分子檢測(cè)測(cè)定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分子檢測(cè)測(cè)定，包括在容許細(xì)胞破碎和核酸處理的條件下直接用亞硫酸氫鹽試劑處理生物樣品；從所述經(jīng)處理的樣品中去除所述亞硫酸氫鹽試劑；并且檢測(cè)所述經(jīng)處理的樣品中的靶核酸。
【專利說(shuō)明】分子檢測(cè)測(cè)定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于處理樣品以進(jìn)行分子檢測(cè)測(cè)定，特別是處理臨床樣品以進(jìn)行核酸檢測(cè)測(cè)定以檢測(cè)疾病的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]人的分子測(cè)試已經(jīng)對(duì)醫(yī)療診斷和患者管理變得越來(lái)越重要。動(dòng)物的分子測(cè)試在獸醫(yī)應(yīng)用中日漸重要。核酸測(cè)試是現(xiàn)代法醫(yī)學(xué)、移民、親子鑒定和其它人身份應(yīng)用的必需工具。實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)對(duì)癌癥研究、鑒定生物標(biāo)志、素質(zhì)因素和潛在藥物靶標(biāo)變得越來(lái)越重要。RNA基因分型涵蓋研究、應(yīng)用測(cè)試和診斷學(xué)的所有領(lǐng)域中一系列用于分析個(gè)體或細(xì)胞之間遺傳差異的應(yīng)用。處理生物樣品時(shí)，目前的分子測(cè)試需要在用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，對(duì)樣品進(jìn)行特定預(yù)處理。目前認(rèn)為樣品預(yù)處理是必需的并且已經(jīng)開發(fā)了許多商業(yè)試劑盒和系統(tǒng)并且正用于市場(chǎng)中。不幸的是，預(yù)處理增加了分子測(cè)試的成本并且需要額外處理時(shí)間和設(shè)備。
[0004]人類遺傳標(biāo)記控股有限公司(Human Genetic Signatures Pty Ltd)(悉尼,澳大利亞)已經(jīng)開發(fā)了如W02006/058393和US7833942中所公開的用于檢測(cè)微生物的方法。所述方法包括用一種試劑處理微生物 的微生物核酸以形成源自微生物核酸的簡(jiǎn)化形式的核酸，所述微生物核酸具有可用于檢測(cè)微生物的獨(dú)特核酸序列。
[0005]本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了不需要如同分子檢測(cè)測(cè)定中目前所需要的樣品預(yù)處理的改進(jìn)的分子檢測(cè)測(cè)定。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明涉及對(duì)生物樣品進(jìn)行的分子檢測(cè)測(cè)定，其不需要樣品清除步驟或處理生物樣品以溶解細(xì)胞或純化核酸。
[0008]在第一方面，本發(fā)明提供了一種分子檢測(cè)測(cè)定，包括:
[0009](a)在容許細(xì)胞破碎和核酸處理的條件下直接用亞硫酸氫鹽試劑處理生物樣品；
[0010](b)從所述經(jīng)處理的樣品中去除所述亞硫酸氫鹽試劑；并且
[0011](C)檢測(cè)所述經(jīng)處理的樣品中的靶核酸。
[0012]在步驟(a)之前，所述生物樣品不需要細(xì)胞破碎或化學(xué)/物理處理。
[0013]所述生物樣品可選自糞便、鼻腔、血液、血漿、血清、口腔細(xì)胞、膿液、傷口、濃縮濾液、腦脊髓液、精液、液基細(xì)胞學(xué)(LBC)、組織、FFPE、激光捕獲細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、沉淀細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)物、細(xì)菌菌落、病毒懸液、抽吸物、支氣管灌洗、痰液樣品、環(huán)境樣品、環(huán)境濃縮物、糧食、原料、水樣或水濃縮物等。
[0014]檢測(cè)到的核酸可為DNA、RNA或DNA和RNA的組合。
[0015]所述測(cè)定適合于檢測(cè)動(dòng)物的傳染病、遺傳性疾病或遺傳特性。優(yōu)選地，所述動(dòng)物為人。
[0016]所述傳染病可由微生物引起，所述微生物包括細(xì)菌、病毒、類病毒、酵母菌、真菌、朊病毒、寄生蟲或變形蟲。
[0017]所述遺傳性疾病可為癌癥、突變、拷貝數(shù)改變、遺傳病癥、環(huán)境誘導(dǎo)的疾病、由暴露于致癌物引起的疾病、特征在于基因組中核苷酸重復(fù)長(zhǎng)度擴(kuò)大或減小的疾病。
[0018]遺傳特性可為對(duì)癌癥或任何其它疾病的易感性，其中遺傳和表觀遺傳變化促成疾病狀態(tài)的發(fā)展。
[0019]優(yōu)選地，亞硫酸氫鹽試劑為亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸鈉。優(yōu)選地，以濃度為約2.5M至約3.5M，pH范圍為約4.5至約5.5使用亞硫酸氫鹽試劑。更優(yōu)選地，以濃度為約3M，pH為約5.0使用亞硫酸氫鹽試劑。
[0020]優(yōu)選地，步驟(a)包括在約75°C和95 °C之間加熱約I分鐘至30分鐘。更優(yōu)選地，在約80°C和95°C之間的溫度下加熱所述樣品約10至20分鐘。應(yīng)了解，溫度和加熱持續(xù)時(shí)間可根據(jù)處理的樣品和待檢測(cè)核酸的細(xì)胞來(lái)源而改變。
[0021]可通過(guò)任何適合方式從經(jīng)處理的樣品中去除亞硫酸氫鹽。實(shí)例包括基于柱的純化或基于珠粒的純化最佳，但是在一些情況下簡(jiǎn)單的沉淀步驟可能已足夠。
[0022]去除亞硫酸氫鹽之后，優(yōu)選地使所述樣品再懸浮于pH為至少10，更優(yōu)選介于約pHll.5至約12.5的洗脫緩沖液中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少為約12的pH適合大多數(shù)樣品。
[0023]亞硫酸氫鹽試劑將經(jīng)處理的核酸中的胞嘧啶修飾為尿嘧啶。在雙鏈DNA中，亞硫酸氫鹽試劑將互補(bǔ)雙鏈基因組DNA的每條鏈中的胞嘧啶修飾為尿嘧啶，形成除非互補(bǔ)核酸分子外的兩種衍生物。
[0024]在一種優(yōu)選的形式中，衍生微生物核酸大體上含有堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)并且具有與相應(yīng)的未經(jīng)處理的核酸大體上相同的堿基總數(shù)。
[0025]如果擴(kuò)增經(jīng)處理的核酸，則擴(kuò)增的核酸大體上含有堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)?？赏ㄟ^(guò)任何適合方式例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、恒溫?cái)U(kuò)增或信號(hào)放大進(jìn)行擴(kuò)增。
[0026]在一種優(yōu)選的形式中，所述測(cè)定進(jìn)一步包括為經(jīng)處理的樣品提供核酸引物或探針。
[0027]優(yōu)選地，經(jīng)處理的樣品經(jīng)歷擴(kuò)增反應(yīng)以形成對(duì)微生物或遺傳指示物特異的靶核酸分子。
[0028]優(yōu)選通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)靶核酸分子。適合的擴(kuò)增檢測(cè)的實(shí)例包括PCR、qPCR、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、數(shù)字PCR、恒溫?cái)U(kuò)增或信號(hào)放大。
[0029]也可通過(guò)測(cè)序法例如Roche454、ABI SOLiD或離子激流系統(tǒng)(1n torrentsystem) > Illumina Hi Seq SBS 技術(shù)、太平洋生物科學(xué)公司(Pacific Biosciences)米用的Helicos Heliscope或SMRT技術(shù)或任何其它等效技術(shù)檢測(cè)經(jīng)處理的核酸。
[0030]在一種優(yōu)選的形式中，通過(guò)以下方式檢測(cè)靶核酸分子:
[0031]提供能夠與微生物特異性核酸分子的靶區(qū)域結(jié)合的檢測(cè)配體并且容許檢測(cè)配體有足夠時(shí)間與靶區(qū)域結(jié)合；并且
[0032]測(cè)量檢測(cè)配體與靶區(qū)域的結(jié)合以檢測(cè)微生物特異性核酸分子的存在。
[0033]在另一種優(yōu)選的形式中，通過(guò)分離擴(kuò)增產(chǎn)物并且使分離的產(chǎn)物顯現(xiàn)來(lái)檢測(cè)靶核酸分子。優(yōu)選地，通過(guò)電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物并且通過(guò)使凝膠上的一條或多條帶顯現(xiàn)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0034]優(yōu)選地，靶核酸分子不會(huì)自然存在于細(xì)胞中。
[0035]第二方面，本發(fā)明提供了用于分子檢測(cè)測(cè)定以直接處理樣品的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0036]亞硫酸氫鹽試劑；
[0037]核酸洗脫和反應(yīng)試劑；
[0038]所述靶核酸的PCR引物；和
[0039]進(jìn)行所述測(cè)定的說(shuō)明書。
[0040]試劑盒可進(jìn)一步包括核酸分離或純化柱、PCR混合液(mastermix)、PCR試劑、對(duì)照核酸引物、反應(yīng)管、試管、拭子等。
[0041]整篇說(shuō)明書中，除非上下文另外要求，詞“包含(comprise)”或其變型例如“包含(comprises) ”或“包含(comprising) ”將理解為暗示包括陳述的元素、整數(shù)或步驟或一組元素、整數(shù)或步驟，但不排除任何其它元素、整數(shù)或步驟或一組元素、整數(shù)或步驟。
[0042]對(duì)已經(jīng)包括在本說(shuō)明書內(nèi)的文件、行為、材料、裝置、物品等的任何討論僅僅是為了對(duì)本發(fā)明提供上下文關(guān)系的目的。不得將其視為承認(rèn)任何或全部這些問(wèn)題形成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的組成部分或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的一般常識(shí)，因?yàn)樵陂_發(fā)本發(fā)明之前其在澳大利亞存在。
[0043]為了可能更清楚地理解本發(fā)明，將參考下列附圖和實(shí)施例描述優(yōu)選的實(shí)施方案。
[0044]附圖簡(jiǎn)述
[0045]圖1示出了使用本發(fā)明檢測(cè)艱難梭狀芽孢桿菌(C.difficile)的結(jié)果。A.Fam通道對(duì)艱難梭狀芽孢桿菌的tcdA/B基因有特異性；B.Cy5通道對(duì)提取對(duì)照有特異性。
[0046]圖2示出了來(lái)自相同樣品的3種病毒`的擴(kuò)增結(jié)果。A.Fam=諾如病毒(norovirus)(單鏈RNA病毒)；B.Hex =腺病毒(雙鏈DNA病毒)；C.Cy5 =輪狀病毒(單鏈RNA病毒)。
[0047]圖3示出了將人細(xì)胞加標(biāo)(spike)到排泄物中的影響。A.顯示在3M亞硫酸氫鹽試劑中于95°C下加熱人MRC5細(xì)胞15分鐘，然后再懸浮于高pH緩沖液(12.3)中并且擴(kuò)增人β-球蛋白基因。B.顯示將相同細(xì)胞加標(biāo)到排泄物中，在3Μ亞硫酸氫鹽試劑中于95°C下加熱15分鐘，然后再懸浮于高pH緩沖液(12.3)中并且擴(kuò)增人β_球蛋白基因。
[0048]實(shí)施本發(fā)明的模式
[0049]優(yōu)點(diǎn)
[0050]本發(fā)明有許多包括以下的優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)方法的優(yōu)點(diǎn)。
[0051]a.樣品的細(xì)胞溶解和核酸轉(zhuǎn)化在相同試管中同時(shí)發(fā)生并且不到30分鐘可實(shí)現(xiàn)完全溶解和轉(zhuǎn)化，甚至少到10-20分鐘就可實(shí)現(xiàn)。
[0052]b.可直接處理樣品例如排泄物，而無(wú)靈敏度的損失。
[0053]c.基于本發(fā)明的測(cè)試具有能夠?qū)颊咴紭悠愤M(jìn)行，而無(wú)需用酶(例如蛋白酶K)預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)。
[0054]d.所述方法不需要任何昂貴的純化方法，例如目前市場(chǎng)上的商業(yè)純化試劑盒。這些商業(yè)試劑盒可用于幾乎每種樣品類型，例如血液、糞便、培養(yǎng)細(xì)胞、FFPE、細(xì)菌、病毒和寄生蟲，略舉數(shù)例。這些商業(yè)試劑盒可花費(fèi)幾千美元并且可花2-4小時(shí)純化樣品。世界上幾乎每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室在目前采用的分子測(cè)定的任何后續(xù)擴(kuò)增步驟之前都使用這些試劑盒進(jìn)行樣品純化。
[0055]e.去除亞硫酸氫鹽之后，再將樣品再懸浮于不需要任何進(jìn)一步處理例如熱脫磺化作用的簡(jiǎn)單洗脫緩沖液中，從而簡(jiǎn)化了工藝。[0056]f.所述方法可在相同試管中同時(shí)檢測(cè)來(lái)自相同樣品的RNA和DNA病毒，而無(wú)需使用專門的病毒純化試劑盒。通過(guò)本發(fā)明等效溶解并轉(zhuǎn)化了 RNA和DNA病毒(盡管一個(gè)是單鏈而一個(gè)是雙鏈)。
[0057]g.令人驚訝的是，高pH的洗脫緩沖液不會(huì)降解RNA。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中教授的相悖，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)教學(xué)特別建議不要在高溫和高PH下處理RNA。
[0058]h.所述方法可使用相似條件溶解并轉(zhuǎn)化所有細(xì)菌類型，因此單個(gè)患者樣品可用于艱難梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌(Salmonella)、彎曲桿菌(Camplylobacter)和寄生蟲等的多重測(cè)試，從而對(duì)每種細(xì)菌或靶標(biāo)微生物而言，消除了單獨(dú)提取方法的問(wèn)題。
[0059]1.所述方法適用于難以溶解可以形成使其對(duì)常規(guī)溶解技術(shù)有抵抗力的堅(jiān)韌外殼的樣品例如寄生蟲。因此檢測(cè)祀標(biāo)生物例如結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(TB)(對(duì)常規(guī)溶解技術(shù)非常有抵抗力)會(huì)很理想，因?yàn)樾枰诤怂岬撵`敏診斷測(cè)試。
[0060]j.所述方法能夠只使用10個(gè)拷貝病毒有效地溶解并轉(zhuǎn)化直接來(lái)自于血清的丙型肝炎病毒(HCV)，證明了在極低水平下檢測(cè)重要RNA病毒的實(shí)用性。
[0061]k.所述方法還減少了樣品處理時(shí)間許多個(gè)小時(shí)并且消除了樣品必須純化，然后如同目前進(jìn)行那樣再次轉(zhuǎn)化并純化亞硫酸氫鹽的問(wèn)題。
[0062]1.所述方法適于患者排泄物中結(jié)直腸癌的靈敏檢測(cè)。此類樣品是非侵入性的并且會(huì)減少如同原檢測(cè)方式對(duì)內(nèi)窺鏡檢查的依賴。另外，預(yù)計(jì)‘樣品到結(jié)果’不到3小時(shí)，而無(wú)需復(fù)雜的樣品處理過(guò)程。使用優(yōu)于血清樣品的排泄物進(jìn)行診斷有許多優(yōu)點(diǎn)，最重要的是與其中靈敏度總是主要問(wèn)題的血清樣品不同，在樣品中很可能存在大量人細(xì)胞。
[0063]樣品
`[0064]本發(fā)明適于處理樣品，包括糞便、鼻腔、血液、血漿、血清、口腔細(xì)胞、膿液、傷口、濃縮濾液、腦脊髓液、精液、液基細(xì)胞學(xué)(LBC)、組織、FFPE、激光捕獲細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、沉淀細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)物、細(xì)菌菌落、病毒懸液、抽吸物、支氣管灌洗、痰液樣品、環(huán)境樣品、環(huán)境濃縮物、糧食、原料、水樣或水濃縮物等。
[0065]樣品處理(HGS)
[0066]根據(jù)本發(fā)明處理樣品的優(yōu)選方法如下。將樣品直接放入200μ1的3M(范圍
2.5-3.5Μ)亞硫酸氫鈉ρΗ5.0 (pH范圍4.5-5.5)并且在75。。和95°C之間加熱10-20分鐘。
[0067]通過(guò)任何適合方式從經(jīng)處理的樣品中去除亞硫酸氫鹽。實(shí)例包括基于柱的純化或基于珠粒的純化最佳，但是在一些情況下簡(jiǎn)單的沉淀步驟可能已足夠。
[0068]去除亞硫酸氫鹽之后，使所述樣品再懸浮于pH介于11.5至12.5(優(yōu)選> pH12)的洗脫緩沖液中。
[0069]樣品現(xiàn)已準(zhǔn)備好進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)需進(jìn)一步處理。
[0070]去除亞硫酸氫鹽
[0071]通過(guò)商用方法,例如MethylEasy?技術(shù)(Human Genetic Signatures)可實(shí)現(xiàn)亞硫酸氫鹽去除。簡(jiǎn)言之，向樣品添加240μ1的試劑#3并且將樣品轉(zhuǎn)移到離心機(jī)柱中。然后使柱在10，OOOXg下旋轉(zhuǎn)以去除亞硫酸氫鹽。然后用300 μ I的試劑#4洗滌柱2次，洗滌間期在10，OOOXg下旋轉(zhuǎn)。添加20至50 μ I的洗脫緩沖液并且使樣品旋轉(zhuǎn)到干凈接收管中。樣品現(xiàn)已準(zhǔn)備好進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0072]樣品預(yù)處理[0073]當(dāng)前的樣品預(yù)處理牽涉Qiagen Inc (Valencia, CA91355USA)、Sigma LifeSciences (St Louis, MO, USA)、Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA92008, USA)和Promega Corporation (Madison, WI53711USA)銷售的商業(yè)試劑盒。
[0074]將本發(fā)明與下列方法作比較。
[0075]醫(yī)院“內(nèi)部”測(cè)試
[0076]在95°C下加熱大便樣品10分鐘，然后稀釋并且再擴(kuò)增樣品中艱難梭狀芽胞桿菌的tcdB基因。
[0077]Qiagen 純化
[0078]QIAamp DNA Stool Mini Kit (50)產(chǎn)品目錄號(hào) #51504
[0079]商業(yè)寄生蟲測(cè)試
[0080]AusDiagnostics胃腸道寄生蟲5,產(chǎn)品目錄號(hào):6502。
[0081]結(jié)果
[0082]糞便樣品
[0083]表1、2、3和4中測(cè)試的所有糞便樣品處理如下: [0084]將拭子放在排泄物中，然后轉(zhuǎn)移到裝有200 μ I的3Μ亞硫酸氫鈉(ρΗ5.0)的管內(nèi)，混合，然后在95°C下加熱15分鐘。
[0085]使用MethylEasy?方法去除亞硫酸氫鹽并且使樣品再懸浮于20-50 μ I的洗脫緩沖液中，然后使用標(biāo)準(zhǔn)條件擴(kuò)增。
[0086]表1示出了醫(yī)院“內(nèi)部”測(cè)試的結(jié)果，使用Qiagen純化測(cè)試相同樣品并且使用根據(jù)本發(fā)明的所述方法測(cè)試相同樣品。正如從結(jié)果可見(jiàn)，醫(yī)院“內(nèi)部”測(cè)試產(chǎn)生7個(gè)假陰性結(jié)果和I個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果(通過(guò)EIA和培養(yǎng)以及可商購(gòu)的分子診斷試劑盒進(jìn)行確認(rèn))，表明所述方法不具有對(duì)檢測(cè)患者原始樣品中艱難梭狀芽胞桿菌的所需靈敏度。使用Qiagen方法，4個(gè)樣品沒(méi)有足夠物質(zhì)用于處理，而I個(gè)樣品給出假陰性結(jié)果(通過(guò)EIA的GDH陽(yáng)性)。這些結(jié)果證明了根據(jù)本發(fā)明所述方法(HGS方法)用于快速診斷艱難梭狀芽胞桿菌的實(shí)用性。另外，使用HGS方法易于測(cè)定體積有限的樣品。另外，Qiagen方法需要至少2小時(shí)樣品制備時(shí)間并且必須稱出預(yù)定量的排泄物。
[0087]表1.醫(yī)院“內(nèi)部”測(cè)試與Qiagen純化與HGS方法檢測(cè)艱難梭狀芽胞桿菌的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種分子檢測(cè)測(cè)定，包括: 在容許細(xì)胞破碎和核酸處理的條件下直接用亞硫酸氫鹽試劑處理生物樣品； 從所述經(jīng)處理的樣品中去除所述亞硫酸氫鹽試劑；并且 檢測(cè)所述經(jīng)處理的樣品中的靶核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定,其中生物樣品選自糞便、鼻腔、血液、血漿、血清、口腔細(xì)胞、膿液、傷口、濃縮濾液、腦脊髓液、精液、液基細(xì)胞學(xué)(LBC)、組織、FFPE、激光捕獲細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、沉淀細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)物、細(xì)菌菌落、病毒懸液、抽吸物、支氣管灌洗、痰液樣品、環(huán)境樣品、環(huán)境濃縮物、糧食、原料、水樣或水濃縮物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定，用于檢測(cè)動(dòng)物的傳染病、遺傳性疾病或遺傳特性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定，其中所述傳染病由微生物引起。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定，其中所述微生物為細(xì)菌、病毒、類病毒、酵母菌、真菌、朊病毒、寄生蟲或變形蟲。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定，其中所述遺傳性疾病為癌癥、與拷貝數(shù)改變相關(guān)的疾病、遺傳病、環(huán)境誘導(dǎo)的疾病、由暴露于致癌物引起的疾病、特征在于核苷酸重復(fù)長(zhǎng)度擴(kuò)大或減小的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其中所述亞硫酸氫鹽試劑為亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定，其中以濃度為2.5M至3.5M，pH范圍為4.5至5.5使用所述亞硫酸氫鹽試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的`測(cè)定，其中以濃度3M，pH為5.0使用所述亞硫酸氫鹽試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其中所述處理步驟包括在75°C和95°C之間加熱I至30分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的測(cè)定，其中在80°C和95°C之間的溫度下加熱所述樣品10至20分鐘。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其中通過(guò)基于柱的純化、基于珠粒的純化或沉淀去除所述亞硫酸氫鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其中去除所述亞硫酸氫鹽之后，使所述經(jīng)處理的樣品再懸浮于PH為至少10的洗脫緩沖液中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測(cè)定，其中所述洗脫緩沖液的pH為11.5至12.5。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的測(cè)定，其中所述洗脫緩沖液的pH為至少12。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，進(jìn)一步包括為所述經(jīng)處理的樣品提供核酸引物或探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的測(cè)定，其中通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)所述靶核酸分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的測(cè)定，其中所述擴(kuò)增為PCR、qPCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、數(shù)字PCR、恒溫?cái)U(kuò)增或信號(hào)放大。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的測(cè)定，其中通過(guò)對(duì)所述經(jīng)處理的材料進(jìn)行測(cè)序來(lái)檢測(cè)所述靶核酸。
20.一種用于分子檢測(cè)測(cè)定以直接處理樣品的試劑盒，所述試劑盒包含: 亞硫酸氫鹽試劑；核酸洗脫和反應(yīng)試劑；所述靶核酸的引物；和進(jìn)行所述測(cè)定的說(shuō)明書。`
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103874766SQ201180073300
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月7日
【發(fā)明者】道格拉斯·斯潘塞·米勒 申請(qǐng)人:人類遺傳標(biāo)記控股有限公司