專利名稱：一種水稻干旱誘導表達蛋白、其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及水稻中一種能夠準確應答干旱脅迫的蛋白及其編碼基因，以及這種基因的調控元件在水稻抗旱中的應用。
背景技術：
干旱等非生物逆境一直是限制作物生長和產量的重要因素，并且隨著全球環(huán)境惡化、氣候異常等變化將日益危害著我國的糧食生產安全。通過超量表達逆境應答過程中的重要基因可以顯著提高作物的抗逆性。傳統(tǒng)基因工程中超量表達通常利用的是組成型啟動子，其缺點是對植物可能產生一定的毒害作用和資源浪費；而誘導型啟動子卻不同，它可以驅動目標基因只有在植株受到誘導信號刺激后才上升表達，不僅節(jié)約了植株細胞內有限的資源，也減輕了目標蛋白對植株可能產生的負面效應，其目標性和專一性更強。通過干旱條件下的水稻轉錄譜分析，我們獲得了一個干旱脅迫后誘導表達的基^LOC_ 0s01g0849000。LOC— 0s01g0849000 ^ Plant lipid transfer/seed storage/trypsin-alpha amylase inhibitor結構域。該結構域多與脂肪轉運，種子貯存以及酶蛋白活性抑制相關。植物在處于干旱逆境時，這些蛋白通常表達量上升，減少了脂肪以及蛋白質的消耗，從而幫助植株在逆境中存活更長的時間。對基因0s01g0849000i—勞分析后發(fā)現徹似冰擬湘浙基因的啟動子屬于干旱誘導型啟動子，專門在植物體受到干旱脅迫時啟動該基因的表達，以抵御干旱逆境。根據這一特性，我們在該啟動子3’端連接一個報告基因GUS，在植物受到干旱逆境脅迫時，報告基因便開始表達，經過一種便捷有效的染色方法就可以估量植物水分的缺失，以便及時補救，有效減少甚至避免損失。L0C_ 0s01g0849000受干旱誘導表達的特性，可以應用于水稻抗旱育種，這對于深入研究植物抗旱機制有重大意義。L0C_徹似冰擬^^^的調控元件啟動子驅動報告基因的方法更是提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的手段，具有較高的實際應用價值，應用前景廣闊。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一個來源于水稻的可應答干旱的基因及改造該基因后的可以報告干旱程度的基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法。本發(fā)明所提供的可應答干旱的基因，名稱為0s01g0849000，來源于水稻iOryza sativa Lssp. japonica)；是下述氨基酸殘基序列之一
1)序列表中的SEQID No:l ；
2)將序列SEQID No :1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發(fā)育具有調控作用的蛋白質。序列表中的SEQ ID No: 1由118個氨基酸殘基組成。編碼本發(fā)明徹似冰擬湘洲，是下述核苷酸序列之一1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；
2)編碼序列SEQID No: 1蛋白質序列的DNA ；
3)與序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；
4)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件為用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下雜
交并洗膜。序列表中的SEQ ID No:2由702個堿基組成，其編碼框為自5’端第76位堿基到第432位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質。本發(fā)明所提供的可應答干旱的基因徹似冰擬湘洲的調控元件為該基因的啟動子區(qū)域，是下述核苷酸序列之一
1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；
2)與序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
3)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件為用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下雜交并洗膜。含有本發(fā)明基因的重組表達載體、轉基因細胞系和工程菌以及擴增該基因中任一片段的引物對均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法。在實際應用中，將的啟動子與報告基因Gtt 融合，將該構建LOC_ 0s01g0849000-promoter~gus轉化水稻，可以估量植物水分的缺失。上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構建。本發(fā)明的LOC_ 0s01g0849000是一個抗旱基因，可以在水稻受到干旱脅迫時大量表達，以抵御干旱逆境。而l—的轉基因植株可以報告水稻干旱程度。本發(fā)明不但提供了一種抗旱基因，更提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法，同時也對深入研究植物抗旱機制及功能有重大意義。本發(fā)明的蛋白質及其編碼基因具有較高的實際應用價值，應用前景廣闊。


圖1為野生型水稻在干旱處理和未處理條件下，LOC_ 0s01g0849000基因熒光定量PCR檢測結果。圖2為野生型水稻和Zi^ 0s01g0849000~vromoter-g\xs轉基因水稻在干旱和未處理條件下的GUS染色圖。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。所用引物由英駿生物技術有限公司完成，測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。實施例1.水稻抗旱基因Zi^ 0s01g0849000飽篩1。對水稻進行正常培養(yǎng)，至二級枝梗形成時，停止?jié)菜敝镣寥浪趾窟_到20%_30%，并保持該濕度約一周(5-7天)利用基因芯片比較分析對照植物與被脅迫植物的基因表達譜，根據水稻基因芯片的結果，并與擬南芥中已取得的在類似脅迫條件下生殖器官中基因表達的變化情況比較，初步篩選到一些候選基因。0s01g0849000就是其中之一。以水稻未受干旱脅迫的花期、受到干旱脅迫的花期的總RNA為模板，用AMV反轉錄酶(TaKaRa)合成cDNA (依據Plant RT — PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用戶手冊進行)，用熒光定量PCR試劑盒STOR Premix Ex Taq (TaKaRa)檢測對照植物與被脅迫植物中0s01g0849000的表達情況(依據TaKaRa的用戶手冊進行)。所用5’和3’引物分別為5，-GCCGTGGCCATGACCAT-3， (SEQ ID No:4)和 5，-CACGTGACAAAGGTAACATCAGTTT-3’ (SEQID No:5)。反應按照下列程序進行預變性95°C 3分鐘，1個循環(huán)；變性95°C 10秒，退火與延伸60°C 30秒，40個循環(huán)。對比該基因在未受干旱脅迫的花期和受到干旱脅迫的花期的表達量，我們發(fā)現徹似冰擬^^^在受到干旱脅迫的花序中誘導表達(圖1)。實施例2. LOC_徹似冰擬湘㈨啟動子的克隆。在 Rice Genome Annotation Project 網站(http://rapdb. lab. nig. ac. jp/)查找徹似冰擬湘洲序列，分析該序列，并得到其啟動子部分序列。提取水稻總DNA，以水稻總DNA為模板，PCR擴增徹似冰擬湘洲的啟動子部分。引物序列分別為5' _GGATCCttcgcatctgtacccaataa_3' (SEQ ID No:6)和 5' _CCATGGgtcgtctgcaactctgag_3'(SEQ ID No:7)。50ul PCR反應體系包含水稻基因組DNAlul，高保真酶KOD plus(TOYOBO) lul，10X 緩沖液 5ul，2. 5uM dNTP 4ul，25mMMg2+2ul, 20uM 的 5，和 3，引物各lul，50%甘油5ul，水30ul。反應條件為94° C預變性2分鐘；94° C變性30秒，55° C退火30秒鐘，68° C延伸4分30秒，共35個循環(huán)。反應結束后，將PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約3500bp的擴增片段。然后將該片段連至PMD19-T (TAKARA)，經桑尼公司測序正確再經召a H I和AfcoI酶切，克隆到載體pl301中(在L0C_ 0s01g0849000啟動子之后下游連接GUS報告基因)，測序驗證其正確后得到質粒pl301- L0C— As似冰■■-promoterο實施例3.重組質粒pl301-Zi^ flsiV^^^^^^-promoter轉化水稻植株。將重組質粒pl301- L0C_ flsiV^^^^^^-promoter 轉化到水稻中。參照 Hiei等(Plant Mol Biol, 1997,35 205 - 218)的方法轉化水稻。將質粒 pl301- L0C_0s01g08490000~x>romoter通過電激法轉入根瘤農桿菌EHA105中，經篩選獲得陽性克隆。將攜帶質粒 pl301- L0C_ 0s01g0S49000~promoter 的農桿菌EHA105 接種到 5ml 含 100mg/L 卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)至對數生長期晚期，再1 :100擴大培養(yǎng)到0D600為0.1左右。收集農桿菌菌體并重懸于轉染培養(yǎng)基中。按照常規(guī)方法浸染水稻日本晴的愈傷組織，經共培養(yǎng)感染、抗性培養(yǎng)基篩選及分化培養(yǎng)基上分化得到潮霉素抗性的陽性苗。待小苗長至IOcm左右時，將小苗移至室外網室種植，收種即得Tl代種子。實施例4.質粒pl301-Zi^ flsiV^^^^^^-promoter轉基因水稻植株報告干旱脅迫效果的檢測。將得到的轉基因水稻Tl代種子正常種植，在水稻二級枝梗形成時，停止灌溉，監(jiān)測土壤含水量，使之保持在20-30%，持續(xù)一周。取下花序浸于gus染液中，于37°C放置Mh，70%乙醇浸泡24h以洗脫雜色，觀察經過干旱處理與對照組的花器染色程度。圖2即為轉基因水稻植株和野生型水稻花序的gus染色結果。未受干旱處理的轉基因水稻植株，其花序里報告基因gus的表達水平非常之低，而受過干旱處理的轉基因水稻植株，其報告基因卻呈現了高度表達，因而證明了 0s01g0849000的啟動子為一種干旱誘導型的啟動子，在植物受到干旱脅迫后在花器官中誘導表達。同時我們的結果還提供了一種檢測植株水分缺虧的方法，即通過便捷有效的染色就可以較為地準確估量植物水分缺失的程度，以便及時補救，有效減少甚至避免損失。
權利要求
1.一種水稻干旱脅迫應答蛋白，其特征在于為下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(1)序列SEQ ID No 1 ；(2)將序列SEQID No: 1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發(fā)育具有調控作用的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述的干旱脅迫應答蛋白的基因，其特征在于為下述核苷酸序列之(1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；(2)編碼序列SEQID No: 1蛋白質序列的DNA ；(3)與序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(4)在高嚴謹條件下與序列SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的干旱脅迫應答蛋白的基因的調控元件，即該基因的啟動子，其特征在于為下述核苷酸序列之一(1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；(2)與序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；(3)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件的表達載體。
5.含有權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件的轉基因細胞系。
6.含有權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件的工程菌。
7.權利要求2或3所述的水稻花期干旱脅迫應答基因及其調控元件在植物生長發(fā)育中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于將所述水稻花期干旱脅迫應答基因的調控元件啟動子區(qū)域與報告基因Gtt？融合后轉化水稻，在受過干旱處理的轉基因水稻植株里，其報告基因呈現誘導表達。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體為一種水稻干旱誘導表達蛋白、其編碼基因和應用。該蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNo1；2)將序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發(fā)育具有調控作用的蛋白質。本發(fā)明還提供水稻抗旱基因及建立于此基因調控元件基礎上的有效檢測植物所受干旱脅迫程度的方法。經檢測，該方法具有快速、準確估量水稻植株所受干旱影響程度的特點。本發(fā)明為植物缺水檢測提供了一種快速、便捷、有效的方法，并為植物抗旱研究及干旱育種提供了一個優(yōu)質基因，具有較高的實際應用價值，應用前景廣闊。
文檔編號C12N1/21GK102558323SQ201210000730
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權日2012年1月4日
發(fā)明者石金磊, 董愛武, 金菁, 隋鵬飛 申請人:復旦大學