經(jīng)工程化以發(fā)酵木糖的遺傳修飾的熱纖梭菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的一個(gè)方面涉及生物質(zhì)材料的木糖部分向燃料和化學(xué)品的工業(yè)生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及生物質(zhì)材料的木聚糖部分向燃料和化學(xué)品的工業(yè)生物轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)菌熱纖梭菌，一種在聯(lián)合生物加工配置中具有作為生物催化劑的巨大潛能的高纖維素分解性生物體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明是賦予熱纖梭菌發(fā)酵木糖的能力的遺傳修飾和利用該修飾產(chǎn)生的菌株。在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾由來自解糖熱厭氧桿菌(T.saccharolyticum)的操縱子中包含的兩個(gè)基因組成。所述基因表達(dá)具有木糖異構(gòu)酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠發(fā)酵木聚糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞。
【專利說明】經(jīng)工程化以發(fā)酵木糖的遺傳修飾的熱纖梭菌
[0001]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
[0002]能量轉(zhuǎn)換、利用和獲取是我們時(shí)代的許多巨大挑戰(zhàn)(包括與持續(xù)性、環(huán)境質(zhì)量、安全性和貧困相關(guān)的挑戰(zhàn))的起因。需要新興技術(shù)的新型應(yīng)用來應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。生物技術(shù)，最強(qiáng)大的新興技術(shù)之一，可產(chǎn)生重要的新能量轉(zhuǎn)換方法。生物質(zhì)及其衍生物是用于能量至對人類有用的形式的生物轉(zhuǎn)化的來源。
[0003]生物質(zhì)是來自活的或最近活的生物體的生物材料例如木材、廢物、(氫)氣體和醇燃料。生物質(zhì)是基于碳、氫和氧的。還可發(fā)現(xiàn)氮和少量其它原子，包括堿金屬、堿土金屬和重金屬。金屬通常見于功能性分子例如卟啉中，其包括包含鎂的葉綠素。植物特別地將水和二氧化碳組合成糖構(gòu)建塊。所需的能量通過基于葉綠素的光合作用從光產(chǎn)生。平均起來，0.1至1%的可獲得的光被作為化學(xué)能貯存在植物中。糖構(gòu)建塊是陸生植物、木質(zhì)素、半纖維素和纖維素中發(fā)現(xiàn)的所有主要部分的起始點(diǎn)。生物質(zhì)被公認(rèn)為用于產(chǎn)生可再生燃料和化學(xué)品的原料的有前景的來源。
[0004]阻礙從生物質(zhì)原料廣泛產(chǎn)生能量的主要障礙是普遍缺乏用于克服此類材料至有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的低成本技術(shù)。生物質(zhì)包含可被轉(zhuǎn)化成乙醇或其它產(chǎn)物例如乙酸鹽、丙酮酸鹽、乳酸和乙酸的碳水化合物部分(例如，纖維素和半纖維素)以及戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)。為了轉(zhuǎn)化這些部分，最終必須將纖維素、半纖維素、木糖和阿拉伯糖轉(zhuǎn)化或水解成單糖；歷史上已證明水解是有問題 的。
[0005]生物介導(dǎo)的過程有希望用于能量轉(zhuǎn)化。涉及酶促或微生物水解的生物質(zhì)處理方案通常包括4個(gè)生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；(I)糖解酶(纖維素酶或半纖維素酶)的產(chǎn)生；(2)存在于預(yù)處理的生物質(zhì)中的碳水化合物組分至糖的水解；(3)己糖(例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的發(fā)酵；和⑷戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)的發(fā)酵。這4個(gè)轉(zhuǎn)化以單個(gè)步驟在稱為聯(lián)合生物加工(CBP)的過程配置中進(jìn)行，所述過程配置與其它集成度不太高的配置區(qū)別在于其不包括用于纖維酶和/或半纖維素酶產(chǎn)生的專用處理步驟。
[0006]CBP提供了比特征在于專門的纖維素酶生產(chǎn)的方法成本更低且效率更高的潛力。有益之處部分來源于避免了與生產(chǎn)纖維素酶相關(guān)的資金成本、底料和其它原材料和設(shè)施。此外，使用CBP，數(shù)個(gè)因素支持實(shí)現(xiàn)較高速率的水解，因此減小了反應(yīng)器的體積和資金投入，包括酶-微生物協(xié)同作用，以及使用噬熱生物體和/或復(fù)合的纖維素酶系統(tǒng)。此外，纖維素粘附性的分解纖維素的微生物可能相對于非粘附性的微生物(例如污染物)成功地競爭纖維素水解的產(chǎn)物，這會增加基于微生物纖維素利用的工業(yè)方法的穩(wěn)定性。通過以下兩個(gè)策略在開發(fā)能夠進(jìn)行CBP的微生物方面取得了進(jìn)展:對天然存在的分解纖維素的微生物進(jìn)行工程化改造以改善與產(chǎn)物相關(guān)的特征，例如產(chǎn)率和效價(jià)；以及對表現(xiàn)出高產(chǎn)物產(chǎn)率和效價(jià)的不分解纖維素的生物體進(jìn)行工程化改造以表達(dá)異源纖維素酶和半纖維素酶系統(tǒng)以能夠利用纖維素和半纖維素。
[0007]滿足乙醇產(chǎn)生的需要的一個(gè)方法是轉(zhuǎn)化生物質(zhì)、例如材料例如農(nóng)業(yè)廢物、玉米殼、玉米芯、纖維素物質(zhì)等中發(fā)現(xiàn)的糖以產(chǎn)生乙醇或其它產(chǎn)物。在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中，將微生物用作生物催化劑來將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可使用的終產(chǎn)物例如乙醇。大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用中的高效生物質(zhì)轉(zhuǎn)化需要能夠耐受高濃度的糖和乙醇并且能夠同時(shí)發(fā)酵超過一種糖的微生物。
[0008]木糖極其豐富地存在于生物質(zhì)原料中。其可構(gòu)成多至40%的木質(zhì)纖維素材料(Ladisch等人，Biotechnol Bioeng, 25:1-2，1983)。通過發(fā)酵,木糖可被轉(zhuǎn)化成可用作液體燃料或化學(xué)原料的乙醇。通過酶促發(fā)酵或作為發(fā)酵的副產(chǎn)品，木糖還可被轉(zhuǎn)化成木糖醇，其是有前景的具有減少齲齒的性質(zhì)的天然甜味劑。木糖醇還可被糖尿病患者使用。
[0009]盡管許多細(xì)菌具有發(fā)酵簡單己糖、戊糖的能力，但木糖和阿拉伯糖是其中在生物質(zhì)中最難代謝的糖。一些細(xì)菌可將戊糖發(fā)酵成乙醇和其它副產(chǎn)品，具有改善的從戊糖產(chǎn)生乙醇的能力的細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)行了遺傳工程化。參見，例如，Xiao等人，Appl.Environ.Microbiol.,77:7886-7895,2011。然而，此類細(xì)菌對低pH和高濃度的乙醇敏感，它們在發(fā)酵中的用途與副產(chǎn)品形成相關(guān)，并且產(chǎn)生的乙醇水平仍然太低。由于至少這些原因，在大規(guī)模乙醇生產(chǎn)中使用此類細(xì)菌在經(jīng)濟(jì)上是不可行的。因此，本領(lǐng)域需要能夠?qū)⑽焯前l(fā)酵成乙醇的纖維素分解性生物體。
[0010]生物體例如解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)天然地能夠通過木糖異構(gòu)酶途徑利用木糖。在木糖異構(gòu)酶途徑中，木糖異構(gòu)酶(XI)將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖。隨后木酮糖被利用ATP的激酶木酮糖激酶O(K)磷酸化成木酮糖-5-磷酸，其為戊糖磷酸途徑的中間產(chǎn)物。因此，產(chǎn)生木糖發(fā)酵纖維素分解性生物體(所述生物體可用作CBP生物體)的一個(gè)方法是把將木糖發(fā)酵成乙醇所需的來自木糖異構(gòu)酶途徑的基因克隆進(jìn)入纖維素分解性生物體，以便纖維素分解性生物體可產(chǎn)生代謝木糖所需要的酶。
[0011]熱纖梭菌(Clostridium-thermocellum)是有很大潛能在聯(lián)合生物加工配置中作為生物催化劑的高度分解纖維素的生物體。熱纖梭菌作為CBP生物體的經(jīng)濟(jì)潛力受到其不能發(fā)酵木糖的能力的限制。目前不存在已知的能夠發(fā)酵木糖的熱纖梭菌菌株(無論是工程化的還是未工程化的)。因此，能夠發(fā)酵木糖的熱纖梭菌菌株將具有作為CBP生物體的極大工業(yè)適用性。
[0012]雖然已對熱纖梭菌的基因組完全測序，并且已將許多熱纖梭菌基因克隆進(jìn)入其它細(xì)菌，但仍未建立用于將外來基因引入該微生物的可靠方法。此類方法的缺乏已成為對目的在于增加基礎(chǔ)理解和應(yīng)用能力的熱纖梭菌的研究的重大障礙。由于使得熱纖梭菌能夠發(fā)酵木糖所需的多個(gè)且極其可能的基因組修飾，以及轉(zhuǎn)化該生物體的困難和不可預(yù)測性，目前不能產(chǎn)生適用于從生物質(zhì)工業(yè)化產(chǎn)生乙醇和其它產(chǎn)物的熱纖梭菌菌株。因此，迄今為止，不存在已鑒定的具有發(fā)酵木糖的能力的熱纖梭菌菌株。因此，在本領(lǐng)域需要開發(fā)一個(gè)或多個(gè)能夠發(fā)酵木糖的熱纖梭菌菌株，所述熱纖梭菌菌株可在聯(lián)合生物加工配置中用作生物催化劑。
[0013]本發(fā)明第一次提供了包含賦予熱纖梭菌發(fā)酵木糖的能力的遺傳修飾的熱纖梭菌菌株。
[0014]發(fā)明概述
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠發(fā)酵木糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含異源多核苷酸的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸具有與SEQ ID NO: 1-2的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一性的核苷酸序列；或SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及發(fā)酵液，其包含:(a)能夠發(fā)酵木糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞；和(b)培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含木糖，并且其中所述培養(yǎng)基能夠支持所述宿主細(xì)胞的生長。
[0018]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含能夠發(fā)酵木糖的本發(fā)明的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞和至少一種其它宿主細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
[0019]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及發(fā)酵木糖的方法，包括溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含:(a)生物質(zhì)，其中生物質(zhì)包含木糖，和(b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木糖。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生一種或多種木糖發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含:(a)生物質(zhì)，其中生物質(zhì)包含木糖，和(b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木糖以產(chǎn)生一種或多種木糖發(fā)酵產(chǎn)物。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠發(fā)酵木聚糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及發(fā)酵液，所述發(fā)酵液包含:(a)能夠發(fā)酵木聚糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞；和(b)培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基包含木聚糖，并且其中培養(yǎng)基能夠支持所述宿主細(xì)胞的生長。
[0023]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含能夠發(fā)酵木聚糖的本發(fā)明的重組熱纖梭菌和至少一種其它宿主細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
[0024]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及發(fā)酵木聚糖的方法，包括:溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含包括:(a) 生物質(zhì)，其中生物質(zhì)包含木聚糖；和(b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木聚糖。
[0025]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生一種或多種木聚糖發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含:(a)生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)包含木聚糖；和(b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木聚糖以產(chǎn)生一種或多種木聚糖發(fā)酵產(chǎn)物。
[0026]附圖概述
[0027]圖1描述了木糖異構(gòu)酶/木酮糖激酶在LDH基因座上的整合。
[0028]圖2描述了質(zhì)粒pMU1793，其被設(shè)計(jì)和構(gòu)建來將XI/XK操縱子整合在包含次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPT)基因的缺失的熱纖梭菌的染色體中。
[0029]圖3描述了 XI/XK操縱子在乳酸脫氫酶(LDH)基因座上的無縫整合的診斷性PCR確認(rèn)的圖像。野生型對照基因組DNA用于產(chǎn)生在泳道14中觀察到的擴(kuò)增子，觀察到預(yù)期的
2.9KB條帶。整合的XI/XK操縱子應(yīng)當(dāng)以4966bp (在泳道2_5和8中觀察到的大小)運(yùn)行。
[0030]圖4描述了在利用熱纖梭菌菌株T2(Aldh::XI/XK)接種的培養(yǎng)基中在156小時(shí)時(shí)的木糖濃度的終點(diǎn)分析。
[0031]圖5描述了 T2菌株的終產(chǎn)物HPLC分析。
[0032]圖6顯示在48小時(shí)時(shí)在T3培養(yǎng)物中觀察到的孢子形成的證據(jù)。
[0033]圖7顯示了 T3培養(yǎng)物在72小時(shí)時(shí)的顯微鏡檢查。
[0034]圖8描述了 T6培養(yǎng)物在10和20g/l木糖上的生長的終點(diǎn)分析。
[0035]圖9顯示了 T6培養(yǎng)物在10g/l微晶粉末纖維素(avicel)上的生長。
[0036]圖10顯示了 M2236培養(yǎng)物在包含木糖作為唯一糖源的CM3培養(yǎng)基上的生長。木糖被M2236菌株消耗并且M2236菌株產(chǎn)生乙醇，而M1570菌株不能將大量木糖轉(zhuǎn)化成乙醇。
[0037]發(fā)明詳述
[0038]本說明書公開了一個(gè)或多個(gè)整合本發(fā)明的特征的實(shí)施方案。公開的實(shí)施方案僅舉例說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不限于公開的實(shí)施方案。本發(fā)明由其所附帶的權(quán)利要求界定。
[0039]在下列說明中，為了解釋目的，顯示了具體的數(shù)字、材料和配置以提供完全徹底地理解本發(fā)明。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很顯然的是可在這些具體的詳細(xì)內(nèi)容不存在的情況下實(shí)施本發(fā)明。在一些情況下，可省略或簡化公知的特征以使本發(fā)明明了。
[0040]描述的實(shí)施方案和以及本說明書中提及的〃 一個(gè)實(shí)施方案"、"一個(gè)不例性實(shí)施方案"等，表示描述的實(shí)施方案可包括具體的特征、結(jié)構(gòu)或特性，但每一個(gè)實(shí)施方案可以不一定包括該具體的特征、結(jié)構(gòu)或特性。此外，此類短語不一定是指同一個(gè)實(shí)施方案。此外，當(dāng)結(jié)合實(shí)施方案描述具體特征、結(jié)構(gòu)或特性時(shí)，應(yīng)理解，結(jié)合其它實(shí)施方案(無論是否明確地描述過)實(shí)現(xiàn)這樣的特征、結(jié)構(gòu)或特性在本領(lǐng)域技術(shù)人員員的知識范圍內(nèi)。
[0041]本文中“一個(gè)/ 一種(a) ”或“一個(gè)/ 一種(an) ”的描述可指單數(shù)項(xiàng)或復(fù)數(shù)項(xiàng)。應(yīng)理解，在本文中無論何處利用詞語“包含”描述實(shí)施方案，也提供了以“由……組成的”和/或“基本上由……組成的”的術(shù)語描述的另外的類似實(shí)施方案。
[0042]定義
[0043]術(shù)語〃異源的〃，當(dāng)用于指多核苷酸、基因、多肽或酶時(shí)，是指通常不是在宿主生物體中發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、基因、多肽或酶?！ó愒吹摹ㄟ€包括從來源生物體取出并且隨后以與對應(yīng)的天然基因不同的形式(例如，不在該生物體基因組的其天然位置中)引入來源生物體的天然編碼區(qū)或其部分。可通過例如基因轉(zhuǎn)移將異源多核苷酸或基因引入宿主生物體。異源基因可包括作為嵌合基因(包含被引入天然宿主的非天然調(diào)控區(qū))的一部分的天然編碼區(qū)。外來基因可包含插入非天然生物體或嵌合基因的天然基因。異源多核苷酸、基因、多肽或酶可來源于任何來源，例如真核生物、原核生物、病毒或合成的多核苷酸片段。如本文中所用，術(shù)語"異源的"是指來源于除內(nèi)源來源外的來源的載體、質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞的元件。因此，例如，異源序列可以是來源于來自相同宿主，來自宿主細(xì)胞的不同菌株或來自不同分類群(例如，不同界、門、綱、目、科、屬或種或這些分類之一內(nèi)的任何亞組)的生物體的不同基因或質(zhì)粒的序列。術(shù)語〃異源的〃在本文中也與術(shù)語〃外源的〃同義地使用。
[0044]"啟動(dòng)子"意指幫助特定基因轉(zhuǎn)錄的DNA的區(qū)域。啟動(dòng)子通常位于它們調(diào)控的基因附近，在相同的鏈上和上游(朝向有義鏈的5’區(qū)域)。術(shù)語"啟動(dòng)子"或"替代啟動(dòng)子"意欲包括可轉(zhuǎn)錄地控制其在天然狀態(tài)不轉(zhuǎn)錄地控制的目標(biāo)基因的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，替代啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制導(dǎo)致目標(biāo)基因表達(dá)的增加。在某些實(shí)施方案中，將替代啟動(dòng)子置于目標(biāo)基因的5’。替代啟動(dòng)子可用于替代天然啟動(dòng)子或除了天然啟動(dòng)子外還可使用替代啟動(dòng)子。替代啟動(dòng)子相對于其中使用其的宿主細(xì)胞是內(nèi)源的，或其可以是被引入宿主細(xì)胞的異源多核苷酸序列，例如相對于其中使用其的宿主細(xì)胞是外源的。
[0045]如本文中所用，術(shù)語〃終止子〃或〃轉(zhuǎn)錄終止子〃是在基因組DNA上標(biāo)記基因或操縱子轉(zhuǎn)錄結(jié)束的遺傳序列的部分。
[0046]如本文中所用，術(shù)語〃操縱子〃是指包含一簇在單個(gè)調(diào)控信號或啟動(dòng)子的控制之下基因的基因組材料的功能單位。所述基因被一起轉(zhuǎn)錄成mRNA鏈，并且在細(xì)胞質(zhì)中被一起翻譯或經(jīng)歷反式剪接以產(chǎn)生單獨(dú)翻譯的單順反子mRNA，即各自編碼單個(gè)基因產(chǎn)物的mRNA的幾條鏈。這樣的結(jié)果是操縱子中包含的基因可一起表達(dá)或根本不表達(dá)。最初操縱子被認(rèn)為僅存在于原核生物中，但自1990年代早期在真核生物中發(fā)現(xiàn)首個(gè)操縱子以來，已出現(xiàn)更多的證據(jù)表明它們比先前假定的更常見。操縱子主要存在于原核生物中，但也存在于一些真核生物中，包括黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲。
[0047]〃嗜熱〃或〃耐熱〃細(xì)菌是其最適生長溫度高于約45°C的細(xì)菌。嗜熱細(xì)菌為生物技術(shù)方法提供了許多有利方面，所述生物技術(shù)方法中有許多在高溫下運(yùn)行得更快和更高效。更高的溫育溫度增加擴(kuò)散速率和非氣態(tài)目標(biāo)化合物的可溶性，并且傾向于阻止非嗜熱微生物污染。在高溫下進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)還消除或極大減少了冷卻成本。
[0048]〃嗜溫〃意指在約20_45°C的溫度下旺盛生長的生物體。
[0049]術(shù)語〃基因〃或〃多核苷酸〃或〃多核苷酸序列〃意欲包括核酸分子，例如多核苷酸，其包括編碼多肽的開放閱讀框，并且還可包括非編碼調(diào)控序列和內(nèi)含子。此外，該術(shù)語意欲包括映射至功能基因座的一個(gè)或多個(gè)基因。此外，該術(shù)語意欲包括用于選擇目的的特定基因?；?qū)τ谒拗骷?xì)胞可以是內(nèi)源的或可被重組地引入宿主細(xì)胞，例如作為游離地維持的質(zhì)粒或穩(wěn)定地整合進(jìn)入基因組的質(zhì)粒(或其片段)。除了質(zhì)粒形式以外，基因可以例如以線性DNA的形式存在。在某些實(shí)施方案中，基因或多核苷酸參與乙酸鹽至不帶電荷的溶劑、包括但不限于丙酮、異丙醇、乙酸乙酯或乙醇的生物轉(zhuǎn)化的至少一個(gè)步驟。因此，該術(shù)語意欲包括編碼多肽例如醋酸鹽激酶(ACK)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(PTA)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)、醛脫氫酶(ADH)和/或醇脫氫酶(ADH)、乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(ACS)、乙醛脫氫酶、乙醛/醇脫氫酶、甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD)、乙酰-CoA合成酶、硫解酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸脫羧酶、D-木糖途徑中的酶例如木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，L-阿拉伯糖途徑中的酶例如L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和L-核酮糖-5-磷酸4差向異構(gòu)酶的任何基因。術(shù)語基因還意欲包括所有拷貝的特定基因，例如細(xì)胞中編碼特定基因產(chǎn)物的所有DNA序列。
[0050]術(shù)語〃表達(dá)〃意欲包括基因至少在mRNA產(chǎn)生的水平上的表達(dá)。
[0051]術(shù)語〃表達(dá)產(chǎn)物〃意欲包括表達(dá)的基因的所得的產(chǎn)物，例如多肽。
[0052]術(shù)語〃纖維素分解活性〃意欲包括水解寡己糖或多己糖的糖苷鍵的能力。纖維素分解活性還可包括使纖維素和半纖維素解聚合或脫支的能力。
[0053]術(shù)語〃木聚糖分解活性〃意欲包括水解寡戊糖和多戊糖中的糖苷鍵的能力。
[0054]如本文中所用，術(shù)語〃乳酸脫氫酶〃或"LDH"意欲包括能夠?qū)⒈猁}轉(zhuǎn)化成乳酸鹽的酶。應(yīng)理解，LDH還可催化羥基丁酸鹽的氧化。LDH包括對應(yīng)于酶委員會編號1.1.1.27的那些酶。
[0055]如本文中所用，術(shù)語〃醇脫氫酶〃或〃ADH〃意欲包括能夠?qū)⒁胰┺D(zhuǎn)化成醇例如乙醇的酶。ADH還包括能夠?qū)⒈D(zhuǎn)化成異丙醇的酶。ADH包括對應(yīng)于酶委員會編號1.1.1.1的那些酶。
[0056]如本文中所用，術(shù)語〃磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶〃或〃PTA〃意欲包括能夠通過從5-磷酸核糖基1-焦磷酸轉(zhuǎn)移5-磷酸核糖基，將次黃嘌呤轉(zhuǎn)化成肌苷一磷酸和將鳥嘌呤轉(zhuǎn)化成鳥苷一磷酸的酶。該酶在通過嘌呤補(bǔ)救途徑產(chǎn)生嘌呤核苷酸中起著中心作用。HPT包括對應(yīng)于酶委員會編號2.4.2.8的那些酶。
[0057]如本文中所用，術(shù)語〃次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶〃或〃HPT〃意欲包括能夠?qū)⒁阴?磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的酶。PTA包括對應(yīng)于酶委員會編號2.3.1.8的那些酶。[0058]"木糖代謝酶"可以是參與木糖降解、代謝和/或水解的任何酶，包括木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖脫氫酶、木糖醇脫氫酶、木糖酸脫水酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶蛋白。參見例如 Gu 等人，BMC Genomics, 11:255-268，2010。
[0059]〃木酮糖激酶〃 (XK)意指催化化學(xué)反應(yīng):ATP+D_木酮糖# ADP+D-木酮糖5_磷酸的酶。因此，該酶的兩種底物為ATP和D-木酮糖，而其兩種產(chǎn)物為ADP和D-木酮糖5-磷酸。該酶屬于轉(zhuǎn)移酶的家族，特別是以醇基團(tuán)作為受體的轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的那些轉(zhuǎn)移酶(磷酸轉(zhuǎn)移酶)。該酶種類的系統(tǒng)名為ATP:D-木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)移酶。常用的其它名稱包括木酮糖激酶(磷酸化)和D-木酮糖激酶。該酶參與戊糖和葡糖醛酸的互變。XK包括對應(yīng)于酶委員會編號2.7.1.17的那些酶。
[0060]〃木糖異構(gòu)酶"(XI)意指催化化學(xué)反應(yīng):D_木糖# D-木酮糖的酶。該酶屬于異構(gòu)酶的家族，特別是使醛糖與酮糖互變的那些分子內(nèi)氧化還原酶。該酶種類的系統(tǒng)名為D-木糖醛糖酮糖異構(gòu)酶。 常用的其它名稱包括D-木糖異構(gòu)酶、D-木糖酮異構(gòu)酶和D-木糖酮醇-異構(gòu)酶。該酶參與戊糖與葡糖醛酸互變以及果糖和甘露糖代謝。該酶在工業(yè)上用于在高果糖玉米糖漿的制造中將葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖。其有時(shí)被稱為"葡萄糖異構(gòu)酶〃。XI包括對應(yīng)于酶委員會編號5.3.1.5的那些酶。
[0061]如本文中所用，術(shù)語〃木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)〃或〃木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〃意欲包括參與木糖橫穿生物膜的運(yùn)動(dòng)(從而促進(jìn)宿主生物體利用木糖)的膜蛋白。參見，例如Gu等人，BMCGenomics, 11:255-268, 2010。如本文中所用，術(shù)語〃木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因〃意欲包括編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的基因。
[0062]本發(fā)明的某些實(shí)施方案在微生物內(nèi)提供了某些基因或特定多核苷酸序列的“滅活”或“缺失”，基因或特定多核苷酸序列的“滅活”或“缺失”可被理解為包括“遺傳修飾”或“轉(zhuǎn)化”，以便所述微生物的所得菌株可被理解為“遺傳修飾的”或“轉(zhuǎn)化的”。在某些實(shí)施方案中，微生物的菌株可來源于細(xì)菌、真菌或酵母。
[0063]本發(fā)明的某些實(shí)施方案在嗜熱或嗜溫微生物內(nèi)提供了某些基因或特定多核苷酸序列的“插入”(例如，添加、整合、引入或?qū)?，基因或特定多核苷酸序列的插入可被理解為包括“遺傳修飾”或“轉(zhuǎn)化”，以便所述嗜熱或嗜溫微生物的所得菌株可被理解為“遺傳修飾的”或“轉(zhuǎn)化的”。在某些實(shí)施方案中，微生物的菌株可來源于細(xì)菌、真菌或酵母。
[0064]術(shù)語〃CBP生物體〃意欲包括本發(fā)明的微生物，例如具有適合于CBP的性質(zhì)的微生物。
[0065]術(shù)語〃發(fā)酵(fermenting) 〃和〃發(fā)酵(fermentation) 〃意欲包括籍以從碳水化合物產(chǎn)生乙醇(特別地作為發(fā)酵的產(chǎn)物)的酶促過程(例如，細(xì)胞或無細(xì)胞，例如，裂解物或純化的多肽混合物)。
[0066]如本文中所用，術(shù)語發(fā)酵的〃不期望的終產(chǎn)物〃意欲包括除乙醇和二氧化碳外的發(fā)酵產(chǎn)物。不期望的終產(chǎn)物可包括但不限于醋酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽和甘油醛。
[0067]如本文中所用，〃選擇〃或〃選擇法〃或〃選擇方案〃是指用于對給定的菌株施加壓力(或攻擊)以適合新的條件的方法。選擇法有利于原始菌株的零星發(fā)生的“變體”，其中變體經(jīng)歷一些遺傳或表觀遺傳改變，所述改變賦予適合于實(shí)施方案的培養(yǎng)條件的生長有利方面。
[0068]在本發(fā)明的一個(gè)方面，插入基因或特定多核苷酸序列以激活它們編碼的活性例如酶的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，可將編碼乙醇的代謝產(chǎn)生中的酶，例如代謝戊糖和/或己糖的酶的基因添加至嗜溫或嗜熱生物體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，酶可賦予代謝戊糖的能力以及參與例如D-木糖途徑和/或L-阿拉伯糖途徑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可將編碼將醋酸鹽轉(zhuǎn)化成不帶電荷的溶劑(包括但不限于丙酮、異丙醇、乙酸乙酯或乙醇)的酶的基因添加至嗜溫或嗜熱生物體。
[0069]在本發(fā)明的一個(gè)方面，可部分、大體上或完全地缺失、沉默、滅活或下調(diào)基因或特定多核苷酸序列，以使它們編碼的活性例如酶的表達(dá)失活。缺失提供了最大穩(wěn)定性，因?yàn)椴淮嬖谑雇蛔兓貜?fù)以恢復(fù)功能的機(jī)會?；蛘?，可通過插入破壞基因的功能和/或表達(dá)的核酸序列(例如，Pi轉(zhuǎn)導(dǎo)或本領(lǐng)域已知的其它方法)，部分、大體上或完全地缺失、沉默、滅活或下調(diào)基因。術(shù)語〃消除(eliminate) 〃、〃消除(elimination) 〃和〃敲除〃可與術(shù)語〃缺失〃、〃部分缺失〃、〃大體上缺失〃或〃完全缺失〃互換使用。在某些實(shí)施方案中，可通過定點(diǎn)同源重組以敲除特定基因來工程化目標(biāo)微生物的菌株。在其它實(shí)施方案中，可將RNAi或反義DNA (asDNA)用于部分、大體上或完全沉默、滅活或下調(diào)特定目標(biāo)基因。
[0070]在某些實(shí)施方案中，本文中描述的被靶向缺失或滅活的基因?qū)τ谖⑸锏奶烊痪昕梢允莾?nèi)源的，從而可被理解為稱為"天然基因"或"內(nèi)源基因〃。如果生物體未曾被遺傳工程化或未曾另外地通過人工以有意改變生物體的基因和/或表型構(gòu)造的方式進(jìn)行操作，則該生物體以“天然狀態(tài)”存在。例如，野生型生物體可被認(rèn)為以天然狀態(tài)存在。在其它實(shí)施方案中，被靶向缺失或滅活的基因?qū)τ谏矬w可以是非天然的。
[0071]類似地，本文中描述的本發(fā)明的酶對于微生物的天然菌株可以是內(nèi)源的，從而可被理解為稱為“天然的”或“內(nèi)源的”。
[0072]如本文中所用，術(shù)語〃表達(dá)〃是指來源于本發(fā)明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可指mRNA至多肽的翻譯。
[0073]術(shù)語〃木質(zhì)纖維素 〃是指由木質(zhì)素和纖維素組成的材料。
[0074]"糖解酶"可以是參與碳水化合物降解、代謝和/或水解的任何酶，包括淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、纖維素分解和淀粉分解輔助酶(accessory enzyme)、菊糖酶、左聚糖酶和戊糖水解酶。
[0075]"戊糖利用酶"可以是參與戊糖降解、代謝和/或水解的任何酶，包括木聚糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸4-差向異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖脫氫酶、木糖醇脫氫酶、木糖酸脫水酶、木糖轉(zhuǎn)酮醇酶和/或木糖轉(zhuǎn)醛醇酶。
[0076]〃纖維素分解酶〃可以是參與纖維素降解、代謝和/或水解的任何酶。術(shù)語〃纖維素酶"是指主要由真菌、細(xì)菌和原生動(dòng)物產(chǎn)生的、催化纖維素的溶纖作用(即水解)的一類酶。然而，還存在由其它類型的生物體例如植物和動(dòng)物產(chǎn)生的纖維素酶。已知幾種在結(jié)構(gòu)和機(jī)理上不同的不同類型的纖維素酶。該組酶的EC編號是EC3.2.1.4。存在基于催化的反應(yīng)的類型的一般類型的纖維素酶:內(nèi)切纖維素酶斷裂內(nèi)部鍵以破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)并且暴露單個(gè)纖維素多糖鏈；外切纖維素酶從由內(nèi)切纖維素酶產(chǎn)生的暴露的鏈的末端切割2-4個(gè)單位，從而產(chǎn)生四糖或二糖例如纖維二糖。存在兩個(gè)主要類型的外切纖維素酶(或纖維二糖水解酶，縮寫為CBH)-從纖維素的還原末端向前作用的一個(gè)類型，和從纖維素的非還原末端向前作用的一個(gè)類型；纖維二糖酶或β -葡糖苷酶將外切纖維素酶產(chǎn)物水解成單個(gè)單糖；通過自由基反應(yīng)使纖維素解聚的氧化纖維素酶，例如纖維二糖脫氫酶(受體)；使用磷酸鹽而非水使纖維素解聚的纖維素磷酸化酶。在最熟悉的纖維素酶活性的案例中，酶復(fù)合物將纖維素?cái)嗔殉搔?葡萄糖。"纖維素酶"可以是參與纖維素降解、代謝和/或水解的任何酶,包括內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、纖維二糖磷酸化酶、纖維糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、內(nèi)切木聚糖酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、swollenin、葡糖醒酸基酯酶、棒曲霉素和阿魏酸酯酶蛋白。
[0077]〃淀粉分解酶〃可以是參與淀粉酶降解、代謝和/或水解的任何酶。術(shù)語〃淀粉酶〃是指將淀粉斷裂成糖的酶。淀粉酶存在于人唾液中，在唾液中其開始降解的化學(xué)過程。包含大量淀粉但少量糖的食物例如大米和馬鈴薯，當(dāng)咀嚼它們時(shí)味道有點(diǎn)甜，因?yàn)榈矸勖笇⑵涞矸鄣囊恍┑矸墼谧炖镛D(zhuǎn)化成糖。胰臟也使淀粉酶(α-淀粉酶)將飲食淀粉水解成二糖和三糖，所述二糖和三糖被其它酶轉(zhuǎn)化成葡萄糖以給身體提供能量。植物和一些細(xì)菌也產(chǎn)生淀粉酶。所有淀粉酶都是糖苷水解酶并且作用于α-1,4-糖苷鍵。一些淀粉酶，例如Y-淀粉酶(葡糖淀粉 酶)，還作用于α -1, 6-糖苷鍵。淀粉酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1)、β -淀粉酶(EC3.2.1.2)和Y -淀粉酶(EC3.2.1.3)。淀粉酶可以是參與淀粉酶降解、代謝和/或水解的任何酶，包括α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶和α -葡糖苷酶。α -淀粉酶是鈣金屬酶，在鈣不存在的情況下不能發(fā)揮作用。通過在沿著淀粉鏈的隨機(jī)位置上作用，α -淀粉酶分解長鏈碳水化合物，最終從直鏈淀粉產(chǎn)生麥芽三糖和麥芽糖或從支鏈淀粉產(chǎn)生麥芽糖、葡萄糖和“極限糊精”。因?yàn)槠淇勺饔糜诘孜锏娜魏挝恢?，因此?淀粉酶傾向于比β_淀粉酶更快速地作用。在動(dòng)物中，其是主要的消化酶并且其最適PH為約6.7-7.0。淀粉酶的另一種形式β_淀粉酶也可由細(xì)菌、真菌和植物合成。通過從非還原末端作用，β-淀粉酶催化第二 α-1，4糖甘鍵水解，一次切除兩個(gè)葡萄糖單位(麥芽糖)。許多微生物產(chǎn)生降解細(xì)胞外淀粉的淀粉酶。除了切割直鏈淀粉和支鏈淀粉的非還原末端上的最后一個(gè)α (1-4)糖苷鍵，從而產(chǎn)生葡萄糖外，Y-淀粉酶還切割α (1-6)糖苷鍵。另一種淀粉分解酶是支鏈淀粉酶。支鏈淀粉酶是一個(gè)特殊類型的葡聚糖酶，是一種淀粉分解性的外酶，其降解支鏈淀粉。支鏈淀粉被當(dāng)作通過α-1，6-糖苷鏈連接的麥芽三糖單位的鏈。支鏈淀粉酶(EC3.2.1.41)也被稱為支鏈淀粉-6-葡聚糖水解酶(脫支酶)。另一種淀粉分解酶，異支鏈淀粉酶，將支鏈淀粉水解成異葡糖基麥芽糖(6-α-麥芽糖基葡萄糖)。異支鏈淀粉酶(EC3.2.1.57)也被稱為支鏈淀粉4-葡聚糖水解酶。〃淀粉酶〃可以是參與淀粉酶降解、代謝和/或水解的任何酶，包括α-淀粉酶、β_淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、異支鏈淀粉酶和α-葡糖苷酶。
[0078]術(shù)語〃木聚糖〃包括眾多種在植物細(xì)胞壁和一些藻類中發(fā)現(xiàn)的高度復(fù)雜的多糖。木聚糖是從木糖的單位產(chǎn)生的多糖。
[0079]術(shù)語〃木聚糖酶〃是給予一類將線性多糖β -1, 4-木聚糖降解成木糖，從而分解半纖維素(植物細(xì)胞壁的主要組分之一)的酶的名稱。這樣，其在以植物資源旺盛生長的微生物中起著主要作用(哺乳動(dòng)物，相反地，不產(chǎn)生木聚糖酶)。此外，木聚糖酶存在于真菌中以將植物物質(zhì)降解成可用的營養(yǎng)物。木聚糖酶包括對應(yīng)于酶委員會編號3.2.1.8的那些酶。"木糖代謝酶"可以是參與木糖降解、代謝和/或水解的任何酶，包括木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖脫氫酶、木糖醇脫氫酶、木糖酸脫水酶、木糖轉(zhuǎn)酮醇酶和木糖轉(zhuǎn)醛醇酶蛋白。
[0080]"戊糖水解酶"可以是參與戊糖降解、代謝和/或水解的任何酶，包括木聚糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸4-差向異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖還原酶、木糖脫氫酶、木糖醇脫氫酶、木糖酸脫水酶、木糖轉(zhuǎn)酮醇酶和/或木糖轉(zhuǎn)醛醇酶。
[0081]生物質(zhì)
[0082]生物質(zhì)可包括本領(lǐng)域已知的或本文中描述的任何類型的生物質(zhì)。術(shù)語〃木質(zhì)纖維材料"、"木質(zhì)纖維底物"和"纖維質(zhì)生物質(zhì)"意指包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素或其組合的任何類型的生物質(zhì),例如但不限于木質(zhì)生物質(zhì)、牧草、草本能源作物、非木質(zhì)植物生物質(zhì)、農(nóng)業(yè)廢物和/或農(nóng)業(yè)殘?jiān)?、林業(yè)殘?jiān)?或林業(yè)廢物、造紙污泥和/或廢紙污泥、廢水處理污泥、城市固體廢物、來自濕法及干法破碎玉米乙醇植物的玉米纖維和糖加工殘?jiān)?。術(shù)語〃半纖維素質(zhì)"、"半纖維素質(zhì)部分"和"半纖維素質(zhì)級分"意指木質(zhì)纖維材料的非木質(zhì)素、非纖維素組成部分，例如但不限于半纖維素(即，包含木糖葡聚糖、木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖)、果膠(例如，同型聚半乳糖醛酸、鼠李聚糖半乳糖醛酸I和II及木糖聚半乳糖醛酸)和蛋白聚糖(例如，阿拉伯半乳聚糖-蛋白、伸展蛋白和富含脯氨酸的蛋白質(zhì))。生物質(zhì)還包括淀粉以及己糖和戊糖。
[0083]在非限定性實(shí)例中，木質(zhì)纖維材料可包括但不限于木質(zhì)生物質(zhì)，例如再循環(huán)木漿纖維、鋸屑、硬木材、軟木材及其組合；草，例如柳枝稷、大米草、黑麥草、利甘草、芒草或其組合；糖加工殘?jiān)绲幌抻诟收嵩?；農(nóng)業(yè)廢物例如但不限于稻草、稻殼、大麥秸、玉米芯、谷類稻桿、小麥稻，油菜稻桿、燕麥稻桿、燕麥殼和玉米纖維；稻桿例如但不限于大豆稻桿，玉米稻桿；肉質(zhì)植物(succulent),例如但不限于龍舌蘭；和林業(yè)廢物例如但不限于再循環(huán)木漿纖維、鋸屑、硬木材(例如，白楊木、橡木、楓木、樺木、柳樹)、軟木材或其任意組合。木質(zhì)纖維材料可包含一種纖維；或者，木質(zhì)纖維材料可包含源自不同木質(zhì)纖維材料的纖維的混合物。其它木質(zhì)纖維材料是 農(nóng)業(yè)廢物例如谷類秸桿，包括小麥秸桿、大麥秸桿、油菜秸桿和燕麥秸桿；玉米纖維；秸桿例如玉米秸桿和大豆秸桿；草，例如柳枝稷、草蘆、大米草和細(xì)葉芒；或其組合。
[0084]紙污泥也是用于乳酸鹽或醋酸鹽產(chǎn)生的活性的原料。紙污泥是從打漿和造紙產(chǎn)生的固體殘?jiān)?，并且通常從初沉池中的處理廢水中取出。
[0085]聯(lián)合生物加工
[0086]聯(lián)合生物加工(CBP)是用于纖維質(zhì)生物質(zhì)的加工策略，包括將如下4個(gè)生物介導(dǎo)的事件合并入單個(gè)過程步驟中:酶產(chǎn)生、水解、己糖發(fā)酵和戊糖發(fā)酵。實(shí)施此策略需要開發(fā)利用纖維素、半纖維素和其它生物質(zhì)組分例如己糖和戊糖，同時(shí)還以足夠高的產(chǎn)率和濃度產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的微生物。CBP的可行性得到動(dòng)力學(xué)和生物能量分析支持。參見van Walsum和 Lynd (1998)Biotech.Bioeng.58:316。
[0087]醋酸
[0088]在兩個(gè)通過磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)和醋酸鹽激酶(ACK)催化的反應(yīng)步驟中從乙酰-CoA產(chǎn)生醋酸鹽。由這些酶介導(dǎo)的反應(yīng)示于下面:
[0089]PTA 反應(yīng):乙酰-CoA+ 磷酸=CoA+ 乙酰磷酸(EC2.3.1.8)
[0090]ACK 反應(yīng):ADP+ 乙酰磷酸=ATP+ 醋酸(EC2.7.2.1)[0091]熱纖梭菌在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下產(chǎn)生醋酸并且具有良好注釋的編碼PTA和ACK的基因。
[0092]丙酮酸
[0093]丙酮酸是重要的代謝中間化合物。例如，在好氧條件下，丙酮酸可被氧化成乙酰輔酶A(乙酰-CoA)，隨后乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，該循環(huán)繼而產(chǎn)生合成的前體、CO2和還原的輔因子。隨后通過一系列酶促步驟將氫等同物提供給氧來氧化輔因子，從而導(dǎo)致水和ATP的形成。該能量生成過程稱為氧化磷酸化。
[0094]木糖代謝
[0095]木糖是可被多種生物體代謝為有用的產(chǎn)物的五碳單糖。存在兩個(gè)主要的木糖代謝途徑，每一個(gè)途徑在它們利用的特征酶中是獨(dú)特的。一個(gè)途徑稱為〃木糖還原酶-木糖醇脫氫酶"或XR-XDH途徑。木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)是用于該木糖降解法中的兩個(gè)主要的酶。由XYLl基因編碼的XR負(fù)責(zé)木糖至木糖醇的還原，并且得到輔因子NADH或NADPH的幫助。木糖醇 隨后被通過XYL2基因表達(dá)的XDH氧化成木酮糖，并且專門地利用輔因子NAD+來實(shí)現(xiàn)。由于該途徑中需要的不同輔因子以及它們可得以使用的程度的原因，不平衡可導(dǎo)致木糖醇副產(chǎn)品的過度生產(chǎn)以及期望的產(chǎn)物的產(chǎn)生不足。已在實(shí)驗(yàn)室中測試了XR和XDH酶水平的不同表達(dá)以試圖最優(yōu)化木糖代謝途徑的效率。
[0096]木糖代謝的另一途徑稱為〃木糖異構(gòu)酶〃 (XI)途徑。酶XI負(fù)責(zé)將木糖直接轉(zhuǎn)化成木酮糖，并且不通過木糖醇中間產(chǎn)物進(jìn)行。兩個(gè)途徑都產(chǎn)生木酮糖，雖然使用的酶不同。在木酮糖產(chǎn)生后，XR-XDH和XI途徑都通過木酮糖激酶(XK)(基因XKSl編碼)繼續(xù)進(jìn)行，以進(jìn)一步將木酮糖修飾成木酮糖-5-P，隨后其進(jìn)入戊糖磷酸途徑以進(jìn)行進(jìn)一步分解代謝。
[0097]除了上述兩個(gè)主要途徑外，木糖還可通過兩個(gè)氧化途徑(稱為Weimberg途徑和Dahms途徑)來進(jìn)行分解代謝，所述兩個(gè)途徑在原核微生物中是共有的。Weimberg途徑是這樣的氧化途徑:其中D-木糖被D-木糖脫氫酶氧化成D-xylono-內(nèi)酯，隨后內(nèi)酯酶將所述內(nèi)酯水解成D-木糖酸。木糖酸脫水酶分離出水分子，從而產(chǎn)生2-酮3-脫氧-木糖酸。第二脫水酶形成2-酮戍二酸半醒,其隨后被氧化成2-酮戍二酸。Dahms途徑的起始與Weimberg途徑一樣，但2-酮-3脫氧-木糖酸被醛縮酶分裂成丙酮酸和乙醇醛。
[0098]關(guān)于在木糖代謝過程中通過戊糖磷酸途徑的流動(dòng)的研究已顯示限制該步驟的速度可有益于至乙醇的發(fā)酵的效率?？商岣咭掖籍a(chǎn)量的對該流動(dòng)的修飾包括a)降低磷酸葡糖異構(gòu)酶活性，b)使GNDl基因缺失，和c)使ZWFl基因缺失(J印psson等人，Appl EnvironMicrobiol.68:1604-1609, 2002)。由于戊糖磷酸途徑在代謝過程中產(chǎn)生額外的NADPH，因此限制該步驟將幫助修正NAD(P)H與NAD+輔因子之間的已明顯的不平衡并且減少木糖醇副產(chǎn)物。比較兩個(gè)木糖代謝途徑的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示XI途徑最能夠代謝木糖以產(chǎn)生最大的乙醇產(chǎn)率，而XR-XDH途徑達(dá)到快得多的乙醇生產(chǎn)速率(Karhumaa等人，Microb CellFact.2007Feb5;6:5)。也參見國際公布號W02006/009434，將其通過引用整體并入本文。
[0099]宿主細(xì)胞
[0100]用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括任何原核或真核細(xì)胞；例如，選自細(xì)菌、藻類和酵母細(xì)胞的微生物。其中適合用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞是微生物例如，梭菌屬(Clostridium)的微生物。
[0101]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是耐熱或嗜熱微生物。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可包含抗生素標(biāo)記或可以不包含抗生素標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是選自梭菌屬的細(xì)菌和具有與梭菌屬種類的特征相似的特征的其它細(xì)菌。
[0103]纖維素分解和木聚糖分解性微生物
[0104]在文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)為具有纖維素分解性和木聚糖分解性的幾種微生物已通過多種方式表征，包括它們在微晶纖維素和樺木木聚糖以及多種其它糖上的生長的能力。此外，還可通過其它方式、包括但不限于它們使纖維素和半纖維素解聚和脫支的能力，來表征此類微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)纖維素分解性生物體是熱纖梭菌。
[0105]表I概述了熱纖梭菌在Avicel?.上的生長
[0106]
【權(quán)利要求】
1.一種能夠發(fā)酵木糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其包含一種或多種編碼一種或多種能夠代謝木糖的酶的異源多核苷酸。
3.權(quán)利要求1或2的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主包含編碼木糖異構(gòu)酶的異源多核苷酸。
4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主包含編碼木酮糖激酶的異源多核苷酸。
5.權(quán)利要求2-4的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞,其中所述一種或多種異源多核苷酸來源于解糖熱厭氧桿菌。
6.權(quán)利要求2-5的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含乳酸脫氫酶啟動(dòng)子和終止子。
7.包含一種或多種異源多核苷酸的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO: 1-2的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一性的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含與SEQID NO: 1-2的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少95%的同一'丨生的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求8的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含與SEQID NO: 1-2的核苷酸序列之任一項(xiàng)相同的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求2-9的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸被表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中一種或多種異源多核苷酸的表達(dá)賦予重組宿主細(xì)胞發(fā)酵木糖的能力。
12.權(quán)利要求2-11的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。
13.權(quán)利要求2-12的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其包含至少兩個(gè)拷貝的整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組的異源多核苷酸。
14.權(quán)利要求2-13的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸在特定的位點(diǎn)被整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。
15.權(quán)利要求2-14的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中異源多核苷酸的至少一個(gè)的整合發(fā)生在宿主細(xì)胞的基因組的特定基因的位點(diǎn)。
16.權(quán)利要求15的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中特定基因是宿主細(xì)胞的乳酸脫氫酶基因。
17.權(quán)利要求2-11的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸在宿主細(xì)胞中存在于染色體外質(zhì)粒中。
18.權(quán)利要求15的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述特定基因由于異源多核苷酸的整合而被破壞。
19.權(quán)利要求15的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述特定基因由于異源多核苷酸的整合而缺失。
20.權(quán)利要求18的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞不能產(chǎn)生被破壞的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
21.權(quán)利要求19的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞不能產(chǎn)生缺失基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求2-21的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種編碼一種或多種酶的異源多核苷酸包含在操縱子中。
23.權(quán)利要求15的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中將一種或多種異源多核苷酸的起始密碼子與特定基因的啟動(dòng)子在讀框內(nèi)整合在宿主細(xì)胞的基因組中。
24.權(quán)利要求15的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中將一種或多種異源多核苷酸的終止密碼子與特定基因的終止子在讀框內(nèi)整合在宿主細(xì)胞的基因組中。
25.權(quán)利要求2-11的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸隨機(jī)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。
26.權(quán)利要求7的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸編碼包含與SEQIDNO:3-4的氨基酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。
27.權(quán)利要求8的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸編碼包含與SEQIDNO:3-4的氨基酸序列之任一項(xiàng)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。
28.權(quán)利要求9的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸編碼包含與SEQIDNO:3-4的氨基酸序列之任一項(xiàng)相同的氨基酸序列的多肽。
29.權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其還包含對于宿主細(xì)胞是內(nèi)源的一個(gè)或多個(gè)基因的缺失。
30.權(quán)利要求29的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)對于宿主細(xì)胞是內(nèi)源的基因的缺失包括次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPT)基因。
31.權(quán)利要求1-30的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞將木糖發(fā)酵成乙醇。
32.權(quán)利要求1-30的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞將木糖發(fā)酵成乙酸。
33.權(quán)利要求1-30的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞將木糖發(fā)酵成丙酮酸。
34.權(quán)利要求1-33的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其還包含PTA基因的缺失。
35.權(quán)利要求34的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞將木糖發(fā)酵成乙醇作為終產(chǎn)物并且不產(chǎn)生不期望的終產(chǎn)物。
36.一種發(fā)酵液，其包含: (a)能夠發(fā)酵木糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞；和 (b)培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含木糖，并且其中所述培養(yǎng)基能夠支持所述宿主細(xì)胞的生長。
37.權(quán)利要求36的發(fā)酵液，其中所述重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞是權(quán)利要求1-35的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
38.一種共培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求1-35的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞和至少一種其它宿主細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的共培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)相同的木糖代謝酶。
40.權(quán)利要求38的共培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)不同的木糖代謝酶。
41.權(quán)利要求38的共培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)至少一種共同的木糖代謝酶。
42.發(fā)酵木糖的方法，其包括: 溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含: (a)生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)包含木糖；和 (b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木糖。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞是權(quán)利要求1-35的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
44.產(chǎn)生一種或多種木糖發(fā)酵產(chǎn)物的方法,包括: 溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包括: (a)生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)包含木糖；和 (b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木糖以產(chǎn)生一種或多種木糖發(fā)酵產(chǎn)物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞是權(quán)利要求1-35的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述一種或多種木糖發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇。
47.重組熱纖梭菌宿主細(xì) 胞，其能夠發(fā)酵木聚糖。
48.權(quán)利要求47的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其包含一種或多種編碼一種或多種能夠代謝木聚糖的酶的異源多核苷酸。
49.權(quán)利要求48的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸在特定位點(diǎn)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。
50.權(quán)利要求49的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸的至少一個(gè)的整合發(fā)生在宿主細(xì)胞的基因組的特定基因的位點(diǎn)。
51.權(quán)利要求50的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述特定基因由于所述異源多核苷酸的整合而被破壞。
52.權(quán)利要求50的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述特定基因由于所述異源多核苷酸的整合而缺失。
53.權(quán)利要求51的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞不能產(chǎn)生被破壞的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
54.權(quán)利要求52的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞不能產(chǎn)生缺失基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
55.權(quán)利要求48的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞,其中所述一種或多種異源多核苷酸在宿主細(xì)胞中存在于染色體外質(zhì)粒中。
56.權(quán)利要求48的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸隨機(jī)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。
57.權(quán)利要求47-56的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞將木聚糖發(fā)酵成乙醇。
58.一種發(fā)酵液,其包含: (a)能夠發(fā)酵木聚糖的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞；和 (b)培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含木聚糖，并且其中所述培養(yǎng)基能夠支持所述宿主細(xì)胞的生長。
59.權(quán)利要求58的發(fā)酵液,其中所述重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞是權(quán)利要求47-56的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
60.—種共培養(yǎng)物,其包含權(quán)利要求47-56的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞和至少一種其它宿主細(xì)胞。
61.權(quán)利要求60的共培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)相同的木聚糖代謝酶。
62.權(quán)利要求60的共培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)不同的木聚糖代謝酶。
63.權(quán)利要求60的共培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)至少一種共同的木聚糖代謝酶。
64.發(fā)酵木聚糖的方法，其包含: 溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含: (a)生物質(zhì)，其中所述生 物質(zhì)包含木聚糖；和 (b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木聚糖。
65.權(quán)利要求64的方法,其中所述重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞是權(quán)利要求47-56的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
66.產(chǎn)生一種或多種木聚糖發(fā)酵產(chǎn)物的方法,其包括: 溫育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含: (a)生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)包含木聚糖；和 (b)重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞能夠發(fā)酵木聚糖以產(chǎn)生一種或多種木聚糖發(fā)酵產(chǎn)物。
67.權(quán)利要求66的方法,其中所述重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞是權(quán)利要求47-56的任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述一種或多種木聚糖發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇。
69.權(quán)利要求1-34的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞,其還包含一種或多種異源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO: 5-21的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一'I"生的核苷酸序列。
70.權(quán)利要求1-34的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞,其還包含一種或多種異源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO: 5-21的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少95%的同一'I"生的核苷酸序列。
71.權(quán)利要求1-34的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其還包含一種或多種異源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:5-21的核苷酸序列之任一項(xiàng)相同的核苷酸序列。
72.權(quán)利要求69的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。
73.權(quán)利要求70的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一項(xiàng)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。
74.權(quán)利要求71的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種異源多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一項(xiàng)相同的氨基酸序列的多肽。
75.權(quán)利要求1-34的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞,其還包含一種或多種異源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一'I"生的核苷酸序列。
76.權(quán)利要求1-34的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞,其還包含一種或多種異源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一項(xiàng)具有至少95%的同一'I"生的核苷酸序列。
77.權(quán)利要求1-34的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其還包含一種或多種異源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與SEQ ID N0:39-50的核苷酸序列之任一項(xiàng)相同的核苷酸序列。
78.權(quán)利要求75的重組熱纖梭菌,其中所述一種或多種異源多核苷酸編碼包含與SEQID NO:51-62的氨基酸序列之任一項(xiàng)具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。
79.權(quán)利要求76的重組熱纖梭菌,其中所述一種或多種異源多核苷酸編碼包含與SEQID NO:51-62的氨基酸序列之任一項(xiàng)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。
80.權(quán)利要求77的重組熱纖梭菌，其中所述一種或多種異源多核苷酸編碼包含與SEQID NO:51-62的氨基酸序列之任一項(xiàng)相同的氨基酸序列的多肽。
81.—種共培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求1-35的任一項(xiàng)的重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞和至少一種權(quán)利要求69-80的任一項(xiàng)的其它重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞。
82.權(quán)利要求1-35的任一項(xiàng)的第一重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞，其通過在包含木糖作為唯一糖源的培養(yǎng)基上生長10代以產(chǎn)生第二重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞來進(jìn)行選擇，所述第二重組熱纖梭菌宿主細(xì)胞比未經(jīng)歷 所述選擇的在其它方面相同的細(xì)胞更高效地利用木糖。
【文檔編號】C12P19/24GK103429751SQ201180066549
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月22日
【發(fā)明者】A·阿吉羅斯, T·巴雷特, N·卡亞薩, D·霍格塞特 申請人:馬斯科馬公司