能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及適合用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株。
【專利說明】能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的新德式乳桿菌保加利亞亞種菌株
[0001]本發(fā)明涉及益生菌領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染的新德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)菌株。
[0002]根據(jù)美國國家酸奶協(xié)會(NYA)或國際生命科學(xué)會(ILSI)最近批準(zhǔn)的定義，益生菌是在以充足量消化時發(fā)揮超出基本營養(yǎng)之外的健康益處的活微生物。在屬于乳品工業(yè)常用的屬乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)的種類中已描述了益生菌。認(rèn)為益生菌通過阻止致病微生物的發(fā)展和/或更直接地作用于免疫系統(tǒng)而在腸道微生物叢水平上進行干預(yù)。
[0003]幽門螺桿菌(H.pylori)是革蘭氏陰性螺旋形細菌，其寄居在超過50%世界人口的人胃粘液層中。而被幽門螺桿菌感染的大多數(shù)個體是無癥狀的，雖然他們的胃上皮出現(xiàn)炎癥體征，15%至20%的幽門螺桿菌感染個體出現(xiàn)疾病。實際上，幽門螺桿菌是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾病、萎縮、化生、發(fā)育異常、胃癌和胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的主要病原體(參見綜述Fox和Wang, 2007以及Polk和Peek, 2010)。[0004]在感染期間，幽門螺桿菌特通過該細菌產(chǎn)生的多個粘附分子(粘附素)如BabA和SabA蛋白特異性地與內(nèi)襯胃上皮的胃上皮細胞結(jié)合。粘附至胃上皮細胞使細菌免受流體流動、蠕動和粘液層的脫落。幽門螺桿菌粘附至胃粘膜誘導(dǎo)胃上皮細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過氧化應(yīng)激、細胞凋亡和/或自體吞噬機制造成胃上皮細胞損傷和萎縮。因此，幽門螺桿菌粘附至胃上皮細胞是建立胃粘膜感染的關(guān)鍵步驟。
[0005]對幽門螺桿菌感染患者的標(biāo)準(zhǔn)治療是兩種抗生素聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，所謂的三聯(lián)療法。然而，由于抗生素耐藥性或較差的順應(yīng)性，三聯(lián)療法治療后的幽門螺桿菌的根除率在下降。此外，盡管有幾次臨床試驗，目前尚無有效的疫苗上市。
[0006]由上述內(nèi)容可見，需要對用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的三聯(lián)療法的替代療法或補充療法。
[0007]已提出使用產(chǎn)生乳酸、細菌素和其它抗菌物質(zhì)的益生乳酸菌(LAB)作為替代療法。Boyanova等人(2009)已發(fā)現(xiàn)幾種德式乳桿菌保加利亞亞種(L.bulgaricus)菌株,其以菌株依賴性方式在體外(使用瓊脂孔擴散法)抑制幽門螺桿菌菌株包括耐抗生素菌株的生長。然而，所研究的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株未被明確鑒定出來，且是公眾不能獲得的。Simova等人(2009)篩選了幾種產(chǎn)生細菌素的乳酸菌。之后，他們通過采用兩種體外方法(瓊脂孔擴散法及Barefoot和Klaenhammer的臨界稀釋試驗)來分析這些菌株的無細胞上清液(CFS)的抗微生物活性而測定了所述菌株的抗微生物活性。他們發(fā)現(xiàn)，由于其抗微生物活性，德式乳桿菌保加利亞亞種BB18菌株的CFS抑制了廣譜致病微生物(細菌或酵母菌)包括幽門螺桿菌菌株的生長。
[0008]本申請發(fā)明人分離了一種新的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株并發(fā)現(xiàn)該菌株在體外和體內(nèi)抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。這種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株(命名為DN_100_0602或CNCM 1-4428)因而能夠用于通過靶向建立這一感染的主要步驟(即通過抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞)治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染。
[0009]因此，本申請的保護主題是根據(jù)布達佩斯條約于2011年2月3日在CNCM(國家培養(yǎng)物和微生物保藏中心((Collection Nationale de Cultures de Microorganismes),25rue du Docteur Roux,巴黎)以保藏號CNCM 1-4428保藏的菌株德式乳桿菌保加利亞亞種。
[0010]該菌株CNCM 1-4428具有以下特性:
[0011]-形態(tài)學(xué):革蘭氏陽性微生物，不動的、桿狀的、具有顆粒的長桿菌，
[0012]-代謝:同型發(fā)酵(homofermentive),過氧化氫酶(-),
[0013]-糖發(fā)酵(在37°C下在MRS培養(yǎng)基中采用API50CH試驗持續(xù)48h獲得的結(jié)果):葡萄糖、果糖、甘露糖和乳糖。
[0014]此外，該菌株能夠在體外和體內(nèi)抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。
[0015]如本文所用，術(shù)語“抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞”是指顯著抑制(即全部或部分抑制)幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞?？梢匀缦旅鎸嵤├?中所示在體外測量幽門螺桿菌菌株對上皮細胞粘附的抑制。
[0016]本發(fā)明還涵蓋了突變菌株或由親本菌株CNCM 1-4428衍生的遺傳轉(zhuǎn)化菌株，前提條件是它們能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。這些突變體或遺傳轉(zhuǎn)化菌株可以是其中親本菌株的一種或多種內(nèi)源性基因已經(jīng)突變，例如以改變一些其代謝性質(zhì)(例如其發(fā)酵糖的能力、其耐酸性、其在胃腸道轉(zhuǎn)運的存活力、其酸化后性質(zhì)或其代謝產(chǎn)物的生成)的菌株。它們也可以是由親本菌株CNCM 1-4428通過一種或多種目標(biāo)基因進行遺傳轉(zhuǎn)化得到的菌株，例如為了賦予所述遺傳轉(zhuǎn)化的菌株額外的生理特征，或允許其表達具有治療或疫苗益處的蛋白，人們希望通過所述菌株給予這樣的蛋白。這些菌株可以由CNCM1-4428菌株通過用于乳酸菌屬隨機誘變或定點誘變以及遺傳轉(zhuǎn)化的常規(guī)技術(shù)，如Gury等人(2004)或Perea V6lez等人(2007)描述的那些，或者通過被稱為“基因組改組”的技術(shù)(Patnaik等人，2002和Wang等人，2007)獲得。
[0017]本發(fā)明的保護主題也是用于獲得能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的方法，該方法包括誘變或遺傳轉(zhuǎn)化菌株CNCM 1-4428的步驟。
[0018]本發(fā)明的保護主題也是細胞組分(cell fractions),其可以由如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428獲得，前提條件是它們能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞。它們特別是由所述菌株的培養(yǎng)物獲得的DNA制劑或細菌細胞壁制劑。它們還可以是培養(yǎng)物上清或這些上清的部分。舉例來說，菌株CNCM 1-4428的無細胞上清(CFS)可以通過使用用于從Simova等人(2009)公開的另一種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株獲得CFS的方法而獲得。[0019]本發(fā)明的保護主題也是用于獲得能夠抑制幽門螺桿菌菌株粘附至上皮細胞的細胞組分的方法，該方法包括以下步驟:
[0020]a)培養(yǎng)如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM1-4428，以及
[0021]b)由步驟a)中的培養(yǎng)物獲得細胞組分。
[0022]本發(fā)明的保護主題也是包含根據(jù)本發(fā)明的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428，或由根據(jù)本發(fā)明的所述菌株獲得的細胞組分的組合物。
[0023]在本發(fā)明的組合物中，所述菌株可以以全菌形式使用，所述全菌可以是活的或死的?？蛇x地，所述菌株可以以細菌裂解物的形式或以細菌成分的形式使用；例如，可以通過測試它們在幽門螺桿菌對上皮細胞的粘附方面的性質(zhì)來選擇適合這種用途的細菌成分。優(yōu)選細菌細胞以活的、有生命力的細胞存在。
[0024]本發(fā)明的組合物可以是任何適合施用特別是經(jīng)口施用的形式。這包括例如固體、半固體、液體和粉末。液體組合物由于更易施用，例如作為飲料，而是普遍優(yōu)選的。
[0025]組合物可以包含每克如上所述的至少一種細菌菌株干重至少IO5個cfu、優(yōu)選至少IO6 個 cfu。
[0026]組合物還可以包含除了根據(jù)本發(fā)明的菌株以外的其他細菌菌株，特別是益生菌菌株，如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬或乳球菌屬菌株。
[0027]當(dāng)細菌是活細菌形式時，組合物可以通常包含每克組合物干重IO5至IO13個菌落形成單位(cfu),優(yōu)選至少IO6個cfu,更優(yōu)選至少IO7個cfu,更優(yōu)選至少IO8飛cfu以及最優(yōu)選至少IO9個cfu。在液體組合物的情況中，這一般對應(yīng)于IO4至IO12個菌落形成單位(cfu),優(yōu)選至少IO5個cfu,更優(yōu)選至少IO6個cfu,更優(yōu)選至少IO7個cfu,以及最優(yōu)選至少IO9 個 cfu/ml ο
[0028]組合物可以是營養(yǎng)組合物，包括食品、食品補充劑和功能性食品?！ㄊ称费a充劑〃是指由一般在食 品中使用的化合物制成的產(chǎn)品，但其是以片劑、粉劑、膠囊劑、飲劑的形式或一般與食物不相關(guān)的任何其它形式，且其對人們的健康是有益處的。"功能性食品"是對人們的健康也有益處的食物。具體地說，食品補充劑和功能性食品能夠?qū)膊±缏约膊【哂斜Ｗo性或治療性的生理效應(yīng)。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)組合物也包括嬰兒食品、嬰兒乳配方或嬰兒后續(xù)配方(infantfollow-on formula) 0優(yōu)選地，本發(fā)明組合物是營養(yǎng)品或藥物產(chǎn)品、營養(yǎng)補充劑或醫(yī)療食
品O
[0030]組合物可以是乳制品，優(yōu)選發(fā)酵乳制品。發(fā)酵產(chǎn)品可以以液體形式存在或者以通過干燥發(fā)酵的液體獲得的干粉形式存在。乳制品的實例包括凝固、攪拌或可飲用形式的發(fā)酵乳和/或發(fā)酵乳清、乳酪和酸乳酪。
[0031]發(fā)酵產(chǎn)品也可以是發(fā)酵的植物，如凝固、攪拌或可飲用形式的發(fā)酵的大豆、谷物和/或水果。
[0032]在優(yōu)選的實施方案中，發(fā)酵的產(chǎn)品是新鮮產(chǎn)品。未經(jīng)過劇烈的熱處理步驟的新鮮產(chǎn)品具有如下優(yōu)點:細菌菌株以活體形式存在。
[0033]本發(fā)明的保護主題也是用作藥物的如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物。
[0034]本發(fā)明的保護主題也是用作用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的藥物的如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物。
[0035]本發(fā)明的保護主題也是如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物作為藥物優(yōu)選用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的藥物的用途。[0036]本發(fā)明的保護主題也是如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428，或者如上面所定義的組合物在制備藥物優(yōu)選用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的藥物中的用途。
[0037]本發(fā)明的保護主題也是用于治療或預(yù)防有需要的受試者中幽門螺桿菌感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM 1-4428，或如上面所定義的組合物。
[0038]治療有效量的確定對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，尤其是考慮到本文所提供的詳細公開內(nèi)容后。
[0039]本發(fā)明的保護主題也是用于生產(chǎn)藥物，優(yōu)選用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染的藥物的方法，所述方法包括將如上面所定義的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，優(yōu)選菌株CNCM
1-4428，或者如上面所定義的組合物并入到至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑中。
[0040]如本文所用，治療或預(yù)防由其涵蓋:預(yù)防感染、穩(wěn)定幽門螺桿菌的載量和/或降低幽門螺桿菌的載量。治療或預(yù)防還涵蓋緩解下面所述的與幽門螺桿菌相關(guān)的至少一種癥狀。
[0041]用于診斷幽門螺桿菌感染的方法是本領(lǐng)域中已知的。舉例來說，可以通過血液抗體試驗、糞便抗原試驗或碳尿素呼氣試驗來進行幽門螺桿菌感染的診斷。也可以通過內(nèi)窺鏡下活組織檢查之后進行尿素酶試驗、組織學(xué)檢查或微生物培養(yǎng)來進行幽門螺桿菌感染的診斷。
[0042]與幽門螺桿菌感染相關(guān)的癥狀或疾病是胃痛、胃灼熱、酸反流、腹痛、反胃、嘔吐、噯氣、胃氣脹、惡心、胃炎如慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾病、萎縮、化生、發(fā)育異常、胃癌和胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。
[0043]根據(jù)下面的進一步描述可以更清楚地理解本發(fā)明，即示出CNCM 1-4428菌株的抗感染性質(zhì)的實施例以及隨附的附圖。
[0044]圖1顯示了對接受對照產(chǎn)品的被幽門螺桿菌SSl感染的小鼠或被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-4428治療的小鼠或被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1632 (Lbl30)治療的小鼠在治療前(第一棒)、治療后3周(第二棒)及處死前(第三棒)測量的體重變化(以克計)。
[0045]圖2顯示了通過免疫組織化學(xué)使用抗-幽門螺桿菌抗體在(i)未被幽門螺桿菌感染的小鼠、(ii)接受對照產(chǎn)品(非發(fā)酵乳品)的被幽門螺桿菌SSl感染的小鼠、(iii)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1632 (Lbl30)治療的小鼠以及(iv)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-4428治療的小鼠中獲得的感染得分。得分的定義:0:無感染腺；1:極少感染腺，2:25%感染腺，3:25至50%感染腺，4:>50%感染腺。
[0046]圖3顯示了通過實時PCR在⑴未被幽門螺桿菌感染的小鼠、(ii)被幽門螺桿菌SSl感染但接受對照產(chǎn)品(非發(fā)酵乳品)的小鼠、(iii)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-4428治療的小鼠以及(iv)被幽門螺桿菌SSl感染且用德式乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1632 (Lbl30)治療的小鼠中獲得的幽門螺桿菌SSlDNA的量化。
[0047]實施例1:選擇德式乳桿菌保加利亞亞種菌株評估其對幽門螺桿菌對胃上皮細胞的粘附的作用
[0048]使用經(jīng)過改良的OleastiO等人(2008)描述的方法來評估兩種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株(CNCM 1-4428和于1995年10月25曰在CNCM保藏的CNCM1-1632)對幽門螺桿菌對上皮細胞的粘附性質(zhì)的作用。
[0049]1.1材料&方法
[0050]測試了兩種幽門螺桿菌菌株:菌株J99 (BabA2 ；ATCC號:700824)和菌株
09.193 (BabAl，由Yoshio Yamaoka在日本分離得到，來自O(shè)ita大學(xué))。米用50的MOI (感染復(fù)數(shù))對這些菌株進行測試。將幽門螺桿菌細胞在幽門瓊脂(Bi0m6rieUX，法國)中培養(yǎng)24h之后轉(zhuǎn)移到PBS緩沖液中。將兩種幽門螺桿菌菌株的細菌懸浮液的濃度分別標(biāo)準(zhǔn)化至
2.108cfu/mL(對應(yīng)于 OD60cinm=I)。
[0051]采用50的MOI對這兩種德式乳桿菌保加利亞亞種懸浮液進行測試(對應(yīng)于每孔25 μ L標(biāo)準(zhǔn)化的德式乳桿菌保加利亞亞種的懸浮液)。
[0052]在感染實驗前一天在500 μ L補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基F12中接種100000 個上皮 AGS 細胞(ATCC 號:CRL_1739)。
[0053]幽門螺桿菌懸浮液的染色
[0054]在1000Og下將ImL幽門螺桿菌懸浮液離心10分鐘。將沉淀物(pellet)重懸浮于ImL稀釋液A (Diluent A)(來自PKH2綠色熒光細胞連接試劑盒(PKH2Green FluorescentCell Linker Kit), Sigma Aldrich, Saint-Louis),并加入 2.5 μ L PKH2 (Sigma Aldrich,Saint-Louis)。將懸浮液在室溫下孵育2分鐘30秒。通過加入2mL胎牛血清停止染色。然后加入4mL DMEM/F12培養(yǎng)基，之后在1000Og下離心懸浮液10分鐘。將沉淀物重懸浮于4mL培養(yǎng)基中并在1000Og下離心10分鐘。將該洗滌步驟重復(fù)兩次以除去多余的熒光染料。
[0055]粘附的測暈
[0056]用PBS洗滌3次以除去未粘附的細菌之后，采用胰蛋白酶遵循標(biāo)準(zhǔn)條件解離上皮AGS細胞。通過流式細胞術(shù)分析熒光發(fā)射。使用FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson)測量熒光。以三重重復(fù)進行每種條件。
[0057]在兩種條件下進行幽門螺桿菌感染
[0058]-在感染前(pre)條件下:在用幽門螺桿菌感染前l(fā)h30將待測試的德式乳桿菌保加利亞亞種懸浮液加入到上皮AGS細胞。在感染后lh30(孵育時間共計3h)通過流式細胞術(shù)分析細胞；
[0059]-在同時感染(Co)條件下:同時將待測試的德式乳桿菌保加利亞亞種懸浮液和幽門螺桿菌菌株加入到上皮AGS細胞，并在孵育lh30后通過流式細胞術(shù)分析細胞。
[0060]XiS
[0061]采用與幽門螺桿菌菌株一起孵育lh30的上皮AGS細胞獲得熒光強度的對照值。
[0062]相對于未暴露于德式乳桿菌保加利亞亞種的幽門螺桿菌對上皮AGS細胞的粘附(其被設(shè)定為100%)給出粘附百分比值。
[0063]根據(jù)三重重復(fù)獲得的平均值分析結(jié)果，并且當(dāng)根據(jù)Student’s檢驗結(jié)果是顯著不同(P〈0.05)時對其進行評分。
[0064]1.2 結(jié)果
[0065] 結(jié)果在下文表1中示出。[0066]復(fù)1:用2種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株獲得的它們對幽門螺桿菌對上皮AGS
細胞的粘附的作用結(jié)果。
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，特征在于其以編號1-4428保藏在CNCM。
2.一種用于獲得能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的方法，所述方法包括誘變或遺傳轉(zhuǎn)化權(quán)利要求1的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株的步驟。
3.一種德式乳桿菌保加利亞亞種菌株,特征在于其能夠通過根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法獲得，以及其能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞。
4.一種用于獲得能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞的細胞組分的方法，所述方法包括以下步驟: a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，和 b)從步驟a)的培養(yǎng)物中獲得細胞組分。
5.一種細胞組分，特征在于其能夠通過權(quán)利要求4所述的方法獲得，以及其能夠抑制幽門螺桿菌粘附至上皮細胞。
6.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株或根據(jù)權(quán)利要求5所述的細胞組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，特征在于其包含每克根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株干重至少105個cfu,優(yōu)選至少106個cfu。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的組合物，特征在于其是營養(yǎng)組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，特征在于其是乳制品。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的菌株或根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的組合物，其用作藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的菌株或組合物，特征在于所述藥物用于治療或預(yù)防幽門螺桿菌感染。
【文檔編號】C12R1/225GK103987839SQ201180072799
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月9日
【發(fā)明者】佩吉·加羅, 加埃勒·凱雷, 拉斐爾·布爾代-西卡爾, 弗朗西斯·梅格勞德 申請人:熱爾韋·達諾尼公司