木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的快速且低成本的酶促完全轉(zhuǎn)化的制作方法
【專利摘要】提供用于改進(jìn)加工木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法。使熱水預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)在高初始纖維素酶載量(至少15FPU/g?DM)下進(jìn)行分步水解和發(fā)酵(SHF)或預(yù)水解并進(jìn)行同步糖化和發(fā)酵(SSF)。隨后回收纖維素酶，并與較低劑量補(bǔ)充的新鮮的酶一起用于隨后的水解循環(huán)。水解循環(huán)之間損失的酶活性被改進(jìn)的整個(gè)工藝優(yōu)勢(shì)抵消。
【專利說(shuō)明】木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的快速且低成本的酶促完全轉(zhuǎn)化
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明大體上涉及加工木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，其包括預(yù)處理生物質(zhì)的分步水解和發(fā)酵(SHF)和同步糖化和發(fā)酵(SSF)，特別是，涉及通過(guò)在非常高的初始纖維素酶載量下的酶促水解和纖維素酶回收來(lái)改進(jìn)加工效率。
【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素生物質(zhì)提供有前景的石油替代物，提供可再生且〃碳中和(carbonneutral)"的燃料如生物乙醇和其它傳統(tǒng)石油基產(chǎn)品如塑料的來(lái)源。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可被酶促水解，以提供隨后用于各種生物合成工藝的可發(fā)酵碳水化合物。
[0003]由于其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通常只有在一些使得纖維素纖維易于被酶催化的預(yù)處理后，木質(zhì)纖維素才能通過(guò)目前已知的酶活性來(lái)有效地水解。此類預(yù)處理工藝通常包括加熱至較高溫度(100至250°C)。降低成本或以其他方式增加生產(chǎn)規(guī)模的商業(yè)可行性的生物質(zhì)預(yù)處理和加工方法已引起強(qiáng)烈的興趣。
[0004]嚴(yán)重影響木質(zhì)纖維素生物質(zhì)加工的總成本的一個(gè)因素是纖維素酶的成本。因此，更有效地利用纖維素酶或改進(jìn)可發(fā)酵碳水化合物的總產(chǎn)率的預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶促水解方法是有利的。
[0005]已受到相當(dāng)大關(guān)注的一類改進(jìn)是用于回收酶或以其他方式降低酶消耗的策略。
[0006]之前關(guān)于纖維素酶回收的研究表明回收主要取決于兩個(gè)因素-α)水解程度和
(ii)使用的原料的木質(zhì)素含量。作為一般趨勢(shì)，據(jù)報(bào)道，在原料水解更完全的情況下，改進(jìn)回收中的酶回收。然而，由于原料變得水解更完全，這種改進(jìn)的纖維素酶回收的傾向被纖維素酶對(duì)木質(zhì)素的非特異性結(jié)合增加的相關(guān)傾向所抵消。不同回收策略的比較表明，原料的木質(zhì)素含量是控制纖維素酶回收的唯一最重要的變量。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)I。
[0007]已經(jīng)提出了許多纖維素酶回收策略。在未通過(guò)化學(xué)處理脫木質(zhì)素的原料中，現(xiàn)行的方法是在原料水解的中間程度下回收酶。首先從水解反應(yīng)混合物中過(guò)濾或以其他方式回收纖維素殘余物，然后與新鮮原料接觸，使得以高達(dá)50-70%的水平回收纖維素酶活性。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)2和3。
[0008]在通過(guò)化學(xué)處理脫木質(zhì)素的原料中，以前的研究指出，在“完全”水解后，其中沒(méi)有纖維素殘余物剩下，可獲得最大的酶回收。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)I。然而，最近的研究表明，組合使用脫木質(zhì)素的底物和表面活性劑時(shí)，最佳的纖維素酶回收要求從上清液和纖維素殘余物兩者中回收，即最佳的回收要求小于"完全"的原料水解程度。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)4和5。
[0009]之前開發(fā)纖維素酶回收策略的努力集中在降低酶載量。稀釋酶體系通常被認(rèn)為是可取的。在較高的酶載量下，任何給定原料在酶促水解反應(yīng)中任何給定時(shí)間點(diǎn)的水解程度增加了。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)6。然而，該效果是對(duì)數(shù)性的，意味著為了獲得給定時(shí)間點(diǎn)下轉(zhuǎn)化率的較小差異要求大的酶載量差異。因此，為了優(yōu)化酶促水解時(shí)間而不產(chǎn)生過(guò)度的酶成本，現(xiàn)有技術(shù)之前認(rèn)為比較稀釋的酶濃度是可取的。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)7。商業(yè)規(guī)模的生物乙醇生產(chǎn)的技術(shù)經(jīng)濟(jì)模型之前表明，大約10FPU/g干物質(zhì)(DM)預(yù)處理生物質(zhì)的纖維素酶載量是理想的，因?yàn)檫@被認(rèn)為是在合理成本下提供合理水解時(shí)間內(nèi)最高的葡萄糖產(chǎn)量。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)30
[0010]之前認(rèn)為> 10FPU/g DM預(yù)處理生物質(zhì)的纖維素酶載量在商業(yè)規(guī)模生物乙醇生產(chǎn)中是不可取的。在連續(xù)水解回收系統(tǒng)中總成本和葡萄糖產(chǎn)量的一個(gè)廣泛的比較表明，在使用未脫木質(zhì)素的原料時(shí)，20FPU/g DM的高酶載量相對(duì)于更稀釋的10FPU/g DM的載量不具有優(yōu)勢(shì)。參見(jiàn)參考文獻(xiàn)2。
[0011]我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用高的初始酶載量(至少17FPU/g DM)，然后在從之前循環(huán)中回收的纖維素酶活性的每個(gè)水解循環(huán)中補(bǔ)充較低劑量的酶，可進(jìn)行具有整體優(yōu)勢(shì)的依靠SHF或SSF的商業(yè)生物乙醇生產(chǎn)中的纖維素酶回收。在這些高纖維素酶水平下,非特異性木質(zhì)素結(jié)合似乎變得飽和?？蓛H使用低水平的新鮮酶補(bǔ)充，在多個(gè)水解循環(huán)中保持高酶劑量水平。這些高纖維素酶活性水平大大縮短水解時(shí)間，導(dǎo)致資本成本降低和生產(chǎn)規(guī)模能力增加。高纖維素酶活性水平還導(dǎo)致更完全的轉(zhuǎn)化％，降低所生產(chǎn)的每升乙醇的生物質(zhì)成本。使用預(yù)處理的未脫木質(zhì)素的木質(zhì)纖維素原料獲得了有效的結(jié)果。在一些情況下，可如此大大改進(jìn)水解產(chǎn)率和回收纖維素酶活性至如此高程度，以使與在商業(yè)酶供應(yīng)商推薦的低酶水平下所獲得的相比，降低每升乙醇最終的酶消耗。
[0012]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0013]提供用于改進(jìn)生物乙醇生產(chǎn)中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)加工的方法。使熱水預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)在高初始纖維素酶載量(至少15FPU/g DM)下進(jìn)行分步水解和發(fā)酵(SHF)或預(yù)水解并進(jìn)行同步糖化和發(fā)酵(SSF)。隨后回收纖維素酶，并與較低劑量補(bǔ)充的新鮮酶一起用于隨后的水解循環(huán)。水解循環(huán)之間的酶活性損失被改進(jìn)的整個(gè)工藝優(yōu)勢(shì)抵消。
[0014]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0015]圖1顯示在72小時(shí)SSF工藝體系的實(shí)驗(yàn)中乙醇產(chǎn)量作為時(shí)間和纖維素酶劑量的函數(shù)。
[0016]圖2顯示6小時(shí)水解后的葡萄糖濃度作為表示為FPU/g DM的纖維素酶劑量的函數(shù)。
[0017]圖3顯示實(shí)施例3中報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方案。
[0018]圖4顯示使用經(jīng)優(yōu)化用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化且由N0V0ZYMES?提供的可商購(gòu)的纖維素酶制劑來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，每個(gè)回收循環(huán)后獲得的乙醇濃度。
[0019]圖5顯示使用經(jīng)優(yōu)化用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化且由GENENC0R?提供的可商購(gòu)的纖維素酶制劑來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，表示每個(gè)回收循環(huán)后的纖維素酶活性回收的6小時(shí)預(yù)水解后的葡萄糖濃度。
[0020]一些實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明
[0021]提供具有改進(jìn)效率的生物乙醇生產(chǎn)中加工木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法。
[0022]從2000年以來(lái)，最大的商業(yè)纖維素酶生產(chǎn)者已經(jīng)集中研究以在第二代生物乙醇生產(chǎn)中降低生產(chǎn)成本和改進(jìn)經(jīng)優(yōu)化用于轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的纖維素酶混合物的特定活性。特別是N0V0ZYMES?和GENENC0R?在2009-2010年分別以商標(biāo)CELLIC CTEC2?和ACCELLERASE1500?推出新的商業(yè)纖維素酶混合物。
[0023] GENENC0R?在2009年推出專門為第二代生物煉制開發(fā)的可商購(gòu)生物質(zhì)酶的改進(jìn)變型，并以商標(biāo)ACCELLERASE1500?銷售。已表明其成功地水解包括甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿和針葉木漿的一系列預(yù)處理原料。ACCELLERASE 1500?的產(chǎn)品信息頁(yè)指出劑量?jī)?yōu)化范圍是0.1-0.5mL/g纖維素或大約0.05-0.25mL/g DM預(yù)處理生物質(zhì)。
[0024]N0V0ZYMES?在2010年推出專門為第二代生物煉制開發(fā)的可商購(gòu)生物質(zhì)酶的改進(jìn)變型，并以商標(biāo)CELLIC CTEC2?銷售。已表明其成功地水解包括甘蔗渣、玉米秸桿、小麥秸桿和針葉木漿的一系列預(yù)處理原料。N0V0ZYMES?分發(fā)的產(chǎn)品信息材料，具體地是"FuelEthanol Application〃材料中提供的CELLIC CTEC2?的〃劑量指引〃，指出從低到高的劑量范圍，其對(duì)應(yīng)于0.015-0.06g酶/g纖維素或約0.0075-0.03g酶/g DM預(yù)處理生物質(zhì)的范圍內(nèi)的〃商業(yè)上可行的纖維素水解的目標(biāo)〃。
[0025]〃纖維素酶活性〃是指纖維素中l(wèi)，4-13_D-糖苷鍵的酶水解。在從細(xì)菌、真菌或其它來(lái)源中獲得的商業(yè)或其它纖維素酶制劑中，纖維素酶活性通常包含不同酶活性的混合，所述酶包括與β -葡糖苷酶一起分別催化1，4-β -D-糖苷鍵內(nèi)水解和外水解的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶(也稱為纖維素二糖水解酶)，所述P.葡糖苷酶將外切葡聚糖酶水解的低聚糖產(chǎn)物水解成單糖。經(jīng)優(yōu)化用于水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的商業(yè)混合物經(jīng)常還含有用于轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)但本身不是纖維素酶的酶，如催化與木質(zhì)纖維素材料中的纖維素有關(guān)且由各種單糖組成的雜聚合物半纖維素水解的半纖維素酶，所述單糖最特別是木糖，但還包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和其它糖。
[0026]如現(xiàn)有技術(shù)眾所周知的，總的纖維素酶活性，包括不同纖維素酶的任何混合物，可便利地測(cè)定為稱為__濾紙單位__的單一活性表達(dá)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)__濾紙單位"(FPU)是指通過(guò) Adney, B.和 Baker, J., Laboratory Analytical Procedure#006,^Measurementof cellulase activity", 1996 年 8 月 12 日，USA National RenewableEnergy Laboratory(NREL)的方法測(cè)定的濾紙單位,上述文獻(xiàn)以其整體方式通過(guò)引用明確地引入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，F(xiàn)PU提供纖維素酶活性的量度，但是其它的酶活性可有用地包括在纖維素分解酶的有效混合物中，包括但不限于半纖維素酶活性。
[0027]在丹麥Fredericia的INBIC0N?實(shí)驗(yàn)室，我們測(cè)定經(jīng)優(yōu)化用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解并由GENENC0R?以商標(biāo)ACCELLERASE 1500?銷售的商業(yè)纖維素酶制劑的以濾紙單位計(jì)的纖維素酶活性為約60 (FPU)/ml。因此，可將GENENC0R?建議的優(yōu)化范圍重新計(jì)算為約3 — 15FPU/g DM預(yù)處理生物質(zhì)。我們測(cè)定經(jīng)優(yōu)化用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解且由N0V0ZYMES?以商標(biāo)CELLIC CTEC2?銷售的商業(yè)纖維素酶制劑以濾紙單位計(jì)的纖維素酶活性為約120FPU/g酶。因此，可將由N0V0ZYMES?建議的〃商業(yè)上可行的纖維素水解的目標(biāo).‘劑量重新計(jì)算為約1.4FPU/g DM。
[0028]考慮到纖維素酶劑量對(duì)第二代生物乙醇生產(chǎn)的商業(yè)化可行性至關(guān)重要，現(xiàn)有技術(shù)之前已尋求使纖維素酶劑量最小化。例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)9。
[0029]相反地，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，令人驚訝地，使用SHF或SSF時(shí)，使用高初始酶載量(至少15FPU/g DM)可獲得更大的整個(gè)工藝優(yōu)勢(shì)。
[0030]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種高的酶劑量回收方案，由此在多個(gè)水解循環(huán)中保持至少15FPU/g DM或至少12FPU/g DM或至少10FPU/g DM的纖維素酶活性水平。僅需要在初始水解循環(huán)中添加高的酶劑量。通過(guò)從之前循環(huán)中回收纖維素酶活性和補(bǔ)充較低劑量的新鮮纖維素酶制劑，而在隨后的水解循環(huán)中保持高的酶水平。
[0031]相對(duì)于低劑量體系，高劑量體系即使在每升乙醇的酶消耗量增加的情況下，也提供整體優(yōu)勢(shì)。使用高劑量體系導(dǎo)致水解時(shí)間急劇縮短。該水解時(shí)間的縮短提供生產(chǎn)規(guī)模的直接利益，因?yàn)榻档土速Y本成本(可使用更小的水解罐)和增加了生產(chǎn)能力(實(shí)現(xiàn)更高的生物質(zhì)生產(chǎn)能力)。此外，在高劑量體系中，更完全地水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，以致轉(zhuǎn)化率接近100%。這反過(guò)來(lái)降低了每升乙醇的總生物質(zhì)成本。在其它情況下，可如此顯著地改進(jìn)水解產(chǎn)率和回收纖維素酶活性至如此高的程度，以致與使用商業(yè)酶供應(yīng)商推薦的較低酶劑量下可獲得的相比，高劑量體系提供相當(dāng)或甚至更低的每升乙醇的最終酶消耗量。
[0032]表1顯示在使用本發(fā)明方法的多個(gè)水解循環(huán)中可大致保持的理論高初始纖維素酶劑量的計(jì)算值，其中每升乙醇的酶成本與低劑量體系相當(dāng)。所示的纖維素酶活性回收水平限定了在每個(gè)水解循環(huán)中通過(guò)低劑量補(bǔ)充可維持的高酶劑量的水平。所示的補(bǔ)充劑量簡(jiǎn)單地是[1-(回收率％/100)]*(實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化所需的酶劑量)。理論高劑量計(jì)算基于假定水解中的轉(zhuǎn)化率為100%。因此，理論可持續(xù)高劑量應(yīng)通過(guò)系數(shù)(高劑量下的實(shí)際轉(zhuǎn)化率)/100%來(lái)校正。相當(dāng)?shù)拿赋杀颈硎荆ㄟ^(guò)10個(gè)具有補(bǔ)充的回收循環(huán)在完全轉(zhuǎn)化下生產(chǎn)每升乙醇的總酶消耗量相當(dāng)于通過(guò)10個(gè)普通發(fā)酵循環(huán)在5FPU/g DM和在相當(dāng)?shù)腄M下生產(chǎn)每升乙醇的總酶消耗量?！ㄆ胀òl(fā)酵〃是指使用5FPU/g DM的經(jīng)優(yōu)化用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解且由N0V0ZYMES?以商標(biāo)CELLIC CTEC2?提供的商業(yè)纖維素酶制劑在50°C下預(yù)水解經(jīng)蒸汽預(yù)處理的小麥秸桿6小時(shí)，然后使用普通面包酵母在30-33°C下SSF144小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)條件。
[0033]如下確定表1的計(jì)算:每升乙醇目標(biāo)物的相當(dāng)酶成本是在SSF體系中144小時(shí)，25% DM下，5FPU/g DM下的典型乙醇產(chǎn)量。該典型產(chǎn)量是70%的理論轉(zhuǎn)化率，其在參考DM水平下產(chǎn)生152升乙醇。
[0034]因此，所述相當(dāng)目標(biāo)是5FPU/152升乙醇或0.0328947FPU/升乙醇，其中g(shù) DM是常數(shù)。
[0035]參考DM水平下的100%轉(zhuǎn)化率是218升乙醇。利用在該SSF體系中超過(guò)15FPU的任何劑量可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化的假設(shè)，我們計(jì)算了在10個(gè)具有酶補(bǔ)充的回收循環(huán)中使用的總酶。
[0036]我們得到[總酶FPU]/2180升乙醇=0.0328947FPU/升乙醇，其中g(shù) DM是常數(shù)。
[0037]術(shù)語(yǔ)[總酶FPU]是回收率％和由X給出的起始酶濃度的函數(shù)，其可求解以滿足條件[總酶]=(2180) * (0.0328947) = 71.7
[0038]如下確定X的計(jì)算:[((9個(gè)回收循環(huán))*(1-回收率％補(bǔ)充)+l)*X] =71.7
[0039]因此，例如，在15FPU和58%回收率時(shí)的計(jì)算為:[總酶FPU] = 15+9* (6.3補(bǔ)充劑量)=15+56.7 = 71.7
[0040]類似地，例如，在18.1FPU和67%回收率時(shí)的計(jì)算為:[總酶FPU] = 18+9* (5.96補(bǔ)充劑量)=18.1+53.6 = 71.7
[0041]表1.由給定的平均纖維素酶實(shí)際回收率％下的以FPU/g DM計(jì)的給定補(bǔ)充劑量計(jì)算的在每升乙醇相當(dāng)酶 成本下可持續(xù)的以FPU/g DM計(jì)的理論高纖維素酶劑量
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種加工木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的方法，其包括 -提供熱水預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì) -使所述預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)行使用至少15FPU/g DM的初始纖維素酶劑量的初始酶促水解，至轉(zhuǎn)化率為95%或更高，然后 -隨后的水解循環(huán)，其中將從一種水解混合物中回收的纖維素酶活性與l_6FPU/g DM的新鮮纖維素酶補(bǔ)充劑量一起使用，以水解隨后的水解混合物中的其他生物質(zhì)， 其中從pH為7.5至9.5的來(lái)自上清液和來(lái)自水解殘余洗滌物的一種水解混合物中回收纖維素酶活性，并再用于隨后的水解混合物，以使回收的纖維素酶活性的平均量為從其中回收活性的水解開始時(shí)的存在量的至少約58%，和 其中使在隨后的水解混合物中的回收酶和補(bǔ)充新鮮的纖維素酶的循環(huán)重復(fù)三次或更多次。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中隨后使所述水解混合物進(jìn)行發(fā)酵至至少4重量％的乙醇濃度。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中在約60°C或更低的溫度下真空蒸餾后，回收纖維素酶活性。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是小麥秸桿。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)在水解之前使用回收的酶溶液浸潰新鮮的預(yù)處理生物質(zhì)，在隨后的水解循環(huán)中包括回收的纖維素酶活性。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述初始纖維素酶劑量為至少18FPU/gDM。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中用于提供所述補(bǔ)充劑量的纖維素酶制劑與用于提供所述初始纖維素酶劑量的纖維素酶制劑不同。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述纖維素酶是經(jīng)優(yōu)化用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的可商購(gòu)纖維素酶制劑。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中以自動(dòng)水解的形式在pH2.5至8.0進(jìn)行熱水預(yù)處理。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行熱水預(yù)處理至對(duì)數(shù)強(qiáng)度小于3.95。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中以SSF工藝形式進(jìn)行水解。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中以SHF工藝形式進(jìn)行水解。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇所述補(bǔ)充劑量，以使在至少三個(gè)水解循環(huán)中保持酶劑量平均值為至少10FPU/g DM。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇所述補(bǔ)充劑量，以使在至少三個(gè)水解循環(huán)中保持酶劑量平均值為至少12FPU/g DM。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇所述補(bǔ)充劑量，以使在至少三個(gè)水解循環(huán)中維持酶劑量為至少10FPU/g DM。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇所述補(bǔ)充劑量，以使在至少三個(gè)水解循環(huán)中維持酶劑量為至少12FPU/g DM。
【文檔編號(hào)】C12P7/00GK103930553SQ201180074749
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2011年10月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月6日
【發(fā)明者】簡(jiǎn)·拉森, 馬丁·丹·杰普森 申請(qǐng)人:因比肯公司