對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，更具體地，提供一種生成對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，從而在診斷及治療肝吸蟲類時，增加靈敏度和特異性的抗原蛋白質(zhì)，上述對肝吸蟲類具有活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號1至序列號4的組中。
【專利說明】對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對肝吸蟲類的診斷及治療具有有用的抗原活性的蛋白質(zhì)及對上述抗原蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。
【背景技術(shù)】
[0002]人體感染肝吸蟲時，肝吸蟲寄生在膽管中，從而引發(fā)肝吸蟲癥。肝吸蟲癥作為在韓國流行的慢性寄生蟲疾病，2004年韓國國民的肝吸蟲感染率為2.4%，預(yù)計有約120萬人左右的感染者，并且，肝吸蟲癥在4大江流域形成本土化，從而持續(xù)出現(xiàn)感染者。肝吸蟲癥也在中國、越南、泰國、柬埔寨、老挺、俄羅斯及東歐國家流行。
[0003]肝吸蟲會寄生在肝膽管中，并產(chǎn)下蟲卵。蟲卵會隨著糞便一同排出，并流向淡水，從而被作為第一中間宿主的沼螺或幾種淡水貝類吃掉，并且，在貝類的體內(nèi)經(jīng)過胞蝴、雷蝴發(fā)育為尾蝴，再向作為第二中間宿主的鯉魚和淡水魚的肌肉內(nèi)侵入，發(fā)育為后尾蝴(metacercaria)。 人或動物生吃那些被后尾蝴感染的淡水魚時，后尾蝴在十二指腸中脫囊，并直接經(jīng)由膽總管向肝內(nèi)的膽道移動，從而成長為成蟲。由此感染的肝吸蟲在膽道中寄生，并刺激膽道上皮，來引發(fā)膽道炎、膽道周圍纖維化、黃疸、消化不良及肝功能低下等，還會引發(fā)作為并發(fā)癥的膽石、肝硬化及膽囊炎。膽石的情況下，在肝吸蟲的流行區(qū)域中，在膽石的約1/3中發(fā)現(xiàn)肝吸蟲蟲卵。當(dāng)嚴(yán)重的炎癥持續(xù)很久時，最后會引發(fā)膽管癌。通過肝吸蟲類的感染引發(fā)的膽管癌、膽管內(nèi)結(jié)石及化膿性膽管炎等多種并發(fā)癥比起肝吸蟲感染本身而言是非常嚴(yán)重的疾病，因此，在發(fā)展成此類重癥疾病之前，在早期診斷是否感染，并提前治療是非常重要的。
[0004]通過用卩比喹酮(praziquantel)給藥來對肝吸蟲進(jìn)行驅(qū)蟲。這種藥品不僅對肝吸蟲發(fā)揮優(yōu)秀的驅(qū)蟲效果，還對肺吸蟲、腸吸收蟲類及裂體吸蟲也發(fā)揮優(yōu)秀的驅(qū)蟲效果。治療肝吸蟲后，人體由于沒有生成對肝吸蟲的抵抗力，因此，利用吡喹酮進(jìn)行驅(qū)蟲后，還會發(fā)生肝吸蟲的再次感染。
[0005]作為肝吸蟲癥感染的診斷方法，現(xiàn)在所使用的標(biāo)準(zhǔn)檢查法是顯微鏡蟲卵糞便檢查法。一條肝吸蟲成蟲一天所產(chǎn)下的蟲卵數(shù)量大約在100個左右。對肝吸蟲蟲體的負(fù)荷較低的感染者的情況下，顯微鏡蟲卵糞便檢查法的蟲卵檢測率會降低，從而需要進(jìn)行反復(fù)檢查，因此，具有糞便檢查所需時間過長的缺點。并且，還具有患者不愿意采取和提出診斷用糞便的問題和在解讀寄生蟲蟲卵方面需要熟練的專業(yè)人員的問題。除此之外，還補充利用血清學(xué)抗體檢查、超聲波檢查法、內(nèi)視鏡逆行性膽道照影術(shù)及皮內(nèi)反應(yīng)檢查法。血清抗體檢查法將肝吸蟲粗蛋白用作抗原，雖然靈敏度高，但特異度低。粗抗原蛋白對肝吸蟲感染者的血清實施免疫印跡(immunoblotting),即，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA, enzyme linkedimmunosorbent assay)的結(jié)果表明，雖然靈敏度高,但特異度低，因交叉反應(yīng),不適合用作鑒別診斷寄生蟲感染的抗原蛋白質(zhì)(Chen et al.，1994)。肝吸蟲粗抗原為了改善與其他寄生蟲感染者的血清進(jìn)行交叉反應(yīng)的非特異性陽性反應(yīng)，需要解決研發(fā)一種特異度和靈敏度都優(yōu)秀的單一抗原蛋白質(zhì)的難題。[0006]皮內(nèi)反應(yīng)檢查在以前感染過的人群中也顯示陽性反應(yīng)(Chung et al., 1995 ；Sandun et al.，1959; Walton和主，1959 ;金東燦外，1969 ;鄭浩然外，1989)，并與肺吸蟲、豬囊尾蝴等感染者進(jìn)行交叉反應(yīng)(Hunter，1958)。因此，皮內(nèi)反應(yīng)檢查法是一種用作用于個人或集團(tuán)管理的檢查法方面存在很多限制的檢查法。
[0007]1950年以后，作為檢測寄生蟲特異性抗體的血清學(xué)檢查法，研發(fā)出補體結(jié)合反應(yīng)法、免疫熒光法、免疫電泳法、免疫瓊脂擴(kuò)散法及酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)等。血清學(xué)檢查法是在由于蟲體幼小而無法產(chǎn)下蟲卵，或者由于蟲體衰老而無法產(chǎn)下蟲卵的情況下，從血清中檢測出抗體，來診斷肝吸蟲感染的診斷法。其中，從感染者的血液中檢測肝吸蟲抗原蛋白質(zhì)的抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定法有效地利用于肝吸蟲癥的診斷。為了研發(fā)免疫血清檢查試劑盒，確保靈敏度和特異度都很高的肝吸蟲特異抗原是非常重要的。近來，為了以血清學(xué)的方式診斷肝吸蟲癥，使用了肝吸蟲的粗抗原。這種粗抗原是由不明成分的大量蛋白質(zhì)混合而成的，且與其他寄生蟲感染血清進(jìn)行交叉反應(yīng)。因此，比起此類粗抗原，期待由單一蛋白質(zhì)分離、純化而成的單一抗原蛋白質(zhì)作為血清學(xué)診斷抗原更為有用。但是，將到目前為止的可作為候選物質(zhì)的多個抗原候選蛋白質(zhì)一次性地表達(dá)、純化為具有溶解性的蛋白質(zhì)，并通過免疫印跡或免疫酶反應(yīng)法評價抗原性是在工作的規(guī)模或工作量方面也并不輕松。
[0008]長久以來，陸續(xù)進(jìn)行有關(guān)抗原蛋白質(zhì)的研究，通過多個研究團(tuán)隊，評價了多個抗原候選蛋白質(zhì)。對少數(shù)蛋白質(zhì)的抗原性評價研究在最近的10多年間一直持續(xù)進(jìn)行，而到目前為止，尚未研發(fā)出可用作有用的診斷試劑的靈敏度和特異度均高的優(yōu)秀的單一抗原蛋白質(zhì)。利用單一抗原蛋白質(zhì)的情況下，雖然特異度高，但由于靈敏度低，因此，對肝吸蟲感染負(fù)荷低的患者的診斷具有限制等，從而使靈敏度和特異度均高的診斷法無法定立。因此，由于抗原性非常強，需要持續(xù)研發(fā)靈敏度和特異度都很卓越的肝吸蟲抗原蛋白質(zhì)。
[0009]對此，本發(fā)明從分子生物學(xué)、免疫血清學(xué)的方面查明現(xiàn)有的肝吸蟲癥的診斷抗原的問題，從而提供既能維持特異度，還能使靈敏度優(yōu)秀的肝吸蟲癥的診斷及治療用抗原。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]要解決的技術(shù)問題
[0011]本發(fā)明要提供具有對肝吸蟲類的診斷及治療有用的抗原活性的蛋白質(zhì)及對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。
[0012]并且，本發(fā)明要提供將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的肝吸蟲類診斷用組合物。
[0013]并且，本發(fā)明要提供將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的肝吸蟲類預(yù)防或治療用疫苗組合物。
[0014]技術(shù)方案
[0015]本發(fā)明要提供對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0016]上述肝吸蟲類可以是選自肝吸蟲、泰國肝吸蟲及貓肝吸蟲的組中。
[0017]本發(fā)明要提供一種對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。
[0018]由選自堿基序列的全部或一部分中的序列來表示上述基因，上述堿基序列選自包含序列號5至序列號8的組中。
[0019]本發(fā)明要提供肝吸蟲類診斷用組合物，該組合物將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0020]本發(fā)明要提供肝吸蟲類預(yù)防用或治療用疫苗組合物，該組合物將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0021]本發(fā)明要提供對肝吸蟲類具有抗原的蛋白質(zhì)的抗體，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0022]技術(shù)效果
[0023]本發(fā)明利用無細(xì)胞高通量(cell-freehigh-throughput)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)特異度和靈敏度優(yōu)秀的抗原蛋白質(zhì)，從而生產(chǎn)對肝吸蟲癥的診斷及治療有用的抗原蛋白質(zhì)及抗原蛋白質(zhì)組合物。 本發(fā)明的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，它的片段或突變體由于具有優(yōu)秀的特異性和靈敏度，在預(yù)防或治療肝吸蟲類感染方面可用作很好的免疫原或免疫刺激劑，并且，在診斷肝吸蟲類方面可用作診斷用抗原，因此，本發(fā)明的產(chǎn)業(yè)上的利用價值將會非常大。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是用于選擇肝吸蟲表達(dá)序列標(biāo)簽(EST, Expressed Sequence Tag)克隆的，圖1a表示從預(yù)測為分泌蛋白質(zhì)的EST中確認(rèn)切割位點(cleavage site),圖1b表示掌握選自肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體信息庫中的EST的讀序(read)結(jié)構(gòu)信息,來選擇包含起始密碼子(startcodon)和切割位點(cleavage site)的一個讀序(read)。
[0025]圖2是涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR, Polymerase Chain Reaction)引物的研制，圖2a表示第一次PCR引物，圖2b表示第二次PCR引物。
[0026]圖3表不麥胚無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(Wheat germ cell-free protein synthesis)過程(出處:cell-free sciences)。
[0027]圖4表不抗體蛋白芯片的說明圖。
[0028]圖5涉及融合克隆(In-fusion cloning),圖5a涉及PCR引物的研制，圖5b涉及麥胚無細(xì)胞表達(dá)運載體(Wheat germ cell-free expression vector)的研制。
[0029]圖6部分表示確認(rèn)肝吸蟲分泌蛋白質(zhì)的互補脫氧核糖核酸(cDNA, complementaryDeoxyribonucleic acid)的結(jié)果。
[0030]圖7表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖7a部分表示第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖7b部分表示第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0031]圖8部分表不重組蛋白陳列-抗體反應(yīng)(recombinant protein array-Antibodyreaction)的突光發(fā)色結(jié)果。
[0032]圖9是以正常對照組血清的突光強度(fluorescence intensity)的比率(ratio)表示對各個重組蛋白質(zhì)的肝吸蟲患者血清的陽性反應(yīng)強度。
[0033]圖10表示確認(rèn)多個抗原候選EST克隆的cDNA插入(insert)。[0034]圖11表示麥胚系統(tǒng)(wheat germ system)中生產(chǎn)的抗原候選抗原重組蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果。
[0035]圖12表示對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化之后的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)結(jié)果。
[0036]圖13是檢測重組候選抗原蛋白質(zhì)的抗原性的，是表示利用ELISA的對肝吸蟲感染者血清及對照組正常人血清(_)的反應(yīng)性分析結(jié)果(Cs，肝吸蟲感染血清；0v，泰國肝吸蟲感染血清；Pw,肺吸蟲感染血清)。
【具體實施方式】
[0037]本發(fā)明提供對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)及對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。并且，本發(fā)明還要提供將對肝吸蟲類具有活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的組合物。
[0038]肝吸蟲感染者預(yù)計有大約140萬人，從而對韓國國民的健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅，因此，對肝吸蟲的管理是必須的。為了增大肝吸蟲癥管理的效率性，要反復(fù)形成對非特定多數(shù)的大規(guī)模的檢查。并且，醫(yī)院也要能夠容易檢查肝吸蟲感染。但是，目前用于肝吸蟲癥的診斷的顯微鏡蟲卵檢查法等雖然能夠直接確認(rèn)是否感染肝吸蟲，但很難檢測出感染初期或輕感染或非蟲卵性感染，也不適合進(jìn)行大量檢查，并且，需要能夠鑒別蟲卵的熟練的專業(yè)人員，并且，血清學(xué)的診斷法雖然能夠進(jìn)行大規(guī)模的集體診斷，但在肝吸蟲蟲體的負(fù)荷低的情況下，有可能被解讀為假陰性(false negative)等的基于現(xiàn)有方法的肝吸蟲類的診斷方法未能定立同時滿足靈敏度和特異度的診斷法。為了克服這些問題，本
【發(fā)明者】為了診斷肝吸蟲類，為了提供靈敏度和特異度的同時制備費用更加低廉的抗原蛋白質(zhì)而付出努力的過程中，確認(rèn)了一旦使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，既能使抗原的特異性優(yōu)秀，還能提高靈敏度，從而完成了本發(fā)明。
[0039]以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0040]本發(fā)明提供對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，上述對肝吸蟲類具有活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0041]本發(fā)明的肝吸蟲類(Liver Fluke)可以是成蟲具有寄生在動物的肝及膽道等的生態(tài)條件的吸蟲類，優(yōu)選地，可以是選自包含肝吸蟲(Clonorchis sinensis)、泰國肝吸蟲(Opisthorchis viverrini)及貓肝吸蟲(Opisthorchis felineus)的組中的一種。
[0042]本發(fā)明的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)意味著可根據(jù)被肝吸蟲類感染的人或動物來源抗血清來識別的蛋白質(zhì)。其中，“根據(jù)抗血清來識別”意味著與抗血清中包含的抗體成分相結(jié)合，并且，通常能夠通過為了檢測這一結(jié)合所使用的免疫印跡法、ELISA及免疫沉淀法等免疫學(xué)方法對其抗原進(jìn)行檢測和/或定量。這些抗原蛋白質(zhì)對于人類或動物而言，作為誘導(dǎo)對肝吸蟲類感染的感染防御免疫的疫苗用抗原，也作為用于診斷是否感染及進(jìn)行狀態(tài)的抗原非常有用。
[0043]本
【發(fā)明者】從被肝吸蟲類感染的人類或動物中確認(rèn)是否感染，并為了準(zhǔn)確診斷患者，操作具有抗原性的基因，來篩選和制備抗原性高的蛋白質(zhì)。
[0044]本發(fā)明的序列號I相當(dāng)于下述實施例的抗原蛋白質(zhì)#12，由183個氨基酸序列組成。[0045]本發(fā)明的序列號2相當(dāng)于下述實施例的抗原蛋白質(zhì)#15，由107個氨基酸序列組成。
[0046]本發(fā)明的序列號3相當(dāng)于下述實施例的抗原蛋白質(zhì)#17，由139個氨基酸序列組成。
[0047]本發(fā)明的序列號4相當(dāng)于下述實施例的抗原蛋白質(zhì)#18，由274個氨基酸序列組成。
[0048]上述序列號I至序列號4的氨基酸序列(參照圖14)是來源于以實驗方式被后尾蝴感染的兔子中回收的從韓國患者中分離的肝吸蟲(Clonorchis sinensis)的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)不僅意味著由選自包含序列號I至序列號4的組中的氨基酸組成的蛋白質(zhì)或上述蛋白質(zhì)的多個片段蛋白質(zhì)，還能通過一種以上的置換、缺失、逆位及轉(zhuǎn)位等突變，使此類蛋白質(zhì)包含作為本發(fā)明目的的對肝吸蟲類具有抗原活性的所有變異蛋白質(zhì)。
[0049]在本發(fā)明中，只要是由被肝吸蟲類感染的人或動物來源的抗血清來識別的，由序列號I至序列號4表示的一部分氨基酸序列組成的多肽也包含在本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)中。由這些一部分氨基酸序列組成的多肽將由例如由序列號I至序列號4表示的氨基酸序列組成的抗原蛋白質(zhì)作為 原料，通過使用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶、胰蛋白酶等蛋白酶的消化酶進(jìn)行切割后，或者通過由溴化氰等化學(xué)處理進(jìn)行切割后，通過蛋白質(zhì)純化方法之一的已知方法，對具有抗原性的目的肽片段進(jìn)行隔離純化等來獲得。并且，將上述序列號I至序列號4表示的氨基酸序列作為對象，并通過化學(xué)合成法制備利用公知的抗原決定基(epitope)預(yù)測程序來決定的肽片段之后，可通過免疫印跡法、ELISA及免疫沉淀法等免疫學(xué)方法來驗證其抗原性。
[0050]本發(fā)明的對肝吸蟲類具有抗原活性的抗原蛋白質(zhì)有可能是利用所屬領(lǐng)域技術(shù)中的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，并通過合成或重組來生產(chǎn)的，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的抗原蛋白質(zhì)的特征在于，包含選自包含序列號I至序列號4的組中的氨基酸序列。上述技術(shù)能夠參照文獻(xiàn)[例如，SambiOok MolecularCloning:A Laboratory Manual, Second Edition(1989);DNA Cloning, Volumes I and
II(D.N.Glovere, ed., 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed., 1986) ; NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins, eds., 1984);Transcription andTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins, eds., 1984);Animal Cell Culture(R.1.Freshney,ed., 1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986);B.Perbal1A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984);the Methods in Enzymology series(AcademicPress, Inc.), especially volumesl54andl55;Gene Transfer Vectors for MammalianCells (J.H.Miller and M.P.Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);Mayerand Walker, eds., (1987), Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology (Academic Press,London);Scopes, (1987), Protein Purificaiton!Principlesand Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of ExperimentalImmunology, Volumes 1-1V (D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds.，1986)],但在通過無細(xì)胞高通量(cell-freehigh-throughput)重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)制備的重組蛋白質(zhì)的情況下，既能維持三級結(jié)構(gòu)，還能生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)，從而可呈現(xiàn)優(yōu)秀的效果。
[0051]并且，上述制備的抗原蛋白質(zhì)通過所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的方法對該蛋白質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)化或糖化等加工也能屬于本發(fā)明的范圍。
[0052]作為本發(fā)明的一例，本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)可以是通過如下方法制備的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)。步驟1，分析肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體，來篩選分泌蛋白質(zhì)及抗原候選蛋白質(zhì)的cDNA克??；步驟2,提取上述篩選的抗原候選蛋白質(zhì)cDNA克隆的質(zhì)粒DNA,并通過兩步(two-step) PCR擴(kuò)增目標(biāo)cDNA ;步驟3,利用麥胚無細(xì)胞系統(tǒng)(wheat germ cell-freesystem)，將上述擴(kuò)增的cDNA合成為重組蛋白質(zhì)；以及步驟4，在上述重組蛋白質(zhì)中，使用肝吸蟲感染者的血清,來篩選抗原性高的克隆。
[0053]本發(fā)明將對肝吸蟲類具有抗原的蛋白質(zhì)對吸蟲感染者的血清及對照組正常人的血清進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖13和表6所示，由本發(fā)明的序列號I至序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有優(yōu)秀的特異度和靈敏度。
[0054]本發(fā)明的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)可以是將單一蛋白質(zhì)作為抗原的(單一抗原)，也可以是將復(fù)合蛋白質(zhì)作為抗原的(復(fù)合抗原)，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自包含序列號I至序列號4的組中的氨基酸序列。
[0055]肝吸蟲寄生在膽道內(nèi)，位于抗原蛋白質(zhì)需要通過膽道上皮層，在宿主的免疫監(jiān)視體系中公示的公示效率比較低的解剖學(xué)位置。由于此類病態(tài)生理學(xué)的特性，肝吸蟲感染者中，肝吸蟲特異抗體的生產(chǎn)效率較低，血中抗體效價也不高?？紤]此類肝吸蟲癥的病態(tài)生理學(xué)特性時，本發(fā)明中作為維持粗抗原(crude extracts)的高靈敏度,并使交叉反應(yīng)最小化的方法，作為本發(fā)明的一例，能夠混合多個單一抗原來制備復(fù)合抗原(mult1-antigenmix),由此可用作診斷抗原。
[0056]在本發(fā)明的肝吸蟲復(fù)合抗原中使用的多個單一抗原蛋白質(zhì)由于特異度高，因此，既能與其他寄生蟲及病原體進(jìn)行鑒別診斷，還因抗原蛋白質(zhì)相互之間的抗原決定基相互不同，因此，能夠與肝吸蟲感染者血液中 的相互不同的抗體相結(jié)合，來增加復(fù)合抗原的陽性反應(yīng)率。肝吸蟲類的單一抗原蛋白質(zhì)分布在相互不同的組織，或?qū)儆谙嗷ゲ煌纳?代謝途徑時，會使抗原決定基相異，因此，多個單一抗原能夠與相互不同的抗體相結(jié)合，來提高復(fù)合抗原的陽性反應(yīng)率(靈敏度)。
[0057]本發(fā)明要提供對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0058]本發(fā)明的基因可包含對序列號I至序列號4的氨基酸序列的全部或一部分進(jìn)行編碼的任何基因，但優(yōu)選地，可以是由選自堿基序列的全部或一部分中的序列表示的基因，其中，上述堿基序列選自包含序列號5至序列號8的組中。并且，本發(fā)明的范圍還可包含對通過一種以上的置換、缺失、逆位及轉(zhuǎn)位等突變來使此類蛋白質(zhì)變形的對肝吸蟲類具有抗原活性的所有變異蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。
[0059]本發(fā)明的序列號5相當(dāng)于對上述氨基酸序列號I (抗原蛋白質(zhì)#12)進(jìn)行編碼的DNA序列(參照圖15)。
[0060]本發(fā)明的序列號6相當(dāng)于對上述氨基酸序列號6 (抗原蛋白質(zhì)#15)進(jìn)行編碼的DNA序列(參照圖16)。
[0061]本發(fā)明的序列號7相當(dāng)于對上述氨基酸序列號3 (抗原蛋白質(zhì)#17)進(jìn)行編碼的DNA序列(參照圖17)。[0062]本發(fā)明的序列號8相當(dāng)于對上述氨基酸序列號4 (抗原蛋白質(zhì)#18)進(jìn)行編碼的DNA序列(參照圖18)。
[0063]本發(fā)明要提供將對肝吸蟲類具有活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的組合物，上述對肝吸蟲類具有活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，包含氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0064]本發(fā)明的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)及其片段或突變體由于具有優(yōu)秀的特異性和靈敏度，因此，能夠在制備肝吸蟲類的預(yù)防或治療用疫苗時作為有用的成分來利用，并且，也能提供于肝吸蟲類的抗體生產(chǎn)。
[0065]本發(fā)明的肝吸蟲類(Liver Fluke)可以是成蟲具有寄生在動物的肝及膽道等的生態(tài)條件的吸蟲類，優(yōu)選地，可以是選自包含肝吸蟲(Clonorchis sinensis)、泰國肝吸蟲(Opisthorchis viverrini)及貓肝吸蟲(Opisthorchis felineus)的組中的一種。
[0066]本發(fā)明的適用對象包括人類或非人類，優(yōu)選地，可以是人類、貓、狗、牛、羊等，但并不局限于此。
[0067]本發(fā)明提供將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的預(yù)防或治療用主動免疫化用疫苗組合物，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0068]本發(fā)明提供免疫化用疫苗，其設(shè)計目的在于，治療肝吸蟲類感染或者防止被肝吸蟲類感染，而此類疫苗能 夠通過所屬領(lǐng)域主旨的常規(guī)的疫苗制備方法來制備。
[0069]將免疫學(xué)量的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)或其片段與制藥方面接受的適合的輔料、運載體或賦形劑進(jìn)行組合，并以對人類或動物進(jìn)行免疫化方面有效的量，適當(dāng)注射上述疫苗，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自包含序列號I至序列號4的組中的氨基酸序列。免疫學(xué)量也可以是指在人類或動物身上充分產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)的蛋白質(zhì)或其片段的數(shù)量。
[0070]制備作為活性成分的包含本發(fā)明的氨基酸序列或一部分氨基酸序列的疫苗是所屬領(lǐng)域主旨的。典型的有，如上的疫苗能夠制備成液狀溶液或懸浮液的注射劑，也能在注射前制備成液狀的溶液或在制備成懸浮液之前制備成適合的固體劑型。制劑還能進(jìn)行乳化?；钚悦庖咴猿煞执蟾旁谥扑幧峡杀唤邮?，并能與活性成分和賦形劑等一同進(jìn)行混合。適合的賦形劑有，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合物，并且，選擇性地，疫苗可含有少量的輔助物質(zhì)，例如，潤濕劑、乳化劑、PH緩沖劑或增進(jìn)疫苗的功效的佐劑(adjuvant)。疫苗通常利用注射方式，進(jìn)行腸胃外給藥，例如，皮下給藥或肌肉內(nèi)給藥。適合其他不同給藥方式的追加制劑可包含栓劑，以及在一些情況下，可包含口服用制劑。栓劑的情況下，現(xiàn)有結(jié)合劑及運載體可包含例如，聚亞烷基二醇或甘油三酸酯，并且，此類栓劑可由含有0.5%至10%的活性成分的混合物形成，優(yōu)選地，由含有1%-2%活性成分的混合物形成，但本發(fā)明的范圍并不局限于此。口服用制劑可包含例如，制藥等級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等普遍使用的賦形劑。此類組合物能夠采用液劑、懸浮劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或粉劑的形態(tài)，并可包含10%-95%的活性成分，優(yōu)選地，包含25%-70%的活性成分，但本發(fā)明的范圍并不局限于此。
[0071]本發(fā)明的疫苗可包含例如由鹽酸或磷酸之類的無機(jī)酸或由乙酸、乙二酸、酒石酸、扁桃酸等有機(jī)酸形成的酸加成鹽以及制藥上接受的鹽。并且，由游離羧基形成的鹽可由例如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣或氫氧化鐵之類的無機(jī)堿及異丙基胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等有機(jī)堿衍生。
[0072]疫苗能夠以預(yù)防學(xué)或治療學(xué)的有效量，給藥到需要該疫苗的受試者。給藥的量會根據(jù)所要治療的受試者、可合成抗體的受試者的免疫系統(tǒng)的能力及所需的保護(hù)程度有所不同。要進(jìn)行給藥的活性成分的準(zhǔn)確劑量會根據(jù)醫(yī)療診療醫(yī)生的判斷有所不同。就皮下或肌肉注射的給藥量而言，例如，相當(dāng)于每一名受試者的活性成分約為0.0Olmg至IOmg,在口服用、直腸栓劑用，尿道用或陰道用制劑的情況下，給藥量能夠在約0.005mg至50mg的范圍，但本發(fā)明的范圍并不局限于此。雖然適合最初給藥及追加注射的治療法也會不同，但在最初給藥之后，普遍隔著大約I周至約2周進(jìn)行后續(xù)的注射或其他不同給藥過程，但本發(fā)明的范圍并不局限于此。
[0073]并且，本發(fā)明提供對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)的抗體，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0074]本發(fā)明提供能夠與對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)或其片段進(jìn)行特異性結(jié)合的抗體，具體地，上述多個抗體能夠根據(jù)例如文獻(xiàn)(〃Antibodies:A LaboratoryManual, Lane, H.D.et al.eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)或文獻(xiàn)[Kohler and Milstein, Nature 256:495497 (1975)]中主旨的方法等現(xiàn)有的公知方法容易地制備。具體地，本發(fā)明的識別蛋白質(zhì)或其片段的抗體，通過常規(guī)的方法，對動物身上的肝吸蟲的蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖呋?，從而能夠容易地制備。上述多個抗體能夠用于親和性色譜法、免疫學(xué)診斷法等。免疫學(xué)診斷法能夠有用地選自免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELI SA)、熒光或發(fā)光分析法等中。
[0075]本發(fā)明提供將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的肝吸蟲類預(yù)防或治療用被動免疫化用組合物，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0076]除了免疫學(xué)量的活性 疫苗以外，本發(fā)明的單利的抗體或上述抗體的活性片段也能適用于制藥組合物合/或疫苗研發(fā)，使得對肝吸蟲感染進(jìn)行被動免疫化，上述活性疫苗通過蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的用藥，使抗體在患者體內(nèi)生成。
[0077]本發(fā)明的抗體為了治療或預(yù)防由肝吸蟲類引起的感染，可形成為適合給藥到人類或動物的制藥組合物的形態(tài)。本發(fā)明的包含抗體的制藥組合物能夠與鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其他不同的治療學(xué)化合物，以及包含它們的組合物的所屬領(lǐng)域普遍使用的任一適合的制藥輔料、賦形劑或運載體一同進(jìn)行組合來制備而得。制藥組合物的適合的給藥方法可包括局部、口服、肛門、陰道、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)及真皮內(nèi)給藥，但并不局限于此。就皮下或肌肉注射的給藥量而言，例如，相當(dāng)于每一名受試者的活性成分約為0.0Olmg至10mg，在口服用、直腸栓劑用，尿道用或陰道用制劑的情況下，給藥量能夠在約0.005mg至50mg的范圍，但本發(fā)明的范圍并不局限于此。
[0078]本發(fā)明的抗體組合物還能以增進(jìn)免疫原性反應(yīng)方面有效的量與適合的佐劑一同進(jìn)行給藥。例如，適合的佐劑可包含明礬(磷酸鋁或氫氧化鋁)及其他不同佐劑，例如，皂苷及其純化后的成分Quil A、弗氏完全佐劑、RIBBI佐劑以及用于研究用及獸醫(yī)學(xué)用途的其他不同佐劑?；瘜W(xué)定義的其他制劑的例包含胞壁酰二肽、單磷酰脂質(zhì)A、磷脂質(zhì)結(jié)合體、蛋白脂質(zhì)體內(nèi)結(jié)合體的膠囊化及脂質(zhì)囊泡中的蛋白質(zhì)的膠囊化。
[0079]本發(fā)明的用于給藥抗體組合物的優(yōu)選給藥量成為對預(yù)防或治療肝吸蟲類感染有效的量，并且，上述量會根據(jù)感染的性質(zhì)及受試者的狀態(tài)而不同。根據(jù)本發(fā)明所使用的抗體或制藥制劑的“有效量”意味著能夠發(fā)揮預(yù)防學(xué)或治療學(xué)效果的，非毒性且充分的上述制劑的量。所需的抗體或特定制劑的準(zhǔn)確量根據(jù)受試者的種類、年齡、一般健康狀態(tài)、要治療的病態(tài)的重癥度、所使用的特定運載體或佐劑及其給藥方式等會有所不同。因此，任一特定抗體組合物的“有效量”以特定的環(huán)境為基礎(chǔ)，會有所不同，而適當(dāng)?shù)挠行Я吭诜謩e適用時，使用常規(guī)的實驗，從而會根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來決定。給藥量能夠調(diào)節(jié)為適合接收組合物的各個受試者，并且，上述給藥量根據(jù)各個個體的年齡、體重及代謝，會有所不同。并且，組合物可含有穩(wěn)定劑或制藥上接受的防腐劑。追加地，本發(fā)明的抗體可變形為在給藥時具有更小的免疫原性的抗體。
[0080]本發(fā)明提供將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為有效成分的肝吸蟲類診斷用組合物，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
[0081]本發(fā)明提供 將對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)作為診斷用抗原的診斷用試劑盒，上述對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)包含選自包含序列號I至序列號4的組中的氨基酸序列，在診斷由肝吸蟲類引發(fā)的疾病的情況下，優(yōu)選地，在進(jìn)行血清學(xué)診斷時有用，并且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)由于抗原性非常強大，靈敏度和特異度卓越，且只能將重組或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)作為抗原來使用，因此，具有在操作及診斷時，穩(wěn)定性高的優(yōu)點。
[0082]并且，本發(fā)明的肝吸蟲類的診斷用抗原能夠提供于所屬領(lǐng)域中普遍使用診斷抗原來診斷疾病的所有診斷方法及確認(rèn)肝吸蟲類檢測的診斷方法，并且，作為一例，可使用于瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(AGID)、酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)、免疫色譜反應(yīng)法及肝吸蟲癥快速診斷測試(RDT, Rapid Diagnostic Test)等。即，本發(fā)明使從受試者身上采取的生物學(xué)抗體試樣和本發(fā)明的肝吸蟲類診斷用抗原進(jìn)行反應(yīng)，從而可提供給檢測抗原-抗體反應(yīng)的診斷試劑盒。
[0083]優(yōu)選實施方式
[0084]以下，通過實施例及實驗例更加詳細(xì)說明本發(fā)明。這些實施例及實驗例僅用于例示本發(fā)明，因此，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實施例及實驗例。
[0085]實施例
[0086]實施例1:肝吸蟲抗原候選蛋白質(zhì)的cDNA篩選
[0087]實施例1-1:肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體信息的分析
[0088]I)肝吸蟲分泌蛋白質(zhì)的預(yù)測
[0089]利用以生物信息學(xué)的方式預(yù)測分泌蛋白質(zhì)的信號P-自然網(wǎng)絡(luò)(SignalP-naturalnetworks)和信號 P-隱馬爾可夫模型(SignalP-hidden Markov model)程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析了在肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體庫中登錄的肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體cDNA族(cluster) 12830 個。
[0090]2) EST 克隆(clone)的選擇
[0091]肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體由單態(tài)(singlet)和簇組成,上述單態(tài)由一個讀序(read)組成,上述簇由2個以上的讀序組成。預(yù)測為分泌蛋白質(zhì)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST, expressed-sequencedtag)為簇的情況下,選擇了包含切割位點(cleavage site)的讀序(參照圖1)。
[0092]實施例1-2:抗原蛋白質(zhì)cDNA的篩選
[0093]分析肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體信息，來篩選被預(yù)測為具有抗原性的EST，并且，利用肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體的注釋(annotation)信息，來選擇與在其他生物體中被預(yù)測為具有抗原性的蛋白質(zhì)具有高相似度的抗原候選的EST。
[0094]實施例1-3:引物DNA的提取
[0095]從篩選的EST克隆的細(xì)胞庫存(cell stock)中，提取質(zhì)粒DNA。
[0096]I)為了獲取肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體信息而制備的肝吸蟲cDNA庫構(gòu)建于pBK-CMV、pBluscript-SK (-)或 pAD-GAL4_2.1。在篩選的 607 個 EST 克隆當(dāng)中，構(gòu)建于 pBK-CMV 載體的515個克隆在包含卡那霉素的溶菌肉湯(LB, lysogeny broth)培養(yǎng)基中培養(yǎng),構(gòu)建于pBluescript-SK (-)或pAD-GAL4_2.1的92個克隆在包含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0097]2)使用質(zhì)粒小抽試劑盒(QIAprep Spin Miniprep Kit)(凱杰公司(QIAGEN),希爾敦(Hilden),德國(Germany)),提取包含肝吸蟲抗原候選蛋白質(zhì)的cDNA的質(zhì)粒DNA。
[0098]3)由于所擁有的肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體庫的信息是EST堿基序列，因此，沒有插入(insert)cDNA整體長度的相關(guān)信息。為了對此進(jìn)行確認(rèn)，構(gòu)建于pBK-CMV的515個克隆利用限制性內(nèi)切酶BamHI和SmaI (羅氏公司(Roche),曼海姆(Mannheim),德國(Germany))進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建于pBluescript-SK (-)的68個克隆和構(gòu)建于pAD_GAL4_2.1的24個克隆利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切。
[0099]實施例2:利用基于麥胚細(xì)胞的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(Wheat germ cell basedcell-free protein synthe sis)系統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)
[0100]實施例2-1:引物(Primer)的研制及合成
[0101]I)第一次PCR引物的研制(參照圖2a)
[0102]制備包含SI序列的引物，使得靶cDNA能夠與deSP6E02his_Sl相結(jié)合，上述deSP6E02his_Sl 為第二次 PCR 的正義引物(sense primer)。
[0103]首先，選擇包含切割位點(Cleavage site)的開放閱讀框(0RF, open readingframe),并包含起始密碼子(start codon)來研制23±2nt長度的基因特異性引物(gene-specific primer)之后，在正義引物中包含SI序列。反義引物(Antisense primer)是利用克隆了肝吸蟲cDNA的載體的序列來研制的。研制的引物是由柏業(yè)公司(Bioneer，大田(Daejeon),韓國(korea))合成的。
[0104]2)第二次PCR引物的研制(參照圖2b)
[0105]制備引物，使得在PCR產(chǎn)物中附加SP6啟動子序列和EOI翻譯增強子序列(translational enhancer sequence)及多聚組氨酸標(biāo)簽(His-tag)。
[0106]研制了包含SP6啟動子的5’ -末端序列的SPU引物，并研制了包含SP6啟動子的3’-末端序列、EOl 翻譯增強子序列(translational enhancer sequence)和 His-tag 序列的deSP6E02his-Sl引物。反義引物(Antisense primer)使用了與第一次PCR中使用的反義引物相同的反義引物。研制的引物是由柏業(yè)公司(Bioneer,大田(Daejeon),韓國(korea))合成的。
[0107]實施例2-2:|E cDNA的擴(kuò)增
[0108]實施兩步(Two-step) PCR,制備了用于麥胚無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(wheat germcell-free protein synthesis)的線性 PCR-擴(kuò)增基因(linear PCR-amplified gene)。
[0109]I)第一次 PCR
[0110]將提取的肝吸蟲抗原候選蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNAl μ 1、10ρΜ基因特異性(gene-specific)第一次PCR正義引物I μ 1、IOpM反義引物I μ l、2mM各個脫氧核苷三磷酸(dNTP)ly l，25mM氯化鎂(MgCl2)2 μ l、AmpliTaq黃金聚合酶(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)，福特斯市(Foster City),加利福尼亞州(CA)，美國(USA)) 0.25 μ 1、IOX緩沖液2 μ I及蒸餾水11.75 μ I進(jìn)行混合，制備20 μ I的反應(yīng)液。對DNA聚合酶進(jìn)行25次如下過程:在940C的溫度下激活，在94°C的溫度下進(jìn)行I分鐘變性，在65°C的溫度下進(jìn)行I分鐘退火(annealing),在72°C的溫度下進(jìn)行I分鐘延伸(extension)。
[0111]2)第二次 PCR
[0112]將以1:10的比率稀釋的第一次PCR產(chǎn)物1μ 1、0.ΙμΜ的deSP6E02his_Sl引物
0.5μ 1、10μΜ的SPU引物0.5μ 1、10μΜ反義引物0.5μ 1、2.5mM的各個脫氧核苷三磷酸(dNTP)4y 1、5υ/μ I 的 Ex Tag 聚合酶 0.25 μ 1、10X 緩沖液 5 μ I 及蒸餾水 38.25 μ I 進(jìn)行混合，制備50 μ I的反 應(yīng)液。對DNA聚合酶進(jìn)行35次如下過程:在94°C的溫度下激活，在980C的溫度下進(jìn)行10秒鐘變性，在60°C的溫度下進(jìn)行30秒鐘退火(annealing)，在72°C的溫度下進(jìn)行I分鐘延伸(extension)。
[0113]實施例2-3:肝吸蟲抗原候選蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)
[0114]利用基于麥胚的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法(Wheat germ based cell-free proteinsynthesis)生產(chǎn)肝吸蟲診斷抗原候選蛋白質(zhì)。
[0115]I)麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及翻譯(Wheat germ cell-free transcription 及translation)
[0116]在96孔板(well plate)中分別注入lug的第二次PCR產(chǎn)物。
[0117]轉(zhuǎn)錄用(Transcription)試劑是將1.5X轉(zhuǎn)錄用緩沖液(Transcriptionbuffer),3.75mM核苷三磷酸(NTP)混合物、1.2U/ul核糖核酸酶(RNases)抑制劑、2.4U/ulSP6RNA聚合酶的試劑在冰上混合而成的，作為翻譯用(Translation)試劑準(zhǔn)備了 1200D/ml的WEPR01240、40ng/ul的肌酸激酶(creatine kinase)。將所要使用的SUB-AMIX試劑在冰面上融化。
[0118]將具有第二次PCR產(chǎn)物的孔板、轉(zhuǎn)錄用(Transcription)試劑和翻譯用(Translation)試劑的混合物以及準(zhǔn)備好的SUB-AMIX試劑安裝于自動化的蛋白質(zhì)合成設(shè)備(robotic protein synthesizer)。
[0119]轉(zhuǎn)錄用(Transcription)試劑自動添加到96孔板(well plate),并在37°C的溫度下進(jìn)行6小時反應(yīng)，來生產(chǎn)信使核糖核酸(mRNA，Message RNA)。
[0120]翻譯用(Translation)試劑和準(zhǔn)備好的SUB-AMIX試劑會自動添加，并在26°C的溫度下進(jìn)行16小時反應(yīng)，來生產(chǎn)蛋白質(zhì)(參照圖3)。
[0121]實施例2-4:通過蛋白芯片的抗原性鑒定
[0122]本發(fā)明將利用麥胚系統(tǒng)(Wheat germ system)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)通過蛋白芯片與人血清進(jìn)行反應(yīng)，來判斷抗原性(參照圖4)。
[0123]I)準(zhǔn)備蛋白芯片
[0124]在載玻片上處理試劑，準(zhǔn)備胺芯片(amine chip)，使得抗體更加緊貼。具體地，將載玻片在溫度為70 V的H202/NH40H/H20 (1:1:5, v/v)溶液中浸泡10分鐘，并進(jìn)行清洗后，在95%的乙醇(v/v)中溶解1.5%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(aminopropyItrimethoxysiIane)的溶液中浸泡2小時后,按乙醇、蒸懼水的順序依次清洗3次。利用空氣干燥這胺改性(amine-modified)載玻片，并在110°C的溫度下烘烤I小時。在這載玻片貼上直徑為1.5mm的200個(25X8)斑點(spot)形狀的鐵氟龍膠帶，來制備孔板(well)形狀的蛋白芯片(protein chip)。
[0125]2)抗體載玻片的制備
[0126]在準(zhǔn)備好的胺芯片處理抗組氨酸(ant1-histidine)抗體,來制備抗體載玻片，并與重組蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。即，將五抗體(penta-His antibody)(凱杰公司，希爾敦,德國)以10ug/ml的濃度在磷酸緩沖液(phosphate buffer)中稀釋,按每Iul進(jìn)行點樣(spotting),并在37°C的溫度下進(jìn)行2小時反應(yīng)之后，利用添加0.1%的吐溫20 (Tween-20)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將反應(yīng)好的陳列(array)清洗10分鐘，第二次利用蒸餾水清洗5分鐘，然后用空氣干燥(每個步驟都相同)。之后，為了封閉(blocking)對蛋白芯片的非特異性相互作用(nonspecific interaction),在37°C的溫度下處理I小時添加5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS/T之后進(jìn)行清洗(如同上述),然后分別將利用麥胚系統(tǒng)(wheat germ system)生產(chǎn)的抗原蛋白質(zhì)按每Iul向各個孔板(well)點樣(spotting)之后,在37°C的溫度下反應(yīng)I小時后進(jìn)行清洗。通過ELISA檢測，利用磷酸緩沖液將未感染寄生蟲癥患者的血清或感染肝吸蟲癥患者的混合(pooled)血清稀釋到50倍，將稀釋的患者血清按每Iul向各個孔板(well)點樣(spotting)之后，在37°C的溫度下反應(yīng)I小時后進(jìn)行清洗。在各個孔板(well)中，以IOug的濃度點樣alexa546_抗人免疫球蛋白(alexa546-anti_human IgG)(英杰生命科技有限公司(Invitrogen),卡爾斯巴德(Carlsbad),加利福尼亞州(CA),美國(USA))之后，在37°C的溫度下反應(yīng)I小時，然后在包含I %的Tween-20的磷酸鹽緩沖液中清洗載玻片20分鐘，第二次在蒸懼水中清洗5分鐘。利用突光掃描儀(fluorescence scanner),以543nm的激光(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer)，馬薩諸塞州(MA)，美國(USA))分別測定強度(intensity)。所有實驗均反復(fù)進(jìn)行三次(Jung et al.，2009)。
[0127]實施例3:利用通 過蛋白芯片被選為抗原候選的EST的克隆和麥胚無細(xì)胞系統(tǒng)(wheat germ cell-free system)的重組蛋白質(zhì)的過量生成和通過蛋白芯片的抗原性評價
[0128]實施例3-1:抗原候選EST的克隆
[0129]為了生產(chǎn)麥胚無細(xì)胞系統(tǒng)(Wheat germ cell-free system)的重組蛋白質(zhì)，將通過蛋白芯片獲得高評價的抗原性而被篩選的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST, expressed-sequencedtag)的ORF在麥胚無細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)載體中實施了克隆。
[0130]I)實施融合克隆(In-fusion cloning)
[0131]制備引物，使得在插入體的兩個末端對麥胚無細(xì)胞表達(dá)運載體(wheat germcell-free expression vector) (pEU-E01-HiS-TEV-N2)包含同源序列(homologoussequence)。并且，進(jìn)行PCR，利用能夠使載體和插入體的同源部位產(chǎn)生融合的酶，準(zhǔn)確、迅速地實施了克隆。
[0132]首先，正義引物和反義引物分別在5’方向包含EcoRV或BamHI限制性內(nèi)切酶位點，來包含與載體同源的16-20bp的序列，而在3’方向添加對篩選的EST特異的22-33bp的序列(參照圖5a)，將質(zhì)粒DNA作為模板，添加1.25U的EX Tag聚合酶(寶生物公司(Takara)，日本(Japan))、I X緩沖液、20uM的脫氧核苷三磷酸(dNTP)、分別為0.4皮摩爾(pmole)的正義引物及反義引物，來制備反應(yīng)液。對DNA聚合酶進(jìn)行30次如下過程:在94°C的溫度下激活,在94°C的溫度下進(jìn)行I分鐘變性(denaturation),在63°C或68°C的溫度下進(jìn)行30秒鐘退火(annealing),在72°C的溫度下進(jìn)行I分鐘延伸(extension)。之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，來確認(rèn)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量之后，使用PCR純化試劑盒(凱杰公司(Qiagen),德國(Germany))進(jìn)行純化。利用融合優(yōu)勢PCR克隆試劑盒(In-fusionadvantage PCR cloning kit)(克隆技術(shù)公司(Clontech),美國(USA)),將由 EcoRV或BamHI限制性內(nèi)切酶處理的pEU-E01-His-TEV-N2載體(無細(xì)胞科學(xué)公司(Cellfree sciences),日本(Japan);參照圖5b)和純化的PCR產(chǎn)物，分別在37°C的溫度下進(jìn)行15分鐘反應(yīng)、在50°C的溫度下進(jìn)行15分鐘反應(yīng)。將反應(yīng)物在三羥基甲基氨基甲烷緩沖液(TE buffer,Tris (hydroxymethyI)metylaminomethane buffer)中稀釋為 5 倍，將其中的 2.5ul 轉(zhuǎn)化(transformation)到TOPlO (Invitrogen公司，美國)細(xì)胞,并涂敷于包含氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基之后，在37°C的溫度下放置16小時，來培養(yǎng)細(xì)菌菌落。所獲得的菌落經(jīng)過快速PCR和菌落培養(yǎng)之后，利用限制性內(nèi)切酶來處理通過實施小量質(zhì)粒提取(minipr印)而獲得的DNA之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，由此確認(rèn)插入體的大小并進(jìn)行篩選,并實施自動測序(automaticsequencing)(千年基因公司(Macrogen),首爾)，來鑒定ORF連接。
[0133]2)質(zhì)粒DNA的過量生產(chǎn)
[0134]為了準(zhǔn)備lug/ul的高濃度質(zhì)粒DNA,培養(yǎng)細(xì)菌,實施中量質(zhì)粒提取(midiprep)。首先，將已確認(rèn)ORF的克隆的細(xì)菌在包含氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜。利用未添加核糖核酸酶A (RNase A)的中量質(zhì)粒提取試劑盒(midiprep kit)(富聯(lián)生物科技股份有限公司(Viogene),臺灣(Taiwan))純化質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行收集后，在TE緩沖劑中溶解，以使質(zhì)粒DNA的濃度達(dá)到lug/ul。
[0135]實施例3-2:肝吸蟲抗原候選蛋白質(zhì)的過量生產(chǎn)
[0136]利用基于麥胚的無細(xì)胞 蛋白質(zhì)合成(Wheat germ based cell-free proteinsynthesis)方法,大量生產(chǎn)附加組氨酸標(biāo)簽(histidine tag)的肝吸蟲抗原候選重組蛋白質(zhì)，并使用鎳(nickel)瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化。
[0137]將實施例3-1-2中進(jìn)行純化的質(zhì)粒DNA按每25ug分別注入。
[0138]將IX翻譯用緩沖劑、2.5mM的核苷三磷酸(NTP混合物(mix))、lU/ul的RNase抑制劑及l(fā)U/ul的SP6RNA聚合酶試劑在冰上混合，使得每次反應(yīng)中使用的轉(zhuǎn)錄用試劑為250ul。在溫度為37°C的培養(yǎng)基(incubator)中，將上述混合液反應(yīng)6小時，來轉(zhuǎn)錄為RNA后，反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從而確認(rèn)RNA的數(shù)量和質(zhì)量。翻譯用試劑在冰上融化，從而準(zhǔn)備1200D/ml的WEPR07240H及40ng/ul的肌酸激酶(creatine kinase)。混合轉(zhuǎn)錄用試劑中生成的mRNA溶液250ul和翻譯用混合物(translation mixture)250ul,并分別注入到6-孔板的每個孔中。將在冰上融化而成的5.5ml的1XSUB-AMIX SGC溶液覆蓋(overlay)在翻譯用混合物(translation mixture)上,為了防止蒸發(fā),利用石臘進(jìn)行密封(sealing)。在15°C的溫度下，將上述混合液反應(yīng)20小時，來生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
[0139]之后，倒出鎳瓊脂糖凝膠(Nickel sepharose)的液體部分，并添加蒸懼水。向色譜柱倒入樹脂(resin),并向色譜柱裝填平衡緩沖液(equilibration buffer=沖洗緩沖液(wash buffer):20mM 憐酸鹽緩沖液(phosphate buffer),0.3M NaCl,20mM 咪唑(imidazole), pH7.5),使表達(dá)重組蛋白質(zhì)的溶液(solution) 10次經(jīng)由色譜柱之后,利用達(dá)到色譜柱體積10倍的沖洗緩沖液清洗色譜柱。使用洗脫緩沖液(elution buffer) (20mM憐酸鹽緩沖液(phosphate buffer), 0.3M NaCl, 20mM 咪唑(imidazole), ρΗ7.5)來洗脫(elution)重組蛋白質(zhì)，并將洗脫的重組蛋白質(zhì)向磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析。之后，為了測定蛋白質(zhì)的濃度和鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)程度，對純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行12.5% SDS-PAGE。
[0140]實施例3-3:利用ELISA方法的重組蛋白質(zhì)的抗原性鑒定
[0141]在0.05m碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer) (pH9.6)中，稀釋在麥胚無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(Wheat germ based cell-free protein synthesis)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)、純化的蛋白質(zhì)，使得最終濃度成為2.5ug/ml，然后按每200ul分別注入到96孔的酶聯(lián)免疫(EIA，EnzymeImmunoassay)孔板(well plate)中。作為對照組,在肝吸蟲的蟲體中添加磷酸鹽緩沖液，并利用均質(zhì)器(homogenizer)進(jìn)行磨碎。對勻衆(zhòng)進(jìn)行離心分離,并回收上清液,來制備粗抗原。用碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)粗抗原，使其濃度達(dá)到5ug/ml后使用，或者按每200ul分別注入后，在_70°C的溫度下保管。在4°C的溫度下，將抗原包被孔板反應(yīng)一整夜之后，利用磷酸鹽緩沖液-0.05 % tWeen-20(PBS/T)清洗5次抗原包被孔板。在抗原性鑒定中，使用了肝吸蟲感染者的血清83個，泰國肝吸蟲感染者的血清35個，肺吸蟲感染者的血清14個，寄生蟲非感染正常人的血清40個。利用PBS/T，將患者的血清稀釋成1:100。在抗原包被(coating)的各個孔中放入稀釋的血清 200ul，并在37°C的溫度下反應(yīng)I小時，利用PBS/T，將各個孔清洗5次。山羊-過氧化物酶-人免疫球蛋白(Goat-peroxidase human IgG)第二抗體以1:4000的比率在PBS/T中被稀釋，按每200ul分別注入到各個孔中，并在37°C的溫度下反應(yīng)I小時，利用PBS/T，將各個孔清洗5次。在蒸餾水中稀釋被甲醇溶解的基質(zhì)ο-苯二胺(phenylene diamine),使得最終濃度達(dá)到0.005%,并添加過氧化氫,使得最終濃度達(dá)到0.025%。向各個孔(well)添加已稀釋的基質(zhì)200ul，經(jīng)過20分鐘后添加25ul的8N H2SO4,來使顯色反應(yīng)停止，然后在酶聯(lián)免疫檢測儀(ELISA reader)中，以490nm測定吸光度。之后，將在正常人對照組的吸光度平均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差2倍后的值設(shè)定為截止(cutoff)值，并判定陽性血清。
[0142]實驗例及結(jié)果
[0143]實驗例1.肝吸蟲抗原候選蛋白質(zhì)的cDNA篩選
[0144]實施例1-1肝吸蟲分泌蛋白質(zhì)的cDNA篩選
[0145]分析研究團(tuán)隊所持有的肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體，來篩選抗原候選蛋白質(zhì)的cDNA。利用信號P3.0 (SignalP3.0)進(jìn)行分析，來確保被預(yù)測為分泌蛋白質(zhì)的793個肝吸蟲轉(zhuǎn)錄體的信息，此時篩選出247個單態(tài)(singlet)和546個重疊群(contig)。重疊群(contig)通過確認(rèn)讀序(read)結(jié)構(gòu)信息來選擇包含切割位點(cleavage site)的讀序,但除了被選的237個相同讀序之外，選擇了肝吸蟲分泌蛋白質(zhì)的EST讀序556個。
[0146]下列表I表示篩選肝吸蟲分泌蛋白質(zhì)的cDNA。
[0147]表I
[0148]
【權(quán)利要求】
1.一種對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，包含選自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列選自包含序列號I至序列號4的組中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，上述肝吸蟲類是選自包含肝吸蟲、泰國肝吸蟲及貓肝吸蟲的組中。
3.一種基因，其特征在于，對權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，上述基因由選自堿基序列的全部或一部分中的序列表示，上述堿基序列選自包含序列號5至序列號8的組中。
5.一種肝吸蟲類診斷用組合物，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)作為有效成分。
6.一種肝吸蟲類預(yù)防或治療用疫苗組合物，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)作為有效成分。
7.一種抗體，其特征在于，`針對權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C12N15/30GK103459414SQ201180069611
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月29日
【發(fā)明者】洪性琮 申請人:韓國中央大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)