處。
[0055]因此，本發(fā)明的一個實施方案是組合物，其中所述非復(fù)制性益生菌微生物通過熱處理成為非復(fù)制性的益生菌。
[0056]這種熱處理可以在至少71.5° C進行至少I秒。
[0057]可以使用長期熱處理或者短期熱處理。
[0058]今天在工業(yè)規(guī)模上，通常優(yōu)選的是短期熱處理，如UHT樣的熱處理。該類型的熱處理減少了細菌負荷，并且減少了加工時間，因此減少了營養(yǎng)的破壞。
[0059]本發(fā)明人第一次證實經(jīng)高溫短時間熱處理的益生菌微生物顯示抗炎免疫譜而不管它們起始的性質(zhì)如何。特別地，通過該熱處理發(fā)展了新的抗炎譜或增強了現(xiàn)存的抗炎譜。
[0060]因此通過使用對應(yīng)于通常工業(yè)可應(yīng)用的熱處理的特定的熱處理參數(shù)可能產(chǎn)生具有抗炎免疫譜的非復(fù)制性益生菌微生物，即使該非復(fù)制性益生菌微生物的活的對應(yīng)物不是抗炎菌株。
[0061]因此，例如熱處理可以是在約71.5-150° C下約1_120秒的高溫處理。高溫處理可以是高溫/短時間(HTST)處理或者超高溫(UHT)處理。
[0062]益生菌微生物可以在約71.5-150° C下進行約1_120秒的短期高溫處理。
[0063]更優(yōu)選地，微生物可以在約90-140° C，例如90° -120° C下進行約1_30秒的短
期高溫處理。
[0064]這種高溫處理使微生物至少部分成為非復(fù)制性的。
[0065]高溫處理可以在正常大氣壓下進行，但也可以在高壓下進行。典型的壓力范圍是I至50巴，優(yōu)選I至10巴，更優(yōu)選2至5巴。顯然，如果益生菌在液體或者固體培養(yǎng)基中進行熱處理，當(dāng)加熱時，壓力是優(yōu)選的。因此應(yīng)用的理想壓力將取決于提供微生物的組合物的性質(zhì)和使用的溫度。
[0066]高溫處理可以在約71.5-150° C，優(yōu)選地約90-120 ° C，甚至更優(yōu)選地約120-140° C的溫度范圍內(nèi)進行。
[0067]高溫處理可以在約1- 120秒，優(yōu)選地約1-30秒，甚至更優(yōu)選地約5_15秒的短期內(nèi)進行。
[0068]該給定的時間范圍指的是益生菌微生物在給定的溫度下進行的時間。注意取決于提供微生物的組合物的性質(zhì)和量并且取決于使用的加熱設(shè)備的結(jié)構(gòu)，熱應(yīng)用的時間可以不同。
[0069]然而，通常用高溫短時間(HTST)處理、巴氏瞬間滅菌法或者超高溫(UHT)處理處理本發(fā)明的組合物和/或微生物。
[0070]UHT處理是超高溫處理或者超熱處理(都簡寫為UHT)，所述UHT處理涉及在超過135° C(275° F)的溫度下通過短時間約1-10秒的加熱使組合物至少部分滅菌，超過135° C的溫度是滅活奶中細菌孢子需要的溫度。例如，用超過135° C的溫度的方式加工奶允許在必要的保持時間(2-5秒)內(nèi)降低細菌負荷，使得能夠連續(xù)流動操作。
[0071]有兩種主要類型的UHT系統(tǒng):直接和間接系統(tǒng)。在直接系統(tǒng)中，通過蒸汽注射或者蒸汽注入處理產(chǎn)品，然而在間接系統(tǒng)中，使用板式熱交換器、管式熱交換器或者刮面式換熱器對產(chǎn)品進行熱處理。UHT系統(tǒng)的組合可應(yīng)用于產(chǎn)品制備方法中的任一步驟或者多個步驟。
[0072]HTST處理定義如下(高溫/短時間):設(shè)計的巴氏消毒法實現(xiàn)了 5個數(shù)量級的減少:滅活奶中存活微生物數(shù)目的99.9999%。認為該處理足夠破壞幾乎全部的酵母、霉菌和常見的腐敗細菌并且也保證足夠破壞常見致病性熱抗性生物。在HTST方法中將奶加熱到71.7V (161。F)持續(xù) 15-20 秒。
[0073]巴氏瞬間滅菌法是易腐飲料如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品的熱巴氏消毒法。它在產(chǎn)品裝入容器之前進行以殺死腐敗微生物從而使產(chǎn)品更安全并且延長它們的貨架期。當(dāng)液體在71.50C (160° F)至74V (165° F)的溫度下進行約15至30秒的處理時，液體在可控的持續(xù)流中移動。
[0074]對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“短時間高溫處理”將包括例如高溫短時間(HTST)處理、UHT處理、和巴氏瞬間滅菌法。
[0075]因為這樣的熱處理提供了具有改進的抗炎譜的非復(fù)制性益生菌，本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防或治療炎癥病癥。
[0076]如果使用長期熱處理使益生菌微生物成為非復(fù)制微生物，這種熱處理可以在約70-150° C的溫度范圍進行約3分鐘-2小時，優(yōu)選地在80-140° C的范圍進行5分鐘-40分鐘。
[0077]盡管本領(lǐng)域一般性教導(dǎo)了通過長期熱處理成為非復(fù)制的細菌在發(fā)揮它們的益生菌性質(zhì)方面一般沒有活細胞有效，但是本發(fā)明人能證實經(jīng)熱處理的益生菌比它們活的對應(yīng)物更好地刺激免疫系統(tǒng)。
[0078]本發(fā)明也涉及包含益生菌微生物的組合物，所述益生菌微生物通過在至少約70° C下至少約3分鐘的熱處理成為非復(fù)制的益生菌。
[0079]通過體外免疫作圖證實非復(fù)制性益生菌的免疫增強效果。使用的體外模型使用來自人外周血單核細胞(PBMCs)的細胞因子作圖，并且在本領(lǐng)域中被接受為用于免疫調(diào)節(jié)化合物檢測的標(biāo)準(zhǔn)模型(Schultz等人，2003, Journalο f Dairy Research7 O，I 65-1 73;Tay 1r 等人,2006, Clinical andExperimental Allergy, 36, 1227-1235;Kekkonen 等人，2008，World Journal ofGastroenterology, 14, 1192-1203)。
[0080]一些作者/研究團隊已經(jīng)使用了體外的PBMC測定，例如根據(jù)它們的免疫譜，即它們的抗-或者促-炎癥特征對益生菌分類(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14，1192-1203)。例如，在腸結(jié)腸炎的小鼠模型中已經(jīng)顯示該測定允許候選益生菌抗炎效應(yīng)的預(yù)測(Foligne，B.，等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在臨床試驗中該測定通常用作讀出并且顯示得到與臨床結(jié)果一致的結(jié)果(Schultz等人，2003，Journalof Dairy Research70, 165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and ExperimentalAllergy, 36，1227-1235)。
[0081]在過去的幾十年中變應(yīng)性疾病已經(jīng)逐步增加并且如今被WHO認為是流行病。一般來說，認為免疫系統(tǒng)的Thl和Th2反應(yīng)之間的不平衡導(dǎo)致對Th2介體產(chǎn)生的強烈的偏向，引起變態(tài)反應(yīng)。因此，可通過恢復(fù)免疫系統(tǒng)的Thl和Th2臂之間適當(dāng)?shù)钠胶鉁p輕、下調(diào)或者預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。這暗示了減輕Th2反應(yīng)或者至少暫時地增強Thl反應(yīng)的必要性。后者將是免疫增強反應(yīng)的特征，常伴隨著例如IFNY，TNF_a和IL-12的更高水平(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203;Viljanen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。
[0082]因此，本發(fā)明的組合物允許治療或者預(yù)防涉及受損的免疫防御的病癥。
[0083]本發(fā)明描述的組合物允許增強對疫苗特別是口服疫苗的應(yīng)答。
[0084]非復(fù)制微生物的任何量將是有效的。然而，通常優(yōu)選地，至少90%，優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非復(fù)制的。[0085]在本發(fā)明的一個實施方案中，所有微生物是非復(fù)制的。
[0086]因此，在本發(fā)明的組合物中，至少90%，優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非復(fù)制的。
[0087]所有益生菌微生物可用于本發(fā)明的目的。 [0088]例如，益生菌微生物可以選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、丙酸桿菌屬或者它們的組合，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilu)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、二丁酮乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌(Escherichia coli)和 / 或它們的混合物。
[0089]根據(jù)本發(fā)明的組合物可以例如包含非復(fù)制的益生菌微生物，所述益生菌微生物選自長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、約漢遜氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC15、乳乳球菌NCC2287或它們的組合。
[0090]所有這些菌株按照布達佩斯條約保藏和/或可以通過商業(yè)途徑得到。
[0091]按照布達佩斯條約已經(jīng)保藏的菌株如下:
[0092]長雙歧桿菌NCC3001:ATCC BAA-999
[0093]雙歧桿菌NCC2705:CNCM 1-2618
[0094]短雙歧桿菌NCC2950:CNCM 1-3865
[0095]乳雙歧桿菌NCC2818:CNCM 1-3446
[0096]類干酪乳桿菌NCC2461:CNCM 1-2116
[0097]鼠李糖乳桿菌NCC4007 =CGMCCl.3724
[0098]嗜熱鏈球菌NCC2019:CNCM 1-1422
[0099]嗜熱鏈球菌NCC2059:CNCM 1-4153
[0100]乳乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154
[0101]干酪乳桿菌NCC4006:CNCM 1-1518
[0102]干酪乳桿菌NCC1825:ACA-DC6002
[0103]嗜酸乳桿菌NCC3009:ATCC700396
[0104]保加利亞乳桿菌NCC15:CNCM 1-1198
[0105]約漢遜氏乳桿菌Lal:CNCM 1-1225[0106]路氏乳桿菌DSM17983:DSM17983
[0107]路氏乳桿菌ATCC55730:ATCC55730
[0108]大腸桿菌Nisslel917:DSM6601
[0109]命名為ATCC的菌株保藏在ATCC專利保藏中心(ATCC Patent Depository),10801University Blvd., Manassas, VA20110,美國。
[0110]命名為CNCM的菌株保藏在國立微生物保藏中心(COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMESXCNCM),25rue du Docteur Roux，F(xiàn)_75724PARIS Cedexl5,法國。
[0111]命名為CGMCC的菌株保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center),微生物學(xué)研究所(Institute ofMicrobiology),中國科學(xué)院(Chinese Academy of Sciences),中關(guān)村(Zhongguancun)，P.0.Box2714，北京(Beijing) 100080，中國。
[0112]命名為ACA-DC的菌株保藏在希臘協(xié)調(diào)微生物保藏中心(Greek CoordinatedCollections of Microorganisms), DairyLaboratory, Department of Food Science andTechnology, Agricultural University of Athens,75, Iera odos, Botanikos, Athens,11855，希臘。
[0113]命名為DSM的菌 株保藏在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig,德國。
[0114]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解他們可以自由組合本文描述的本發(fā)明的所有特征，而不背離公開的本發(fā)明范圍。
[0115]本發(fā)明其他的優(yōu)點和特征從以下的實施例和附圖中是明顯的。
[0116]圖1A和B顯示用“短時間高溫”處理的益生菌的抗炎免疫譜的增強。
[0117]圖2顯示非抗炎益生菌菌株經(jīng)過“短時間高溫”處理后成為抗炎的益生菌菌株，即在體外展示顯著的抗炎免疫譜。
[0118]圖3A和B顯示通過商業(yè)途徑可得到的產(chǎn)品中使用的益生菌菌株，其經(jīng)過“短時間高溫”處理后在體外展示增強的或者新的抗炎免疫譜。
[0119]圖4A和B顯示乳品起始菌株(即Lcl起始菌株)，其經(jīng)過高溫?zé)崽幚砗笤隗w外展示增強的或者新的抗炎免疫譜。
[0120]圖5顯示非抗炎益生菌菌株，其經(jīng)過HTST處理后在體外展示抗炎免疫譜。
[0121]圖6:PBMC 數(shù)據(jù)的主要成分分析(IL_12p40，IFN- Y , TNF- a , IL-10)，所述 PBMC 數(shù)據(jù)由活的和經(jīng)熱處理的(140° C15秒)益生菌和乳品起始菌株產(chǎn)生。每個點代表活的或經(jīng)熱處理的一種菌株，所述菌株通過它的NCC號或者名稱鑒定。
[0122]圖7顯示活的和受熱處理的(85° C，20分鐘)菌株的IL-12p40/IL_10比例?？偟膩碚f，在85° C20分鐘的熱處理導(dǎo)致IL-12p40/IL-10比例的增加，該結(jié)果與本發(fā)明的“短時間高溫”處理的結(jié)果相反(圖1、2、3、4和5)。
[0123]圖8顯示體外細胞因子分泌的增強，該細胞因子分泌來自受熱處理的細菌刺激的人 PBMCs。
[0124]圖9顯示在用鹽水攻擊的OVA敏化的小鼠(陰性對照)中，在用OVA攻擊的OVA敏化的小鼠(陽性對照)以及用OVA攻擊并且用進行熱處理的或者活的短雙歧桿菌NCC2950處理的OVA敏化小鼠中觀察的腹瀉強度的百分數(shù)。結(jié)果顯示為腹瀉強度的百分數(shù)(平均值土SEM，從4次獨立的實驗計算)，100%的腹瀉強度相應(yīng)于陽性對照(敏化并且用變應(yīng)原攻擊的)組中發(fā)生的癥狀。
[0125]圖10顯示了與其他經(jīng)熱處理的菌株相比，在120 °C下熱處理15秒鐘的Lal (NCC533,保藏號CNCM 1-1225)在體外強烈地誘導(dǎo)腸上皮細胞中的hBDlmRNA。將T84細胞與經(jīng)熱處理的菌株溫育4小時。通過實時PCR分析hBDl的基因表達。條形代表對未刺激的細胞的基本表達歸一化的平均值土 sem。
[0126]圖11顯示了經(jīng)高溫及短時間處理的Lal (NCC533,保藏號CNCM1-1225)傾向于最好地誘導(dǎo)hBDlmRNA的表達。用活的和在120°C下熱處理15秒鐘或在85°C下熱處理20分鐘的Lal (NCC533,保藏號CNCM1-1225)刺激T84細胞4小時。通過實時PCR分析hBDl的基因表達。條形代表對未刺激的細胞的基本表達歸一化的平均值土sem。
[0127]實施例1:
[0128]方法學(xué)
[0129]細菌制備:
[0130]活的益生菌在宿主免疫系統(tǒng)上傳遞的健康益處一般認為是菌株特異性的。在體外(PBMC測定)誘導(dǎo)高水平IL-10和/或誘導(dǎo)低水平促炎細胞因子的益生菌在體內(nèi)已經(jīng)顯示是有效的抗炎菌株(Foligne, B.,等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0131]一些益生菌菌株用于研究受熱處理的益生菌的抗炎性質(zhì)。這些益生菌菌株是長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NC C4007、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002 (NCC1825)以及大腸桿菌Nissle。也測試了一些起始培養(yǎng)菌株，其包括商業(yè)上用于生產(chǎn)雀巢LcI發(fā)酵產(chǎn)品的一些菌株:嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、保加利亞乳桿菌NCC15和乳乳球菌NCC2287。
[0132]在5-15L生物反應(yīng)器中用為每種菌株優(yōu)化的條件培養(yǎng)細菌細胞?？梢允褂盟谐Ｓ玫募毦L培養(yǎng)基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知這些培養(yǎng)基。當(dāng)PH調(diào)節(jié)到5.5時，連續(xù)地加入30%的堿溶液(NaOH或Ca(OH)2X適當(dāng)時，通過向頂空充入CO2維持厭氧條件。在標(biāo)準(zhǔn)的厭氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌。
[0133]通過離心(5，OOOx g，4° C)收集細菌細胞并在適當(dāng)體積的磷酸緩沖鹽水(PBS)中重懸浮以達到約109-101(lCfU/ml的終濃度。用15%的甘油將制備物的一部分冷凍于-80° C。對細胞的另一部分通過如下條件進行熱處理:
[0134]-超高溫:通過間接熱注射，在140°C持續(xù)15秒，
[0135]-高溫短時間(HTST):通過間接熱注射，在74°C，90° C和120° C分別持續(xù)15秒，
[0136]-長時間低溫(85°C，20分鐘)，在水浴中。
[0137]熱處理時，將樣品冷凍于-80° C直至使用。
[0138]細菌制備物的體外免疫作圖:
[0139]評估活的和受熱處理的細菌制備物的免疫譜(即體外誘導(dǎo)來自人血細胞的特定細胞因子分泌的能力)。從血液濾器分離人外周血單核細胞(PBMCs)。用細胞密度梯度分離后，收集單核細胞并且用Hanks平衡鹽溶液洗滌兩次。然后用補充10%胎牛血清(Bioconcept，巴黎，法國)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma)以及0.1%慶大霉素(Sigma)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM, Sigma)重懸浮細胞。然后在48孔板中將PBMCs(7xl05細胞/孔)與活的以及經(jīng)熱處理的細菌(相當(dāng)于7xl06cfU/孔)共同培養(yǎng)36小時。培養(yǎng)36小時后，在細胞因子測量之前將培養(yǎng)板冷凍并保存于-20° C。平行地進行(即對相同批次的PBMCs進行相同的實驗)活的細菌和它們受熱處理的對應(yīng)物的細胞因子作圖。 [0140]36小時的培育后，按照制造商的說明用ELISA(R&D DuoSet人IL-10，BD OptEIA人IL12p40，BD OptEIA人TNF a，BD OptEIA人IFN- y)測定細胞培養(yǎng)上清液中的細胞因子(IFN- Y , IL-12p40, TNF-α 和 IL-10)水平。IFN- y , IL_12p40 和 TNF-α 是促炎細胞因子，而IL-10是有效的抗炎介體。結(jié)果表示成4個個體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM,并且代表每次實驗用4個供體進行的2次單獨實驗的結(jié)果。計算每種菌株的IL-12p40/IL-10比例作為體內(nèi)抗炎效應(yīng)的預(yù)測值(Foligne1B.,等人，2007，WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。
[0141]將通過ELISA (見上文)測定的每種菌株的數(shù)值細胞因子值傳送至BioNumericsv5.10軟件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利時)。對該組數(shù)據(jù)進行主要成分分析(PCA，尺寸標(biāo)注技術(shù))。該分析包括減去這些特征上的均值以及除以這些特征上的方差。
[0142]結(jié)果
[0143]通過超高溫(UHT)/高溫短時間(HTST)樣的處理產(chǎn)生的抗炎譜
[0144]對研究的益生菌菌株進行一系列的熱處理(超高溫(UHT)，高溫短時間(HTST)以及85° C下20分鐘)并將它們的體外免疫譜與活細胞的免疫譜比較。當(dāng)與人PBMC溫育時，活的微生物(益生菌和/或乳品起始培養(yǎng)物)誘導(dǎo)不同水平的細胞因子產(chǎn)生(圖1，2，3，4和5)。這些微生物的熱處理以溫度依賴的方式改變PBMC產(chǎn)生的細胞因子水平?！岸虝r間高溫”處理(120° C或140° C15秒)產(chǎn)生具有抗炎免疫譜的非復(fù)制細菌(圖1，2，3和4)。實際上，經(jīng)UHT樣處理的菌株(140° C，15秒)誘導(dǎo)更少的促炎細胞因子(TNF- a , IFN-y, IL-12p40)而維持或者誘導(dǎo)額外的IL-10產(chǎn)生(與活的對應(yīng)物比較)。與活細胞相比，任何經(jīng)UHT樣處理的菌株得到的IL-12p40/IL-10比例更低(圖1，2，3和4)。對于經(jīng)HTST樣處理，即進行120° C15秒(圖1，2，3和4)，或74。C和90。C15秒(圖5)熱處理的細菌，該觀察結(jié)果也是有效的。熱處理(UHT樣或HTST樣處理)對益生菌菌株(圖1，2，3和5)和乳品起始培養(yǎng)物(圖4)的體外免疫譜具有相似的效應(yīng)。PBMC數(shù)據(jù)的主要成分分析揭示活的菌株全部沿著X軸散布，說明所述菌株在體外展示非常不同的免疫譜:促炎細胞因子的從低(左側(cè))到高(右側(cè))的誘導(dǎo)物，所述PBMC數(shù)據(jù)由活的和經(jīng)熱處理(140° C，15秒)的益生菌和乳品起始菌株產(chǎn)生。經(jīng)熱處理的菌株聚集在圖的左側(cè)，表明經(jīng)熱處理的菌株誘導(dǎo)較少的促炎細胞因子(圖6)。相比，在85° C熱處理20分鐘的細菌比活細胞誘導(dǎo)更多的促炎細胞因子和更少的IL-10，得到更高的IL-12p40/IL-10比例(圖7)。
[0145]UHT樣和HTST樣處理增強或者產(chǎn)生抗炎譜。
[0146]不管它們各自起始的免疫譜(活細胞)如何，經(jīng)UHT和HTST處理的菌株展示了抗炎譜。已知體內(nèi)抗炎和體外展示抗炎譜的益生菌菌株(長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818)經(jīng)“短時間高溫”處理后在體外展示增強的抗炎譜。如圖1顯示，經(jīng)UHT樣處理的雙歧桿菌菌株的IL-12P40/IL-10比例比活的對應(yīng)物的IL-12p40/IL-10比例更低，因此經(jīng)UHT樣處理的樣品顯示改進的抗炎譜。更顯著地，為非抗炎活菌株也證實通過UHT樣或HTST樣處理產(chǎn)生抗炎譜。活的鼠李糖乳桿菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC2461都在體外展示高的IL-12p40/IL_10比例(圖2和5)。顯示這兩種活的菌株不能提供針對小鼠中TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的保護。經(jīng)“短時間高溫”處理后(UHT或HTST)，鼠李糖乳桿菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC2461誘導(dǎo)的IL-12p40/IL_10比例顯著地降低，達到低至用雙歧桿菌菌株得到的水平。這些低的IL-12p40/IL-10比例是由于IL-12p40產(chǎn)生的低水平以及IL-1O分泌沒有改變(鼠李糖乳桿菌NCC4007)或者受到顯著誘導(dǎo)(類干酪乳桿菌NCC2461)(圖2)。
[0147]因此:
[0148]-通過UHT樣和HTST樣的熱處理可以增強活的微生物的抗炎譜(例如長雙歧桿菌NCC2705、長雙歧桿菌NCC3001、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818)。
[0149]-通過UHT樣和HTST樣的熱處理可以從非抗炎的活的微生物(例如，鼠李糖乳桿菌NCC4007、類干酪乳桿菌NCC2461、乳品起始株嗜熱鏈球菌NCC2019)產(chǎn)生抗炎譜。
[0150]-證實從商業(yè)途徑可得到的產(chǎn)品中分離的菌株(圖3A&B)也具有抗炎譜，所述菌株包括益生菌大腸桿菌菌株。
[0151]對于所有測試的益生菌和乳品起始菌株，例如乳桿菌、雙岐桿菌和鏈球菌，UHT樣/HTST處理的影響是相似的。
[0152]將UHT樣/HTS T處理應(yīng)用于體外展示不同的免疫譜的一些乳桿菌、雙岐桿菌和鏈球菌。所有這些菌株經(jīng)過UHT樣/HTST處理后比它們活的對應(yīng)物(圖1，2，3，4、5和6)誘導(dǎo)更少的促炎細胞因子，表明UHT樣/HTST處理對得到的非復(fù)制細菌的免疫性質(zhì)的影響可以推廣至所有益生菌，特別是乳桿菌和雙岐桿菌以及特定的大腸桿菌菌株，并且推廣至所有乳品起始培養(yǎng)物，特別是鏈球菌、乳球菌和乳桿菌。
[0153]實施例2:
[0154]方法學(xué)
[0155]細菌制備:
[0156]用五種益生菌菌株研究非復(fù)制性益生菌的免疫增強性質(zhì):3種雙岐桿菌(長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2種乳桿菌(類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。
[0157]細菌細胞在MRS上以批次發(fā)酵的形式在37°C生長16-18小時，不控制pH。離心細菌細胞(5，OOOx g，4°C C)并且在用鹽水稀釋之前用磷酸緩沖鹽水重懸浮細菌細胞以達到約10E10Cfu/ml的終濃度。長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007在水浴中85° C下熱處理20分鐘。短雙歧桿菌NCC2950在水浴中90° C下熱處理30分鐘。等分經(jīng)熱處理的細菌懸浮液，并且在使用之前將細菌懸浮液冷凍保存于-80° C?；畹募毦谑褂弥霸?5%PBS-甘油中-80° C貯存。
[0158]細菌制備物的體外免疫作圖:
[0159]評估活的和受熱處理的細菌制備物的免疫譜(即體外誘導(dǎo)來自人血細胞的特異細胞因子分泌的能力)。從血濾器中分離人外周血單核細胞(PBMCs)。用細胞密度梯度分離后，收集單核細胞并且用Hanks平衡鹽溶液洗滌兩次。用補充10%胎牛血清(Bioconc印t，巴黎，法國)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma)以及0.1%慶大霉素(Sigma)的Iscove’ s改良的Dulbecco’ s培養(yǎng)基(MDM, Sigma)重懸細胞。然后在48孔板中將PBMCs(7xl05細胞/孔)與活的以及經(jīng)熱處理的細菌(相當(dāng)于7xl06cfu/孔)共同培養(yǎng)36小時。檢測活的和受熱處理的細菌對PBMCs的效應(yīng)，該PBMCs來自分入2次單獨實驗中的8個個體供體。培養(yǎng)36小時后，在細胞因子測量之前將培養(yǎng)板冷凍并保持在-20° C。平行進行(即相同的實驗中在相同批次的PBMCs上)活的細菌和它們受熱處理的對應(yīng)物的細胞因子作圖。
[0160]按照制造商的說明，用ELISA(R&D DuoSet 人 IL-10, BD OptEIA 人 IL12p40, BDOptEIA人TNF α，BD OptEIA人IFN- Y )測定培養(yǎng)36小時后細胞培養(yǎng)上清液中的細胞因子(IFN- Y，IL-12p40, TNF- α 和 IL-10)水平。IFN- y，IL_12p40 和 TNF- α 是促炎細胞因子，而IL-1O是重要的抗炎介體。結(jié)果表示成4個個體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM，并且結(jié)果代表2次單獨實驗(每次實驗用4個供體進行)。
[0161]活的和經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在變應(yīng)性腹瀉的預(yù)防中的體內(nèi)效應(yīng)
[0162]用變應(yīng)性腹瀉的小鼠模型檢測短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進效應(yīng)(Brandt E.B等人，JCI2003; 112(11):1666-1667)。雄性Balb/c小鼠在致敏(以14天的間隔經(jīng)腹膜內(nèi)注射兩次卵白蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀；第O天和第14天)后受到6次OVA的經(jīng)口攻擊(第27天、29天、32天、34天、36天、39天)，導(dǎo)致暫時的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數(shù)的改變(總的IgE的血漿濃度，OVA特異的IgE，小鼠肥大細胞蛋白酶1，即MMCP-1)。在OVA致敏之前4天(第-3天、-2天、-1天、O天以及第11天、12天、13天和14天)以及在攻擊時期中(第23天至39天)通過管飼法施用活的或者在90° C熱處理30分鐘的短雙歧桿菌NCC2950。使用約IO9菌落形成單位(cfu)或者當(dāng)量cfu/小鼠的每日細菌劑量。
[0163]益果
[0164]經(jīng)過熱處理后誘導(dǎo)‘促 炎’細胞因子的分泌
[0165]體外評估了經(jīng)熱處理的細菌菌株刺激人外周血單核細胞(PBMCs)的細胞因子分泌的能力。將經(jīng)熱處理的細菌刺激PBMCs時基于四種細胞因子的免疫譜與在相同的體外測定中活的細菌細胞誘導(dǎo)的免疫譜比較。
[0166]平板接種經(jīng)熱處理的制備物并且用于評估任何活菌計數(shù)的缺失。經(jīng)熱處理的細菌制備物在平板接種后沒有產(chǎn)生任何菌落。
[0167]當(dāng)用PBMCs溫育時，活的益生菌誘導(dǎo)不同的和菌株依賴性的細胞因子產(chǎn)生水平(圖8)。與益生菌活的對應(yīng)物比較，益生菌的熱處理改變了 PBMCs產(chǎn)生的細胞因子水平。經(jīng)熱處理的細菌比它們活的對應(yīng)物誘導(dǎo)更多的促炎細胞因子(TNF-α，IFN-Y，IL-12p40)。相t匕，與活細胞比較，經(jīng)熱處理的細菌誘導(dǎo)相似或者更低量的IL-10 (圖8)。這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)熱處理的細菌比它們活的對應(yīng)物更能刺激免疫系統(tǒng)，并且因此更能加強弱化的免疫防御。換句話說，體外數(shù)據(jù)說明受熱處理后細菌菌株的增強的免疫增強效應(yīng)。
[0168]為了說明經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (與活細胞相比)對免疫系統(tǒng)的增強效應(yīng)，在變應(yīng)性腹瀉的動物模型中測試了活的和經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (菌株A)。
[0169]與陽性對照組比較，用經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后，腹瀉強度明顯地持續(xù)降低(41.1%±4.8)，然而用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后，腹瀉強度只降低20±28.3%。這些結(jié)果表明經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950比它的活的對應(yīng)物展示針對變應(yīng)性腹瀉增強的保護效應(yīng)(圖9)。
[0170]因此，顯示經(jīng)過熱處理后益生菌增強免疫防御的能力得到提高。
[0171]實施例3:
[0172]實驗方案: [0173]使用傳代30-40代的T84細胞并且在包含5%的胎牛血清(FCS) (AminedBioConcept)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良的必需培養(yǎng)基/F_12 (Sigma D6421)中培養(yǎng)該T84細胞。以2xl06細胞/每孔的濃度將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，并且在5%C02 - 95%空氣37° C下該細胞生長成單細胞層。匯集后生長I周的細胞用血清和無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)至少12小時。該步驟對于消除血清誘導(dǎo)的防衛(wèi)素的表達以及防止抗生素對益生菌和細胞免疫反應(yīng)的任何影響是必需的。細胞進一步地與益生菌或者熱處理的菌株培養(yǎng)4小時。在培養(yǎng)時間結(jié)束時，用PBS洗滌并且按照供應(yīng)商的方案用TriPure?分離試劑收獲細胞。在如此處理的細胞中人hBDl和hBD2的基因表達用定量PCR評估。
[0174]在該實驗中使用的細菌菌株是長雙歧桿菌(B.longum) (NCC2705,保藏號CNCM 1-2618)，乳雙歧桿菌(B.lactis) (NCC2818,保藏號 CNCM 1-3446)，約氏乳桿菌(Lai, NCC533,保藏號 CNCM 1-1225)，類干酪乳桿菌(L.paracasei) (ST11, NCC2461,保藏號CNCM 1-2116)。這些菌株經(jīng)檢測是活的或者在120° C - 15秒或者85° C - 20分鐘下進行熱處理。
[0175]結(jié)果:
[0176]與其他檢測的熱處理菌株比較，在120° C- 15秒熱處理的Lal (NCC533,保藏號CNCM 1-1225)在培養(yǎng)4小時后誘導(dǎo)了強烈的hBDlmRNA的表達(圖10)。這些數(shù)據(jù)是獨特的，因為hBDl的表達(組成型表達的)被如今科學(xué)界認為幾乎不能被微生物、微生物產(chǎn)物或者炎
癥調(diào)節(jié)O
[0177]活的和經(jīng)熱處理的Lal (NCC533,保藏號CNCM 1-1225)都強烈地誘導(dǎo)hBDlmRNA的表達，然而經(jīng)熱處理的Lal (高溫和短時間處理)引發(fā)hBDl最高的誘導(dǎo)(圖11)。
[0178]打印輸出(原始的是電子表格)
[0179](該頁不作為國際申請的一部分并且不認為是國際申請頁)
[0180]
【權(quán)利要求】
1.包含非復(fù)制性益生菌微生物的組合物，其用于預(yù)防或治療上呼吸道感染和/或其癥狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其待施用于兒童。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其中所述上呼吸道感染選自鼻炎、鼻竇炎、鼻咽炎、咽炎、會厭炎、喉炎、喉氣管炎、氣管炎或其組合；并且所述癥狀選自咳嗽、咽喉痛、流鼻涕、鼻充血、頭痛、低熱、面部脹感(facial pressure)、打噴嚷及其組合。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其用于保護兒童免于上呼吸道感染。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其用于增強兒童對抗上呼吸道感染的能力。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其用于減少上呼吸道感染將持續(xù)的時間。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其用于幫助兒童從較少發(fā)生的上呼吸道感染恢復(fù)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其包含相應(yīng)于約IO6至IO12Cfu量的非復(fù)制性益生菌微生物。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其中所述非復(fù)制性益生菌微生物通過熱處理，優(yōu)選地通過在至少71.5° C至少I秒的高溫處理成為非復(fù)制性微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述熱處理是在約71.5-150° C約1-120秒的高溫處理，并且優(yōu)選地是高溫/短時間(HTST)處理或者超高溫(UHT)處理。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述熱處理在約70-150°C的溫度范圍內(nèi)進行約3分鐘至2小時，優(yōu)選地在約80-140° C的溫度范圍內(nèi)進行約5分鐘至40分鐘。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其中至少90%，優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地99.9%，最理想的全部所述益生菌是非復(fù)制性的。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其中所述益生菌微生物選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、丙酸桿菌屬或者它們的組合，例如長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、唾液乳桿菌、路氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、約漢遜氏乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、乳乳球菌、嗜熱鏈球菌、乳乳球菌、二丁酮乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌、大腸桿菌和/或它們的混合物。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其中所述益生菌微生物選自長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、約漢遜氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC15、乳乳球菌NCC2287或它們的組合。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物，其每日劑量含有約0.005mg -1OOOmg的非復(fù)制性微生物。
【文檔編號】C12N1/20GK103547276SQ201180064474
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月11日
【發(fā)明者】V·珀蒂, C·L·加西亞-羅德納斯, M·尤莉塔, A·梅賽尼爾, G·普里烏特, S·努特恩 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司